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对雄性欧洲鳗鲡 (安圭拉) 进行激素成熟和精子冷冻保存的处理和处理

Developmental Biology

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Summary

欧洲鳗鲡成熟和精子冷冻保存的协议在过去的几年里得到了改善。这篇文章描述了最佳的协议可利用人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 诱导成熟和甲醇为剂。

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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Abstract

在过去的几年中, 几个研究小组一直致力于开发和改进欧洲鳗鲡处理和成熟的新协议。到目前为止, 每周注射人类绒毛膜促性腺激素 (hCG) 已证明成熟男性经过短短5-6 周的治疗, 生产高品质的精子在几个星期。此外, 使用不同的扩增剂、冷冻、冷却和解冻时间的精子冷冻保存协议已经被描述为欧洲鳗鲡。在这里, 我们表明, Tanaka´s 扩展解决方案可以直接用于施肥或冷冻保存, 使不必要的使用不同类型的解决方案和稀释。此外, 甲醇作为剂的使用使得该协议易于使用, 因为甲醇具有低毒性和不激活精子。精子不需要在加入剂后立即保存, 并且在解冻后可以长时间使用。此外, 在解冻后精子活力仍很高, 但比新鲜精子低。这项工作的目的是为欧洲鳗鱼的处理, 成熟和精子冷冻保存提供最佳的协议。

Introduction

在过去25年中, 欧洲鳗鲡 (安圭拉) 到达欧洲海岸的数量稳步下降, 有 90% 1,2,3。有几个因素解释这一急剧下降, 包括污染, 感染, 过度捕捞和栖息地破坏。所有这一切都对这一物种产生了深远的影响, 导致将欧洲鳗鲡列入国际自然保护联盟 (IUCN) 名单, 作为严重濒危的4。因此, 在圈养的繁殖技术和规程的发展是必要的。

欧洲鳗鲡在圈养中的成熟是通过荷尔蒙治疗来实现的5,6,7但是在两性的配子生产上很难同步8。虽然新的雄激素植入物的发展已经显示出加速卵子在鳗鱼9,10, 雌性的最终成熟时间仍然是高度可变的, 难以控制11。因此, 短期储存精子12,13,14和冷冻保存技术是复制管理所必需的, 使配子同步不必要的8

欧洲鳗鲡精子的超低温保存自 2003年15,16开始开发。一些研究人员设计成功的协议使用二甲基亚砜 (亚砜) 或甲醇作为冷冻16,17,18,19,20。尽管两种协议都已成功使用, 但用亚砜保存的解冻精子所获得的细胞活力低于甲醇20,21。此外, 鳗鱼精子被激活与亚甲基亚砜接触, 需要更繁琐的精子操作19, 因此, 甲醇是一个更适合剂欧洲鳗鲡精子比亚砜。

在这里, 欧洲鳗鲡最佳处理和荷尔蒙治疗的协议将在下面描述。此外, 最好的欧洲鳗鱼精子冷冻保存协议, 使用甲醇作为剂和一个协议的精子质量的评估也将描述。

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Protocol

本议定书所述的与欧洲鳗鲡有关的所有程序均由大学 Politècnica de València 的动物实验伦理学委员会批准, 遵循西班牙的法律和法规, 控制实验并活动物的程序。

1. 鱼类保养

  1. 把欧洲鳗鲡带到一个研究设施, 并把它们放在一个200升水族馆与循环系统。使用恒温器和冷却机保持恒定的20° c 温度。
  2. 保持在黑暗的条件下的鱼, 以避免压力22 , 并在实验中没有食物。
  3. 在头3天内将鱼放在淡水中。然后每隔一天更换1/3 的水, 再加满海水, 直到达到37.0 ±0.3 克/升的盐度。

2. 荷尔蒙治疗

注: 荷尔蒙治疗包括每周注射人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 在整个持续时间 (九周) 的实验。

  1. 通过稀释生理盐水 (0.9% 氯化钠) 中的激素, 在1µL 的浓度下提前准备 hCG 激素。
    注意: 在-18 ° c 的时候, 荷尔蒙可以在这个浓度下被稀释一周以上。
  2. 为了麻醉鱼, 准备一个40升的柔性桶与5升的系统水。
    1. 在250毫升瓶, 稀释300毫克的因在100毫升的70% 乙醇。
    2. 将稀释后的因倒入桶中 (最终浓度 0.36 mM) 并适当混合。这是最后的因浓度为60毫克/升。
    3. 将鱼单独放入水中, 因, 等待几秒钟, 直到因生效, 鱼被适当地麻醉。
      注意: 要确认鱼是被麻醉的, 把鱼放在仰卧位, 检查它是否保持在那个位置。
  3. 为了管理荷尔蒙, 在1.5 毫升的塑料管中, 称鱼和准备 hCG 激素, 剂量为1.5 的鱼/克。
    1. 用塑料管中的 hCG 激素填充1毫升注射器。
    2. 将麻醉鱼置于仰卧位, 并在辅助或注射器中, 在腹腔内仔细注射激素。
  4. 把鱼放回水族馆, 并监测它直到完全恢复。
    注意: 荷尔蒙管理必须在整个实验中每周进行一次。通常情况下, 欧洲鳗鲡在激素治疗6-7 周后开始 spermating。

3. 精子取样

  1. 要获得最好的质量样本, 在荷尔蒙管理后提取精子 24 h6,23
  2. 麻醉在步骤2.2 中描述的因的鱼。
  3. 将麻醉鱼放在仰卧位, 用蒸馏水清洗生殖器区域, 用纸擦干, 避免在生殖器区出现粪便污染, 或通过与水族馆的海水接触, 防止意外精子活化。
  4. 把手指放在鱼的两侧, 按摩小心地从胸鳍侧向生殖器区域施压, 迫使精子出来。
    1. 重复按摩直到没有更多的精子从生殖器口出来。
  5. 使用真空泵将精子收集到15毫升塑料管中。
  6. 稀释被提炼的精子1:10 在修改的 Tanaka´s 扩展器解答24 (137 毫米氯化钠, 76.2 毫米 NaHCO3, 在蒸馏水) 在 4 c。
    注: 扩能剂溶液中的精子应保持在 4 c。

4. 精子质量评价

  1. 准备人工海水13 (以 mM 为单位: 氯化钠 354.7, 氯化镁2 52.4, CaCl2 9.9, Na2如此4 28.2, 氯化钾 9.4, 在蒸馏水中) 与2% 牛血清白蛋白 (BSA) (w: v), 调整 pH 值到 8.2, 渗透到 1100 mOsm/千克, 并保持它在 4 c, 以避免细菌生长。
  2. 打开计算机辅助精子分析软件 (CASA), 并选择鱼精子模块。
    1. 单击属性打开软件的系统设置。在那里, 设置捕获选项每秒60图像。选择负位相光学, Makler 室和10X 尺度。
    2. 然后在分析值上, 选择Fish作为种类和粒子区域大于2µm2和小于20µm2
    3. 在速度参数上, 当单元格在10到45µm/秒之间移动时设置为慢速, 当在45和100µm/秒之间移动时设置为, 并在移动速度超过100µm/秒时设置为快速
      注: 速度低于10µm/秒的精子被认为是 immotile。
    4. 选择渐进值作为80% 的直线度 (STR) 并保存属性。
    5. 单击捕获字段(将打开带有照相机的实时图像的窗口)。
      注: 计算机辅助精子分析系统由显微镜、摄像机和图像分析软件组成。
  3. 在计数室, 投入4µL 人工海水和增加0.5 µL 的精子溶液 (精子稀释剂溶液)。
    1. 将图像与显微镜聚焦在10X 放大的负相位。十五年代激活后, 单击计算机辅助精子分析软件中的从视频捕获
    2. 分析每一个样品一份, 并选择样本的运动高于70% 的冷冻保存。
      注意: 这是非常重要的选择, 只有高质量的精子, 以成功的这一冷冻保存协议。

5. 精子冷冻法

  1. 预先准备液氮 (大约2.5 升) 在 34 cm x 34 cm x 30 cm 和 5 cm 厚实的发泡胶盒。
    注: 在任何时候保持4-5 厘米高的液氮水平。
    1. 建立一个浮动结构, 预冻结精子。使用2块聚苯乙烯 (20 厘米 x 5 厘米), 用2塑料管将其绑定, 并将结构放置在液氮上。这一结构需要漂浮在液氮上的大约高度3厘米的表面 (图 1)。

Figure 1
图 1.用于液氮预冻结的浮动结构示意图.该结构由两片低密度发泡胶 20 cm x 4 cm x 5 cm 连接与塑料管 14 cm。秸秆被放置在塑料管在3厘米以上的液氮。请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 将精子、延长剂溶液和甲醇在1.5 毫升塑料管中掺入 1:8: 1, 并轻轻搅拌, 以制备冷冻液。
  2. 在吸管的帮助下, 将冷冻液的480µL 加入到500µL 的吸管中, 并在必要时用模拟粘土将其结束。
  3. 把稻草放在漂浮装置上, 在3厘米高的液体氮气上3分钟。然后, 将稻草放入液氮中。
  4. 10-15 分钟后, 用长钳将吸管转入液氮贮罐, 随时将其浸入液氮中。在这里, 精子可以无限期地储存。

6. 解冻方法

  1. 准备一个带有液氮的泡沫塑料盒, 如步骤5.1 所述, 并准备一个水浴使用 3 L 烧杯与自来水在 40 c。
  2. 用长钳将储罐中的冷冻精子从贮槽中转移到带有液氮的发泡胶盒中。
    1. 把每根稻草放入水浴在 40 c 十三年代。
    2. 将精子倒入1.5 毫升塑料管中, 用剪刀把吸管的闭合端切下来。
  3. 使用计算机辅助精子分析系统分析精子运动, 如步骤4.1 所述。
  4. 保留100µL 的精子, 用流式细胞仪分析精子的生存能力。

7. 流式细胞仪

  1. 使用含有碘碘化物 (PI) 的荧光试剂盒, 它是一种红色的荧光化合物, 它可以染色死细胞的细胞核, 以及一种膜状 permeant 核荧光化合物, 即绿色会使活细胞的细胞核染色。
    1. 准备绿色荧光染色液, 稀释它从股票溶液 (1 毫米) 1:10 在 Tanaka´s 介质的工作解决方案, 100 µM。
    2. 不要稀释 PI 溶液。股票的解决方案是在2.4 毫米。
  2. 对于每个样本, 采取50µL 新鲜或解冻精子和添加0.5 µL 绿色荧光染色工作溶液 (最终浓度1µM) 和2µL PI 溶液 (最终浓度100µM)。
  3. 在黑暗中孵育含有染料 (PI 和绿色荧光染色) 的样品5分钟。
    1. 稀释500µL Tanaka´s 扩剂溶液中的样品, 并与流式细胞仪进行分析。
  4. 打开流式细胞仪, 并创建一个新的协议, 其中包含至少2地块: SS 日志 vs FS 日志和 FL1 vs FL3。
    注意: 绿色荧光染色和碘碘化物可以用可见光波长的光来激发。当与 DNA 结合时, 这些染料的最大荧光量分别为 516 nm 和 617 nm。
    1. 调整不同激光器的电压: SS = 199;FS = 199;FL1= 377;FL3= 372
    2. 建立符合最大事件的购置设置 = 5000 或十五年代 (样品的最终浓度应该是大约100万的细胞/毫升)。使用流读取该示例。
    3. 选择阅读模式单管固定位置模式
    4. 把样品放在旋转木马的正确编号
    5. 阅读示例 (按 F9) 并将收集到的数据保存到 excel 文件 (按 F7) 以进行进一步分析。

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Representative Results

本研究选取了18只有70% 或更高精子活力的鳗鱼精子。结果表明, 与新鲜精子 (表 1图 2) 相比, 解冻后所有质量参数都有所降低。运动结果 (平均± S.E.M., n=18) 显示了更高的总运动和在新鲜的精子的进步运动比总运动和进步运动发现在后解冻精子样品。

在对快速精子细胞的分析中也发现了同样的模式, 即冰冻解冻的样品比新鲜的样品呈现出更低的快速细胞比率。此外, 在解冻后的样品中, 精子的细胞速度也有所降低。

此外, 结果表明, 解冻后的细胞活力呈现减少23± 3.1% (平均± S.E.M., n=18) 从新鲜到冻融样本 (表 1图 2) 活精子细胞。

Figure 2
图 2.新鲜精子和解冻精子的运动、曲线速度和细胞活力数据 (超低温保存后).精子在解冻前被冷冻了24小时。所提出的值是指从18样本中提取精子的± S.E.M.。星号表示解冻和新鲜样品之间有显著差异 (t 检验; p < 0.05)。参数运动表明活动精子总数的百分比, 曲线速度表示精子沿曲线轨迹的平均速度, 细胞活力显示活精子百分率。请单击此处查看此图的较大版本.

快速 + 中等单元格1 (%) 70.7 ±2。8 27.5 ± 2.1 *
曲线速度 (VCL; µm/秒) 118.8 ±2。8 101.5 ± 1.8 *
直线速度 (VSL; µm/秒) 53.3 ±1。9 45.6 ± 1.3 *
平均路径速度 (VAP; µm/秒) 73.3 ±2。1 62.0 ± 1.3 *
跳动交叉频率 (Hz) 27.9 ±0。3 27.1 ±0。6
细胞活力 (活细胞%) 97.7 ±0。3 73.8 ± 2.8 *
1显示曲线速度高于40µm/秒的细胞。

表1。用计算机辅助精子分析系统从新鲜和解冻样品分析不同参数的结果.解冻的样品以前保存了24小时。所有值均为平均± S.E.M. (n=18)。星号表示解冻和新鲜样品之间有显著差异 (t 检验; p < 0.05)。分析的参数有: 运动精子占总运动细胞的百分比;渐进运动的定义为精子的百分比, 在一个基本直线上向前游动;快速和中等细胞定义为精子百分率, 平均曲线速度高于40µm/秒;曲线速度是指精子通过曲线轨迹的平均速度;直线速度, 定义为从第一个检测位置到其在直线上的最后一个位置测量的精子的平均速度;平均路径速度定义为精子平均速度沿其空间平均轨迹;跳动的交叉频率定义为曲线精子头部轨迹穿过其平均路径轨迹的平均速率;细胞活力定义为活精子百分率。

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Discussion

该协议描述了欧洲鳗鲡成熟、处理和精子冷冻保存的完整过程。这里描述的畜牧业条件是最佳的快速成熟和生产高质量精子在这个种类6,7,25。这一冷冻保存协议的成功及其在解冻后的潜在用途很大程度上取决于新鲜精子的质量26。因此, 选择高质量的精子是非常重要的。请注意, 主观的精子质量评估取决于对样本进行评估的研究员的技能、知觉和培训5,27,28 , 并可以根据研究员29。因此, 强烈推荐使用计算机辅助精子分析法来选择最优质的冷冻保存标本。

后解冻精子质量的结果表明, 运动, 速度和细胞存活的参数下降。这与可用的书目是一致的, 尽管物种之间存在很大的差异26,30。例如, 在一项与大西洋鲑鱼 (鲑撒拉族) 的研究中, 用不同的冷冻 (亚砜和甲醇) 冷冻的新鲜精子有 70-95% 的活力。在解冻后的精子活力明显低于新鲜样品, 在8.2% 最佳协议的运动值, 但受精率使用解冻精子高达 42.8%, 这代表了95% 的控制 (新鲜精子) 31。在与大西洋比目鱼 (Hippoglossus Hippoglossus) 的精子不同的研究中, 在冷冻保存和使用解冻精子受精率超过 95% 32后, 发现精子活力没有显著降低。

在欧洲鳗鲡中, 先前的研究也显示了冷冻保存后精子活力的降低, 独立于剂使用的16,18。此外, 类似质量的欧洲鳗鲡冷冻精子已成功用于受精8。在这项研究中, Asturiano et al.使用了亚甲基亚砜作为剂。使用亚甲基亚砜有一些操作上的缺点, 因为这种剂激活精子, 因此需要立即冻结后加入亚甲基亚砜。此外, 解冻后的精子需要立即进行授精。精子 pH 值的降低可以部分解决这一问题19, 但该协议比以甲醇为剂的协议更微妙。

几项研究表明, 以甲醇为剂的阳性结果。例如, 在一项与日本鳗鲡 (安圭拉) 进行的研究中, 使用了一个非常类似的议定书, 在这里提出的, 与10% 甲醇作为剂, 作者成功地受精卵使用新鲜和冷冻保存的精子。在这项研究中, 他们获得了17% 的受精率, 在新鲜和低温保存的精子之间没有显著差异33

本文所提出的协议在解冻后保持了足够的精子质量, 在解冻后表现出类似的精子特征, 使用不同的填充剂和冷冻, 但其优点是易于处理前和后冷冻保存。这是非常重要的, 以准确地遵循的冷却和解冻时间在这里描述以及使用高品质的精子。在未来的研究中, 施肥试验将使用该协议进行测试。

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Disclosures

作者声明他们没有竞争的金融利益。

Acknowledgments

这份出版物是由欧洲联盟的2020玛丽·斯卡洛多斯卡·居里-居里赠款协议 642893 (打动), 成本办公室 (成本行动法 1205, AQUAGAMETE) 和卓越研究中心资助的研究和创新方案-1476-4/2016/FEKUT。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

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References

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