Author Produced

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית, התבגרות, זרע, צלופח האירופית שופרו בשנים האחרונות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול הטוב ביותר הזמינים באמצעות גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עבור גרימת ההבשלה, מתנול כמו cryoprotectant.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במהלך השנים האחרונות, מספר קבוצות מחקר עובדים על פיתוח, שיפור של פרוטוקולים חדשים עבור טיפול צלופח האירופית ו ההבשלה. כמו של עוד, זריקות שבועיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) הוכח כי maturate זכרים אחרי רק 5-6 שבועות של טיפול, בהפקת כרכים גבוהה של זרע באיכות גבוהה במהלך מספר שבועות. בנוסף, פרוטוקולים הקפאה קריוגנית הזרע באמצעות מרחיקי שונים, cryoprotectants, קירור, מפשיר פעמים בעבר תוארו עבור צלופח האירופית. כאן, נראה כי הפתרון extender Tanaka´s ניתן להשתמש ישירות עבור הפריה או הקפאה קריוגנית, עושה את השימוש של סוגים שונים של פתרונות דילולים מיותרים. יתר על כן, השימוש של מתנול cryoprotectant הופך את פרוטוקול זה קל לשימוש כפי מתנול יש רעילות נמוכה והוא אינו מפעיל את הזרע. הזרע אינו צריך להיות cryopreserved מיד לאחר התוספת של cryoprotectant, זה יכול לשמש זמן רב לאחר להיות הקרת. יתר על כן, תנועתיות הזרע הוא עדיין גבוה לאחר מפשיר למרות שזה נמוך יותר מזה של זרע טרי. מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול זמינים בצורה הטובה ביותר עבור אירופה צלופח טיפול, התבגרות, הקפאה קריוגנית זרע.

Introduction

במהלך 25 השנים האחרונות, המספר של צלופחים האירופית (אנגווילה אנגווילה) המגיעים בחוף באירופה ירדו בהתמדה על ידי 90% 1,2,3. ישנם מספר גורמים המסבירים זו ירידה דרסטית כולל זיהום, זיהומים, דייג והרס בית גידול. כל זה יש לו השפעה עמוקה על מין זה, המוביל אל ההכללה של הצלופח האירופית על האיחוד הבינלאומי לשימור הטבע (IUCN) רשימת כמו בסכנת הכחדה קריטית 4. כתוצאה מכך, התפתחות טכניקות ופרוטוקולים עבור רבייה בשבי נחוצים.

ההבשלה של הצלופח האירופית בשבי מושגת על ידי טיפול הורמונלי 5,6,7 אבל בייצור גמטות משני המינים קשה לסנכרן את 8. למרות ההתפתחות של השתלים אנדרוגן חדשים הראו להאיץ oogenesis צלופחים 9,10, העיתוי של ההבשלה הסופי אצל נקבות הוא עדיין מאוד משתנה וקשה לשלוט 11. לכן, אחסון לטווח קצר של הזרע 12,13,14 והקפאה קריוגנית טכניקות נחוצים עבור ניהול רבייה, גורם תא רבייה סינכרון מיותרים 8.

הקפאה קריוגנית בזרע צלופח האירופית פותחה מאז 2003 15,16. מספר חוקרים תוכנן פרוטוקולים מוצלח באמצעות דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או מתנול cryoprotectants 16,17,18,19,20. למרות פרוטוקולים שימשו בהצלחה, הכדאיות שהושג תא הזרע המופשרים cryopreserved עם דימתיל סולפוקסיד הוא נמוך יותר מאשר עם מתנול 20,21. יתר על כן, צלופח זרע מופעל במגע עם דימתיל סולפוקסיד ודורש יותר מייגע זרע מניפולציה 19, לכן מתנול cryoprotectant מתאים יותר לזרע צלופח האירופי מאשר דימתיל סולפוקסיד.

. הנה, פרוטוקול טיפול אופטימלי וטיפול הורמונלי הצלופח האירופית שיפורט להלן. בנוסף לכך, הפרוטוקול הטוב ביותר של הקפאה קריוגנית זרע צלופח האירופי שימוש מתנול cryoprotectant ופרוטוקול להערכת איכות זרע במין הזה יהיה גם המתואר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים לעבודה עם צלופח האירופית שמתואר פרוטוקול זה אושרו על-ידי ועדה של אתיקה של חיה הניסויים-València דה Politècnica Universitat, בעקבות הספרדי החוקים והתקנות שליטה הניסויים ו ההליכים בבעלי חיים.

1. דג תחזוקה

  1. להביא את צלופחים האירופית מתקן מחקר ולשים אותם aquaria 200 L עם מערכת recirculation. השתמש טרמוסטטים וגופי כדי לשמור על טמפרטורה קבועה-20 ° C.
  2. לשמור על הדגים בתנאים כהה כדי למנוע מתח22 , בלי אוכל במהלך הניסוי.
  3. לשמור את הדגים במים מתוקים במהלך 3 הימים הראשונים. ואז לשנות את 1/3 מכמות המים, ממלאים עם מי ים בכל יום עד שהגיע עם מליחות של 37.0 ± 0.3 g/ל'

2. טיפול הורמונלי

הערה: טיפול הורמונלי מורכב זריקות שבועיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) לאורך כל משך (9 שבועות) הניסוי.

  1. הכן את ההורמון hCG מראש-ריכוז של IU 1/µL על ידי דילול ההורמון בתמיסת (0.9% NaCl).
    הערה: ההורמון יכול להישמר מדולל בריכוז זה במשך יותר משבוע ב-18 ° c
  2. כדי עזים ומתנגד הדגים, להכין 40 אני גמיש דלי עם 5 L של מערכת המים.
    1. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל 300 מ"ג בנזוקאין ב- 100 מ של 70% אתנול.
    2. יוצקים את בנזוקאין מדולל בדלי (הריכוז הסופי 0.36 מ מ) ומערבבים היטב. . זה ריכוז בנזוקאין הסופי של 60 מ ג/ל'
    3. להעביר את הדגים, בנפרד, לתוך המים עם בנזוקאין, המתן מספר שניות עד בנזוקאין נכנס לתוקף, הדג הוא מורדם כראוי.
      הערה: כדי לאשר הדגים. הוא מורדם, מניחים את הדגים במצב פרקדן, בדוק כי זה נשאר עדיין במצב הזה.
  3. כדי לנהל את ההורמון, שוקל את הדגים ולהכין ההורמון hCG במינון של 1.5 IU/g של דגים, צינור פלסטיק 1.5 מ.
    1. ממלאים מזרק 1 מ"ל ההורמון hCG מהצינור פלסטיק.
    2. מניחים את הדגים anesthetized במצב פרקדן, עם הסיוע או את המזרק, להזריק הורמון בקפידה באזור בקרום הבטן.
  4. להחזיר את הדגים באקווריום, לפקח עליו עד החלים לחלוטין.
    הערה: המינהל הורמונלי צריך להתנהל שבועית לאורך כל הניסוי. בדרך כלל, צלופחים האירופית להתחיל spermating לאחר 6-7 שבועות של טיפול הורמונלי.

3. זרע הדגימה

  1. כדי להשיג את הדוגמאות הטובות ביותר של איכות, תמצית זרע 24 שעות לאחר ניהול הורמונלי6,23.
  2. עזים ומתנגד הדג עם בנזוקאין כפי שמתואר בשלב 2.2.
  3. מניחים את הדגים anesthetized במצב פרקדן, אזור איברי המין עם טיפת מים מזוקקים יבש ונקי בקפידה בנייר, כדי להימנע צואה זיהום נוכח באזור איברי המין או הפעלת זרע בשוגג על ידי מגע עם מי ים באקווריום.
  4. הנחת האצבעות על משני צדי הדג, עיסוי בקפידה הקשת רוחבית מ במינימום באזור איברי המין כדי לאלץ את הזרע החוצה.
    1. חזור על העיסוי עד אין תאי זרע נוסף יוצא מן הפתח באברי המין.
  5. לאסוף את הזרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות משאבה ואקום.
  6. לדלל את הזרע שחולצו 1:10 ששונה Tanaka´s extender פתרון24 (137 מ"מ NaCl, 76.2 מ מ NaHCO3, בתוך מים מזוקקים) ב- 4 ºC.
    הערה: הזרע בפתרון ה-extender אמור להישמר 4 ºC.

4. הערכת איכות הזרע

  1. להכין מי ים מלאכותי13 (במ מ: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, נה2אז4 28.2, אשלגן כלורי 9.4, במים מזוקקים) עם 2% שור אלבומין (BSA) (w:v), להתאים את ה-pH ל 8.2, osmolality עד 1100 mOsm/kg ולתחזק זה 4 ºC כדי למנוע התפתחות חיידקים.
  2. פתח את תוכנת המחשב בסיוע זרע בניתוח (CASA) ובחר את המודול זרע של דג.
    1. לחץ על מאפיינים כדי לפתוח את הגדרת המערכת של התוכנה. שם, הגדר את האפשרויות לכידת-60 תמונות בשניה. אופטיקה בחר שלב שלילית, Makler קאמרית, סולם X 10.
    2. ואז על ניתוח הערכים, בחר דגים מינים, חלקיקים אזור גדול יותר מיקרומטר 22 וקטנות יותר מיקרומטר 202.
    3. על הפרמטרים מהירות, הגדר איטי כאשר תאים לעבור בין 10 ל- 45 מיקרומטר/s, מוגדר בינוני כאשר נע בין 45 ל 100 מיקרומטר/s מוגדר מהירה כאשר זז מהר יותר 100 מיקרומטר/s.
      הערה: Spermatozoa עם מהירות איטית יותר מ- 10 מיקרומטר/s נחשבו immotile.
    4. בחר את ערכי מתקדמת כמו 80% של יושר (STR) ולשמור את המאפיינים.
    5. לחץ על השדה ללכוד (חלון עם תמונות בשידור חי מן המצלמה תיפתח).
      הערה: מערכת ניתוח המחשב בסיוע זרע נוצר על ידי מיקרוסקופ, מצלמה, תוכנת ניתוח של התמונה.
  3. על החדר ספירה, לשים 4 µL של מי ים מלאכותי, להוסיף 0.5 µL של זרע פתרון (זרע מדולל בפתרון ה-extender).
    1. למקד את התמונה עם המיקרוסקופ בהגדלה X 10 בשלב שלילי. 15 s לאחר ההפעלה, לחץ על לכידת - וידאו בתוכנת ניתוח המחשב בסיוע זרע.
    2. לנתח כל מדגם triplicate ובחרו הדגימות עם תנועתיות גבוה יותר מאשר 70 אחוז על הקפאה קריוגנית.
      הערה: חשוב מאוד לבחור רק באיכות גבוהה זרע להצלחת פרוטוקול זה הקפאה קריוגנית.

5. זרע שיטת הקפאה

  1. להכין מראש חנ (כ- 2.5 L) ב 34 ס"מ x 34 ס"מ x 30 ס מ ו תיבת קלקר בעובי 5 ס מ.
    הערה: לשמור על רמה של חנקן נוזלי של 4-5 ס מ גובה כל הזמן.
    1. לבנות מבנה צפה מראש להקפיא את הזרע. 2 חתיכות פוליסטירן (20 ס מ x 5 ס מ), לאגד אותם עם 2 צינורות פלסטיק ושימוש במקום המבנה על-החנקן הנוזלי. מבנה זה צריך לרחף מעל החנקן הנוזלי בגובה משוער של 3 ס מ מעל פני השטח (איור 1).

Figure 1
איור 1 . הסכימטי של המבנה צף המשמש עבור הקפאת מראש על חנקן נוזלי. המבנה מורכב שתי חתיכות של צפיפות נמוכה קלקר של 20 ס"מ על 4 ס"מ x 5 ס מ מחובר עם צינורות פלסטיק של 14 ס מ. הקשיות ממוקמים מעל צינורות פלסטיק של 3 ס מ מעל החנקן הנוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הכן את הפתרון הקפאה קריוגנית על ידי ערבוב זרע, פתרון ה-extender, מתנול ביחס של 1:8:1 1.5 mL פלסטיק צינורות ומערבבים בעדינות.
  2. בעזרת פיפטה, להוסיף µL 480 של הפתרון הקפאה קריוגנית לתוך קשיות µL 500, במידת הצורך, לסמן אותם על-ידי סגירת קצה אחד עם דגמי חמר.
  3. לשים את הקש על המכשיר צף בגובה של 3 ס מ מעל החנקן הנוזלי למשך 3 דקות. אז, במקום את הקש לתוך החנקן הנוזלי.
  4. לאחר 10-15 דקות, להעביר את הקשיות לתוך מיכל אחסון בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכות ולשמור אותם שקועים חנקן נוזלי בכל עת. . הנה, הזרע ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן.

6. שיטת מפשיר

  1. הכנת קופסת קלקר עם חנקן נוזלי, כפי שמתואר בשלב 5.1 והכן באמבט מים באמצעות 3 L גביע עם מי ברז ב 40 ºC.
  2. להעביר את הקשיות בזרע קפוא מ למיכל אחסון לתוך התיבה קלקר עם חנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכות.
    1. לשים כל קש לתוך אמבט מים ב 40 ºC עבור 13 s.
    2. שופכים את הזרע לתוך צינור פלסטיק 1.5 mL על ידי גזירה את קצוות סגורים של הקש עם מספריים.
  3. לנתח את תנועתיות הזרע באמצעות המחשב בסיוע זרע ניתוח המערכת כמוסבר בשלב 4.1.
  4. שמור µL 100 של זרע כדי לנתח את הכדאיות של spermatozoa עם cytometer זרימה.

7. דנ

  1. להשתמש ערכת פלורסנט המכיל propidium יודיד (PI), אשר הוא מתחם ניאון אדום זה מכתים את הגרעינים של תאים מתים, ממברנה-permeant מתחם פלורסנט גרעינית, ירוק מכתים את הגרעינים של תאים חיים.
    1. הכן את הפתרון מכתימים ניאון ירוק על ידי לדלל אותה מן המניות פתרון (1 מ מ) 1:10 Tanaka´s בינוני לפתרון עבודה של 100 מיקרומטר.
    2. לא לדלל את הפתרון PI. הפתרון מניות הוא 2.4 מ"מ.
  2. עבור כל דגימה, לקחת 50 µL של זרע טרי או המופשרים ולהוסיף 0.5 µL של פלורסנט ירוק מכתים הפתרון עובד (ריכוז סופי 1 מיקרומטר) ו- 2 µL של פתרון PI (ריכוז סופי 100 מיקרומטר).
  3. דגירה בדגימות המכיל הצבעים (PI, צביעת ניאון ירוק) בחושך במשך 5 דקות.
    1. לדלל את הדגימות ב 500 µL של פתרון ה-extender Tanaka´s ולנתח עם cytometer הזרימה.
  4. להפעיל את cytometer זרימה וליצור פרוטוקול חדש המכיל לפחות 2 מגרשים: SS רישום יומן vs FS, FL1 לעומת FL3.
    הערה: שני, פלורסנט יודיד מכתים, propidium יכול להיות שמחים עם אור גלוי באורך הגל הירוק. מתי קשור ל- DNA, פליטת קרינה פלואורסצנטית מרבי צבעים אלה הם 516 nm ו 617 nm, בהתאמה.
    1. התאם את המתחים של לייזרים שונים: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
    2. להגדיר את הסכם רכישה הגדרות לאירועים מרבי = s 5000 או 15 (הריכוז הסופי של המדגם צריך להיות כ- 1 מיליון של תאים/mL). קרא את הדגימה באמצעות זרם נמוך .
    3. בחר את מצב הקריאה צינור יחיד קבוע בעמדה מצב.
    4. הכניסו את הדגימה המספר הנכון של הקרוסלה
    5. לקרוא את הדגימה (הקשת F9) ולשמור את הנתונים שנאספו לקובץ excel (לחיצה על F7) לצורך ניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזרע של צלופחים 18 עם תנועתיות הזרע 70% ומעלה, נבחר במחקר זה. התוצאות הראו ירידה בפרמטרי איכות כל לאחר מפשיר בהשוואה לאלו של זרע טרי (טבלה 1 ואיור 2). התוצאות תנועתיות (זאת אומרת ± S.E.M., n = 18) הראו על תנועתיות מוחלט גבוה יותר, תנועתיות מתקדמת של זרע טרי יותר תנועתיות מוחלט תנועתיות מתקדמת נמצאו דגימות זרע לאחר ההפשרה.

התבנית זהה נמצא בהניתוח של תאי זרע מהיר, שבו דגימות קפוא-הקרת הציג יחס נמוך יותר של תאים מהירה יותר דגימות טריות. בנוסף, בין המהירויות תא הזרע נמדדת גם הצטמצם הדגימות שהביקושים אחרי.

כמו כן, התוצאות הראו את הכדאיות תא לאחר מפשיר הציג ירידה תאי זרע חיים של 23 ± 3.1% (כלומר ± S.E.M., n = 18) מדגימות טריים אל קפוא-הקרת (טבלה 1 ואיור 2).

Figure 2
איור 2 . תנועתיות, מהירות לאכסדרות ונתונים הכדאיות תא זרע טרי, זרע המופשרים (לאחר הקפאה קריוגנית). הזרע היה cryopreserved במשך 24 שעות לפני להיות הקרת. הערכים המוצגים הם אמצעי ± S.E.M. הזרע. מדגימות 18. כוכביות מצביעים על הבדלים משמעותיים בין דגימות המופשרים ורענן (מבחן t; p < 0.05). תנועתיות פרמטר הצביעו על האחוז הכולל spermatozoa תאי, לאכסדרות מהירות ציין את מהירות ממוצעת של spermatozoa לאורך מסלול לאכסדרות, ואת הכדאיות תא ציין את אחוז spermatozoa בחיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תאים מהירה + בינוני1 (%) 70.7 ± 2.8 2.1* 27.5 ±
לאכסדרות מהירות (צ'לו; מיקרומטר/s) 118.8 ± 2.8 1.8* 101.5 ±
מהירות קו ישר (וי; מיקרומטר/s) ±: 53.3 1.9 45.6 ± 1.3*
מהירות ממוצעת נתיב (ידינו; מיקרומטר/s) 73.3 ± 2.1 62.0 ± 1.3*
מכות בין תדר (Hz) 27.9 ± 0.3 27.1 ± 0.6
תא הכדאיות (% של תאים בחיים) 97.7 ± 0.3 2.8* 73.8 ±
1 תאים מציג מהירות לאכסדרות מעל 40 מיקרומטר/s.

טבלה 1. סיכום תוצאות של הפרמטרים השונים מנותח עם זרע המחשב בסיוע מערכת ניתוח מדגימות טריים ומופשרים. דוגמאות המופשרים היו בעבר cryopreserved במשך 24 שעות ביממה. כל הערכים שהוצגו אומר ± S.E.M. (n = 18). כוכביות מצביעים על הבדלים משמעותיים בין דגימות המופשרים ורענן (מבחן t; p < 0.05). הפרמטרים שנותחה היו: תאי spermatozoa המוגדר כאחוז מתוך תאי תאי מוחלט; תנועתיות מתקדמת המוגדר כאחוז של spermatozoa לשחות קדימה קו ישר במהותה; תאים מהירה ובינוניים המוגדר כאחוז של spermatozoa עם מהירות לאכסדרות ממוצע מעל 40 מיקרומטר/s; מהירות לאכסדרות כהגדרתו מהירות ממוצעת של תא זרע דרך שהסיבוב לאכסדרות; מהירות קו ישר כהגדרתו מהירות ממוצעת של תא זרע נמדד מתוך עמדה שזוהו הראשון למיקום האחרון בקו ישר; מהירות הנתיב הממוצע כהגדרתו מהירות ממוצעת של תא זרע לאורך מסלולה הממוצע המרחבי; להכות תדירות קרוס כהגדרתו הקצב הממוצע בו הזרע לאכסדרות ראש המסלול חוצה שהסיבוב נתיב הממוצע; תא הכדאיות המוגדר כאחוז של spermatozoa בחיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את התהליך המלא של הקפאה קריוגנית, התבגרות, טיפול, זרע, צלופח האירופית. גידול בתנאים המתוארים כאן הם אופטימלית עבור התבגרות מהירה והפקה של אמצעי אחסון גבוהה באיכות גבוהה הזרע הזה מינים 6,7,25. ההצלחה של פרוטוקול זה הקפאה קריוגנית והשימוש פוטנציאל להפריה לאחר מפשיר תלויה רבות לאיכות זרע טרי 26. לכן, הבחירה של זרע באיכות גבוהה הוא בעל חשיבות רבה. שימו לב כי הערכת איכות הזרע סובייקטיבית תלוי מיומנויות, התפיסה ואת ההכשרה של החוקר אשר מוערך של27, 5,דגימות28 והוא יכול להוביל הערכות איכות שונה מאוד תלוי חוקר 29. לכן, השימוש של המחשב בסיוע זרע ניתוח מומלץ מאוד לבחור את הדגימות באיכות הטובה ביותר עבור הקפאה קריוגנית.

התוצאות של איכות הזרע פוסט-המפשיר הציג כאן הראו ירידה בפרמטרים של תנועתיות, מהירות הישרדות cell. זה עקבי עם ביבליוגרפיה זמין, אף-על-פי קיימים וקצרה בין המינים 26,30. למשל, במחקר עם סלמון אטלנטי (Salmo סאלאר), זרע טרי עם תנועתיות 70-95% הוקפא באמצעות cryoprotectants שונים (דימתיל סולפוקסיד, מתנול). תנועתיות הזרע לאחר מפשיר היה נמוך משמעותית מאשר בדגימות טריים, עם ערכי תנועתיות בפרוטוקול הטוב ביותר של 8.2%, ובכל זאת שיעור דישון באמצעות זרע המופשרים היה גבוה ככל 42.8%, אשר ייצג את 95% של שליטה (זרע טרי) 31. במחקר אחר עם הזרע של אטלנטיק הליבוט (Hippoglossus hippoglossus), אין הפחתה משמעותית של תנועתיות הזרע נמצאה לאחר הקפאה קריוגנית, שיעור דישון באמצעות זרע המופשרים היה מעל 95% 32.

צלופח האירופית, מחקרים קודמים גם הראו ירידה בתנועתיות הזרע לאחר הקפאה קריוגנית בנפרד cryoprotectant 16,18. בנוסף, cryopreserved הזרע של צלופח אירופאי באיכות דומה שימש בהצלחה עבור הפריה 8. במחקר הזה, Asturiano. et al. משמש דימתיל סולפוקסיד cryoprotectant. השימוש של דימתיל סולפוקסיד יש כמה חסרונות מניפולציה מאז cryoprotectant הזה מפעיל את הזרע, ולכן צריך להיות קפוא מיד על תוספת של דימתיל סולפוקסיד. כמו כן, הזרעה עם זרע המופשרים צריך להתנהל מיד לאחר מפשיר. הירידה של ה-pH זרע חלקית יכול לפתור את הבעיה הזו 19, אבל הפרוטוקול הוא עדין יותר מאשר בפרוטוקול המובאת כאן עם מתנול כמו cryoprotectant.

מספר מחקרים הראו תוצאות חיוביות באמצעות מתנול כמו cryoprotectant. למשל, במחקר שנערך עם הצלופח היפני (אנגווילה חבוש יפני) באמצעות פרוטוקול דומה מאוד לזו המוצגת כאן, עם 10% מתנול כמו cryoprotectant, המחברים מופרית בהצלחה ביצים באמצעות זרע cryopreserved ורענן. במחקר זה, הם להשיג הפריה בשיעור של 17% עם אין הבדלים משמעותיים בין זרע טרי ו- cryopreserved 33.

פרוטוקול המובאת כאן הוכיח לשמר איכות זרע מספיקות לאחר מפשיר, ולהראות מאפיינים דומים זרע לאחר מפשיר ממספר הפרוטוקולים באמצעות מרחיקי שונים ו- cryoprotectants, אך עם היתרונות של טרום טיפול קל, הקפאה קריוגנית פוסט. חשוב מאוד לעקוב במדויק אחרי הקירור מפשיר פעמים המתוארים כאן, כמו גם באמצעות זרע באיכות גבוהה. מחקרים עתידיים, הפריה ניסויים ייבדק באמצעות פרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

פרסום זה מומן על ידי אופק 2020 המחקר האיחוד האירופי, חדשנות תוכנית בהסכם גרנט מארי Sklodowska-קירי לא 642893 (מראה מרהיב), המשרד העלות (עלות הפעולה פא 1205, AQUAGAMETE), ואת מרכז המחקר של המצוינות- 1476-4/2016/FEKUT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. 246 (2011).
  2. Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75, (6), 701-706 (1990).
  3. Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57, (1), 109-121 (2000).
  4. Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. (2014).
  5. Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66, (4), 1012-1020 (2006).
  6. Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57, (6), 1488-1504 (2000).
  7. Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
  8. Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51, (4), 485-491 (2016).
  9. Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
  10. Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
  11. Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. (2016).
  12. Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142, (1-2), 107-118 (1996).
  13. Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45, (3), 407-415 (2010).
  14. Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198, (3), 339-351 (2001).
  15. Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28, (1), 501-502 (2003).
  16. Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30, (3), 283-293 (2004).
  17. Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56, (1-2), 173-175 (2005).
  18. Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35, (2), 225-231 (2004).
  19. Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59, (2), 119-126 (2009).
  20. Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53, (1), 51-57 (2006).
  21. Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42, (2), 162-166 (2007).
  22. Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
  23. Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17, (1), 163-169 (1997).
  24. Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60, (1), 139-146 (2002).
  25. Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27, (3), 529-543 (2015).
  26. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. (2016).
  27. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130, (4), 425-433 (2001).
  28. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, (1-4), 1-28 (2004).
  29. Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, (1), 149-179 (2002).
  30. Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. (2016).
  31. Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76, (2), 300-311 (2011).
  32. Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16, (6), 561-572 (2008).
  33. Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33, (3), 550-552 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics