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処理と治療の男性欧州ウナギ (アンギラ) ホルモンの成熟、精子凍結保存

Developmental Biology

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Summary

ヨーロッパのウナギの成熟と精子の凍結保存のためのプロトコルは、最後の年にわたって改善されています。この資料では、成熟と保護剤の検討としてメタノールを誘発するひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) で使用可能な最適なプロトコルについて説明します。

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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Abstract

最後年の間にいくつかの研究グループは開発とヨーロッパのウナギ処理と成熟の新しいプロトコルの改善に取り組んでいます。としてまだ、ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の毎週の注射は治療の数週間中に質の高い精子の大量の生産わずか 5-6 週間後の男性の成熟に証明しています。さらに、精子凍結保存のプロトコルが異なるエクステンダーを使用して、凍結保護剤と冷却時間を解凍以前について記載されているヨーロッパのウナギ。ここで、紹介受精、凍結保存、Tanaka´s ・ エクステンダー ・ ソリューションが直接使用することができます不要な解決方法および希薄のさまざまな種類の使用法を作るします。さらに、このプロトコルにはメタノールは毒性が低いと、精子をアクティブにしません、保護剤の検討としてメタノールを使用では使いやすいのものとなります。精子は、保護剤の検討、添加後すぐに凍結保存する必要はありません、解凍されて後に長く使用できます。また、精子の運動性は新鮮な精子のそれより低いが融解後依然として高いです。この作業の目的は、ヨーロッパウナギの最高の利用可能なプロトコル処理、成熟、精子凍結保存を表示することです。

Introduction

過去 25 年間欧州ウナギ (アンギラ) ヨーロッパの海岸に到着の数は 90 1,2,3で着実に減少しています。汚染、感染症、乱獲や生息地の破壊を含む抜本的な低下を説明するいくつかの要因があります。これのすべてが重要な絶滅危惧種4としての性質 (IUCN) リストのための国際連合のヨーロッパのウナギを含めることにつながる、この種に大きな影響を与える。その結果、技術や飼育下で繁殖のためのプロトコルの開発が必要です。

捕われの身でヨーロッパのウナギの成熟はホルモン治療5,6,7によって達成されるが、雌雄の配偶子の生産は8を同期することは困難。ウナギ9,の形成を加速する新しいアンドロゲン インプラントの開発を示しているにもかかわらず10女性に最終的な成熟のタイミングはまだ変化して11を制御することは困難。したがって、精子12,13,14および凍結保存技術の短期的なストレージ、繁殖管理、配偶子同期不要な8を作るために必要です。

2003 15,16以来ヨーロッパうなぎ精子の凍結保存をしました。いくつかの研究では、凍結保護剤16,17,18,19,20としてジメチルスルホキシド (DMSO) やメタノールのいずれかを使用して成功したプロトコルを設計されています。両方のプロトコルが正常に使用されているが、DMSO を凍結保存後解凍精子の細胞生存率はメタノール20,21より低い。また、うなぎ精子は DMSO との接触で活性化されより退屈な精子操作19が必要です、そのためメタノールより適切な保護剤の検討欧州ウナギ精子の DMSO よりも。

ここでは、最適なハンドリングとヨーロッパのウナギのホルモン治療のプロトコルは、以下に記載します。これに加えて、この種の精子の質の評価のため、保護剤の検討とプロトコルとしてメタノールを使用して最高のヨーロッパウナギ精子凍結プロトコルは説明もします。

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Protocol

このプロトコルで記述されているヨーロッパのウナギを操作するためのすべての手順は、次の実験を制御するスペイン法令、大学パラオレイ ・ デ ・ バレンシアで動物実験倫理委員会によって承認されたと生きている動物のプロシージャ。

1. 魚の維持

  1. 研究施設にヨーロッパのウナギをもたらすと循環システムの 200 L 水槽に入れてください。定数 20 ° C の温度を維持するためにサーモスタットとクーラーを使用します。
  2. 実験中に食料もないとストレス22を避けるために暗い状態で魚を保ちます。
  3. 最初の 3 日間は、新鮮な水で魚を保ちます。水の 1/3 に変更し、37.0 ± の塩分濃度に到達するまで毎日海水を補充 0.3 g/l.

2. ホルモン治療

注: ホルモン治療毎週注射をひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の実験の全期間 (9 週間) ではあります。

  1. 食塩でホルモンを希釈して 1 IU/μ L の濃度で事前に hCG ホルモンを準備 (0.9 %nacl)。
    注: ホルモンは-18 ° C で一週間以上この濃度で希釈したを保存することができます。
  2. 魚を麻酔するには、システム水量 5 L と 40 L 柔軟なバケットを準備します。
    1. 250 mL のフラスコで 70% エタノール 100 mL にベンゾカインの 300 mg を希釈します。
    2. バケツで希釈ベンゾカインを注ぐ (最終濃度 0.36 mM) と適切にミックスします。これは、60 mg/L の最終ベンゾカイン濃度
    3. ベンゾカインと水に魚を個別に転送し、ベンゾカイン効力し、魚はきちんと麻酔まで数秒を待ちます。
      注: 魚に麻酔がかかることを確認、仰臥位の魚を配置し、それはまだその位置にとどまることをチェックします。
  3. ホルモンを管理、魚の重量を量るし、1.5 mL プラスチック チューブに魚の 1.5 IU/グラムの用量で hCG ホルモンを準備します。
    1. プラスチック製のチューブから hCG ホルモンで 1 mL 注射器を満たしなさい。
    2. 仰臥位と援助や注射器、麻酔下の魚を配置、腹腔内のエリアで慎重にホルモンを注入します。
  4. 魚を水槽に戻るし、それを完全に回復するまでを監視します。
    注: ホルモンの政権は、実験中は毎週実施しています。通常、ヨーロッパのウナギは、ホルモン治療の 6-7 週間後 spermating を開始します。

3. 精子サンプリング

  1. 最高品質のサンプルを得るためには、ホルモン投与6,23後 24 h の精子を抽出します。
  2. 手順 2.2 ベンゾカインで魚を麻酔します。
  3. 仰臥位で麻酔をかけられた魚をプレイス、蒸留水の噴出と性器をきれいし、水槽から海水が付いている接触によって性器または偶発的な精子の活性化に糞便汚染を避けるために、紙で慎重に乾燥します。
  4. 魚の両方の側面に指を置いて、慎重に押すと横方向に胸鰭から性器をうち精子を強制的にマッサージします。
    1. ないより多くの精子が生殖器の開口部から出るまでマッサージを繰り返します。
  5. 真空ポンプを使用して 15 mL プラスチック チューブに精子を収集します。
  6. 4 ° C で、採精された精子 1:10 修正 Tanaka´s エクステンダー ソリューション24 (137 mM NaCl、76.2 mM NaHCO3蒸留水) を希釈します。
    メモ: エクステンダー ・ ソリューションで精子は 4 ° C で維持する必要があります。

4. 精子品質評価

  1. 13人工海水を準備 (mm: NaCl 354.7、MgCl2 52.4、CaCl2 9.9、Na2SO4蒸留水 28.2、KCl 9.4) 2% ウシ血清アルブミン (BSA) (w:v)、8.2、1100 mOsm/kg に浸透するために pH を調整し、維持それは細菌の成長を避けるために 4 ° C で。
  2. 精子のコンピューター支援型分析 (CASA) のソフトウェアを開き、魚精子モジュールを選択します。
    1. ソフトウェアのシステム セットアップを開きますのプロパティをクリックします。そこに、毎秒 60 枚のキャプチャ オプションを設定します。負位相光学、マークラー商工会議所、10 倍の規模。
    2. 分析値の種と粒子領域より大きい 2 μ m2 20 μ m2よりも小さいを選択します。
    3. 速度パラメーター セル 10、45 μ m/s の間移動、45 および 100 μ m/s の間を移動するときにに設定し、100 μ m/s よりも速く動くとき急速に設定低速に設定します。
      注: 10 μ m/秒よりも遅い速度で精子は immotile と考えられていた。
    4. 真直度 (STR) 80% としてプログレッシブの値を選択し、プロパティを保存します。
    5. フィールドのキャプチャ(カメラからのライブ画像のウィンドウが開きます) をクリックします。
      注: コンピューターによる精子分析システムは、顕微鏡、カメラ、画像解析ソフトによって形成されます。
  3. カウントのチャンバーの人工海水の 4 μ L を入れて精子ソリューション (エクステンダー ・ ソリューションで希釈した精子) の 0.5 μ L を追加します。
    1. イメージを集中させ、負のフェーズで 10 倍の倍率での顕微鏡を用いた。15 コンピューターによる精子分析ソフトウェアのビデオからのキャプチャ -をクリックして、アクティブ化後 s。
    2. 凍結保存用 70% よりも高い運動と帳票サンプルを選択すべてのサンプルを分析します。
      注: この凍結プロトコルの成功のため質の高い精子だけを選択する非常に重要です。

5. 精子凍結法

  1. 34 cm × 34 cm × 30 cm、5 cm 厚の発泡スチロールの箱で事前に液体窒素 (約 2.5 L) を準備します。
    注: は、すべての回で液体窒素の 4-5 cm の高さのレベルを保持します。
    1. あらかじめ精子を凍結するフローティング構造を構築します。ポリスチレン (20 cm × 5 cm) 2 個を使用して、2 のプラスチック チューブにそれらをバインドし、液体窒素で構造を配置します。この構造体は、表面 (図 1) に 3 cm のおおよその高さで液体窒素上にフロートする必要があります。

Figure 1
図 1.あらかじめ液体窒素で凍結用フローティング構造模式。構造は低密度 5 x 20 cm × 4 cm のスタイロ フォームの 2 つの部分で構成されています 14 cm のプラスチック製の管と接続されている cm。ストローは、液体窒素の上 3 cm のプラスチック製のチューブ上に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

  1. 精子、エクステンダー ・ ソリューション 1 の比率でメタノールを混合して凍結保存ソリューションを準備: 8:1 1.5 mL プラスチック チューブし、軽くかき混ぜます。
  2. ピペットの助けを借りて、500 μ L ストローに凍結保存液の 480 μ l 添加し必要に応じて、粘土のモデリングの 1 つの端を閉じることによってそれらをマークします。
  3. 3 分間液体窒素の上 3 cm の高さで浮遊装置にわらを置きます。その後、液体窒素にわらを配置します。
  4. 10-15 分後、長い鉗子を使用して液体窒素貯蔵タンクにストローを転送し、すべての回で液体窒素に浸漬しておきます。ここでは、精子は無期限に保存できます。

6. 解凍方法

  1. 5.1 の手順で説明されているように液体窒素で発泡スチロールの箱を準備し、40 ° C で、水道水を 3 L ビーカーを使用して水のお風呂を準備します。
  2. 長い鉗子を使用して液体窒素貯蔵タンクから発泡スチロールの箱に冷凍精子をストローを転送します。
    1. 13 の 40 ° C で水のお風呂にそれぞれ藁を入れて s。
    2. はさみでストローのクローズド エンドを切断することによって、1.5 mL プラスチック チューブに精子を注ぐ。
  3. 4.1 の手順で説明したように、コンピューターによる精子解析システムを用いた精子の運動性を分析します。
  4. 流れの cytometer で精子の生存率を分析する精子を 100 μ l 添加してください。

7. フローサイトメトリー

  1. Propidium ヨウ化 (PI)、死んだ細胞の核を汚れ赤蛍光化合物と膜側の透過物核蛍光化合物、細胞の核をグリーンに汚れを含む蛍光キットを使用します。
    1. 100 μ M の実用的なソリューションにそれから、原液 (1 mM) 1:10 Tanaka´s 培地で希釈することによって緑の蛍光染色液を準備します。
    2. PI ソリューションを薄めないでください。原液は、2.4 mM です。
  2. 各サンプルは、新鮮なまたは解凍精子の 50 μ L を取るし、緑の蛍光染色作業液 (最終濃度 1 μ M) の 0.5 μ L を追加し、PI ソリューション (最終濃度 100 μ M) の 2 μ L。
  3. 5 分間暗い染料 (PI および緑蛍光染色) を含むサンプルをインキュベートします。
    1. Tanaka´s エクステンダー ・ ソリューションの 500 μ L のサンプルを希釈し、流れの cytometer で分析します。
  4. 流れの cytometer をオンにし、少なくとも 2 のプロットを含む新しいプロトコルを作成する: SS ログ対 FS ログ、FL1 vs FL3。
    注: 両方、緑蛍光染色と propidium ヨウ化は目に見える波長の光を励起できること。DNA にバインドされると、これらの染料の最大蛍光性の放出が 516 nm と 617 nm、それぞれ。
    1. 異なるレーザーの電圧調整: SS = 199;FS = 199;FL1 = 377;FL3 = 372
    2. 最大イベントに集録設定合意を設定 = 5000 または 15 秒 (サンプルの最終濃度は約 100 万セル/mL をする必要があります)。フローを使用してサンプルをお読みください。
    3. 読書モードシングル チューブ固定位置モードを選択します。
    4. カルーセルの適切な数のサンプルを置く
    5. (F9 キーを押して) サンプルを読むし、さらに分析 (f7 キーを押して) excel ファイルに収集されたデータを保存します。

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Representative Results

70% 以上精子の運動と 18 ウナギから精子はこの研究に選ばれました。新鮮な精子 (表 1および図 2) からのそれらと比較して融解した後、結果はすべての品質パラメーターの減少を示した。運動の結果 (意味 ± S.E.M.、n = 18) 総運動と解凍後精子サンプルは、進歩的な運動よりも新鮮な精子で高い総運動と進歩的な運動性を示した。

同じパターンは、凍結・融解後のサンプルが新鮮なサンプルよりも速く細胞の低い比率を発表、高速の精子細胞の分析で発見されました。また、精子細胞の速度の測定は、融解後のサンプルでも減った。

3.1 %23 ± の生きた精子細胞の減少を発表した融解後も、結果がその細胞の生存率を示した (意味 ± S.E.M.、n = 18) から凍結する新鮮なサンプル (表 1および図 2)。

Figure 2
図 2.運動、曲線の速度と新鮮な精子と解凍精子 (凍結保存) 後の細胞生存率データ。精子が解凍される前に 24 h の凍結しました。表示値は、平均 ± 18 サンプルから精子の S.E.M. です。印は解凍と新鮮なサンプル間の有意差 (t 検定; < 0.05)。パラメーターの運動には、総運動精子、曲線速度曲線軌道に沿って精子の平均速度および細胞生存率を示して生きている精子の割合の割合が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

高速 + 媒体細胞1 (%) 70.7 ± 2.8 27.5 ± 2.1
曲線速度 (VCL; μ m/s) 118.8 ± 2.8 101.5 ± 1.8*
直線速度 (VSL; μ m/s) 53.3 ± 1.9 45.6 ± 1.3
平均パス速度 (VAP; μ m/s) 73.3 ± 2.1 62.0 ± 1.3
周波数 (Hz) クロスを破ってください。 27.9 ± 0.3 27.1 ± 0.6
細胞生存率 (生きている細胞の %) 97.7 ± 0.3 73.8 ± 2.8*
140 μ m/s の上の曲線速度を示すセルです。

テーブル 1。新鮮で解凍のサンプルから精子の計算機援用解析システムで分析した別のパラメーターの結果のサマリー 。解凍されたサンプルが以前 24 時間凍結しました。± S.E.M. の意味を提示されるすべての値 (n = 18)。印は解凍と新鮮なサンプル間の有意差 (t 検定; < 0.05)。分析パラメーターが: 運動性精子総運動性細胞の割合として定義基本的にストレート ライン; 楽しみにして泳ぐ進歩的な運動精子の割合として定義されています。40 μ m/s; 上記の平均曲線速度を持つ精子の割合として定義される高速中小セル曲線速度曲線軌道; を通じて精子の平均速度として定義直線速度; 直線でその最後の位置を最初の検出された位置から測定精子の平均速度として定義平均パス速度; 空間平均軌道に沿って精子の平均速度として定義クロス周波数を破って; 平均パス軌道が交差する曲線の精子のヘッド軌道平均レートとして定義されています。細胞生存率は生きている精子の割合として定義します。

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Discussion

このプロトコルでは、ヨーロッパのウナギの成熟、処理および精子凍結保存の完全なプロセスについて説明します。ここで説明する飼育条件は早く成熟とこの種6,7,25で質の高い精子の大量生産のため最適です。この凍結プロトコルとその潜在的な解凍後受精の成功は新鮮な精子26の品質に大きく依存します。したがって、質の高い精子の選択は非常に重要なのです。主観的な精子品質評価スキル、知覚とサンプル5,27,28を評価者の訓練によって異なります、によって非常に異なる品質推定につながることができます注研究員29。したがって、コンピューターによる精子分析の使用は凍結保存用の最高品質のサンプルを選択する勧めします。

ここでの運動性、速度、および細胞の存続のパラメーターの減少を示した表示融解後の精子の質の結果。種26,30間偉大なバリエーションが存在するにもかかわらず、これは利用可能な文献と一致。例えば、アトランティック サーモン (ブラウントラウト) の研究で 70-95% の運動と新鮮な精子は、(DMSO とメタノール) 異なる凍結保護剤を用いた凍結されました。融解後の精子の運動性は有意運動値が 8.2% の最適なプロトコル内の新鮮なサンプルで、まだ解凍の精子を使って受精率コントロール (新鮮な精子) 31の 95% を表した 42.8% と高かった。大西洋オヒョウ (オヒョウ オヒョウ) の精子で別の研究で、精子の運動性の有意な減少は認められなかった凍結保存後、解凍の精子を使って受精率は 95% を超えていた32

ヨーロッパのウナギ、先行研究も減少を示した精子運動性の後、保護剤の検討とは関係なく凍結16,18。さらに、同様の品質のヨーロッパのウナギから凍結保存した精子は受精8正常に使用されています。その研究では、Asturianoは、保護剤の検討として DMSO を使用しました。この保護剤の検討、精子を活性化し、したがって DMSO 添加時にすぐに凍結する必要がありますので、DMSO の使用、いくつか操作な欠点です。また、解凍の精子で授精は解凍後すぐに実施する必要があります。精子 pH の低下は部分的にこの問題19を解決できますが、プロトコルは保護剤の検討としてメタノールをここで提示されたプロトコルより敏感。

いくつかの研究は、保護剤の検討としてメタノールを使用して肯定的な結果を示しています。例えば、ウナギ (アンギラ ・ ジャポニカ)、保護剤の検討として 10% メタノールで紹介の 1 つに非常に類似したプロトコルを使用しての調査の著者正常に受精卵新鮮および凍結保存精子を使用しています。本研究では彼らは新鮮および凍結精子33間で有意差を 17% の受精率を得られます。

ここで提示されたプロトコルを解凍後、十分な精子の質を維持し、簡単に処理前の利点が異なるエクステンダーと、凍結保護剤を使用してプロトコルよりも融解後同様の精子特性を示す証明していると凍結保存します。冷却しここで説明の時間を融解し同様良質の精子を使って正確に従うことが非常に重要です。今後の研究でこのプロトコルを使用しての施肥試験がテストされます。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

欧州連合のホライゾン 2020年研究によって資金が供給されたこの文書および革新プログラム マリアスクウォドフスカ キュリー付与契約の下で 642893 (インプレス) コスト オフィス (アクション コスト FA 1205, AQUAGAMETE)、および優れた研究センター-1476-4/2016/FEKUT。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

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References

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