Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Immunology and Infection

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Summary

Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.

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Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (135), e56842, doi:10.3791/56842 (2018).

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Abstract

Lipoproteine sind wichtige Bestandteile der bakteriellen Zellhülle und potente Aktivatoren der Säugetier-angeborenen Immunantwort. Trotz ihrer Bedeutung für Zellphysiologie und Immunologie bleibt noch viel um zu entdecken über neuartige Lipoprotein Formen, wie sie synthetisiert werden und die Wirkung der verschiedenen Formen auf wirtsimmunität. Um gründliche Studien über Lipoproteine zu ermöglichen, dieses Protokoll beschreibt eine Methode für bakterielle Lipoprotein Bereicherung und Vorbereitung der N-terminalen tryptic Lipopeptide für die Strukturaufklärung von Matrix-assisted Laser desorption ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS). Erweiterung auf einer etablierten Triton X-114 Phase Partitionierung Methode für die Extraktion von Lipoprotein und Anreicherung von der bakteriellen Zellmembran, das Protokoll enthält zusätzliche Schritte aus, um nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, Lipoprotein Ertragssteigerung zu entfernen und Reinheit. Da Lipoproteine in Toll-Like-Rezeptor (TLR) Assays allgemein verwendet sind, ist es wichtig, zunächst die N-terminalen Struktur von MALDI-TOF MS. hierin charakterisieren, ein Verfahren vorgestellt, um konzentrierter hydrophobe Peptide in N-terminale angereichert zu isolieren Lipopeptide geeignet für die direkte Analyse von MALDI-TOF-MS/MS.-Lipoproteine, die von Sodium Dodecyl Sulfat Poly-Acrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt wurden auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, in Situ mit verdaut Trypsin, gegenüber dem Vorquartal um polare tryptic Peptide zu entfernen gewaschen und schließlich mit Chloroform-Methanol eluiert. Wenn in Verbindung mit MS mehr polare trypsiniert Peptide aus Waschlösungen, bietet diese Methode die Möglichkeit, sowohl das Lipoprotein zu identifizieren und zu charakterisieren seine N-Terminus in einem einzigen Experiment. Absichtliche Natrium Addukt Bildung können auch als Werkzeug eingesetzt werden, um mehr strukturell informative Fragmentierung Spektren zu fördern. Letztlich werden Bereicherung der Lipoproteine und Bestimmung ihrer N-terminale Strukturen umfangreichere Studien auf diese allgegenwärtige Klasse bakterielle Proteine erlauben.

Introduction

Bakterielle Lipoproteine zeichnen sich durch eine konservierte N-terminale Lipid-modifizierten Cystein, die die kugelförmige Protein-Domäne an die Oberfläche der Zellmembran verankert. Sie verteilen sich universell in Bakterien, bildet 2 bis 5 % aller zellulärer Gene innerhalb einer typischen Genom-1. Lipoproteine spielen eine kritische Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Nährstoffaufnahme, Signaltransduktion, Montage von Proteinkomplexen und bei der Aufrechterhaltung der Zelle Umschlag strukturelle Integrität2. Bei pathogenen Bakterien dienen Lipoproteine als Virulenz Faktoren3,4. Während einer Infektion stachelt Anerkennung der N-terminalen Lipopeptide von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 2 eine angeborene Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger zu entfernen. Je nach dem N-terminalen Acylation Zustand sind Lipoproteine Alternative TLR2-heterodimerisierenden-komplexe in der Regel anerkannt. TLR2-TLR1 erkennt N-Acylated Lipopeptide, während TLR2-TLR6 bindet freie Lipopeptide α-Aminosäure Termini. Einmal gebunden, konvergieren die Signalwege induzieren Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen3,4.

Früher dachte man, dass Lipoproteine von gram-positiven Bakterien Diacylated und die von Gram-negativen Bakterien Triacylated waren, unterscheiden sich in das Fehlen oder Vorhandensein einer Amid-linked Fettsäure auf der erhaltenen N-terminalen Cystein Rückstand. Diese Annahme wurde durch den Mangel an Sequenz Orthologe in gram-positiven Genomen, Lnt, Gram-negative N-Acyl-Transferase unterstützt, die Triacylated Lipoproteine5bildet. Jedoch haben neuere Studien Lipoprotein Triacylation in gram-positiven Firmicuten, dass fehlende Lnt, sowie drei neuartige N-terminale Lipoprotein Strukturen bezeichnet die Peptidyl, Lyso und N -Acetyl Formen6,7 gezeigt. ,8. Diese Erkenntnisse werfen Fragen über mögliche noch entdeckt Lipoprotein Formen, neben grundlegende Fragen wie diese neuartige Lipoproteine entstehen und welche physiologischen Zweck oder nutzen die verschiedenen Formen vermitteln. Darüber hinaus zeigen sie die aktuelle Unfähigkeit der Genomik, Lipoprotein Struktur Vorhersagen. In der Tat haben wir vor kurzem eine neuartige Klasse von Lipoprotein-N-Acyl-Transferasen, Lit, von Enterococcus Faecalis und Bacillus Cereus , das Lyso-Formular Lipoproteine9macht aufgerufen. Dies zeigt die Notwendigkeit, die aufgrund ihrer extrem hydrophoben Charakters und begrenzte Methoden zur Verfügung, um ihre molekulare Struktur charakterisieren eine Herausforderung sein Lipoprotein Struktur, experimentell zu überprüfen.

Um Studien auf Lipoprotein Induktion der Host Immunantwort sowie die N-terminale Strukturaufklärung zu erleichtern, haben wir mehrere zuvor beschriebenen Protokolle um bakterielle Lipoproteine reinigen und Vorbereiten der N-terminalen tryptic angepasst Lipopeptide für die Analyse von MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteine sind angereichert mit einer etablierten Triton X-114 (im folgenden als Tensid oder TX-114 bezeichnet) Phase Partitionierung Methode, mit der Optimierung zu entfernen Verunreinigungen nicht-Lipoproteine und Lipoprotein Ertrag zu steigern. Diese Lipoproteine sind geeignet für den direkten Einsatz in TLR Tests oder für weitere Reinigung durch SDS-PAGE. Für MALDI-TOF MS Übertragung der Lipoproteine auf Nitrozellulose-Membran bietet ein Gerüst für die effiziente in Situ Trypsin-Verdauung waschen und anschließende Elution von der Membranoberfläche, was zu sehr gereinigt N-terminale Lipopeptide. Nitrozellulose nachweislich Probenbehandlung Erleichterung und Verbesserung des Sequenz-Abdeckung für stark hydrophobe Peptide aus integrale Membrane Proteine13,14, sowie Lipoproteine9,10 . Die Methode hat den zusätzlichen Vorteil der Fraktionierung Peptide basierend auf Polarität, so dass fortgeschrittene Waschlösungen für hohes Vertrauen Proteinidentifikation gleichzeitig mit N-terminale Strukturaufklärung in einem einzigen Experiment analysiert werden können . Dieses Protokoll eindeutig Merkmale vorsätzliche Natrium Addukt Bildung, übergeordnete Ion Fragmentierung in Richtung Dehydroalanyl-Ionen während MS/MS, Beihilfe bei der strukturellen Zuordnung des N- Acylation Staates zu fördern. Der N-Terminus ist variabel und wichtige Funktion im Zusammenhang mit TLR Anerkennung der Lipoproteine. Zusammengenommen hat dieses Protokoll auf Lipoproteine, mit den einzelnen Stufen der Reinigung und Strukturaufklärung von MALDI-TOF MS leicht angepasst, je nach Ziel des Experiments intensive und reproduzierbare Studien erlaubt.

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Protocol

(1) Zelle Wachstum und Lyse

  1. Wachsen Sie Bakterien in 15 mL tryptic Soy Bouillon (TSB) oder ähnliche rich Media zu späten exponentiellen Phase (OD600 von 1,0-1,5). Ernten von Zellen durch Zentrifugation, einmal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung/EDTA (TBSE) waschen und mit Protokoll fortfahren oder bis zum Gebrauch einfrieren.
    Hinweis: TBSE: 20 mM Tris-Hydrochlorid (HCl), pH 8.0, 130 mM Natriumchlorid (NaCl), und 5 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)). Lipoprotein-Ausdruck und Modifikation können durch Wachstumsbedingungen (z.B. Säure, Salzgehalt, Wachstumsmedien) und Wachstum Phase15beeinflusst werden. Zellwachstum kann skaliert werden, wie gewünscht, sondern 15 mL von Zellen ist für eine einzelne Vorbereitung der Lipoproteine empfehlen, da überschüssige Biomasse Lipoprotein Ertrag verringern kann. Eine 15-mL-Vorbereitung ergibt in der Regel genügend Blut für die optimale Beladung von ~ 2-4 Fahrspuren auf einem standard Mini SDS-PAGE-Gel.
  2. Zellen in 800 μl TBSE mit 1 mM Phenylmethyl Sulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mg/mL Lysozym aufzuwirbeln. Lösung zu einem 2,0 mL Gewinde Microcentrifuge Schlauch mit Schraubverschluss und o-Ring zu übertragen und 20 min bei 37 ° c inkubieren
    Hinweis: Bestimmte Arten sind nicht anfällig für Lyse von Lysozym. Eine entsprechende lytische Enzym sollten ersetzt werden, um Lyse zu erleichtern.
  3. Die Röhre ~ 800 μl 0.1 mm Zirkonia/Kieselsäure Perlen hinzu und stören Zellen durch Schütteln mit maximaler Geschwindigkeit (7.000 u/min) auf einem Homogenisator für 5 Zyklen von 30 s jeweils mit 2 min ruhen auf dem Eis zwischen jedem Zyklus.
  4. Zentrifuge Probe bei 3000 X g für 5 min bei 4 ° C (pellet-Perlen und ungebrochene Zellen). Übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch und halten Sie auf dem Eis.
  5. Die restlichen Pellets 200 μL TBSE hinzu und zurück zu den Homogenisator für einen weiteren Zyklus. Zentrifugieren Sie (siehe oben) und kombinieren Sie überstand mit der vorherigen überstand (sollte 800-1000 μl Gesamtvolumen) zu.

(2) Anreicherung von Lipoproteinen durch TX-114 Phase Partitionierung

  1. Den Überstand mit TX-114 Tensid, eine Endkonzentration von 2 % (Vol/Vol) durch das Hinzufügen von ein gleiches Volumen von 4 % (Vol/Vol) das Tensid in eiskalten TBSE ergänzen und Inkubation für 1 h, mischen durch Umkehrung jedes ~ 15 min auf Eis.
    Hinweis: Wenn gekühlt, wird der überstand und Tensid mischbar sein.
  2. Übertragen Sie das Rohr auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren Sie für 10 min, Phasentrennung zu induzieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur , Bi-phasisch Trennung aufrechtzuerhalten.
  3. Vorsichtig aus der oberen wässrigen Phase pipette und verwerfen. Die untere Tensid-Phase um das Rohr zu seinem ursprünglichen Volumen wieder aufzufüllen eiskalte TBSE hinzu und kehren Sie um zu mischen. Inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
  4. Übertragen Sie das Rohr auf 37 ° C Wasserbad inkubieren 10 min induzieren Phasentrennung und Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,4 einmal mehr für eine Gesamtmenge von 3 Trennungen. Entfernen der oberen wässrigen Phase und entsorgen.
  6. Entfernen Sie Pellet ausgefällten Proteine, die im Laufe der Extraktionen (sichtbar an der Unterseite des Rohrs), gebildet, indem die Tensid-Phase 1 Volumen von eiskalten TBSE hinzufügen. Zentrifugieren Sie bei 4 ° C bei 16.000 x g für 2 min zu unlöslichen Protein Pellets.
    Hinweis: Probe sollte eine einzelne Phase bleiben. Wenn Phasentrennung auftritt, neu chill Probe und Zentrifugieren Sie wieder. Das Pellet besteht im Allgemeinen aus nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, aber zur weiteren Analyse beibehalten werden.
  7. Übertragen Sie den überstand sofort zu einem frischen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1250 μl 100 % Aceton Pipette oben und unten gründlich, um die Probe von der Spitze zu waschen, wie es zähflüssig sein wird. Mischen Sie durch Umkehrung und Inkubation über Nacht bei-20 ° C Protein ausgefällt.
  8. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur, pellet-Lipoproteine mit Augenmerk auf die Ausrichtung des Rohres. Lipoproteine bildet einen dünnen, weißen Film entlang der Außenwand des Rohres.
  9. Waschen Sie Pellet zweimal mit 100 % Aceton. Dekantieren Sie Aceton und lassen Sie Probe an der Luft trocknen.
  10. 20-40 μl 10 mm Tris-HCl, pH 8.0 oder ein standard Laemmli SDS-PAGE Probe Puffer16 hinzufügen und gründlich von oben und unten an der Wand mit der ausgefällten Lipoproteine pipettieren aufzuwirbeln. Kratzen Sie die Seite des Rohrs mit der PIPETTENSPITZE, Lipoproteine zu verdrängen.
    Hinweis: Lipoproteine löst sich nicht in Tris-Puffer, aber eher eine Suspension bilden.
    1. Lipoproteine bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.

(3) SDS-PAGE, Elektroblotting und Färbungen mit Ponceau S

  1. Separate Lipoproteine durch SDS-PAGE mit Standardmethoden16.
    Hinweis: Die entsprechenden Gel Acrylamid-Anteil variiert je nach Verwendungszweck und Größe der Lipoproteine. Hier wurden E. Faecalis Lipoproteine über 10 % Tris-Glycin Gel getrennt, während eine 16,5 %-Tris-Tricine-Gel für die kleineren E. Coli Lipoprotein Lpp17verwendet wurde.
  2. Übertragen Sie die Lipoproteine auf Nitrozellulose Transfer Membran mit einem standard Elektroblotting-Verfahren.
    Hinweis: Eine halbtrockene Übertragung mittels Bjerrum Schafer-Nielsen Puffer plus 0,1 % SDS wurde in 25 V, 1,3 mA für 15 min18. Alternativ könnte Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran verwendet werden, jedoch wie es mehr hydrophobe als Nitrozellulose, es effizient Elution von hydrophoben Lipopeptide von der Membrane in späteren Schritten verringern kann.
  3. Übertragen Sie die Nitrozellulose-Membran auf einen Behälter und Deckel mit Ponceau S-Lösung (0,2 % (w/V) Ponceau S in 5 % Essigsäure). Rock, sanft für 5 min oder bis rot-rosa Bänder sichtbar sind.
  4. Ponceau S Lösung abgießen und sorgfältig ausspülen der Nitrozellulose-Membran mit dH2O überschüssiges entfernen Flecken.
    Hinweis: Ponceau-gefärbten Bändern werden schnell destain. Wenn die Bänder verschwinden, wiederholen Sie Färbung.
  5. Mit einer sauberen Rasierklinge Verbrauchsteuern Sie die gewünschte Band und den Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Waschen Sie dreimal mit 1 mL dH2O, vollständig die Band destain.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Speichern Sie den ausgeschnittenen Bereich bedeckt mit Wasser bei-20 ° C bis zur Verwendung.
  6. Abschnitt zu übertragen, um eine saubere Oberfläche und mit einer sauberen Rasierklinge, Würfel des Nitrozellulose-Streifens in kleine Stücke von ca. 1 mm x 1 mm. sammeln die Stücke in einem 0,5 mL eiweißarme Bindung Microcentrifuge Schlauch.
  7. Waschen Sie die Stücke zweimal mit 0,5 mL des frisch zubereiteten 50 mM Ammonium Bicarbonat (NH4HCO3), pH 7,8 im Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Grade Wasser.

4. folgen Verdauung, Lipopeptide Extraktion aus Nitrozellulose-Membran, Ablagerung auf MALDI Ziel- und Datenerfassung

  1. Nitrozellulose-Stücke in 20 μl einer 20 μg/mL Lösung von Trypsin in 50 mM NH4HCO3pH 7,8 in HPLC Grade Wasser aufschwemmen. Wirbel zu mischen, dann kurz drehen, um sicherzustellen, dass alle Stücke die Trypsin-Lösung vollständig abgedeckt sind. Decken Sie den Schlauch Deckel mit Paraffin Film um Verdunstung zu verhindern und Digest über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  2. Drehung der Probe bei 16.000 x g für 30 s und Entfernen der Flüssigkeit durch pipettieren.
    Hinweis: Dies entfernt trypsiniert hydrophilen Peptide, die später durch MALDI-TOF MS Proteinidentifikation untersucht werden können.
  3. 50 μL der 0,5 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in HPLC Grade Wasser hinzufügen. Vortex mischen, dann drehen Sie die Probe kurz um sicherzustellen, dass alle Stücke von der Lösung bedeckt sind. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch pipettieren.
    Vorsicht: TFA ist Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.
  4. Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit 50 μL der 10 % Acetonitril HPLC Grade Wasser.
    Vorsicht: Acetonitril ist Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit 50 μL der 20 % Acetonitril HPLC Grade Wasser.
    Hinweis: Dadurch werden alle mäßig hydrophoben Peptiden lose gebunden, die Nitrozellulose entfernt.
  6. Eluieren fest gebundenen Lipopeptide, hinzufügen 15 μl 10 mg/mL frisch zubereiteten α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) Matrix in Chloroform-Methanol (2:1, V/V) gelöst und 10 min bei Raumtemperatur mit intermittierenden Vortexen inkubieren.
    1. Alternativ fügen Sie 15 μl Chloroform-Methanol zu eluieren Lipopeptide und mischen Sie mit Matrix zu einem späteren Zeitpunkt hinzu. Andere Matrizen, wie z. B. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB), sollte als Alternative zu CHCA getestet werden, wenn unbefriedigende Ergebnisse, für eine bestimmte Lipopeptide Komposition erzielt werden.
      Vorsicht: Chloroform und Methanol sind gesundheitsschädlich bei Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.
    2. Optional: Natrium zu fördern Bildung Addukt, ergänzen die Lösung von CHCA in Chloroform-Methanol mit wässrigen Natriumbicarbonat (Nahco33) um eine Endkonzentration von 1 mM.
  7. Drehen Sie die Probe kurz. Übertragen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Flüssigkeit auf einen neuen low-Protein Bindung Microcentrifuge Schlauch. Diese Lösung enthält den Großteil der N-terminalen Lipopeptide.
    Hinweis: Die Nitrozellulose kann ganz oder teilweise in der Chloroform-Methanol-Lösung auflösen. Dies wirkt sich nicht negativ auf MS-Ergebnisse und kann als alternative Methode zur Steigerung Lipopeptide Rendite verwendet werden. PVDF-Membran löst sich nicht auf die gleiche Weise.
  8. 1 μl der eluierten Lipopeptide mit CHCA auf einer polierten Stahl MALDI-Ziel zu hinterlegen.
    Hinweis: Das Chloroform-Methanol wird schnell verdunsten hinterließ kristallisierten CHCA und Lipopeptide. Eine optionale zweite 1 μL aliquoten kann auf den gleichen Punkt Erhöhung der probenkonzentration deponiert werden. Chloroform-Methanol kann deutlich nach Absetzung des Ziels verbreitet und als solche sollte darauf geachtet werden um zu vermeiden, Probe mischen auf dem Ziel. Es wird empfohlen, zu hinterlegen und schießen mehrere Flecken jeder Probe.
  9. Fahren Sie sofort mit Massenspektrometrie. Scannen Sie alle Bereiche des Spots für Lipopeptide Signal, vor allem, wenn der Spot zwei Schichten der Probe, enthält, wie die zweite Schicht der Lipopeptide zum äußeren Rand der Stelle schieben kann.
    Hinweis: Empfohlene Ausgangspunkt Laserstärke ist 25 %, obwohl es möglicherweise erforderlich, erhöhen die Intensität um Signal zu erwerben und die Summe mehrere Spektren (20 oder mehr Scans) um ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Hier Spektren wurden erworben, auf einem MALDI-TOF-TOF-Instrument (siehe die Tabelle der Materialien) mit einer Fabrik konfiguriert Instrument-Methode für den Reflektor positiv-Ionen-Nachweis über den 700-3500 m/Z -Bereich. Das Gerät wurde mit einer Rinderserumalbumin (BSA) folgen Peptid Mischung kalibriert.

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Representative Results

Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Die Lipoprotein-angereicherten Bruchteil extrahiert von Enterococcus Faecalis ATCC 19433 von TX-114 ist in Abbildung 2dargestellt. Zum Vergleich zeigt sich auch das bandenmuster die ausgefällten Proteinfraktion. Proteine aus dieser Fraktion wurden von MALDI-MS zu sehr reichlich kontaminierende Proteine als Lipoproteine (Tabelle 1) bestätigt. Der Massenspektren in Abbildung 3 zeigen das tryptic Peptid Ion Profil von E. Faecalis Lipoprotein PnrA, der auftritt, mit anschließenden wäscht von Nitrozellulose-gebundenen PnrA mit Lösungsmitteln zunehmender Polarität (Peak Zuweisungen in aufgeführt Tabelle 2). Abbildung 4 zeigt die N-terminal strukturelle Charakterisierung von PnrA durch MALDI-TOF MS/MS, enthüllt diagnostische N- Acylated Dehydroalanyl Gipfeln mit Lyso-Lipoprotein Form bestimmt. Abbildung 5 zeigt die Wirkung von Natrium Addukt Bildung auf Fragmentierung, mit der Sodiated Elternteil Ion bevorzugt Fragmentierung zu Gunsten des N- Acylated Dehydroalanyl ions.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische des Protokolls. Lipoproteine können sind angereichert mit TX-114 Phase Partitionierung und direkt, am häufigsten in TLR-Assays verwendet, oder weiter zur Strukturaufklärung von SDS-PAGE gereinigt. Lipoproteine sind Nitrozellulose, verdaut mit Trypsin, schrittweise, gewaschen und die daraus resultierende Lipopeptide eluiert mit Chloroform-Methanol für die Strukturanalyse von MALDI-MS übertragen. Die Trypsin und Nitrozellulose Waschlösungen können zur Proteinidentifizierung und MS Analyse gespeichert werden. w /:; TFA: Trifluoroacetic Säure; ACN: Acetonitril; CHCA: α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure; entscheiden Sie sich: optional; MALDI: Matrix-assisted Laser Desorption ionisation; MS: Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Profil des TX-114 bereichert Proteine aus E. Faecalis. Eine 10 %-Tris-Glycin SDS-PAGE-Gel befleckt mit Coomassie blau (A) und die entsprechenden Nitrozellulose-Membran gebeizt mit Ponceau S (B) zeigen eine unterschiedliche Streifenbildung zwischen die ausgefällten Proteinfraktion ("PPT") und den gereinigten Muster Lipoproteine ("LP"). Die angegebenen Coomassie gefärbt Bands wurden herausgeschnitten und als nicht-Lipoproteine von MALDI-MS tryptic Peptide (siehe Tabelle 1) identifiziert. PnrA wurde identifiziert und durch das Protokoll beschriebenen analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Ionen-Profil und Fülle Veränderungen mit Polarität der Nitrozellulose waschen Lösungen. (A) die Trypsin-Fraktion zeigt mehrere interne Peptid-Fragmente E. Faecalis -Lipoprotein PnrA in Abbildung 2angegebenen entspricht. Die 10 % (B) und 20 % (C) Acetonitril waschen Brüche Änderungen anzeigen Signalintensität und einen Rückgang der Gesamtzahl der einzelnen Peaks. (D) die endgültige Elution Bruchteil hochangereichertes mit der N-terminalen Lipopeptide bei m /Z 997, durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet. Intensität der einzelnen Spektren wird für den Vergleich der Signalintensität ( a) normalisiert. Spitzen-Massen und zugeordneten Sequenzen sind in Tabelle 2aufgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Band Protein-ID Beitritt Nr. Molekulargewicht EST. Peptid-Graf
1 Dehnung Faktor Tu GB | EOL37301.1 | 43.387 15
2 NADH-peroxidase GB | EOL34572.1 | 49.520 9
3 Pyruvat Dehydrogenase E1component, alpha-Untereinheit GB | EOL34709.1 | 41.358 12
4 Pyruvat Dehydrogenase E1 Komponente, Beta-Untereinheit GB | EOL34710.1 | 35.373 19
5 30er Jahre ribosomale Protein S2 GB | EOL33066.1 | 29.444 16
6 30er Jahre ribosomale Protein S3 GB | EOL37312.1 | 24.355 14

Tabelle 1: ausgefällten Proteine sind nicht-Lipoprotein Kontaminanten. Proteine wurden durch tryptic verdauen und MALDI-MS in gel Verdauung Protokolle19 mit Standard und werden von oben nach unten in der gleichen Reihenfolge auf dem Coomassie-Gel in Abbildung 2aufgelistet. Jedes Protein wurde mit einem Konfidenzintervall (CI) mehr als 95 % identifiziert.

Höchstzahl Theoretischen Masse Protein-Position Nein. der verpasste geschnittenen Seiten Peptidsequenz
1 631.3409 170-176 0 GVADAAK
2 675.4035 316-321 1 TKEAVK
3 826.4093 163-169 0 FQAGFEK
4 893.4839 121-128 0 NVVSATFR
5 943.5359 240-247 0 VWVIGVDR
6 1040.5047 188-197 0 YAASFADPAK
7 1200.6331 273-284 0 GVGTAVQDIANR
8 1316.6997 290-301 0 FPGGEHLVYGLK
9 1385.7827 83-94 0 FNTIFGIGYLLK
10 1432.743 149-162 0 VGFVGGEEGVVIDR
11 1568.7802 259-272 1 DGKEDNFTLTSTLK
12 1672.8289 240-254 1 VWVIGVDRDQDADGK
13 1707.8184 129-145 0 DNEAAYLAGVAAANETK
14 1724.8027 35-49 0 SFNQSSWEGLQAWGK
15 1797.9228 257-272 2 TKDGKEDNFTLTSTLK
16 1872.9854 285-301 1 ALEDKFPGGEHLVYGLK
17 1945.9613 230-247 1 DLNESGSGDKVWVIGVDR
18 2240.1345 149-169 1 VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK
19 2675.2543 230-254 2 DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK

Tabelle 2: Massen und die entsprechenden Folgen Peptide beobachtet. In Silico Trypsin-Verdauung von E. Faecalis PnrA (GenBank: EOL37280.1) wurde durchgeführt mit PeptideMass20,21, Seiten schneiden ermöglicht bis zu zwei verpasst. Die theoretischen Massen der Gipfel beobachtet auf den Spektren in Abbildung 3 aufgeführt sind, sowie die entsprechenden Peptid-Sequenzen.

Figure 4
Abbildung 4: MALDI-TOF MS von E. Faecalis Lipoprotein PnrA. (A) Elternteil MS Spektrum an der m /Z 997-Region, die N-terminale Lipopeptide von E. Faecalis PnrA entspricht. (B) MS/MS Lipopeptide Peak zeigt, dass es Lyso Form, mit der Diagnose N- Acylated Dehydroalanyl Peptid Fragment Ion Spitze durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet. (C)wird die aufgeklärt Struktur dargestellt. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung9geändert. R.I.: relative Intensität Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Natrium Addukt Bildung fördert die übergeordneten Ion Fragmentierung in Richtung Dehydroalanyl Lipopeptide Ionen. (A) MALDI-TOF-Spektren des E. Coli Lipoprotein Lpp N-terminalen Peptids (türkis spurlos) und mit (blaue Spuren) die Zugabe von Natriumbicarbonat. Zugabe von Natriumbicarbonat in der endgültigen eluierten Bruch führt zu einer 22 Da Erhöhung von der berechneten Masse der übergeordneten Lipopeptide. Im Vergleich mit dem MS/MS-Spektrum des protonierten ions (B)der MS/MS-Spektrum an das entsprechende Sodiated Ion (C) zeigt deutliche bevorzugte Fragmentierung in Richtung N-Acyl-Dehydroalanyl Ion durch neutrale Beseitigung der Diacylthioglyceryl Glyko-, durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet. Die Struktur des übergeordneten Triacylated Lpp N-terminalen tryptic Peptids (D) und N-Acyl-Dehydroalanyl Peptid Fragment Ion (E) dargestellt. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung9geändert. R.I.: relative Intensität Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das Protokoll hierin beschreibt zwei Phasen der Lipoprotein-Charakterisierung: Anreicherung von TX-114 phase Partitionierung und strukturellen Bestimmung durch MALDI-TOF MS. Während der TX-114 Extraktion entfernt zusätzliche Zentrifugation kontaminierende Proteine, die während dieses Prozesses, gefolgt von Aceton Niederschlag hochangereichertem Lipoproteine Ausbeute auszufällen. Durch die Begrenzung des Ausmaßes der jede Vorbereitung auf 15 mL im Wert von Zellen, können mehrere Proben problemlos parallel verarbeitet und auf Wunsch gebündelt am Ende des Protokolls.

Für die Strukturanalyse von MS erleichtert die Übertragung der Lipoproteine auf Nitrozellulose Trypsin-Verdauung, Wasch- und anschließende Elution von der Membrane. In unseren Händen erweist dieser Ansatz sich vorzuziehen, Waschmittel-vermittelten Extraktion aus traditionellen Polyacrylamid-Gel Stecker, wie die Lipoproteine sind mit der Oberfläche der Nitrozellulose-Membran verbunden und nicht in Polyacrylamid eingebettet. Lipoprotein-Verband mit der Nitrozellulose-Oberfläche verhindert auch weitgehend das gemeinsame Problem der unspezifischen Adsorption an Container Oberflächen durch hydrophobe Peptide. Schrittweise Elution der Nitrozellulose Stücke entfernt mehr hydrophile, interne tryptic Peptide die MALDI-TOF MS, hohes Vertrauen Protein Identifikation Zuordnungen zu erreichen, während reproduzierbar ergibt sich der endgültige Elution Schritt analysiert werden können konzentrierte Lipopeptide in einem kleinen Volumen, das weitgehend frei von störenden Salze und Ionen-Verunreinigungen zu unterdrücken ist.

Erfolgreiche MS-Analyse von einem Lipoprotein unterliegt seiner Fülle, und als solche den dunkelsten Bands aus der Ponceau S-gefärbten Membran sind wahrscheinlich die besten Ergebnisse liefern. Es ist jedoch möglich, dass mehrere Lipoproteine während Seite Trennung, erschwert die resultierenden Spektren in einem einzigen Band migrieren können. Daher, es wird dringend empfohlen, zuerst das Protein identifizieren durch Peptid Masse Fingerabdrücke (PMF), die kann erreicht werden, indem MS Spektren über den gesamten Trypsin-Bruch oder entweder Acetonitril waschen Bruchteil zu sammeln und die daraus resultierenden Gipfel in Eingabe einer Software wie Maskottchen22. Sobald die Proteinsequenz festgestellt worden ist, hilft Berechnung der Mass folgen N-terminale Lipopeptide deutlich bei der Auswahl welche Ionen fragmentieren von MS/MS.

Zusätzliche Probe Heterogenität kann aus verschiedenen Kettenlängen Acyl auf Lipoproteine innerhalb einer Bevölkerung und ihrer N-terminale Modifikationen, beides je nach Quelle Bakterien6führen. Während Variation in Kettenlänge für markante Gipfel Cluster auf übergeordnete Spektren, zeichnet sich durch 14 Da Schritten entsprechend Methylen-Gruppen (- CH2-), macht kann die gesamte Lipopeptide Signal aufgeteilt und Empfindlichkeit zu verringern. Es ist auch wahrscheinlich, dass die verschiedenen Lipoprotein Formen Bereicherung und Fragmentierung, beeinflussen, obwohl wir Triacylated, Diacylated und Lyso-Form Lipoproteine mit dem beschriebenen Protokoll erfolgreich identifiziert haben. In ähnlicher Weise hinzufügen die unterschiedlichen Peptid Moieties Lipoproteine eine weitere Ebene der Komplexität Analysen, unabhängig von ihrer N-terminale Struktur, wie eine sehr hydrophil Aminosäure-Zusammensetzung Lipopeptide Partitionierung in die organische Chloroform Phase verhindern kann Verwendung von anderen Extraktion Methoden8. Übertragung der Lipoprotein auf Nitrozellulose würden helfen solche Lipopeptide studieren wie alle Elution Brüche in dieser Methode analysiert werden können.

Zeichnung aus der bisherigen Literatur mit Triacylglycerides und Phospholipide23, vorsätzliche Natrium Addukt Bildung kann verwendet werden, um informativer Fragmentierung über Bildung zu fördern die (N-Acyl)-Dehydroalanyl-Peptid-Ion. Diese charakteristischen Ionen sind Schlüssel zum Zuweisen von Struktur, da die Acylation Stand der N-Terminus von Acyl-Substitutionen auf LED-Glyko-isoliert ist. Natrium Addukt Bildung bietet eine bequeme alternative Möglichkeit, Oxidation mit Wasserstoffperoxid, Schwefel, die nachweislich fördern auch N-Acyl-Dehydroalanyl Peptid Fragmentierung6,8. Obwohl Natrium Addukte können zeigen eine allgemeine Unterdrückung des übergeordneten Ionen-Signals, die spezifische Erhöhung der Fragmentierung in Richtung Dehydroalanyl-Ionen kompensiert verminderte Elternteil Ionen-Intensität. Es kann sich lohnen erkunden andere Matrizen und Fragmentierung von zusätzlichen Addukte die informativsten Spektren zu entlocken.

Dieses Protokoll verbessert die traditionellen TX-114-Phase Verfahren zur Anreicherung von Lipoprotein, Partitionierung, während Trypsin-Verdauung und Elution von Lipopeptide erleichtert die Übertragung der Seite getrennt Lipoproteine auf Nitrozellulose-Membran. MALDI-TOF MS-Analyse auf die gesamten folgen oder waschen Fraktionen ermöglicht Proteinidentifikation im Tandem mit N-terminale Strukturaufklärung von MS/MS in einem einzigen Experiment. Optionale Natrium Addukt Bildung Highlights Unterschiede bei den Lipopeptide N-Terminus von informativer Ion Fragmentierung zu fördern. Die Fähigkeit, regelmäßig reinigen Lipoproteine und prägen ihre N-Termini ermöglichen umfangreiche Studien über wie Roman Lipoprotein Formen hergestellt werden, deren physiologische Rolle innerhalb der bakteriellen Zellhülle und wie sie durch die Säugetier-Immune erkannt werden System.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Forschung im Labor Meredith wurde von Start-up aus Mitteln der Eberly Hochschule der Wissenschaft (Pennsylvania State University) unterstützt. Wir danken Dr. Tatiana Laremore für kompetente technische Beratung und Zugang zu Geräten an der Penn State Proteomics und Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, wo massenspektrometrische Analysen durchgeführt wurden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 110791012
Acetic acid EMD AX0073-9
Acetone EMD AX0116-6
Acetonitrile EMD AX0142-6
Ammonium bicarbonate Fluka Analytical 09830
BioTrace NT Nitrocellulose PALL Life Sciences 66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard Protea PS-204-1
Chloroform Acros Organics 423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP118
HPLC Grade water EMD WX0008-1
Lysozyme Fisher Scientific BP535-1
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) Amresco 0754
Pierce trypsin protease Thermo Scientific 90057
Ponceau S Acros Organics 161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL Eppendorf 022431064
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 792519
Sodium chloride Macron Fine Chemicals 7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich 299537
Tris-hydrochloride (HCl) Fisher Scientific BP152
Triton X-114 Sigma-Aldrich 93422
Tryptic soy broth (TSB) BD 211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) Sigma-Aldrich C8982
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MagNALyser Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad
MALDI-TOF target Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF Bruker Daltonics Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

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References

  1. Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188, (8), 2761-2773 (2006).
  2. Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862, (11), 1414-1423 (2016).
  3. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79, (2), 548-561 (2011).
  4. Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80, (3), 891-903 (2016).
  5. Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279, (23), 4247-4268 (2012).
  6. Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287, (16), 13170-13181 (2012).
  7. Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284, (13), 8406-8411 (2009).
  8. Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278, (5), 716-728 (2011).
  9. Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199, (11), e00099-e00017 (2017).
  10. Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286, (26), 22769-22776 (2011).
  11. Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62, (9), 3916-3921 (1994).
  12. Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67, (6), 2951-2956 (1999).
  13. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7, (2), 308-314 (2008).
  14. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78, (14), 5102-5108 (2006).
  15. Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194, (13), 3299-3306 (2012).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  17. Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
  18. Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. Spring Protocols. 321-334 (2002).
  19. Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
  20. Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18, (3-4), 403-408 (1997).
  21. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Springer Protocols. 571-607 (2005).
  22. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, (18), 3551-3567 (1999).
  23. Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17, (1), 87-96 (2003).

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