조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

Biochemistry

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Summary

프로토콜 blotting 표준 서 500 조 혈 줄기 또는 조상 세포로 몇 가지 분석을 위해 최적화 되었다. 최적화 포함 셀 샘플의 처리, 튜브, 사이 전송 제한 및 직접 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 lysing 주의 한다.

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Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

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Abstract

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 드문 셀, 오래만 25000 ~ phenotypic 포함 된 마우스 골 수와 함께 다시 채우기 HSCs 용어. 서쪽 더 럽 히 프로토콜 최적화 되었고 HSCs (500-15000 셀)의 작은 숫자의 분석에 적합 합니다. Phenotypic HSCs 정화, 정확 하 게 계산, 고 직접 Laemmli 샘플 버퍼에서 lysed. Lysates 셀의 동등한 숫자를 포함 하는 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석 되었다 오 점 준비 하 고 더럽혀 프로토콜 표준 서에 따라 처리. 이 프로토콜, 2000-5000를 사용 하 여 HSCs는 정기적으로 분석 될 수 있다, 그리고 어떤 경우에 데이터는 몇 가지 대부분의 출판물에 20000 ~ 40, 000 셀에 비해 500 셀으로에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 다른 조 혈 모 세포에 일반적으로 적용 되 고 표준 실험실 절차를 사용 하 여 셀의 작은 숫자의 일상적인 분석을 수 있습니다.

Introduction

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 모든 혈액 계보를 야기할 수 있는 각자 경신 세포 이다. 그들은 생 화 확 적인 분석을 어려운 렌더링 골 수에서 비교적 드문 셀입니다. 접근 cytometry, 같은 희귀 세포 분석을 위한 적합 한 세포 표면 마커 및 세포내 단백질의 상대적인 양을 측정 하는 데 매우 유용 했습니다. 그러나, 항 체 접근을 사용 하 셀 permeabilization 절차의 사용을 필요로 하는 세포내 단백질의 분석 하 고 모든 세포 표면 epitopes 살아이 절차1,2. 또한, 다른 단백질 isoforms 또는 분열 제품을 구분 하는 항 체는 종종 cytometry, 사용할 수 없습니다 그리고 그러므로 조사 여전히 의존 서쪽 오 점 특정 유형의 분석.

세포 lysates의 서쪽 오 점 분석은 대부분 실험실에서 일상적인 절차입니다. 세포 세포 표면 분자의 epitopes를 유지 하는 기본 조건에서 순화 될 수 있다 그리고 세포 lysates 수 이후에 준비 하 고 분석 했다. 그러나, 서쪽에 의해 인구 오 점 드문 기본 셀에 단백질의 분석 euthanizing 충분 한 세포를 얻기 위해 동물의 많은 수를 요구할 수 있습니다. 여러 단계로 작은 조정 함으로써, 기존의 서쪽 더 럽 히 프로토콜 HSCs (관심사의 단백질에 따라 500-15000)의 상대적으로 작은 숫자에 단백질을 감지할 수 있었습니다. 조정 포함 셀, 셀 손실 최소화 하기 위해 튜브 사이 세포의 전송을 감소 셀 펠 릿을 신중 하 게 처리를 정확 하 게 계산 하 고 포함 프로테아좀 버퍼 lysing 집중 로드 셀의 정의 수 고 인산 가수분해 효소 억제제입니다. 많은 게시 된 보고서 포함 20000 이상의 HSCs3,,45,6,7; 얻은 서쪽 오 점 이 간단한 절차는 세포와 실험 동물 4와 40 배 사이 해당 데이터를 생성 하는 데 필요한 수를 줄일 것입니다. 프로토콜은 결과 셀 당 기준 보다는 내부 통제를 정상화 하도록 설계 되었습니다. 내부 컨트롤에 데이터 정규화는 간과 될 수 있는 단백질 수준에서 전반적인 감소의 검색 수 있습니다. 셀 당 기준 표준화의 중요성 유전자 표현 데이터8의 분석에 대 한 설명 했다 그리고 동일한 원리 서쪽 오 점 하 여 단백질을 측정에 적용 됩니다. 이 최적화 된 프로토콜은 세포의 작은 숫자를 분석할 필요가 누군가 위해 유용 해야 한다.

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Protocol

모든 절차는 기관 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행 되어야 합니다. 절차 murine 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSCs, HPs)의 분석을 위해 개발 되었다 그러나 다른 세포 인구의 분석을 위해 적응 시킬 수 있다.

1. 교류 Cytometry 절연 Murine HSCs 및 HPs의

  1. 문학6에 설명 된 대로 murine 골 수 세포를 수확.
    참고: 그림 1그림 2에 표시 하는 데이터에 골 C57BL/6J 쥐에서 수확 했다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 마우스 리니지 고갈 키트를 사용 하 여 골 수 세포의 계보 소모를 수행 합니다.
  3. 설명7에 대 한 관심의 세포 표면 마커 항 체와 세포를 품 어. 그림 1그림 2에 나와 실험에서 Sca 1, 키트, Flt3, 및 계보 (Lin) 마커 Mac1, Gr1, CD3e, B220, 그리고 Ter119 항 체 사용 됩니다.
  4. 정렬 2000-20000 린- Sca1++ Flt3 키트- 세포 (HSCs) 또는 Lin-Sca1-키트+ 셀 (HPs) 0.1 mL의 인산 염을 포함 하는 1.5 mL Eppendorf 관에 버퍼링 2% 태아 소와 염 분 (PBS) 혈 청 (FBS)입니다.
    참고: 그림 1그림 2에 표시 된 데이터에 대 한 셀은 정렬 Flow Cytometer 70 µ M 노즐을 사용 하 여. 최대 컬렉션 볼륨 1.4 mL 이다입니다.

2. 샘플 준비

참고:이 단계는 중요 한. 샘플을 매우 신중 하 게 처리 합니다. 제거는 상쾌한, 될 매우 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.

  1. 원심 분리기는 1.5 mL 튜브 4 ° C에서 진동 물통 회전자에서 정렬된 셀을 포함, 500 x g 5 셀에서 상쾌한의 약 100 µ L 제외한 모든 분 제거에 대 한 매우 부드럽게 사용 하는 피 펫 20 µ L 피펫으로 팁 작은. 펠 릿을 방해 하지 마십시오.
    1. 샘플 미만 5, 000 셀이 포함 하는 경우 정렬 된 샘플의 총 볼륨은 0.2 mL 미만 전송 셀 먼저 낮은 바인딩 0.2 mL PCR 튜브 원심 분리 하기 전에.
    2. 샘플 포함 된 경우 5, 000 개 미만의 세포 볼륨은 0.2 mL 이상, 5 분, 4 ° C, 500 x g에서 원심 분리기와 셀 아래로 회전 하 고는 상쾌한의 200 µ L를 제외한 모든 제거. 수송과 셀 상쾌한, 나머지 200 µ L에 다시 중단 다음 0.2 mL PCR 튜브에 세포를 전송 하 고 다시 아래로 회전. 두 번째 스핀 후 펠 릿에서 모든 하지만 20-30 µ L을 제거 하 고 다시 셀을 일시 중단.
  2. 튜브에서 표면에 뜨는 왼쪽에 셀 resuspend 필요한 경우, 추가 추가 PBS 2 %FBS에서 / PBS (또한 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 / PBS, 또는 혼자 PBS) 농도 5를 x104 5 x 105 셀/mL.
    참고: 셀 계산 사용 cytometry 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 볼륨을 추정 하 여 수집.
  3. 다시 일시 중단 된 셀의 2-5 µ L를 사용 하 여 (제조업체의 지침에 따라) 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer9를 사용 하 여 정확한 셀 농도 결정.
  4. 다시 일시 중단 된 셀 원하는 새로운 1.5 mL 튜브에 세포 수를 포함 하는 볼륨을 전송. 그림1에서 실험, 2000, 1000, 500 HSCs 또는 HPs 전송 했다. 원하는 셀 수는 서쪽 오 점 하 여 얻은 신호 강도 의존 하 고 경험적으로 결정 됩니다. 20 µ L 또는 100 µ L Eppendorf 피 펫 팁을 사용 하 여 전송을 수행 합니다.
  5. 5 분 500 x g, 4 ° C에서 진동 물통 회전자에 셀 원심
  6. 재고 솔루션 x 100을 생성 하려면 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제를 분해.
  7. 증류수의 상응 하는 금액으로는 제조업체에서 제공 하는 4 x Laemmli 샘플 버퍼를 diluting 하 여 2 x Laemmli 샘플 버퍼를 준비 합니다. 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제 2 x Laemmli 샘플 버퍼에 2 x 억제제의 최종 농도를 100 배 재고의 적절 한 금액을 추가 합니다.
    참고: 2 x Laemmli 샘플 버퍼는 사전에 만들 수 있습니다 하지만 프로테아좀 및 인산 가수분해 효소 억제제 다음 단계에 설명 된 대로 2 x Laemmli 샘플 버퍼 (더하기 억제제) 셀 펠 릿에는 세포를 lyse 추가 직전 추가 되어야 합니다.
  8. 조심 스럽게 셀 펠 릿에서 그리고 셀 펠 릿으로 튜브에 남아 상쾌한은 상쾌한의 일부를 제거, 2 x Laemmli 샘플 버퍼 플러스 500의 최종 농도 달성 하기 위해 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제의 동일한 볼륨 추가 셀/1 x Laemmli 샘플 버퍼에 µ l
    참고: 예를 들어 셀 (단계 2.6) 펠 릿에서 상쾌한의 18 µ L를 제거 해야 centrifuging 후 단계 2.5에서 튜브와 남아 상쾌한의 2 µ L 2000 셀 20 µ L의 전체 볼륨에 전송 하는 경우 추가의 동일한 볼륨 (2 µ L) 1 x Laemmli 샘플 버퍼에 500 세포 / µ L의 최종 농도 달성 하기 위해 Laemmli 샘플 버퍼 x 2.
  9. 최대한 빨리 lysate를 생성 하는 펠 릿 resuspend 이 시점에서, 샘플을 즉시 SDS 페이지 젤를 통해 electrophoresed 수 또는 스냅 액체 N2 에서 냉동 고 수 미래 사용을 위한-80 ° C에 저장.

3입니다. 전기 이동 법

  1. 95 ° C에서 열 블록 또는 끓는 물에 5 분 동안 lysates 열.
  2. SDS 페이지 젤 100V에서 표준 프로토콜10를 사용 하 여 통해 (20000 셀 해당 최대 500에서 포함) lysates의 1-40 µ L를 electrophorese.
    참고: 젤으로 로드 lysate의 볼륨 바람직한 신호를 생성 하는 데 필요한 셀의 수에 의해 결정 되 고 관심, 그리고 항 체의 품질의 단백질의 풍부에 따라 달라 집니다. 그림 1에서 데이터 2000, 1000, 500 셀 등가물 lysate의 획득 했다. 우물의 폭 3 m m에 1.5 m m. 치아 수는 1.5 m m의 범위에 잘려야 한다 상용 빗에서가 위를 사용 하 여 넓은 이빨을 가진.

4. 전송 및 차단

참고: 서쪽 오 점 표준 프로토콜11다음을 수행 합니다. 단계는 간단히 여기에 설명 된:

  1. 10 s, 다음 씻어 짧게 막으로 증류수에 대 한 메탄올을 가진 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인을 pretreat.
  2. SDS 페이지 젤에서 전송 장치 제조업체에서 제공 하는 설명서의 지침에 따라 막 단백질을 전송.
  3. 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 PBST의 2 개 mL를 막 차단 전송, 다음 (0.1 %PBS 트윈) 표준 프로토콜11다음 4 ° C에서 하룻밤.

5. 항 체 라벨

  1. 공급 업체에서 권장 하는 항 체 희석을 사용 하 여 4 ° C에서 하룻밤 통에 항 체를 막 품 어.
    참고: 재료의 테이블에서 항 체, 우리 HSCs HPs와 해당 항 체 희석에 대 한 확인 한, 표시 됩니다. 항 체 라벨 표준 절차8를 사용 하 여 수행 합니다.

6입니다. 감지

  1. 씻고 막 3 시간, 실 온에서 PBST에 각 세척에 대 일 분.
  2. 실 온에서 1 분에 대 한 향상 된 화학 버퍼의 2 개 mL를 막 품 어. 다음 제조업체의 지침, 또는 autoradiography 필름과 필름 프로세서 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.

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Representative Results

500-2000 순화 HSCs와 HPs에서 대표적인 결과 그림 1그림 2에 표시 됩니다. 그림 1 에서 β-말라 신호에서 몇 가지 500 HSCs로 검출 될 수 있다 고 HPs 한 마우스의 골 수에서 정화. Note는 3.0 m m 우물에 로드 보다 500 HPs에서 훨씬 더 강력한 신호 생산 로드는 lysates 1.5 m m 우물. 그림 2 은 EIF4G의 서쪽 오 점 및 Rps6의 인 산화 (p-Rps6), 둘 다 단백질 번역12, HSCs의 규칙에 관련 되 고 HPs와 줄기 세포에 의해 자극 없이 (SCF) 생체 외에서요인.

Figure 1
그림 1: HSCs와 HPs β-걸을 위한 서쪽 오 점 murine에서 lysates 수행. HSCs 린-Sca1 계보 고갈 murine 골 수 세포에서 정렬 했다++ Flt3 키트- , 전지와 HPs 했다 Lin-Sca1-키트+. Lysates 셀의 다른 숫자에서 준비 되었다 electrophoresed 12 %SDS 페이지 젤 1mm 스페이서와 함께 미니 유리 접시를 사용 하 여 준비를 통해. 오 점 β-말라 항 체와 함께 조사 했다. 오 점 500에서 2000 HPs로 비교 β-말라 신호 표시는 lysates 1.5 m m 3 m m 우물에 비해 웰 스 (4-6 차선)에 로드 된 때 (레인 1-2). 2 천에서 500 세포 Lysates 레인 7 ~ 9에 로드 되었습니다. M, 분자량 마커입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 갓 격리 HSCs, HPs의 서쪽 오 점 분석에서 생체 외에서 줄기 세포 요소 (SCF) cytokine 자극. HPs 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 순화 했다, centrifuged, resuspended 2에서 %FBS / PBS, 계산, 다음 2 개의 관으로 분할. 첫 번째 튜브에 HPs SCF와 자극 했다 (10 ng/mL) 튜브 SCF의 부재에 5 분에 대 한 교양 했다 두 번째에서 37 ° C (+ SCF), 및 HPs에서 5 분 (-SCF). 셀은 다음 centrifuged와 셀 펠 릿 Laemmli 샘플 버퍼 lysed. HSCs 정화 되었고 직접 경작 하지 않고 Laemmli 샘플 버퍼 lysed. lysates 1.5 m m 우물에 로드 되었고 12 %SDS 페이지 젤을 통해 electrophoresed. 오 점 신장 시작 요소 4 G (EIF4G), 항 체와 함께 개발 된 β-말라와 phosphorylated 작은 리보솜 소 단위 S6 (p-Rps6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

서 부 럽 조직 또는 세포에 특정 단백질 및 신호 통로의 활성화를 탐지 하기 위한 일반적인 기술입니다. 작은 조정에 일반적으로 사용 되는 절차를 도입 하 여 정기적으로 15000 HSCs, 그리고 경우에 따라 몇 가지로 500 HSCs 15 다른 단백질 (자료 테이블)을 감지할 수 있었습니다. The most이 프로토콜의 중요 한 단계는: 1) 정확 하 게 계산 셀, 2) 튜브, 사이 전송의 수를 최소화 및 3) lysing Laemmli 샘플 버퍼와 직접 셀. Lysing Laemmli 샘플 버퍼 셀 펠 릿, 우리는 보다는 제거는 상쾌한의 모든 셀 펠 릿에서 하 고 다시 만약 우리가 대신 튜브에 남아 있는 작은 양의 상쾌한 동등한 추가 Laemmli 샘플 버퍼에서 중단 발견 Laemmli 샘플 버퍼 x 2의 볼륨, 우리 셀 손실을 피할 수 있습니다. 셀 손실의 위험을 감소 또한 centrifuging 진동 물통 회전자에 셀. 트리밍 빗 이빨 잘의 폭을 줄이는 탐지의 감도 향상.

이러한 간단한 조정 절차, 그 10-20 배 더 많은 셀3,,45,6, 를 사용 했다 출판된 논문에 해당 재현성 결과 얻을 수 있었습니다. 7. 다시 다음과 같은 표준 절차13, 세포의 작은 수에서 얻을 수 있는 정보의 양을 증가 blotting에도 말을 박탈 하는 더. 관심사의 단백질을 검출 하는 기능 항 체 및 단백질 풍부의 품질에 의해 제한 됩니다. 이 수정된 기술은 크게 희귀 세포 인구에서 단백질 데이터를 얻기 위해 필요한 동물의 수를 감소 해야 합니다.

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Disclosures

저자는 선언 하는 관심의 충돌이 있다.

Acknowledgments

국립 보건원 부여 R01 CA149976 (N.A.S)이이 작업을 지원 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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