西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない

Biochemistry

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Summary

しみが付くプロトコル標準ウエスタンとして 500 造血幹前駆細胞の数を分析するため最適化を行った。最適化を含むセルのサンプルの処理、管の転送を制限して塩化物イオンとサンプル バッファー内セルを直接溶解に注意してください。

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Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

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Abstract

造血幹細胞 (造血) 希少な細胞は、長い間 25,000 〜 表現型を含むマウス骨髄再 HSCs を長期的です。西部のしみが付くプロトコルの最適化され、造血 (500-15,000 細胞) の小さな数字の解析に適した。表現型の HSCs 精製、正確にカウント、塩化物イオンとサンプル バッファーに直接分離します。同じ数の細胞の溶解液はナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析されたとしみが準備され、次の標準的な西部のしみが付くプロトコルを処理します。このプロトコルは、2,000-5,000 を使用して HSCs を定期的に分析して 500 セル、ほとんどの出版物で報告される 20,000 に 40,000 セルと比較して少ないからいくつかのケースでデータを取得できます。このプロトコルは、その他の造血細胞に一般に適用されるべきし、少数の標準的な検査手順を使用してセルのルーチン分析が可能します。

Introduction

造血幹細胞 (造血) は、すべての血液系統に上昇を与えることができる自己更新のセルです。比較的希少な細胞の骨髄、生化学的解析を困難にレンダリングしています。アプローチ フローサイトメトリーなどの希少な細胞の解析に適しては、セル表面のマーカー、細胞内タンパク質の相対的な量を定量化するために非常に有用されています。細胞内タンパク質の解析抗体アクセスを有効にするセル透過手順の使用を必要とし、すべてではない細胞表面抗原生き残るこれら手順1,2。さらに、異なるタンパク質アイソ フォームや胸の谷間の製品を区別する抗体が多い、フローサイトメトリー用利用可能なしたがって調査官まだに依存西部のしみ特定のタイプの解析。

セル lysates の西部のしみの分析は、ほとんどの実験室の定期的なプロシージャです。細胞表面抗原のエピトープを保持するネイティブの条件下で細胞を浄化することが、セル lysates の準備および分析できる後。ただし、まれな一次電池しみの西部で人口におけるタンパク質の解析は十分なセルを取得する動物の数が多いを安楽死させる要求できます。いくつかの手順を微調整すること、によって、従来の西部のしみが付くプロトコル HSCs (500-15,000、興味の蛋白質によって) の比較的少数の蛋白質を検出することができた。調整は、セル、セルのセル損失を最小限に抑えるためのチューブ間の移管を軽減、細胞ペレットを慎重に処理を正確にカウントし、バッファー含むプロテアソームの集中載荷時とセルの定義された数を溶解し、ホスファターゼ阻害剤。パブリッシュされたレポートの多くは、20,000 以上 HSCs3,4,5,6,7で得られた西部のしみこの簡単な手順は、セルと 4 と 40 倍の間で相当のデータを生成するために必要な実験動物の数を減らすは。プロトコルは、内部統制ではなく、セルごとに結果を正規化する設計されています。これは、内部のコントロールにデータが正規化された場合に見落とすことができる蛋白質のレベルの全体的な削減の検出を可能。 にします。セルごとに正規化の重要性は、遺伝子発現データ8の分析について説明された、西部のしみによって蛋白質を定量化する同じ原則が適用されます。この最適化されたプロトコルは、細胞の小さな数字を分析する必要がある誰にとっても便利でする必要があります。

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Protocol

すべてのプロシージャは、制度上の動物の使用およびケアのガイドラインに従って行われなければなりません。プロシージャは、マウス造血幹・前駆細胞 (造血および HPs) の解析用に開発されたが、他のセル人口の分析のため適応することができます。

1. マウス造血および HPs の流れフローサイトメトリー分離

  1. 文学6で説明するように、マウス骨髄細胞を収穫します。
    注:図 1図 2に示したデータ、骨髄が c57bl/6 j マウスから収穫されました。
  2. 製造元の指示に従って、マウス系統の枯渇キットを使用して骨髄細胞の血統の枯渇を実行します。
  3. 説明7として興味のセル表面のマーカーに対する抗体と細胞を孵化させなさい。図 1および図 2に示すように実験、Sca 1、キット、Flt3、Mac1、Gr1、CD3e、B220、Ter119 系統 (Lin) マーカーに対する抗体を使用します。
  4. 2,000 20,000 林- Sca1 の並べ替え+キット+ Flt3-細胞 (造血) または Lin-Sca1-キット+細胞 (HPs) リン酸の 0.1 mL を含む 1.5 mL エッペン チューブに緩衝生理食塩水 (PBS) 2% 胎児ウシ血清 (FBS)。
    注意: データは、図 1および図 2に示すように、セル ソートされた 70 μ M ノズル流れの Cytometer を使用します。コレクションの最大ボリュームは、1.4 mL です。

2. サンプル準備

注: この手順は重要です。サンプルを非常に慎重に処理します。上清を取り外す場合は、細胞ペレットを邪魔しないように非常に注意します。

  1. 遠心分離機、1.5 mL チューブが 4 ° C でスイング バケツ ローターの並べ替えセルを含む、500 x g、5 分削除以外のすべての約 100 μ L のセルから上澄みのペレット ピペットと 20 μ L ピペット チップを使用して非常に穏やか。ペレットが不可でした。
    1. サンプルは、5,000 未満のセルを含む、並べ替えられたサンプルの合計量は 0.2 mL 未満、最初低結合 0.2 mL PCR チューブ遠心分離前にセルを転送します。
    2. サンプルには、5,000 未満のセルが含まれています、量は 0.2 mL 以上、4 ° C、500 × g で 5 分間遠心分離機でセルをスピンダウンします、上清 200 μ L がすべて削除します。再培養上清の残りの 200 μ L の小球形にされたセルを中断し、0.2 mL PCR チューブにセルを転送、再びスピンダウンします。2 番目のスピンの後ペレットからすべてが 20-30 μ L を削除し、再度セルを中断します。
  2. チューブに上清左の細胞を再懸濁します。必要であれば 2% 追加 PBS を追加 FBS/PBS (2% ウシ血清アルブミン (BSA) を使用することもできます/PBS、または単独で PBS)、濃度が 5 x10 5 x 105セル/mL に4
    注: セルをカウントの使用セルを中断するために使用量を推定するためのフローサイトメトリーによって収集されます。
  3. 再浮遊細胞の 2-5 μ L を使用すると、(製造元の指示に従って) 自動化された細胞カウンターまたは検定9を使用して正確な細胞濃度を決定します。
  4. 必要な新しい 1.5 mL チューブに細胞数を含む再浮遊細胞の量を転送します。図 1に実験のため、1,000、2,000、または 500 の HSCs または HPs に移した。必要な細胞数は西部のしみ、によって得られる信号強度に依存し、は、経験的に決定します。20 μ L または 100 μ L エッペン ピペット チップを使用して転送を実行します。
  5. スイング バケツ ローター 4 ° C、500 × g で 5 分で細胞を遠心します。
  6. 原液 x 100 を生成するための製造元の指示に従って DMSO にプロテアソームとホスファターゼ阻害剤を溶解します。
  7. 2 x Laemmli サンプル バッファーを準備するには、蒸留水の相当量を製造元から提供された 4 x Laemmli サンプル バッファーを希釈します。阻害剤 x 2 2 x Laemmli サンプル バッファー内の最終的な集中を取得するホスファターゼとプロテアソーム阻害剤の 100 x の在庫の適切な量を追加します。
    注: 2 x Laemmli サンプル バッファー、事前に行うことが、プロテアソームとホスファターゼ阻害剤は、次の手順で説明するように、2 x Laemmli サンプル バッファー (プラス阻害剤) 細胞ペレットに細胞を溶解するを追加する前にすぐに追加必要があります。
  8. 慎重に細胞ペレットおよび細胞ペレットをチューブに残って上清に上澄みの部分を削除、2 の x Laemmli サンプル バッファー プラス 500 の最終的な集中を達成するためにプロテアソームとホスファターゼ阻害剤の等量を追加細胞/μ l 1 x Laemmli サンプル バッファー内。
    注: たとえば、ステップ 2.5 でチューブ、ペレットから上澄みの 18 μ L を削除する必要があります (ステップ 2.6) 細胞を遠心分離後、残りは上澄みの 2 μ L に 20 μ L の総ボリュームで 2,000 のセルを転送する場合は追加の等しいボリューム (2 μ L) 2 x 500 細胞/μ L 1 x Laemmli サンプル バッファー内の最終的な集中を達成するために塩化物イオン サンプル バッファー。
  9. できるだけ早く、ライセートを生成するペレットを再懸濁します。この時点で、サンプルは SDS ページのゲルを通ってすぐに electrophoresed することができます。 またはスナップがリキッド N2でフリーズし、将来使用するため-80 ° C で保存することがことができます。

3. 電気泳動

  1. 95 ° C で熱ブロック内、または 5 分間水を沸騰の溶解液を加熱します。
  2. 標準プロトコル10を使用して 100 v で SDS ページのゲルを通って (20,000 セル同等まで 500 から含む) 溶解液の 1 40 μ L を electrophorese します。
    メモ: ライセートのゲルにロードのボリュームは、望ましい信号の生成に必要なセルの数によって決まります、利子および抗体の品質の蛋白質の豊富さによって異なります。図 1のデータは、2,000、1,000、500 セル相当ライセートと得られました。井戸の幅切られるべき 3 mm に 1.5 mm. 歯をすることができます 1.5 mm の範囲で市販の櫛から広い歯のはさみを使用しています。

4. 転送し、ブロック

注: は、次の標準的なプロトコル11西部のしみを実行します。手順は簡単にここで記載されています。

  1. 10 s、それから簡単に膜の洗浄に蒸留水、メタノールとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜を前処理します。
  2. 転送装置の製造元から提供されるマニュアルの指示に従って膜に SDS ページのゲルからタンパク質を転送します。
  3. 2 ml の 5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBST の膜をブロック転送を以下 (0.1% と PBS トゥイーン) 4 ° C 以下の標準プロトコル11で一晩。

5. 抗体の分類

  1. ベンダーによって推奨の抗体希釈を使用して 4 ° C で一晩シェーカーで抗体を膜を孵化させなさい。
    注: 材料表 HSCs と HPs と対応する抗体の希薄を検証しましたが、抗体が表示されます。標準的な手順8を使用して抗体の分類を実行します。

6. 検出

  1. 3 回、室温で PBST で各洗浄のため 5 分、膜を洗浄します。
  2. 2 mL の部屋の温度で 1 分の化学発光のバッファーを持つ膜を孵化させなさい。次の製造元の指示、またはオートラジオグラフィー フィルムとフィルムのプロセッサ イメージング システムを使用して信号を検出します。

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Representative Results

500-2,000 精製造血および HPs の代表的な結果は、図 1図 2のとおりです。500 HSCs から1 β-アクチン信号を検出できるし、HPs が 1 つのマウスの骨髄から精製しました。Lysates を読み込んで 1.5 mm 井戸生産 3.0 mm 井戸への読み込みよりも 500 HPs から非常に強い信号であることに注意してください。図 2は EIF4G の西部のしみ、Rps6 のリン酸化 (p Rps6)、どちらのタンパク質翻訳12の星細胞の調節に関与しているし、HPs と幹細胞による刺激なしで体外(SCF) 要因。

Figure 1
図 1: 造血および HPs lysates と β-アクチンの西部のしみがマウスから実行します。HSCs は Lin-Sca1 として枯渇マウス骨髄細胞からソートされた+キット+ Flt3-細胞および HPs いた Sca1 林--キット+。細胞の数が異なるから調製した溶解液が electrophoresed 1 mm スペーサーとミニ ガラス板を使用した 12 %sds ページのゲルを介して。しみは、β - アクチン抗体プローブでした。しみ lysates は 3 mm 井戸と比較して 1.5 mm 井戸 (レーン 4-6) に読み込まれたときに 500 から 2,000 HPs の比較 β-アクチン信号を示しています (レーン 1-2)。車線 7 に 9 に 2,000 から 500 セル Lysates を読み込みました。M、分子量マーカーです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 新鮮単離造血および HPs の西部のしみの分析刺激培養幹細胞因子 (SCF) サイトカインと。HPs 蛍光活性化セル (FACS) の並べ替えで精製、遠心分離、2 で再停止される %fbs/PBS、カウント、2 つのチューブに分割されます。最初のチューブで HPs SCF と刺激を受けました (10 ng/mL) SCF の不在で 5 分間培養チューブ 2 番目の 37 ° C (+ SCF) および HPs で 5 分間 (-SCF)。遠心し、細胞と細胞ペレットは塩化物イオンとサンプル バッファーと分離します。HSCs は精製され、直接培養せず塩化物イオン サンプル バッファーと分離します。Lysates は 1.5 mm 井戸に読み込まれ 12 %sds ページのゲルを通って electrophoresed。しみは伸長開始因子 4 G (EIF4G) に対する抗体を開発した β-アクチンとサブユニットのリン酸化の小さなリボソーム S6 (p Rps6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

西部にしみが付くことは、組織や細胞の特定の蛋白質とシグナル伝達経路の活性化を検出するための一般的な手法です。一般的に使用されるプロシージャを微調整を導入し、15,000 HSCs と 500 HSCs として、いくつかのいくつかのケースで日常的に 15 の異なった蛋白質 (資材表) を検出することができました。The most このプロトコルの重要なステップは、: 1) 正確にセルをカウント、2) 転送管の数を最小限に抑え、3) 塩化物イオン サンプル バッファーに直接細胞を溶解します。細胞ペレットから上澄みのすべてを削除して再代わりにチューブに上清の小さいボリュームを左し、同等のものを追加、塩化物イオンとサンプル バッファー内に中断はなく、わかったときに塩化物イオン サンプル バッファーを持つ細胞ペレットを溶解、塩化物イオン サンプル バッファー x 2 のボリュームは、我々 は、セル損失を回避できました。スイング バケツ ローターで細胞を遠心分離と、セル損失のリスクも減少しました。検出の感度を改善櫛歯をトリミングすることによって井戸の幅を減らします。

プロシージャにこれらの簡単な調整と同等の 10 〜 20 倍以上のセル3,4,5,6,を使用していた論文の再現性のある結果を取得することができました7します。 さらに、黒子は次の標準的な手順13、少数の細胞から得られる情報量の増加を再しみが付くことのため取り除くことができます。興味の蛋白質を検出する能力は、抗体および蛋白質量の質によって制限されます。この修正テクニック稀な細胞集団からタンパク質データを取得に必要な動物の数が大幅に削減。

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Disclosures

著者は宣言する利害の衝突があります。

Acknowledgments

健康の国民の協会付与 R01 CA149976 (N.A.S) はこの仕事を支えた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

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References

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