Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Standart bir Western blot Protokolü 500 hematopoetik kök veya progenitör hücre olarak birkaç analiz etmek için optimize edildi. En iyi duruma getirme dikkatli hücre örneği işleme, tüpleri arasında aktarımlarını sınırlama ve doğrudan Laemmli örnek arabellek hücrelerde lysing içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hematopoetik kök hücre (HSCs) nadir hücreleri, fare kemik iliği sadece 25.000 ~ fenotipik içeren uzun süreli kullanıma HSCs. Batı blotting iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve HSCs (500-15000 hücreleri) az sayıda analizi için uygun. Fenotipik HSCs saf, doğru sayılır ve Laemmli örnek arabellekte doğrudan lysed. Hücreler eşit sayıda içeren Lysates Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz edildi ve leke hazırlanmıştır ve standart Western blot protokolleri takip işlenir. Bu iletişim kuralı, 2000-5000 kullanarak HSCs düzenli olarak analiz edilebilir ve bazı durumlarda veri olabildiğince az 500 hücreler, çoğu yayınlarda bildirdi 20,000-40,000 hücrelere kıyasla olarak elde edilebilir. Bu iletişim kuralı diğer hematopoetik hücrelerin genel olarak uygulanabilir olmalıdır ve az sayıda hücre standart Laboratuvar yordamları kullanarak rutin çözümleme sağlar.

Introduction

Hematopoetik kök hücre (HSCs) tüm kan soy çıkmasına neden olabilir kendini yenileyerek hücrelerdir. Onlar nispeten nadir biyokimyasal analizler zor işleme kemik iliği hücrelerinde vardır. Akış Sitometresi gibi nadir hücrelerin analiz etmek için uygun yaklaşımlar göreli miktarda hücre yüzey işaretleyicileri ve intraselüler protein miktarının için son derece yararlı olmuştur. Ancak, çözümleme hücre içi proteinlerin hücre permeabilization yordamlar antikor erişimi etkinleştirmek için kullanımı gerektirir ve tüm hücre yüzey epitopları bu yordamları1,2hayatta. Buna ek olarak, farklı protein izoformlarının veya bölünme ürünleri arasında ayırımcılık antikorlar genellikle akış sitometresi için kullanılabilir değildir ve bu nedenle müfettişler, hala analiz türleri kesin Batı lekesi güvenmek.

Hücre lysates Western blot Analizi çoğu laboratuarlarında rutin bir işlemdir. Hücre epitopları hücre yüzey moleküllerin korumak yerel koşullar altında saf ve hücre lysates daha sonra hazırlanan ve analiz. Ancak, nüfus tarafından Western blot nadir İlköğretim hücredeki protein analizi hayvanlar yeterince hücre elde etmek için çok sayıda ötenazi gerektirebilirsiniz. Birkaç adım için küçük ayarlamalar yaparak, geleneksel Batı blotting Protokolü proteinler HSCs (500-15.000 bağlı olarak faiz protein) nispeten az sayıda tespit edebilir başardı. Doğru bir şekilde dikkatle hücre kaybı, en aza indirmek için borular arasında hücre aktarımlarını azaltma hücre Pelet işleme hücreleri, sayım ayarlamaları dahil ve hücrelerin konsantre bir yükleme ile tanımlanmış bir dizi lysing arabellek içeren proteasome ve fosfataz inhibitörleri. Yayımlanmış raporların çoğu Batı lekesi 20.000 veya daha fazla HSCs3,4,5,6,7ile elde içerir; Bu basit bir prosedür hücreleri ve deneysel hayvan 4 ve 40 kat arasında tarafından eşdeğer veri üretmek için gereken sayısını azaltır. Protokol sonuçları hücre başına bazında değil, bir iç kontrol normalleştirmek için tasarlanmıştır. Bu veri bir iç kontrol için normalleştirilmiş Eğer göz ardı edilebilir protein düzeyleri olarak genel indirim olarak algılanmasını sağlar. Bir hücre başına bazında normalize önemini gen ifadesi verileri8analiz için tanımlanmıştır ve Western blot tarafından protein miktarının aynı ilke geçerlidir. Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı herkes için az sayıda hücre analiz etmek gerek yararlı olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanım ve bakım kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Yordamı fare hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSCs ve HPs) analizi için geliştirilmiş, ancak diğer hücre popülasyonlarının analiz için adapte edilebilir.

1. akış sitometresi yalıtım HPs ve fare HSCs

  1. Fare kemik iliği hücreleri edebiyat6' açıklandığı gibi hasat.
    Not: Resim 1 ve Şekil 2sunulan verilerde, kemik iliği C57BL/6J fareler hasat.
  2. Soy tükenmesi kemik iliği hücrelerinin üreticinin yönergelerini izleyerek bir fare soy tükenmesi kit kullanarak gerçekleştirin.
  3. Hücre yüzey işaretleyicileri ilgi karşı antikor içeren hücreler açıklanan7kuluçkaya. Resim 1 resim 2görüldüğü deneylerde antikorlar Sca-1, Kit, Flt3 ve lineage (LIN) işaretleri Mac1, Gr1, CD3e, B220 ve Ter119 için kullanılır.
  4. 2.000-20.000 Lin- Sca1 sıralama+Seti+ Flt3- hücreleri (HSCs) veya Lin-Sca1-Seti+ hücrelere 1,5 mL Eppendorf tüpleri 0.1 mL fosfat içeren (HPs) arabelleğe alınmış serum %2 fetal sığır (PBS) Serum (FBS).
    Not: Resim 1 ve Şekil 2gösterilen veri için akış sitometresi ile 70 µM başlığı kullanarak hücreleri sıralanmış. 1.4 mL en fazla toplama birimdir.

2. numune hazırlama

Not: Bu adım önemlidir. Örnek çok dikkatli bir şekilde işlemek. Süpernatant kaldırırken, hücre Pelet değil rahatsız etmek için dikkatli olun.

  1. Santrifüj 1.5 mL tüpler, sallanan bir kova rotor 4 ° C'de sıralanmış hücreleri içeren hücreden süpernatant ile yaklaşık 100 µL hariç hepsi 5 dk. Kaldır 500 x g cips çok nazikçe bir pipet ve 20 µL damlalıklı bahşiş kullanarak. Pelet rahatsız etmeyin.
    1. Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve sıralanmış örnek hacmi az 0.2 mL ise, hücreleri ilk düşük bağlama 0.2 mL PCR tüpleri Santrifüjü önce aktarın.
    2. Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve birim 0.2 mL den fazla ise, spin 5 min için bir santrifüj-4 ° c, 500 x g, ile aşağı hücreleri ve tüm 200 µL süpernatant, kaldırın. Kalan 200 µL süpernatant, in pelleted hücreleri yeniden askıya sonra hücreleri 0.2 mL PCR tüpleri için aktarmak ve spin aşağı tekrar. Tüm ama 20-30 µL Pelet sonra ikinci spin kaldırmak ve hücreleri yeniden askıya alma.
  2. Tüp süpernatant sol hücrelerde resuspend. Gerekiyorsa, ek PBS % 2 eklemek FBS/PBS (de %2 sığır serum albumin (BSA) kullanabilirsiniz / PBS veya PBS yalnız) bir konsantrasyon 5 elde etmek için x104 5 x 105 hücre/ml.
    Not: hücre sayar kullanım hücreler askıya alma için kullanılan birim tahmin etmek için sitometresi tarafından toplanan.
  3. 2-5 µL yeniden askıya alınan hücrelerin (üreticinin yönergeleri izleyerek) bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre9kullanarak bir doğru hücre konsantrasyonu belirlemek için kullanın.
  4. Bir birimi yeniden askıya alınan hücrelerin hücrelere yeni 1,5 mL tüpler için istediğiniz sayıyı içeren aktarın. Şekil 1' deki deneme için 2.000, 1000 veya 500 HSCs veya HPs transfer edildi. Hücreler için istediğiniz sayıyı Western blot tarafından elde edilen sinyal gücüne bağlıdır ve ampirik olarak belirlenir. 20 µL veya 100 µL Eppendorf pipet ucu kullanarak aktarımı gerçekleştirmek.
  5. Bir sallanan kova rotor 4 ° c, 500 x g, 5 min için hücrelerde santrifüj kapasitesi.
  6. 100 x hisse senedi çözümler üretmek için üreticinin yönergelerine göre proteasome ve fosfataz inhibitörleri olarak DMSO geçiyoruz.
  7. 2 x Laemmli örnek arabellek distile su eşit miktarda ile yapılabileceği 4 x Laemmli örnek arabellek sulandrarak hazırlayın. 2 x inhibitörleri 2 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri 100 x stokunun uygun bir miktarda ekleyin.
    Not: 2 x Laemmli örnek arabellek önceden yapılabilir, ama proteasome ve fosfataz inhibitörleri hemen ve 2 x Laemmli örnek arabellek (plus inhibitörleri) hücre Pelet hücreleri, koşullar için açıklandığı gibi eklemeden önce aşağıdaki adımda eklenmelidir.
  8. Dikkatli bir şekilde hücre Pelet ve hücre Pelet ile tüp içinde kalan süpernatant için süpernatant bir bölümünü kaldırmak, 2 x Laemmli örnek arabellek artı 500 son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri eşit bir birim ekleme hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği.
    Not: 20 µL toplam hacmi 2.000 hücrelerde Pelet süpernatant ile 18 µL kaldırmalısınız hücreleri (adım 2.6) centrifuging sonra adım 2.5, bir tüp ve kalan süpernatant ile 2 µL aktarırsanız Örneğin, (2 µL) eşit hacmi ekleyin 2 x 500 hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için Laemmli örnek arabellek.
  9. Lysate en kısa zamanda üretmek için Pelet resuspend. Bu noktada, örnekleri hemen SDS-sayfa jelleri electrophoresed veya olabilir ek sıvı N2 içinde donmuş ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.

3. Elektroforez

  1. Lysates 95 ° c ısı bloğundaki veya kaynar suda 5 dk için ısı.
  2. 1-40 µL (500 kadar 20.000 hücre eşdeğerleri içeren) lysates, kullanarak standart protokolleri10SDS-sayfa jelleri 100V adlı electrophorese.
    Not: Lysate jel yüklenen hacmi arzu edilen sinyal oluşturmak için gereken hücre sayısı tarafından belirlenir ve ilgi ve antikor kalitesini protein bereket on bağlı olacaktır. Şekil 1 ' deki verileri 2.000, 1000 ve 500 hücre karşılıkları lysate ile elde edilmiştir. Kuyu genişliğini 3 mm için 1,5 mm. 1.5 mm diş olabilir aralığında piyasada bulunan bir tarak makas kullanarak daha geniş dişleri ile kesilmelidir.

4. transfer ve blok

Not: standart protokolleri11takip bir Western blot gerçekleştirin. Belgili tanımlık merdiven burada kısaca özetlenmiştir:

  1. Distile su ile 10 s sonra yıkama membran kısa bir süre için bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran metanol ile pretreat.
  2. Protein SDS-sayfa jel aktarım cihazları üreticisi tarafından sağlanan el kitabındaki yönergeleri takip membran aktarın.
  3. Devri, blok membran ile %5 Sığır serum albumin (BSA) PBST içinde 2 mL (PBS % 0.1 ile ara) standart protokolleri11takip 4 ° C'de gecede.

5. antikor etiketleme

  1. Membran ile antikor gecede 4 ° C'de satıcı tarafından önerilen antikor dilutions kullanarak bir shaker üzerinde kuluçkaya.
    Not: Biz HSCs ve HPs ve karşılık gelen antikor dilutions için doğrulanmış, antikorlar malzemeler tablo gösterilir. Standart prosedürler8kullanarak antikor etiketleme gerçekleştirin.

6. algılama

  1. Membran 3 kez, PBST her makinaya oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
  2. Membran ile Oda sıcaklığında 1 min için geliştirilmiş Kemiluminesan tampon 2 mL kuluçkaya. Üreticinin yönergeleri, veya autoradiography film ve film işlemci aşağıdaki bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri algılayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

500-2000 arıtılmış HSCs ve HPs temsilcisi sonuçlarını resim 1 ve Şekil 2gösterilir. Şekil 1 ' deki β-aktin sinyal az 500 HSCs üzerinden tespit edilebilir ve bir fare kemik iliği HPs saf. Lysates 1.5 mm kuyu yükleme yükleme 3.0 mm kuyu içine daha çok daha güçlü bir sinyal gönderici 500 HPs üretilen unutmayın. Şekil 2 olduğunu EIF4G bir Western blot ve Rps6 fosforilasyon (p-Rps6), hangi her ikisi de protein çeviri12, HSCs içinde düzenlenmesi yer alırlar ve HPs ve stimülasyon kök hücre tarafından olmadan (SCF) vitrofaktör.

Figure 1
Şekil 1: Western Blot β-aktin için lysates ile HSCs ve HPs antikorundan gerçekleştirilen. HSCs Lin-Sca1 tükenmiş lineage fare kemik iliği hücrelerinden sıralanmış+Seti+ Flt3- hücreleri ve HPs edildi Lin-Sca1-Seti+. Hücreleri farklı sayıda hazırlanan Lysates electrophoresed mini cam plakanın ile 1 mm mesafe tutucular kullanılarak hazırlanan % 12 SDS-sayfa jel ile. Leke β-aktin antikor ile sondaj. Lysates 1.5 mm wells (şerit 4-6) ile karşılaştırıldığında 3 mm kuyu içine yüklenen leke 500 2.000 HPs karşılaştırmalı β-aktin sinyalleri gösterir (şerit 1 - 2). 500 hücrelere üzerinden 2.000 Lysates 7-9 yolları doluydu. M, molekül ağırlığı işaretleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: taze izole HSCs ve HPs Western Blot Analizi vitro sitokin kök hücre faktörü (SCF) ile uyarılmış. HPs (FACS) sıralama floresans aktif hücre tarafından arıtılmış, centrifuged, 2'resuspended sayılır, % FBS/PBS, sonra iki tüpler içine bölünmüş. İlk tüp HPs SCF ile teşvik (10 ng/mL) ikinci 37 ° C (+ SCF) ve HPs 5 min için tüp kültürlü için SCF 5 dk yokluğunda (-SCF). Hücreleri sonra centrifuged ve hücre Pelet Laemmli örnek arabellek ile lysed. HSCs saflaştırılmış ve kültür olmadan Laemmli örnek arabellek ile doğrudan lysed. Lysates 1.5 mm kuyu dolu ve % 12'si SDS-sayfa jelleri electrophoresed. Leke uzama Başlatan faktör 4 G (EIF4G), antikorlar ile geliştirilen β-aktin ve fosforile küçük ribozom altbirim S6 (p-Rps6). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Western blot spesifik proteinlerin ve sinyal yolları aktivasyonu dokular veya hücreleri tespit için ortak bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yordam ufak değişiklikler getirerek, biz düzenli olarak 15 farklı proteinler (Malzemeler tablo) 15.000 HSCs ve bazı durumlarda olabildiğince az 500 HSCs olarak tespit edebildik. The Most bu protokolündeki kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde hücreleri sayma, 2) tüpler arası sayısını en aza indirme ve 3) doğrudan Laemmli örnek arabellek içeren hücreleri lysing. Hücre Pelet Laemmli örnek arabelleği ile lysing, biz bu yerine tüm süpernatant hücre Pelet kaldırma ve bunun yerine süpernatant küçük bir hacim içinde tüp yaptı ve eşdeğer eklediyseniz bu Laemmli örnek arabellekte yeniden askıya alma bulundu 2 x Laemmli örnek arabellek hacmi, hücre kaybı önlemek olabilir. Centrifuging sallanan bir kova rotor hücrelerde hücre kaybı riski azalmıştır. Tarak dişleri çıkararak iyi genişliğini azaltarak algılama hassasiyeti geliştirilmiş.

Yordamı bu basit ayarlamalar ile biz tekrarlanabilir sonuçlar 10 - 20 kat daha fazla hücre3,4,5,6, kullanmış olduğu yayımlanan gazetelerde eşdeğer elde başardık 7. Ayrıca, lekesi standart prosedürler13hücreleri az sayıda elde edilebilir bilgi miktarını artırarak, aşağıdaki yeniden kurutma için elimden. Proteinler ilgi algılama yeteneğini antikor ve protein bereket kalitesi ile sınırlı olacaktır. Bu değiştirilmiş teknik hayvanların nadir hücre gruplarından protein verileri elde etmek gerekli sayıda büyük ölçüde azaltacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bildirmek için hiçbir çatışması var.

Acknowledgments

Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 CA149976 (N.A.S) Bu eser desteklenen verin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175, (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30, (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509, (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148, (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122, (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30, (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151, (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics