Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Biochemistry

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Summary

Um padrão ocidental que mancha o protocolo foi otimizado para analisar apenas 500 tronco hematopoiético ou células progenitoras. Otimização envolve cuidado, manipulação da amostra celular, limitando as transferências entre os tubos e lise diretamente as células no buffer de Laemmli sample.

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Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

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Abstract

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células raras, com a medula óssea de rato contendo apenas ~ 25.000 fenotípica longo prazo repopulados a linfócitos. Um protocolo de mancha ocidental foi otimizado e adequado para a análise de um número pequeno de linfócitos (células de 500-15.000). Fenotípicos linfócitos foram purificados, contados com precisão e lysed diretamente no buffer de Laemmli sample. Lisado contendo igual número de células foram analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), e o Borrão foi elaborado e processado seguindo mancha protocolos de padrão ocidental. Usando este protocolo, 2.000-5.000 linfócitos podem ser rotineiramente analisados, e em alguns casos os dados podem ser obtidos de até 500 células, em comparação com as células de 20.000 a 40.000 relatadas na maioria das publicações. Este protocolo deve ser geralmente aplicável a outras células hematopoiéticas e permite a análise de rotina de um número pequeno de células usando os procedimentos padrão do laboratório.

Introduction

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células auto renovadora que podem dar origem a todas as linhagens de sangue. Eles são relativamente raras células na medula óssea, tornando difícil a análises bioquímicas. Abordagens adequadas para a análise de células raras, tais como citometria de fluxo, foram extremamente úteis para quantificar a quantidade relativa de marcadores de superfície celular e proteínas intracelulares. No entanto, a análise de proteínas intracelulares exige o uso de procedimentos de permeabilização celular para permitir o acesso do anticorpo, e nem todos os resumos de superfície de célula sobrevivem nestes procedimentos1,2. Além disso, os anticorpos que discriminem entre proteínas diferentes isoformas ou clivagem produtos muitas vezes não estão disponíveis para citometria de fluxo, e, portanto, os investigadores ainda dependem de borrões ocidentais para determinados tipos de análises.

Análise ocidental do borrão de lisados celulares é um procedimento de rotina na maioria dos laboratórios. Células podem ser purificadas em condições nativas que preservam os epítopos de moléculas de superfície celular, e posteriormente, lisados celulares podem ser preparados e analisados. No entanto, a análise de proteínas em rara célula primária populações por Western blot pode exigir a eutanásia de um grande número de animais para obter células suficientes. Ao fazer pequenos ajustes para vários passos, um protocolo de mancha ocidental convencional foi capaz de detectar proteínas em um número relativamente pequeno de linfócitos (500-15.000, dependendo da proteína de interesse). Os ajustes incluem contando com precisão as células, manipular cuidadosamente o centrifugado, reduzindo as transferências de células entre os tubos para minimizar a perda de células, e lise um número definido de células com uma carga concentrada de buffer contendo Proteassoma e inibidores da fosfatase. Muitos relatórios publicados incluem borrões ocidentais obtidos com 20.000 ou mais linfócitos3,4,5,6,7; Este simples procedimento reduzirá o número de células e animais experimentais necessários para produzir dados equivalentes por entre 4 e 40 vezes. O protocolo visa normalizar os resultados em uma base por célula, ao invés de um controle interno. Isto permite a detecção de globais reduções nos níveis de proteína que podem ser ignorados se dados são normalizados para um controle interno. A importância da normalização em uma base por célula foi descrita para a análise de dados de expressão do gene8, e o mesmo princípio aplica-se a quantificação de proteínas por Western blot. Este protocolo otimizado deve ser útil para qualquer um que precisar analisar um número pequeno de células.

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Protocol

Todos os procedimentos devem ser efectuados de acordo com orientações de cuidados e uso animal institucional. O procedimento foi desenvolvido para a análise de murino tronco e progenitoras células hematopoiéticas (linfócitos e HPs), mas pode ser adaptado para a análise de outras populações de células.

1. fluxo Cytometry isolamento de linfócitos murino e HPs

  1. Colher células-murino da medula óssea, como descrito na literatura6.
    Nota: Nos dados apresentados na Figura 1 e Figura 2, foi colhida da medula óssea de camundongos C57BL/6J.
  2. Execute o esgotamento da linhagem de células de medula óssea usando um kit de depleção de linhagem de rato, seguindo as instruções do fabricante.
  3. Incube as células com anticorpos contra os marcadores de superfície celular de interesse como descrito7. As experiências mostradas na Figura 1 e Figura 2, anticorpos para Sca-1, Kit, Flt3 e marcadores de linhagem (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 e Ter119 são usados.
  4. Classificar a 2.000-20.000 LinSca1+Kit+ Flt3 células (linfócitos) ou LinSca1células Kit+ (HPs) em tubos de Eppendorf 1,5 mL contendo 0,1 mL de fosfato tampão salino (PBS), com 2% de bovino fetal soro (FBS).
    Nota: Para os dados mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células foram classificadas usando um citômetro de fluxo com um bocal de 70 µM. O volume máximo de coleção é 1,4 mL.

2. preparação da amostra

Nota: Este passo é fundamental. Processe a amostra com muito cuidado. Ao remover o sobrenadante, tenha muito cuidado para não perturbar o centrifugado.

  1. Tubos de centrífuga a 1,5 mL contendo células classificadas em um rotor de balde balançando a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min. remover todos, mas aproximadamente 100 µ l do sobrenadante da célula da pelota muito delicadamente, usando uma pipeta e uma ponta da pipeta 20 µ l. Não perturbe a pelota.
    1. Se a amostra contém menos de 5.000 células, e o volume total da amostra classificada é inferior a 0,2 mL, transferi as células primeiro para ligação baixa 0,2 mL da polimerase antes da centrifugação.
    2. Se a amostra contém menos de 5.000 células e o volume é mais do que 0,2 mL, girar as células para baixo com uma centrifugação a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min e remover todos, mas 200 µ l do sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas os restantes 200 µ l do sobrenadante, em seguida, transferir as células para os tubos PCR de 0,2 mL e spin para baixo novamente. Remover todas as mas de 20-30 µ l da pelota após a segunda rodada e re-suspender as células.
  2. Ressuspender as células em esquerda sobrenadante no tubo. Se necessário, adicionar adicionais PBS em 2% FBS/PBS (você também pode usar 2% albumina de soro bovino (BSA) / PBS, ou PBS sozinho) para obter uma concentração de 5 x104 a 5 x 105 células/mL.
    Nota: Use a célula conta coletados por citometria para estimar o volume usado para suspender as células.
  3. Use 2 a 5 µ l de células re-suspensas para determinar uma concentração exata de célula usando um contador de célula automatizada (seguindo as instruções do fabricante) ou um hemocytometer9.
  4. Transferi um volume de re-suspensão células contendo o número desejado de células para novos tubos de 1,5 mL. Para o experimento na Figura 1, 500, 1.000 ou 2.000 linfócitos ou HPs foram transferidos. O número desejado de células varia de acordo com a força do sinal obtido por Western blot e é determinado empiricamente. Realize a transferência usando um 20 µ l ou 100 ponta da pipeta Eppendorf µ l.
  5. Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min.
  6. Para gerar 100 x Soluções conservadas em estoque, dissolva inibidores do Proteassoma e fosfatase em DMSO, de acordo com as instruções do fabricante.
  7. Prepare o amortecedor da amostra 2 x Laemmli diluindo o amortecedor da amostra 4 x Laemmli fornecido pelo fabricante com uma quantidade equivalente de água destilada. Adicione uma quantidade apropriada do stock de inibidores do Proteassoma e fosfatase para obter uma concentração final de 2 inibidores de x em tampão de amostra x Laemmli 2 100 x.
    Nota: O amortecedor da amostra x Laemmli 2 pode ser feita com antecedência, mas os inibidores do Proteassoma e fosfatase devem ser adicionados imediatamente antes de adicionar o 2 x Laemmli tampão de amostra (mais inibidores) para o centrifugado para lisar as células, conforme descrito na etapa seguinte.
  8. Cuidadosamente retire uma porção do líquido sobrenadante do centrifugado e o sobrenadante remanescente no tubo com o centrifugado, adicione igual volume de tampão de amostra x Laemmli 2, além de inibidores do Proteassoma e fosfatase a obter uma concentração final de 500 células / µ l em 1 amortecedor da amostra x Laemmli.
    Nota: por exemplo, se você transferir 2.000 células em um volume total de 20 µ l para um tubo na etapa 2.5, após centrifugação das células (passo 2.6), você deve remover 18 µ l do sobrenadante da pelota e a 2 µ l do sobrenadante que resta adicionar um volume igual (2 µ l) de 2 x Laemmli amortecedor da amostra para obter uma concentração final de 500 células / µ l em 1 amortecedor da amostra x Laemmli.
  9. Resuspenda o pellet para gerar o lisado logo que possível. Neste ponto, as amostras podem ser imediatamente electrophoresed através do gel de SDS-PAGE, ou pode ser snap congelado no líquido N2 e armazenado a-80 ° C para uso futuro.

3. eletroforese

  1. Aqueça os lysates em um bloco de calor a 95 ° C ou em água fervendo por 5 min.
  2. Electrophorese 1-40 µ l dos lysates (contendo 500 até 20.000 equivalentes de célula) através do gel de SDS-PAGE em 100V usando protocolos padrão10.
    Nota: O volume de lisado carregado no gel é determinado pelo número de células necessárias para gerar o sinal desejável e dependerá da abundância da proteína de interesse e a qualidade do anticorpo. Os dados na Figura 1 foram obtidos com 2.000, 1.000 e 500 equivalentes de célula de lisado. A largura do poço deve ser na faixa de 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm, os dentes podem ser cortada de um pente comercialmente disponível com dentes mais amplas, com uma tesoura.

4. transferência e bloquear

Nota: Realize um Western blot seguindo protocolos padrão11. As etapas são brevemente descritas aqui:

  1. Pré-tratamento de uma membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno com metanol para 10 s, em seguida, lave a membrana brevemente com água destilada.
  2. Transferi a proteína do gel SDS-PAGE para a membrana, seguindo as instruções do manual fornecido pelo fabricante do aparelho de transferência.
  3. Após transferência, bloquear a membrana com 2 mL de 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBST (PBS com 0.1% Tween) durante a noite a 4 ° C, seguindo protocolos padrão11.

5. anticorpo rotulagem

  1. Incube a membrana com anticorpos num agitador durante a noite a 4 ° C, que usando diluições de anticorpo recomendadas pelo vendedor.
    Nota: A tabela de materiais, os anticorpos, que nós validados para linfócitos e HPs e as diluições de anticorpos correspondentes, são mostrados. Execute o anticorpo rotulagem usando procedimentos padrão8.

6. detecção

  1. Lave a membrana 3 vezes, 5 min para cada lavagem em PBST à temperatura ambiente.
  2. Incube a membrana com 2 mL de tampão de quimioluminescência reforçada por 1 min à temperatura ambiente. Detecta os sinais usando um sistema de imagem seguindo instruções, do fabricante ou filme autoradiografia e processador da película.

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Representative Results

Resultados representativos de 500-2.000 purificada linfócitos e HPs são mostrados na Figura 1 e Figura 2. O sinal de β-actina na Figura 1 pode ser detectado de apenas 500 linfócitos e HPs purificado da medula óssea de um rato. Observe que os lysates de carregamento em poços de 1,5 mm produzido um sinal mais forte de 500 HPs de carregamento em poços de 3,0 mm. A Figura 2 é um Western blot de EIF4G e a fosforilação de Rps6 (p-Rps6), ambos os quais estão envolvidos na regulação da tradução da proteína12, em linfócitos e no HPs com e sem estimulação de células-tronco do fator (SCF) em vitro.

Figure 1
Figura 1: Western Blot para β-actina realizada com lysates de murino linfócitos e HPs. Linfócitos foram classificados de células de linhagem empobrecida murino medula óssea como Sca1 Lin+Kit+ Flt3 células e HPs foram Sca1 LinKit+. Lisados, preparados a partir de diferentes números de células foram electrophoresed através de um gel de SDS-PAGE 12% preparado usando placas de vidro mini com espaçadores de 1 mm. O Borrão foi sondado com anticorpo de β-actina. O Borrão mostra os sinais de β-actina comparativa de 500 a 2.000 HPs quando os lysates foram carregados em poços de 1,5 mm (faixas 4-6) em comparação com poços de 3mm (faixas 1 - 2). Lisados de 2.000 a 500 células foram carregados em pistas de 7 a 9. M, marcadores de peso molecular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise ocidental do borrão de linfócitos recém isolados e HPs estimulada em vitro com as citocinas, fator de células-tronco (SCF). HPs foram purificados por célula de fluorescência ativada classificação (FACS), centrifugados, resuspended em 2% FBS/PBS, contado, então dividida em dois tubos. O HPs no primeiro tubo foram estimulado com SCF (10 ng/mL) por 5 min a 37 ° C (+ SCF) e HPs no segundo tubo foram cultivados por 5 min na ausência do SCF (-SCF). As células foram então centrifugadas e o sedimento celular lysed com amortecedor da amostra Laemmli. Linfócitos foram purificados e lysed diretamente com amortecedor da amostra Laemmli sem cultivo. Os lisados foram carregados em poços de 1,5 mm e electrophoresed através do gel de SDS-PAGE 12%. O Borrão foi desenvolvido com anticorpos contra o factor de alongamento iniciando 4G (EIF4G), β-actina e fosforilada Ribossoma pequena subunidade S6 (p-Rps6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Mancha ocidental é uma técnica comum para detecção de proteínas específicas e a ativação das vias de sinalização em tecidos ou células. Através da introdução de pequenos ajustes para um procedimento comumente utilizado, fomos capazes de detectar rotineiramente 15 diferentes proteínas (Tabela de materiais) em 15.000 linfócitos e em alguns casos em até 500 linfócitos. The Most passos críticos no presente protocolo são: 1) com precisão contando as células, 2) minimizando o número de transferências entre os tubos e 3) lise das células diretamente com Laemmli amortecedor da amostra. Quando lise o centrifugado com amortecedor da amostra Laemmli, descobrimos que ao invés de retirar todo o sobrenadante o centrifugado e re-suspenso em Laemmli Sample Buffer, se em vez disso deixamos um pequeno volume de sobrenadante no tubo e adicionado um equivalente volume de 2 x Laemmli Sample Buffer, poderíamos evitar perda de célula. Centrifugação as células em um rotor de balde oscilante também diminuiu o risco de perda de célula. Reduzindo a largura do poço por aparar os dentes do pente melhorou a sensibilidade da deteção.

Com esses ajustes simples para o procedimento, fomos capazes de obter resultados reprodutíveis equivalentes àquelas em artigos publicados que tinham usado a 10 - 20 vezes mais células3,4,5,6, 7. Além disso, as manchas podem ser despojadas para a re-mancha seguindo os procedimentos padrão13, aumentando a quantidade de informação que pode ser obtida a partir de um pequeno número de células. A capacidade para detectar proteínas de interesse será limitada pela qualidade do anticorpo e a abundância de proteínas. Esta técnica modificada deve reduzir significativamente o número de animais necessários para obter dados de proteína de populações de células raras.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.

Acknowledgments

Institutos nacionais de saúde conceder R01 CA149976 (distante) com suporte a este trabalho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

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References

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