पेरिनेरियल आक्रमण के Vivo Murine Sciatic तंत्रिका मॉडल में एक

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

हम sciatic तंत्रिका में syngeneic अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं इंजेक्शन द्वारा पेरिनेरियल आक्रमण के vivo murine मॉडल में एक का वर्णन । मॉडल तंत्रिका आक्रमण की हद के ठहराव के लिए अनुमति देता है, और सेलुलर और पेरिनेरियल आक्रमण के आणविक तंत्र की जांच का समर्थन करता है ।

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Deborde, S., Yu, Y., Marcadis, A., Chen, C. H., Fan, N., Bakst, R. L., Wong, R. J. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (134), e56857, doi:10.3791/56857 (2018).

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Abstract

कैंसर की कोशिकाओं को एक प्रक्रिया पेरिनेरियल आक्रमण (्नि), जिसमें कैंसर कोशिकाओं पैदा करना और तंत्रिका microenvironment में विस्थापित के माध्यम से नसों पर आक्रमण । आक्रमण के इस प्रकार के कैंसर के प्रकार की एक किस्म द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, और बहुत बार अग्नाशय के कैंसर में पाया जाता है । माउस अग्ंयाशय के भीतर तंत्रिका तंतुओं के सूक्ष्म आकार orthotopic murine मॉडल में ्नि मुश्किल का अध्ययन renders । यहां, हम ्नि के वीवो मॉडल में एक heterotopic का वर्णन है, जहां हम H7 murine तंत्रिका में syngeneic अग्नाशय के कैंसर सेल लाइन Panc02-sciatic सुई । इस मॉडल में, anesthetized चूहों की sciatic नसों को उजागर कर रहे हैं और कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन । कैंसर की कोशिकाओं के इंजेक्शन के बिंदु से रीढ़ की हड्डी की ओर समीपस्थ नसों में आक्रमण । हमला sciatic नसों तो निकाले जाते है और जमे हुए अनुभाग के लिए OCT के साथ कार्रवाई की । एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इन वर्गों के दाग दोनों के ठहराव की डिग्री आक्रमण और प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की अनुमति देते हैं । इस मॉडल को अपनी बहुमुखी प्रतिभा दी ्नि पर अध्ययन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है । विभिंन आनुवंशिक संशोधनों और/या कैंसर कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के साथ चूहों का उपयोग सेलुलर और ्नि के आणविक तंत्र की जांच के लिए और विभिंन प्रकार के कैंसर के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, तंत्रिका आक्रमण पर चिकित्सकीय एजेंटों के प्रभाव इन चूहों के लिए उपचार लागू करने के द्वारा अध्ययन किया जा सकता है ।

Introduction

नसों एक विशिष्ट ट्यूमर microenvironment है कि कैंसर के विकास और प्रवासन1,2,3उत्तेजित करता है । पेरिनेरियल आक्रमण (्नि) प्रक्रिया है जिसके माध्यम से कैंसर कोशिकाओं में और नसों के आसपास आक्रमण । यह मेटास्टेसिस के एक अनूठे मार्ग के रूप में माना जा सकता है के बाद से कैंसर आक्रमण मूल की साइटों से दूर नसों के साथ फैली हुई है । ्नि अग्नाशय, प्रोस्टेट, सिर और गर्दन, लार, ग्रीवा, और एक 22% से १००%1,2से लेकर घटना के साथ कोलोरेक्टल कैंसर सहित कई प्रकार के कैंसर में पाया जाता है । ्नि दर्द के साथ जुड़ा हुआ है और गरीब पूर्वानुमान और बदतर जीवित रहने की दर1,2के साथ संबद्ध है ।

पेरिनेरियल आक्रमण के मॉडल का विकास इस प्रक्रिया के सेलुलर और आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है, और ्नि कमी करने के लिए उंमीदवार चिकित्सकीय एजेंटों का परीक्षण करने के लिए । इन विट्रो में कैंसर और नसों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के तरीकों सह तंत्रिका explants4के साथ कैंसर कोशिकाओं की संस्कृति, पृष्ठीय रूट ganglions के साथ5,6,7, या विशिष्ट कोशिकाओं के साथ शामिल तंत्रिका microenvironment से ऐसे Schwann कोशिकाओं के रूप में7vivo में दृष्टिकोण, तथापि, और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, कैंसर माउस मॉडल जिसमें कैंसर प्रेरित किया गया है या प्रत्यारोपण और पूरे तंत्रिका microenvironment के लिए लेखांकन का लाभ है के उपयोग में शामिल हैं । अग्नाशय या प्रोस्टेट कैंसर के orthotopic मॉडलों में ्नि की सूचना दी गई है8,9,10 और ्नि की घटनाएं दर्ज हो सकती हैं, लेकिन उन अंगों में नसों के छोटे आकार की वजह से यह देखना मुश्किल होता है पूरी तंत्रिका और इसलिए ्नि की हद तक बढ़ाता है । हम यहां का वर्णन मॉडल एक सरल शल्य प्रक्रिया11के माध्यम से चूहों के sciatic तंत्रिका में इंजेक्ट कर रहे है जिसमें कैंसर की कोशिकाओं ्नि के एक vivo में मॉडल है । heterotopic प्रत्यारोपण रीढ़ की हड्डी की ओर तंत्रिका के भीतर आक्रमण । रीढ़ की हड्डी के लिए इंजेक्शन की साइट से तंत्रिका आक्रमण की लंबाई मापा जा सकता है, साथ ही तंत्रिका के भीतर कैंसर की मात्रा । महत्वपूर्ण बात, हमला तंत्रिका भी सूक्ष्म सहित परख की एक किस्म के लिए एकत्र किया जा सकता है, और आणविक विश्लेषण । कैंसर कोशिकाओं की एक किस्म का परीक्षण किया जा सकता है, और मेजबान चूहों कि आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है या विशिष्ट यौगिकों के साथ इलाज किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया । इस शक्तिशाली परख कैंसर की कोशिकाओं और मेजबान microenvironment के लिए अनुमति देता है ्नि के तंत्र में जांच के लिए संशोधित किया जाएगा ।

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Protocol

पशु विषयों के साथ प्रक्रियाओं के सभी मेमोरियल Sloan Kettering कैंसर सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. कैंसर की कोशिकाओं को तैयार करना

  1. हार्वेस्ट उप-धाराप्रवाह Panc02-H7 कोशिकाओं ३७ ° c पर 5 मिनट के लिए ०.२५% trypsin के साथ । एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    नोट: कोशिकाएं टी-२२५ कुप्पी में उगाई जाती हैं, जिसमें लगभग 12 x 106 कक्ष होते हैं जिनकी कुप्पी प्रति ८०% पर प्रवाहित होती है और 4 मिलीलीटर trypsin/कुप्पी का उपयोग किया जाता है ।
  2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर x ९०० g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पैंड द्वारा कोशिकाओं को धो (ऊपर और नीचे दो बार pipetting द्वारा), और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पर बर्फ पर निलंबन स्थानांतरण ।
  3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर x ९०० g पर फिर से कोशिकाओं को केंद्रापसारक, और गोली परेशान बिना supernatant त्यागें । इंजेक्शन तक बर्फ पर छर्रों कोशिकाओं रखें.

2. चूहे और सर्जरी की तैयारी

नोट: 8-सप्ताहीय, नर और मादा C57BL/6J चूहों का उपयोग इस अध्ययन में किया जाता है. सर्जरी की स्थिति हमारे संस्थान के IACUC नियमों का पालन करती है । उपकरण निष्फल रहे हैं, शल्य कार्य सतह संक्रमित है, पशु संक्रमित है और सर्जन बाँझ दस्ताने पहनता है ।

  1. शल्य चिकित्सा से पहले दिन पर, anesthetize 2% isoflurane का उपयोग कर माउस और फिर या तो एक पतली उस्तरा या एक रासायनिक बालों को हटाने एजेंट के साथ पृष्ठीय पक्ष पर फीमर की लंबाई के साथ फर हटा दें ।
  2. शल्य चिकित्सा के दिन, anesthetize एक प्रेरण कक्ष में 2% isofluorane का उपयोग चूहों । एक पैर की अंगुली चुटकी उत्तेजना और प्रतिक्रिया की कमी से anesthetization की पुष्टि करें ।
  3. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  4. अपने ventral पक्ष पर anesthetized माउस प्लेस, और धीरे hypoallergenic टेप के साथ एक अंग को सुरक्षित अंग में हल्के तनाव पैदा करने के लिए इंजेक्शन हो । संज्ञाहरण एक सटीक vaporizer और नाक शंकु के माध्यम से दिया isoflurane का उपयोग कर बनाए रखा है ।
  5. Betadine के साथ इंजेक्शन साइट साफ है, तो फिर ७०% शराब के साथ । इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं । सुनिश्चित करें कि कोई ढीला बाल शल्य क्षेत्र पर रहता है ।
  6. नीचे 2 मिमी के बारे में छोटी कैंची के साथ एक 1 सेमी चीरा और फीमर के समानांतर बनाओ । बाद में नीचे की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए संदंश के साथ त्वचा को वापस लेना ।
  7. sciatic तंत्रिका gluteus maximus और मछलियां femoris मांसपेशियों को गहरी चलाता है । छोटे कैंची के साथ एक fascial विमान के साथ इन दो मांसपेशियों को अलग और नीचे sciatic तंत्रिका बेनकाब । आसपास की मांसपेशियों से तंत्रिका कुंद विच्छेदन का उपयोग कर मुक्त ।
  8. आकर्षित 3 कैंसर कोशिकाओं के μL (के बारे में ५०,००० कोशिकाओं) एक 10 μL सिरिंज में गोली से ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक नियंत्रण के रूप में पंजाब के 3 μL आकर्षित ।
  9. समर्थन के लिए इंजेक्शन के बिंदु पर तंत्रिका के नीचे एक छोटे से धातु रंग प्लेस । एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ दृश्य के तहत, धातु आधार के खिलाफ तंत्रिका में सुई डालें, प्रविष्टि पर संभव के रूप में तंत्रिका के समानांतर के रूप में सुई रखते हुए । तंत्रिका के पीछे के माध्यम से पंचर नहीं के रूप में सावधान रहना । इस प्रक्रिया के दौरान जितना संभव हो सके तंत्रिका की हैंडलिंग को कम करें ।
  10. धीरे 5 एस पर तंत्रिका में इंजेक्षन । इंजेक्शन क्षेत्र में एक बल्ब का एक गठन एक अच्छा इंजेक्शन इंगित करता है । फिर सुई धीरे से हटाने से पहले 3 एस के लिए जगह में सुई छोड़ दें । 3 एस के लिए जगह में सुई रखते हुए तंत्रिका के बाहर कोशिकाओं के backflow को कम करता है ।
    नोट: इंजेक्शन बाहर तंत्रिका या रीढ़ की हड्डी की ओर किया जा सकता है । यह प्रयोगों के एक सेट के भीतर लगातार रहने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कोशिकाएं बाहर बिखेर दें तो प्रयोग के विश्लेषण में पशु को शामिल नहीं किया जाना चाहिए । अनुभव के साथ, इन घटनाओं बहुत दुर्लभ हैं ।
  11. अपनी मूल स्थिति के लिए तंत्रिका वापस । अधिक मांसपेशियों के साथ तंत्रिका कवर । उचित analgesia के साथ चूहों का इलाज, और फिर 5-0 नायलॉन टांके के साथ त्वचा को बंद करें ।
  12. वसूली के दौरान अवलोकन के लिए एक साफ पिंजरे में अकेले माउस प्लेस, जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से जागता है ।
    नोट: यह पशु पूर्ण चेतना हासिल करने के लिए 5-15 मिनट लगते हैं । पशु उपेक्षित छोड़ दिया जब तक यह पर्याप्त चेतना को कड़ी recumbency बनाए रखने के लिए आ गया है नहीं है । पशु पूरी तरह से बरामद होने तक अन्य पशुओं की कंपनी में नहीं लौटा है । इसके बाद, ७२ ज के लिए हर 24 ज में कम से कम एक बार वसूली का मूल्यांकन करें ।

3. Sciatic तंत्रिका निष्कर्षण

  1. postop दिन #7 पर, euthanize2के साथ चूहों । अपने ventral ओर माउस प्लेस, और पिन का उपयोग कर बाहर के अंगों को स्थिर ।
  2. इंजेक्शन अंग और धड़ के पृष्ठीय पक्ष पर त्वचा को हटा दें ।
  3. कुंद विच्छेदन का प्रयोग, sciatic मांसपेशियों को गहरी तंत्रिका बेनकाब ।
  4. इलीयुम और त्रिकास्थि के बीच तंत्रिका पाठ्यक्रमों । रीढ़ की हड्डी क्षेत्र में तंत्रिका के लिए उपयोग किया है, दो हड्डियों को अलग । पहले संकरे क्षेत्र में बंद कैंची डालें जहां sciatic तंत्रिका स्थित है और फिर माउस पकड़ जबकि कैंची खुला । नाजुक हो और विच्छेदन के दौरान sciatic तंत्रिका की अखंडता को बनाए रखने ।
  5. ध्यान से फीमर के अंत तक sciatic तंत्रिका काटना, और समीपस्थ रीढ़ की हड्डी के लिए ।
  6. नोट: हमला नसों अत्यंत नाजुक और तनाव या सशक्त हैंडलिंग के तहत तोड़ने के लिए प्रवण हैं ।
  7. पहले अपने बाहर का अंत काटने से तंत्रिका फसल । ध्यान से तंत्रिका लिफ्ट जबकि आसंन ऊतक से मुक्त । समीपस्थ अंत में तंत्रिका काट, के रूप में रीढ़ की हड्डी स्तंभ से बाहर निकलने के लिए संभव के रूप में बंद ।
  8. रिकॉर्ड तो एक Vernier कैलिपर का उपयोग कर आक्रमण की सकल लंबाई । यह macroscopic अनुमान ही संकेत है.

4. तंत्रिका प्रसंस्करण और ठहराव

  1. अक्टूबर यौगिक में विच्छेदित तंत्रिका एंबेड । बनाने के लिए नसों longitudinally और संभव के रूप में मोल्ड के तल पर फ्लैट के रूप में जगह सुनिश्चित करें ।
  2. कैसेट पर संकेत समीपस्थ और तंत्रिका के बाहर की ओर पत्र पी और डी अंकन द्वारा ।
  3. सूखी बर्फ के शीर्ष पर जगह एंबेडेड नसों, अगर वे तुरंत खोदी नहीं हैं । नमूना-८० ° c कई हफ्तों के लिए संरक्षित किया जा सकता है ।
  4. 5 माइक्रोन मोटाई और ग्लास स्लाइड पर जगह वर्गों में एक Cryostat microtome का उपयोग कर अनुभाग नमूने. यदि संभव हो, प्रति स्लाइड 2 तंत्रिका वर्गों फिट । तंत्रिका के समीपस्थ ओर इंगित करते हैं ।
  5. दाग स्लाइड एच एंड ई का उपयोग कर12
  6. एक स्लाइड-स्कैनर है कि उच्च संकल्प डिजिटल डेटा प्रदान करता है के साथ डिजिटल धुंधला तंत्रिका वर्गों स्कैन ।
  7. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, माप दूरी बटन, आक्रमण के क्षेत्र, या अन्य वांछित मापदंडों पर क्लिक करके आक्रमण की लंबाई बढ़ाता है । आक्रमण की लंबाई का एक अच्छा आकलन के लिए, एक ही तंत्रिका के कई वर्गों (2 से 4) का उपयोग करें ।

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Representative Results

इस विधि murine sciatic तंत्रिका में अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं के सर्जिकल आरोपण का वर्णन करने के लिए quantifiable तंत्रिका आक्रमण के vivo में मॉडल बनाने के लिए । चित्रा 1 sciatic तंत्रिका और इंजेक्शन की साइट के संरचनात्मक स्थान को दर्शाता है । चित्रा 2 एक नग्न माउस के दो sciatic नसों से पता चलता है. एक पंजाबियों इंजेक्शन तंत्रिका (बाएं) एक तंत्रिका MiaPaCa-2 कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन की तुलना में किया जा सकता है (दाएं) । तंत्रिका कैंसर की कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन ट्यूमर से घुसपैठ की है, और लगता है दोनों मोटा और गहरे रंग की तुलना में पंजाब के साथ इंजेक्शन तंत्रिका ।

चित्रा 3 जंगली प्रकार और NCAM KO चूहों में अग्नाशय के कैंसर सेल Panc02H7 द्वारा sciatic तंत्रिका आक्रमण के quantifiable मतभेद से पता चलता है । NCAM KO चूहों चूहों जिसमें आसंजन अणु तंत्रिका-कोशिका आसंजन अणु 1 की कमी है13। लंबाई और आक्रमण के क्षेत्र इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर quantified गया है । आक्रमण काफी NCAM KO7चूहों में कम पाया गया था ।

Figure 1
चित्र 1 : माउस sciatic तंत्रिका और इंजेक्शन की साइट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक चूहे की दो विच्छेदित sciatic नसों । एक पंजाबियों इंजेक्शन तंत्रिका (बाएं) और एक तंत्रिका MiaPaCa-2 कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन (दाएं) दिखाया जाता है । काले तीर इंजेक्शन की साइट दिखाते हैं ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : एच एंड ई sciatic नसों के अनुदैर्ध्य वर्गों जंगली प्रकार और NCAM KO चूहों में Panc02H7 कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन । सफेद तीर इंजेक्शन और रीढ़ की हड्डी के समीपस्थ पक्ष की साइट से संकेत मिलता है । काले तीर इसी मूल्यों (मिमी) के साथ आक्रमण की लंबाई से संकेत मिलता है । स्केल बार: 5 मिमी (शीर्ष छवियां) और ०.२ mm (नीचे छवियां) । तंत्रिका आक्रमण के ठहराव, के रूप में लंबाई और आक्रमण के क्षेत्र से मापा । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसडी. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), * * p < ०.००५, * * * p < ०.०००५ t परीक्षण का उपयोग कर । (Deborde एट अल., २०१६7से परिणाम) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम पेरिनेरियल आक्रमण है कि अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं द्वारा sciatic तंत्रिका आक्रमण के ठहराव के लिए अनुमति देता है की vivo murine मॉडल में एक का वर्णन । इस मॉडल तंत्रिका आक्रमण के आणविक तंत्र के अध्ययन में सक्षम बनाता है । इस तकनीक का उपयोग कर सफल प्रयोगों प्रक्रिया में तीन महत्वपूर्ण कदम के लिए एक सावधान दृष्टिकोण की आवश्यकता: 1) कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन (कदम २.७, २.८), 2) आक्रमण नसों की निष्कर्षण (चरण ३.४), और 3) काटा नसों के प्रसंस्करण (कदम ४.१) ।

इंजेक्शन तंत्रिका की पीठ की दीवार के माध्यम से puncturing से बचने के लिए बड़ी सावधानी के साथ किया जाना चाहिए, जो कैंसर की कोशिकाओं की हानि की ओर जाता है । एक बार सुई जगह में है, इंजेक्शन एक धीमी और स्थिर गति पर किया जाना चाहिए 5 एस पर कैंसर कोशिकाओं को भी दूर इंजेक्शन के बिंदु से आगे पहुंचाने से हाइड्रोलिक बल को रोकने के लिए । एक अतिरिक्त 3 एस के लिए इंजेक्शन के बाद तंत्रिका में सुई छोड़ वापस प्रवाह और कैंसर सेल रिसाव को कम करेगा । sciatic तंत्रिका निष्कर्षण के दौरान, विच्छेदन बहुत कोमल होना चाहिए के रूप में हमला sciatic तंत्रिका बहुत नाजुक है । कैंसर आक्रमण sciatic तंत्रिका के सामांय सेलुलर संगठन बाधित । हालांकि हमला नसों गैर इंजेक्शन या गैर हमला नसों की तुलना में व्यास में और अधिक मोटा होना दिखाई देते हैं, वे और भी मामूली खींच और हेरफेर के साथ तोड़ने के लिए प्रवण हैं । प्रसंस्करण के लिए OCT में उत्पादेड तंत्रिका की embedding के दौरान, यह है कि तंत्रिका मोल्ड पर पूरी तरह से फ्लैट रखी है बीमा करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । यह कदम नमूने के अनुभागीय उचित विश्लेषण के लिए तंत्रिका की पूरी लंबाई पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है । तंत्रिका पर ठोस ट्यूमर अक्सर करने के लिए मोल्ड के नीचे से तंत्रिका स्थापना से ट्यूमर के कारण समीपस्थ तंत्रिका खंड को रोकने के छंटनी की जरूरत है । तंत्रिका की पूरी लंबाई मोल्ड के खिलाफ पूरी तरह से फ्लैट रखा जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय कई संशोधनों पर विचार किया जा सकता है । जब एक छोटे धातु रंग sciatic तंत्रिका के तहत रखा जा करने के लिए उपलब्ध नहीं है, चौड़े संदंश की एक जोड़ी की सतह के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । एक संदंश को प्रविष्टि के बाद जगह में सुई पकड़ इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इस दृष्टिकोण के नकारात्मक पक्ष इंजेक्शन और तंत्रिका को कुचलने की क्षमता का एक कम दृश्य है अगर अत्यधिक बल प्रयोग किया जाता है । एक और तरीका है एक ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए तंत्रिका उठा, तो संदंश खोलने के लिए नसों खिंचाव । इस विधि को क्रियांवित करने के लिए आसान है और इंजेक्शन के दौरान तनाव और स्थिरीकरण दोनों प्रदान करता है, लेकिन तंत्रिका की अत्यधिक खींच के साथ तंत्रिका नुकसान हो सकता है । इंजेक्शन या तो एक समीपस्थ या बाहर की दिशा में किया जा सकता है, लेकिन हमने पाया है कि दोनों ही मामलों में, कैंसर के आक्रमण की दिशा आमतौर पर रीढ़ की हड्डी की ओर है । इसलिए, हम लंबे इंजेक्शन के लिए आगे हाइड्रोलिक बल कि रीढ़ की हड्डी की ओर कैंसर कोशिकाओं को धक्का कर सकते है कम करना पसंद करते हैं, और बाद में आक्रमण की लंबाई के उपाय पाया । हम सलाह है कि यह प्रयोग के एक सेट के भीतर इंजेक्शन की दिशा के चुनाव में संगत होना जरूरी है ।

हालांकि हम syngeneic भ्रष्टाचार का एक मॉडल वर्तमान, एक समान तकनीक immunodeficient चूहों में मानव कैंसर कोशिकाओं xenografts के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, केवल मामूली बदलाव के साथ । Xenografts नग्न चूहों में कैंसर के आक्रमण की लंबी अवधि की आवश्यकता के लिए syngeneic मॉडल के रूप में तंत्रिका आक्रमण के समान लंबाई उपज हो सकता है । अलग कैंसर सेल लाइनों भी इस्तेमाल किया जा सकता है । ्नि अग्ंयाशय के कैंसर में ही प्रचलित नहीं है, लेकिन यह भी सिर और गर्दन, प्रोस्टेट, और त्वचा के कैंसर के । हमारी प्रयोगशाला सफलतापूर्वक मानव अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों MiaPaCa-2 और Panc17,14,15के साथ sciatic तंत्रिका में नग्न चूहों इंजेक्शन है ।

संभव प्रतिकूल घटनाओं में शामिल घाव dehiscence, के रूप में चूहे कभी-कभार उनके टांके घाव के खुलने में जिसके परिणामस्वरूप चबाना । उस मामले में, घाव फिर से सिले करने की आवश्यकता होगी । हम पहले 3 के बाद ऑपरेटिव दिन के लिए घाव की जांच दैनिक । चूहों को भी एक मामूली लंगड़ा के साथ चल सकता है, दोनों शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के साथ ही कैंसर के साथ अपने sciatic तंत्रिका के आक्रमण की संभावना की वजह से दर्द । यह आमतौर पर गंभीर को दर्द की दवा की आवश्यकता नहीं है ।

इस मॉडल की सीमाएं हैं । खींच और प्रक्रिया के दौरान तंत्रिका की चुटकी के कुछ राशि तंत्रिका में नुकसान पैदा कर सकता है । इसके अलावा, यह तंत्रिका में जा रहा कोशिकाओं की सही संख्या को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, इस मॉडल है कि पहले से ही नसों पर हमला किया है कोशिकाओं के अध्ययन तक ही सीमित है । यह प्राथमिक ट्यूमर में स्थित कैंसर कोशिकाओं के साथ नसों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल नहीं है । जठरांत्र संबंधी मार्ग की नसों बनाम sciatic नसों का उपयोग कर के मुख्य नुकसान यह है कि sciatic तंत्रिका अग्नाशय के कैंसर का एक मेटास्टेटिक साइट नहीं है । संरचना और तंत्रिका तंतुओं की प्रकृति में अंतर आक्रमण को प्रभावित कर सकता है । हालांकि, अग्नाशय नसों की पहुंच और बहुत छोटे आकार इस तरह के एक अध्ययन की अनुमति नहीं होगी ।

हमारे शुरुआती के लिए महत्वपूर्ण सुझाव के लिए योजना बनाई चीरा साइटों के आसपास एक व्यापक क्षेत्र में बालों को दूर करने के लिए इतना है कि स्थलों को आसानी से पहचाना जा सकता है और इंजेक्षन करने के लिए शुरुआत से पहले एक स्थिर स्थिति है सुनिश्चित करने के लिए किया जाएगा । कई इंजेक्शन के बाद, कलाकार तंत्रिका आक्रमण के साथ पशुओं के १००% पाने के लिए सक्षम होना चाहिए ।

इस मॉडल के अध्ययन के लिए अनुमति देता है एक पशु मॉडल में कैंसर और नसों के बीच बातचीत । यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, कैंसर की कोशिकाओं, या दोनों का उपयोग करके oncologic अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है । नसों के साथ ट्यूमर के आक्रमण के खिलाफ औषधीय उपचार भी लंबाई और उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच आक्रमण के क्षेत्र की तुलना द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । इन विभिंन संभव अनुप्रयोगों के इस मॉडल ्नि अध्ययन के लिए एक अत्यंत बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

लेखक आणविक cytology सुविधा और मेमोरियल Sloan Kettering कैंसर केंद्र की पशु सुविधा द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सेवाओं को स्वीकार करते हैं । यह काम NIH अनुदान CA157686 (R.J. वोंग) और P30 CA008748 (मेमोरियल Sloan Kettering कैंसर सेंटर सहायता अनुदान) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) Any Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL Falcon 352098 Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL Axygen MCT-150-C-S Step 1.2
Electric razor WAHL 9962 Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL Baxter 1001936060 Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape 3M Blenderm 70200419342 Step 2.3
Betadine Swapsticks PDI SKU 41350 Step 2.4
Webcol Alcohol Preps Covidien 5110 Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps) Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe Hamilton 80308 Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula Fisher Scientific S50823 Step 2.7
Dissecting microscope Step 2.7
Bupivacine, 1 g Enzo Life Sciences BML-NA139-0001 Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture Ethicon 698H Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds VWR 25608-916 Step 4.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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