Анализ одной ячейки Microfluidic Сенная палочка

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы представляем метод для анализа microfluidic индивидуальных бактериальных клеток линий с помощью Сенная палочка в качестве примера. Этот метод преодолевает недостатки традиционных аналитических методов в микробиологии, позволяя наблюдения сотни поколений клеток в условиях роста плотно контролируемым и единообразной.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cabeen, M. T., Losick, R. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (131), e56901, doi:10.3791/56901 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microfluidic технология преодолевает многие ограничения традиционных аналитических методов в микробиологии. В отличие от методов массовой культуры он предлагает резолюции одноклеточных и длительного наблюдения раз охватывающих сотни поколений; в отличие от агарозы микроскопии основанные на площадку он имеет условия форма роста, которые могут быть жестко контролируется. Потому что непрерывный поток роста средних изолирует клетки в microfluidic устройство от непредсказуемых колебаний в местной химической среде, вызванных рост клеток и метаболизм, подлинные изменения в экспрессии генов и рост клеток в ответ на конкретные стимулы могут наблюдаться более уверенно. Сенная палочка используется здесь как модель бактериального вида продемонстрировать машину «мать»-метод для клеточного анализа типа. Мы покажем, как построить и отвес microfluidic устройства, загрузить его с клетками, инициировать микроскопических изображений и разоблачить клетки на раздражитель путем переключения от одного роста среднего в другой. Стресс отзывчивым репортер используется в качестве примера для выявления типа данных, которые могут быть получены этим методом. Мы также кратко обсудить применение этого метода для другие виды экспериментов, например анализ Бактериальное заспорение.

Introduction

Одна из самых ярких особенностей жизни на земле является его большой устойчивостью и разнообразие. Центральная цель молекулярной биологии — понять логику, в которой клетки используют генов и белков для максимизации их роста и фитнес под широкий спектр условий окружающей среды. Для достижения этой цели, ученые должны уметь уверенно наблюдать как отдельные клетки растут, разделить и выразить свои гены под заданный набор условий, отметив, как клетки отвечают на последующие изменения в их среде. Однако традиционные аналитических методов в микробиологии имеют технические ограничения, которые влияют на типы вопросов, которые могут быть решены. К примеру массовых анализов на основе культуры были весьма полезны с годами, но они предлагают только уровень населения данные, которые могут маскировать значимых в ячейке вариации или поведения меньше суб популяции клеток в общей численности населения. Одноклеточных анализ живых бактерий, основанные на световой микроскопии раскрыть поведение одной ячейки, но также технически ограничены. Бактерии обычно иммобилизованных на агарозы колодки, содержащие среднего роста, но мобильный рост и деление толпы микроскопические видом и истощает имеющиеся питательных веществ после нескольких циклов клеток, существенно ограничивая время наблюдения1, 2. Кроме того местные истощение питательных веществ и сопутствующей накопление метаболических побочных продуктов из-за роста клеток, постоянно меняется окружающей среды рост местной ячейки способами, которые трудно измерить или предсказать. Такие экологические изменения, используя агарозы колодки представляют собой вызов для исследования поведения стационарном или клеточных реакций на конкретные изменения в условиях роста3.

Microfluidic технология, в которой жидкой среде постоянно текла через microfabricated устройства, предлагает решение для классических экспериментальных ограничений. Microfluidic устройство может держать отдельные ячейки в положении для микроскопии клеток, в то время как поток среднего роста постоянно обеспечивает клетки с свежих питательных веществ и смывает метаболических побочных продуктов и избыток клетки, создавая тем самым весьма форма роста окружающей среды. В условиях постоянного роста поведение клеток может наблюдаться в отрыве от влияния экологических факторов, позволяющих беспрепятственный вид внутренней логики клеток. Как потока жидкости microfluidic устройство предотвращает становится переполненном с клетками, наблюдение за одну ячейку линий для десятки или сотни поколений становится возможным4,5. Такие длинные наблюдения раз разрешить обнаружение иначе обнаружить долгосрочный или редкие клеток поведения. И наконец состав среды, которая протекает через устройства могут быть изменены на будет, позволяя клетки, чтобы наблюдать, как они реагируют к возникновению стресса или введения или удаления конкретного соединения.

Микрофлюидика уже пользуется ряд важных приложений. Например он был использован в ткани, орган или орган на чипе устройств, в которых различные типы клеток человека совместно культивируемых для имитации в естественных условиях состояние6; для изучения движения нематод в microstructured средах7; для изучения взаимодействия между бактериальных биопленок (например, 8); и для инкапсуляции и манипуляции крошечные количества клеток или химических веществ (например, 9). Microfluidic приборы также становятся все более популярными в области микробиологии (для отличные отзывы, см. 10 и 11), особенно в их физической и реологические свойства хорошо соответствует12природных микробных ниш. К примеру микрофлюидика недавно работал, микробиологов для таких целей, как точно измеряя клеток рост и деление13,14,15, анализируя возбудителя движения16, мониторинг кворума зондирования17 и18физиологических переходы и для белка подсчета19, среди многих других примеров. Представленные здесь метод разработан специально для анализа линий одного бактериальной клетки, вместо того, чтобы комбинации штаммов или видов. Microfluidic устройство, продемонстрировали здесь использует один из вариантов «мать машина» Дизайн4, в котором клетки выращивают одного файла в окопе microfluidic с одним закрытым концом и один открытый конец; деление и рост клеток толкает потомства клетки и из открытого конца в поток жидкости. Наш анализ обычно сосредоточиться только на ячейку «мать», которая ограничивается на закрытом конце траншеи. Мы рассматриваем этот метод как выдвижение более предыдущих света на основе микроскопии одноклеточных аналитических методов, таких как иммобилизация клеток на агарозы колодки. Хотя B. subtilis используется в качестве модели здесь, метод применим также для других видов бактериальных (кишечная палочка -это еще одна распространенная модель; некоторые виды размеров различных ячеек или морфологии потребуется изготовление новых устройств с различными размерами). Использование флуоресцентных репортеров в ознаменование клетки и визуализировать изменения в экспрессии генов требует использования генетически шансов справиться с возникающими видов; Однако анализ роста клеток и морфология возможны даже без флуоресцентных маркеров.

Настоящий Протокол исключает процесс изготовления кремниевых мастер, с помощью фотолитографии, которая была подробно описана в других5; мастера также может быть легко аутсорсинг от микротехнологий зал. Она включает в себя формования PDMS устройства из армированного кремния мастер; Склеивание устройства на кусок стекла; Сборка microfluidic входе и выходе сантехники, включая щепотку клапанов разрешить средний коммутации; пассивация устройства, подготовке бактериальной клетки и загрузки устройства с бактериальной клетки; установка сантехники на устройство и equilibrating клетки; и загрузка устройства на микроскопом флуоресценции для воображения. Потому что многие приобретения различных изображений и обработки программного обеспечения, инструменты можно использовать для визуализации и анализа данных интерес4,5, пример изображения отображаются, но методы захвата изображения не включаются в этот протокол.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PDMS устройство литья

  1. В среде, свободной от пыли смешать PDMS полимера и отвердителя в соотношении 10:1 и Дега под вакуумом для по крайней мере 10 мин.
  2. Поместите образец кремния (или эпоксидные и полиуретановые реплики) на кусок непрерывной алюминиевой фольги в полистирольные плиты Петри. Залейте дегазацию PDMS смесь мастер на глубину от примерно 5 мм. Дега Петри пластина для по крайней мере 10 минут использования нежный поток воздуха, чтобы сломать поверхности пузырьков.
    Примечание: Размеры используемого устройства двухуровневой предоставляются в сопровождении CAD файла5 (см. дополнительный файл 1). Мастер пластиковые реплики может частично плавать во время дегазации; Если это произойдет, нажмите вниз реплики с чистый пластиковый аппликатор.
  3. Вылечить PDMS по крайней мере 1 часа в духовке при температуре 60 ° C и остыть до комнатной температуры. Удаление алюминиевой фольги, содержащий Мастер и вылечить PDMS от пластины и Петри. Осторожно отделите алюминиевой фольги из задней части мастера, затем тщательно чистить PDMS от мастера.
    Примечание: в качестве альтернативы, PDMS может быть излечен на ночь при комнатной температуре. Относительная уязвимость мастер кремниевой пластины могут быть преодолены с помощью эпоксидный клей окончательно облигаций пластин в 1/16 дюйма-алюминия толщиной диск такого же размера, как пластины.
  4. Как пластины обычно включает в себя несколько microfluidic приборы с немного различных размеров (см. дополнительный файл 1), отрезать одно устройство размером с помощью чистой, острый скальпель.
    Примечание: Для рутинной работы B. subtilis , используйте устройства с 1.0-мкм ширины ячейки траншеи, которые помечены с помощью C или F в сопутствующем файле CAD.

2. устройство перфорации и склеивание

  1. Место кусок полупрозрачного управления ленты (см. Таблицу материалы) над рисунком стороне устройства для повышения видимости функции рисунком. Входные и выходные порты определяются как круговой области на противоположных концах видимой аэрогидродинамических каналов (рис. 1). Для улучшения их видимости при пробивки отверстий в устройства на входе и выходе булавки, Марк впуски и выпуски с точками с помощью острым концом маркера.
    Примечание: Для обеспечения что впускных и выпускных булавки не переполнены, каждый канал пробита, начиная с каналом под Алфавитный указатель для устройства.
  2. Флип PDMS устройство так что узорной сторона вниз и пробить устройства отмеченные точки с помощью биопсии 0,75 мм удар; отказаться от штамповки.
    Примечание: Устройства являются кулаками с узорной стороной вниз, потому что отверстие, порожденных биопсии удар обычно слегка расклешенные где удар входит полимер. Пробивая устройства в Перевернутый ориентации гарантирует, что отверстие на стороне узорной имеет острые границы.
  3. С помощью стереомикроскопом, убедитесь, что перфорированные отверстия совпадают с областями входного и выходного устройства. Использование штраф наконечником пинцеты для удаления любых посторонних фрагменты PDMS из перфорированных отверстий.
  4. Используйте клейкую ленту для удаления пыли с обеих сторон устройства и место в чистой пенополистирольные плиты Петри. Подготовка стекла Обложка 22 x 40 мм смачивания с 100% изопропиловый спирт и трения салфеткой чистых помещений; сухие с потоком пыли воздуха или азота.
  5. Поместите кулаками PDMS устройства функция стороной вверх вместе с очищаемой покровным стеклом в плазме кислород чище.
    1. Плазма лечить устройства со следующими параметрами: вакуум, 70 mTorr; O2 давление, 200 mTorr; продолжительность, 15 s; мощность, 30 Вт сразу же по окончании периода лечения плазмы, удалите устройство и крышка стекла из плазмы чище.
    2. Инвертировать PDMS и поместите его на центр крышки стекла, так что узорной сторона контактов стекла; Убедитесь, что кормления каналов (бег между входным и выходным) выровнены с длинной оси покровным стеклом. Нажмите вниз очень осторожно, для обеспечения того, чтобы PDMS уплотнения против стекла.
  6. Выпекать собрал устройство в духовке для по крайней мере 1 час при температуре 60 ° C. После выпечки, вручную проверьте, что PDMS наклеивания на стекло, осторожно нажав на одном углу устройства.
    Примечание: После того, как устройство тычковой, его следует использовать в течение 24 часов, как полимер будет становиться все более гидрофобных с увеличением времени после плазменной обработки.

3. Microfluidic сантехника подготовка

  1. Вырежьте длины полимерных труб (внутренний диаметр (ID) 0.02 дюймов, внешнего диаметра (OD) 0,06 дюйма) для соответствующей длины, чтобы добраться из шприцевый насос переключения аппарата (если используется) и устройства при монтаже на микроскопе. Вырежьте столько длины как есть microfluidic полос.
  2. Соберите Y узлов для щепотку клапанов (при использовании), резки и присоединение 2-см длины гибкие Силиконовая трубка (0.03 дюймов ID, 0,065 дюйма OD) топ колкостями «Y» и 1-см длины Силиконовая трубка к нижней Барб «Y».
  3. Вырезать 10 см (или необходимости) длины полимерных труб; Соедините их в один конец до перекрестка переключатель, вставив их в 1 см силиконовые трубки сегментов на нижней Барб «Y». Соедините их в другой конец иглы 21G, которые были удалены из их Пластиковый шприц адаптеров и Бент приблизительно 90 ° примерно 9 мм от конца иглы.
  4. 21G тупым иглы соединить один конец трубки сегментов, которые будут выполняться из шприцы для переключения аппарата путем вставки иглы в трубку. Вставьте другие концы каждой длины трубки силиконовые трубки сегментов на входе колкостями Y узлов.
    Примечание: Используйте какой-то аппарат провести щепотку клапанов и развязок на месте; Это можно легко сделать из ящика наконечник микропипеткой (Рисунок 2D).
  5. Вырежьте длины полимерных труб для перевозки отходов от розетки устройства для отходов стакан. Соедините их в один конец для изогнутой иглы 21G, подготовленных как описано выше. Лента на другой конец трубки в отходов стакан.
  6. Подготовить соответствующие объемы средств массовой информации, содержащие 0,1 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА) и заполнить требуемый размер и количество шприцев. Соединить BSA-загружен шприцы подготовлены 21G иглы, прикрепленных к впускной трубы и нагрузки шприцы в шприц насосов.
    Примечание: для типичных экспериментов используются 5 каналов устройства, каждый с 20 мл шприц. Эксперимент, в котором включено средство потребует 2 банки 5 шприцев. Здесь насос, содержащий первый банк называется фаза-1 насос, и насос, содержащий второй банк, с пост переключатель среднего, называется фаза-2 насоса.
  7. Удалите воздух из входе сантехника, запустив шприц насосов на высокий расход потока (> 500 мкл/мин), начала ориентироваться насосы шприц вертикально и выстукивать шприцы довести пузырьков воздуха в верхней. После очистки воздуха от шприцы место шприцевый насос горизонтально и постепенно коснитесь или проведите линии полимеров от шприцы вверх через выключатель аппарат выбить и удалить пузырьки воздуха. Повторите этот процесс для второго банка шприцы (если переключение средств массовой информации).
  8. После того, как удаляются пузырьки воздуха, установить фазы-2 шприцевый насос (т.е., со средой, которая будет использоваться второй, после переключения) до 1,5 мкл/мин, затем приостановить поток. Место небольшой зажимы на сегменты гибкие шланги на ветке Y узлов, соответствующий на втором этапе среднего. Продолжать работать фазы-1 шприцевый насос со скоростью скромный потока (например, 10 мкл/мин) для по крайней мере 30 минут, чтобы удалить второй средней из впускной трубы вниз по течению от перекрестка Y.

4. Подготовка клетки культуры

  1. Растут preculture штамма интерес в требуемой среде на ночь, для неподвижной фазой. Бактериальный штамм должен содержать мутации, которая делает клетки неподвижным, так что клетки не плавать из каналов устройства.
    Примечание: В настоящем Протоколе, бактериальный штамм является B. subtilis 3610 содержащий ведьмаA233V замещения (Эта мутация приводит жгутика прямо, чем винтовой, предотвращая клеток моторику), PrsbV- mNeonGreen Репортер для клетки стресс и учредительных репортер Phyperspank- mNeptune (красный) для выделения ячеек. LB Леннокс средних используется в протоколе пример. Типичный штаммов для экспериментов микрофлюидика содержат один или более флуоресцентные transcriptional репортеров и конститутивно производства, цитоплазматических флуоресцентный белок для облегчения автоматического обнаружения клеток. Рост дефекты были не наблюдаемые когда богатые среднего LB Леннокс был использован, но B. subtilis рост минимальной СМИ может тормозится microfluidic условиях, потому что выделяется siderophores вымываются, средний поток. При таких обстоятельствах рост может быть восстановлена путем добавления цитрат натрия и хлорида железа на носитель, как сообщалось на S750 средних11.
  2. В первой половине дня эксперимента, разбавляют клетки B. subtilis 1:50 в недоумение колбу 250 мл, содержащих 25 мл среднего роста. Рост клеток для 5-6 ч в тряску культуры при 37 ° C для оптической плотности более чем на 1.
    Примечание: Плотной клеточной культуры предпочтительнее, потому что стационарной фазы B. subtilis клетки являются меньше и менее часто встречаются в ячейке цепи, облегчения загрузки устройства. Различных видов бактерий может потребовать других средних или роста условий для оптимальной загрузки.
  3. С помощью шприца с фильтром поры 5 мкм, фильтр примерно 15 мл культуры клеток в 15 мл конические для удаления цепочки B. subtilis ячейки (это ненужным для е. coli и не может быть необходимым с другими видами).
    Примечание: Относительно немногие клетки должны быть удалены; Фильтрат должно быть мутной.
  4. Центрифуга для отфильтрованных культуры за 10 мин на 4000 x g при комнатной температуре. Слить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в остаточных супернатанта жидкости, оставшиеся в трубе, добавляя около 500 мкл свежей среды при необходимости для облегчения закупорить суспензию клеток.

5. устройство загрузки

  1. Осторожно поместите пустой тонкой микропипеткой гель загрузки советы (см. Таблицу материалы) в розетке отверстия microfluidic устройства.
  2. Используя тонкие гель загрузки советы с Р200 микропипеткой, пассивации устройства путем инъекций носитель содержит 1 мг/мл BSA в впускного отверстия, наблюдения за советы в выходе отверстия для контроля заполнения microfluidic каналов (рис. 2A). Инкубируйте устройства при комнатной температуре примерно 5 минут.
    Примечание: BSA обычно используется как на блокирование или пассивации агент, который будет привязан к гидрофобной поверхности PDMS полимера, увеличивая его гидрофильность и уменьшая привязку других белков или клеток (через клетки поверхности молекулы).
  3. Используя тонкие Советы гель загрузки, загрузите каждый канал с ресуспензированы клеток (раздел 4), используя советы в канале розетки для мониторинга хода клетки через устройство (рис. 2B).
    Примечание: Загрузка облегчается, установив микропипеткой Р200 ее максимум 200 мкл тома и затем аспирационных воздушной подушке перед аспирационных небольшого количества клеток (примерно половина объема шлифов кончика пипетки). Объем ресуспензированы клеток не нужно быть точным, как объем PDMS устройства мал по сравнению с микропипеткой. Мы знаем, не верхний предел плотности ресуспензированы клеток, поскольку суспензию клеток может быть накапаны в устройство. Скопления клеток может засорить устройство и следует избегать тщательно закупорить и/или вихревого смешивания.
  4. Аккуратно удалите советы гель загрузки из розетки отверстий, работает один момент для предотвращения повреждения устройства.
  5. Центрифуга устройство настольное microcentrifuge в переходник соответствующей ротора на приблизительно 6000 x g 10 минут (рис. 2 c).
    Примечание: Адаптер обычай обработанной алюминиевой ротор, который был разработан для вписываются в microcentrifuge ротора (рис. 2 c) был использован; различные центрифуги модели могут быть использованы с адаптерами соответствующих ротора. Важной особенностью адаптер является, что она обеспечивает боковое усилие в направлении закрытые концы траншеи клеток, тем самым заставляя клетки в боковые каналы.
  6. Проверка успешной загрузки под микроскопом (рис. 3), но без проставления устройство на слайд держатель/этап вставки.
    Примечание: В настоящем Протоколе, 60 X, 1.4 цель нефти погружение NA Ph3 используется для обоих проверки на данном этапе и для последующей обработки изображений.

6. устройство Ассамблея, уравновешивания и монтаж

  1. Тщательно смонтировать загруженные устройства на стадии Вставка лентой покровным стеклом по обе стороны PDMS в нижней части стадии вставки (т.е., инвертировать вставить этап перед установкой устройства). Инвертировать Ассамблеи Вставка устройство этап, так что PDMS вверх и место на мягкую поверхность, например беспылевой очистки (Рисунок 2D).
  2. Отрегулируйте скорость потока фазы-1 шприц насоса 35 мкл/мин работает с одной полосой движения в то время, вставьте входе иглой, а затем выход иглы (т.е., под управлением отходов стакан; Рисунок 2E).
  3. Оботрите прочь любое превышение среднего салфеткой чистой пыли и Осмотрите прибор на предмет утечек. Изучите выходе трубы для появления избыточного клеток (обычно появляется как мутная полоса) и средних мениска, который будет медленно двигаться в сторону отходов стакан.
  4. Разрешение устройства для запуска в 35 мкл/мин примерно 15-30 мин, до тех пор, пока все подключенные дорожки впадающих в отходов стакан.
  5. Установите фазы-1 шприцевый насос 1,5 мкл/мин и приостановки потока. Весь аппарат насосом и устройством микроскопа (этот процесс помог, поместив его все на тележку подвижного) и возобновлению фазы-1 средний поток на 1,5 мкл/мин тщательно смонтировать сцену вставка с устройством на Перевернутый флуоресцентным микроскопом, используя лента, необходимые для маршрутизации на входе и выходе трубопровода.
  6. Найдите нужное положение устройства для обработки изображений и начать изображений нужным. Обратите внимание, что клетки обычно требуется несколько часов (приблизительно 10 поколений), чтобы достичь устойчивого состояния экспоненциальной фазе роста, и начала захвата изображений может быть отложено, как желательно, чтобы изображения начинается после периода уравновешивания.
    Примечание: Установившегося рост клеток в экспоненциальной фазе должны проверяться в ходе анализа последующих изображений путем отслеживания раз деление клеток и обеспечения того, что они достигли минимальное значение постоянного.

7. Средний переключения

  1. Между раундов изображений приостановите поток фазы-1 шприцевой насос. Аккуратно отсоедините зажимы от фазы-2 силиконовые трубки, перемещение каждой Силиконовая трубка на стадии-1 филиал перекрестка Y. ООН приостановить поток фазы-2 шприца насоса (который был установлен до 1,5 мкл/мин на шаге 3.8) и продолжить изображений.
    Примечание: В 1,5 мкм/мин с длиной 10 см полимерных труб вниз по течению Y развязок, второй этап среднего достигает устройства в приблизительно 50 мин. Время на устройстве могут быть проверены эмпирически, с использованием средств массовой информации, которые содержат частицы флуоресцентные трассирующими.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешных первоначальных клеток, загрузки, как оцениваются фазово контрастной микроскопии перед присоединением microfluidic Сантехнические устройства, будут рассматриваться как имеющие все или почти все microfluidic боковые каналы, содержащие один или несколько бактериальных клеток ( Рисунок 3A). Оптимальная загрузка будет показывать несколько ячеек в каждом канале, но менее каналы наполнит клетки из-за роста клеток в период уравновешивания (рис. 3B). Полосы с плохой загрузки, в котором относительно мало (< 50%) стороны, каналы загружаются с клетками, могут быть использованы, но результирующая плотности данных будет ниже из-за меньшее количество линий клеток изображаемого на каждой визуализации позиции.

После устройства сначала загружается, он является достижение равновесного уровня путем прикрепления microfluidic сантехника и среднего, протекающего через устройство на сравнительно высокий расход потока 35 мкл/мин. Уравновешивания шаг служит для удаления пузырьков воздуха и избыток клетки в канале кормления из устройства и стимулировать клетки в боковые каналы, чтобы начать расти. Клетки, которые удаляются с устройства на средний поток можно часто наблюдать невооруженным глазом как светлой полосы перемещение через трубки розетки к контейнер для отходов; движение таких полос служит визуальный индикатор, который обычно течет жидкость через сантехника и устройства. Микроскопические инспекции уравновешенной устройства следует выявить несколько клеток, помещены в один файл в большинстве боковые каналы (рисунок 3B, 0 минут).

После уравновешенной устройство помещается на микроскопе под поток в 1,5 мкл/мин при 37 ° C, клетки возобновит равномерная и постоянная экспоненциальной фазе роста в течение приблизительно 2 ч (рис. 3B). Постоянный экспоненциальный рост должны быть проверены после анализа изображений непосредственно появление плато в время генерации клеток. На данный момент клетки готовы для флуоресценции или brightfield изображений нужным. Устройство успешно загружен и уравновешенной обычно может быть надежно imaged продолжительностью не менее 24 ч (рис. 4A, C). Представляя средний переключатель (рис. 4AC) расширяет спектр экспериментов, которые могут проводиться, но также увеличивает частоту события катастрофической гибели клеток (рис. 4 d), предположительно путем введения воздуха пузырьки, которые не были успешно очищены от трубы. Еще одним событием, которое может привести к катастрофическим клеточной смерти, что кластеры клеток, расположенных на входе может стать выбили и проходят через питание канал, как показано на рисунке 4 d. Мы не в настоящее время понять, почему это вызывает катастрофические клеточной гибели в устройство, и мы еще не разработали метод, чтобы предотвратить появление таких событий.

Figure 1
Рисунок 1: схема устройства microfluidic. Схематическое устройство отображается примерно для масштабирования. Алфавитный указатель обозначается наряду с входным и выходным отверстием зон, которые пробиты подключиться туп законченному иглы. Как правило, половина узорной каналов используются (затененные серым). Клетки траншеи ориентированы на указателе. Сопутствующий файл CAD (см. дополнительный файл 1) показывает все возможности на устройстве. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Microfluidic устройство пассивирование, ячейка загрузки и уравновешивания. (A) A кабального устройство после пассивации с BSA-содержащих среднего. Гель загрузки советы хранятся в выходе отверстия для отслеживания прохождения среднего и клетки через устройство. Средний мениска является видимым в тонкой части гель загрузки советы (стрелка). (B) устройство после загрузки ячейки. Клетки будут видны как полупрозрачный белый слой в гель загрузки советы (стрелка). (C) гель загрузки советы будут удалены перед центрифугированием в пользовательские сфабрикованы центрифуги адаптер. Медицинская лента (синий) помещается на алюминиевых деталей для смягчения устройство. (D) после центрифугирования и проверки загрузки, устройство приклеенный к вставке Этап микроскопа и прилагается к входным и выходным контактам. На изображении показано средний переключения стало возможным благодаря щепотку клапанов и Y-соединители, которые расположены в аппарат из поле Подсказка микропипеткой. (E) схема весь собранный устройства, от шприца насосов в контейнер для отходов. Выходе трубы работает в небольшой стакан отходов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: сотовый погрузки и роста в устройстве microfluidic. (A) слева направо, фазово контрастной микроскопии устройства, содержащего среднего только перед загрузкой ячейки, то же устройство после того, как клетки были добавлены через пипетирования, но перед центрифугированием и то же устройство после центробежные загрузки. (B) время курс адаптацию клеток и рост в устройства (LB, 37 ° С, расход 1.5 мкл/мин). В начале адаптации, стационарной фазы клетки являются относительно короткими и узкими. Как клетки адаптировать и вернуться к экспоненциальной фазе роста (60-120 мин), они принимают длиннее и шире морфологии. После 120 минут все ячейки в устройстве возобновляют единообразных экспоненциальной фазе роста, и устройство готово для воображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: сотовый роста и среднего, переключение в устройстве microfluidic. (A) Kymographs показаны 550 мин роста до и 1000 мин роста после среднего переключения (серый пунктирная линия) в 2% Этанол как stressor. Изображения были захвачены интервалом 10-мин. Верхней панели показывает transcriptional mNeonGreen репортер (зеленый канал) для стресс индуцированного гена. На нижней панели показывает учредительного mNeptune репортер (красный канал), которая используется в этом случае для автоматизированного клеток сегментации. (B) крупным планом просмотр части kymographs в поле пунктирной Группа A, показаны переходных ответ в зелёном канале после среднего переключатель. Обратите внимание, что рост продолжается через коммутатор, хотя присутствие этанола вызывает клетки становятся короче и расти немного более медленными темпами. Шкала времени отображается горизонтальная панель, и расстояние показано вертикальной чертой. (C) пример следы данных анализируемого флуоресценции одну ячейку линии от эксперимента, отображаемые в панели а. Вертикальные пунктирные линии указывают средние переключатель в 2% Этанол как stressor. (D) пример неудачного средних коммутатора. Когда второй среднего достигает клетки, клетки в каналах будут лизированы. Переключатель сопровождается большое количество клеток, которые проходят мимо в основной канал, вызывая яркие флуоресцентные сигнал (повторно масштабированные изображения, соответствующие размытых региона показано чуть выше его). После переключения наблюдаются никакие дальнейшие клетки, хотя остается тускло люминесцентные клеток мусора в каналах. Шкала времени отображается горизонтальная панель, и расстояние показано вертикальной чертой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол микрофлюидика является гибким, что многие из шагов могут быть изменены для оптимизации ее использования с отдельных видов или деформации или для конкретной цели. Действительно в этом протоколе мы внесли изменения в оригинальной концепции «мать машина»4 для оптимизации ее использования с B. subtilis. Часто траншеи, в которых содержатся клетки представляют собой функцию однослойного, тогда как в настоящем протоколе мы используем два слоя клеток траншеи, с мелкой каналом, окружающие клетки. 2 слойный дизайн был введен как способ увеличить поток питательных веществ и метаболитов от B. subtilis клеток, особенно в Лонг (> 75 мкм) траншей5; Однако однослойные функции часто достаточно для оптимального клеточного роста и часто используются для е. coli, особенно когда они короче (~ 25 мкм)4. Мы обычно используют больше траншеи, как они снижают частоту, с которой B. subtilis клеток цепи, которые возникают в ковшах, являются вытащил их траншеи, средний поток в основной кормовой канала5.

Дальнейшие изменения, например, использование устройств различных размеров (например, ширина канала) или характеристики (например, форма, количество открытых концов) может быть заменен при необходимости. Например ячейки, траншеи, которые открыты на обоих концах (а не на только одном конце, как настоящий протокол) использовались в других исследований по1,,2021. Траншеи, которые открыты на обоих концах избежать старения клеток, потому что они постоянно наполняется новорожденных клетки (в отличие от матери машин, где старые клетки отслеживается, и новые клетки являются вытеснены из канала), хотя тот факт, что старые клетки оказываются из обоих концах обычно ограничивает их наблюдений окно меньше чем 10 поколений1,21. Мы, как правило, добиваются более наблюдений windows (сотни поколений) предлагаемые мать машины, которые делают его возможным для измерения даже низкозатратная по памяти процессов, для которых время ожидания являются десятки или сотни поколений длиной5. Мы также использовали дизайн машины мать соблюдать клетки, которые не растут экспоненциально, как наш анализ заспорение22. В таких случаях дополнительные клетки во всем роста траншей может быть конструктивно проанализированы22.

Многие из шагов в протоколе сравнительно прощать в том, что они могут быть изменены без существенного воздействия протокола итогов. Например, более ранней версии протокола под названием для очистки стекла Крышка последовательных баня 10-мин sonication шаги в 10 M Кох и затем чистой воды, но мы обнаружили, что хорошее устройство склеивание и операция была достигнута с помощью проще на основе изопропиловый спирт Очистка шаг, описанных здесь. Если связь вопрос возникает подозрение что литой на чистоту покровным стеклом, возврат к более строгий протокол очистки рекомендуется. Аналогичным образом хотя мы используем центрифугирования шаг для максимальной загрузки в окопах клетки клетки, достаточно полной загрузки может быть достигнуто даже без этого шага, условии, что очень концентрированной клетки используются для погрузки шага. Это альтернативная стратегия может быть особенно полезно для исследователей, которые не имеют легко доступны центрифуги адаптер для спина устройство. Опять же могут использоваться различные концентрации пассивирования/смазочные агента (BSA в этом протоколе); Мы регулярно использовать концентрации выше 1 мг/мл. В тех случаях, когда деформации могут быть чувствительны к BSA приемлемые результаты могут быть достигнуты даже при отсутствии пассивирующего агента. Действительно когда мы были с помощью microfluidic устройство для изучения заспорение, который требует голодания клеток, мы были обеспокоены, что BSA может действовать как потенциальный источник питательных веществ для клетки, и поэтому мы опустили его из потока среды без соблюдения каких-либо значительные неблагоприятные эффекты22.

Примечательно непрерывного потока среды через устройство можно выявить несколько разных фенотипов, по сравнению с роста клеток в замкнутой системе, такие как колбу. Например истощение питательных веществ или соединение может быть сложным, как клетки часто можно собирать трассировки соединений из потока среды. Действительно мы заметили, что заставить клетки заспорение через голода требует больше времени в чем microfluidic устройство в колбе. Аналогичным образом мы наблюдали, что индукции энергии стресса с помощью гидразоны m хлорфенил цианида Оксидативное фосфорилирование decoupler Карбонильная группа (CCCP) требует несколько раз выше концентрации в microfluidic устройства, чем сообщалось в колбу культуре 23. Таким образом, некоторые оптимизации может потребоваться для достижения удовлетворительных результатов с различными добавками, средний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Этот проект финансировался национальных институтов здравоохранения под GM018568. Этот протокол был проведен в части в центре для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF премии № 1541959. CNS является частью Гарвардского университета. Большое спасибо из-за Норман Томас и лорд Натан за их работу в зачатие и изготовления мастер шаблон, используемый для устройства, показанные здесь и в здании оригинальной версии аппарата. Мы также поблагодарить Johan Паулссон за его ценные совместные консультации и поблагодарить членов его лаборатории за их советы и дальнейшее совершенствование бактериальных microfluidic приборы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning (240)4019862 This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass VWR 48393 172
Plasma Etch PE-50 Plasma Etch Inc. PE-50 Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" Saint-Gobain PPL Corp. AAD04103 For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD HelixMark Standard Silicone Tubing 60-795-05 For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200) Molecular BioProducts 2155 For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane Pall Life Sciences 4560 For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1" McMaster-Carr 75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene Nordson Medical Y210-6005 The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope Nikon This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox Sigma-Aldrich L3022
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1 wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven VWR 414005-106 for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit 3M 2216 B/A may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width 3M to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope Nikon SMZ800N listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 To clean cover glass
Syring pump, 6 channel New Era Pump Systems Inc. NE-1600
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 a brand of dust-free wipes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12, (8), 1487-1494 (2012).
  2. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7, (1), 80-88 (2011).
  3. Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15, (8), 1822-1834 (2015).
  4. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20, (12), 1099-1103 (2010).
  5. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503, (7477), 481-486 (2013).
  6. Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15, (12), Basel. 31142-31170 (2015).
  7. Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13, (9), 1699-1707 (2013).
  8. Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356, (6338), 638-642 (2017).
  9. Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16, (9), 1549-1555 (2016).
  10. Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5, (3), 209-218 (2007).
  11. Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
  12. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15, (1), 23-42 (2015).
  13. Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15, (1), 11 (2017).
  14. Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159, (6), 1433-1446 (2014).
  15. Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25, (3), 385-391 (2015).
  16. Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25, (9), 1201-1207 (2015).
  17. Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1, (4), (2010).
  18. Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139, (20), 5254-5262 (2014).
  19. Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
  20. Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340, (6133), 737-740 (2013).
  21. Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88, (17), 8476-8483 (2016).
  22. Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36, (19), 2856-2869 (2017).
  23. Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13, (7), e1006901 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics