새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

Biology

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Summary

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

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Cabeen, M. T., Losick, R. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (131), e56901, doi:10.3791/56901 (2018).

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Abstract

미세 기술 많은 미생물학에 전통적인 분석 방법에 한계의 극복. 와 달리 대량 문화 방법, 그것은 제공 합니다 단일 셀 해상도 세대;의 수백에 걸쳐 시간 긴 관찰 agarose 패드 기반 현미경과 달리 균일 한 성장 조건에 엄격 하 게 제어 될 수 있다. 성장 매체의 지속적인 흐름 세포 성장 그리고 물질 대사, 본격적인 변화 유전자 발현 및 세포 성장에 대 한 응답에서으로 인 한 현지 화학 환경에서 예측할 수 없는 변화에서 미세 소자에서 셀 분리 하기 때문에 특정 자극을 더 자신 있게 관찰할 수 있습니다. 새 균의 subtilis 사용 "어머니 기계"를 설명 하기 위해 모델 세균성 종으로 여기-세포 분석 방법을 입력. 우리가 생성 및 미세 장치를 수직, 셀 로드, 현미경 이미징, 시작 및 다른 한 성장 매체에서 전환 하 여 세포 자극에 노출 하는 방법을 보여 줍니다. 스트레스 반응 기자가이 방법으로 얻을 수 있는 데이터의 종류를 나타내기 위해 예제로 사용 됩니다. 우리 또한 짧게 실험, 세균 포자 형성의 분석 등의 다른 종류에 대 한이 메서드의 응용 프로그램 추가 설명.

Introduction

지구상의 생명의 가장 눈에 띄는 기능 중 하나는 그것의 큰 탄력성과 다양 한입니다. 분자 생물학의 중앙 목표는 세포를 사용 하 여 유전자와 단백질 그들의 성장 및 다양 한 환경 조건에서 피트 니스를 최대화 하는 논리를 이해 하는 것입니다. 이 위해 과학자 들은 자신 있게 관찰 할 수 있어야 합니다 어떻게 개별 셀 성장 하 고 분할 하 고, 표현 하는 조건의 주어진된 세트에서 그들의 유전자, 세포 그들의 환경에서 이후의 변화에 대처 하는 방법을 지적. 그러나, 미생물학에 전통적인 분석 방법을 해결 될 수 있는 질문의 형식에 영향을 주는 기술적인 한계를가지고. 예를 들어 대량 문화 기반 분석, 년간 매우 유용 되었습니다 아직 의미 있는 셀을 변형 또는 전체 인구에 셀의 작은 부분 모집단의 동작 마스크 수만 인구 수준 데이터를 제공 하는 그들은. 가벼운 현미경 검사 법에 따라 생활 박테리아의 단일 세포 분석 단일 셀 동작을 공개 하지만 기술적으로 제한 되어 있습니다. 박테리아 성장 매체를 포함 하는 agarose 패드에 일반적으로 움직일 수 있지만 셀과 성장 군중 미세한 보기와 실질적으로 제한 하는 관측 시간1, 단지 몇 셀 사이클 후 사용할 수 있는 영양분을 고갈 2. 또한, 영양소의 로컬 고갈 및 셀 증가로 대사 부산물의 수 반하는 상승 끊임없이 측정 또는 예측 하기 어려운 방식으로 지방 세포 성장 환경 변화는. Agarose 패드를 사용 하 여 이러한 환경 변화 연구 또는 특정 변화 성장 조건3에 세포질 응답의 정상 동작에 도전 포즈.

미세 기술, 있는 액체 매체는 ﹙ 장치를 통해 지속적으로 흘러 고전적인 실험 한계에 솔루션을 제공 합니다. 성장 매체의 흐름 끊임없이 신선한 영양소와 세포를 제공 하 고 신진 대사 부산물 및 초과 셀, 매우 균일 한 성장 만드는 씻어 미세 장치 라이브 셀 현미경 검사 법에 대 한 위치에서 개별 셀을 유지할 수 있습니다. 환경입니다. 지속적인 성장 조건에서 셀의 내부 논리에의 한 시 빨리 벗어나게 보기를 허용 하는 환경 요인의 영향에서 고립에서 셀 동작을 관찰할 수 있습니다. 유체 흐름에서 세포 군집 되 고 미세 장치를 방지, 수십 또는 수백 세대에 대 한 단일 세포 계보의 관찰 가능한4,5된다. 이러한 긴 관측 시간 달리 탐지 장기 또는 드문 셀 동작 감지를 허용합니다. 세포는 스트레스의 발병 또는 소개 또는 특정 화합물의 제거 반응으로 관찰 될 수 있도록 마지막으로, 장치를 통해 흐름에 변경 될 수 있는 매체의 구성이 됩니다.

마이크로 이미 중요 한 응용 프로그램의 수를 즐겼다. 예를 들어, 그것은 조직, 기관 또는 몸 온 칩 장치는 여러 인간 세포 유형은는 vivo에서 조건6; 시뮬레이션 공동 경작에 사용 되었습니다. microstructured 환경7; 선 충 운동의 연구에 대 한 (예를 들어, 8); 박테리아 biofilms 간의 상호 작용을 검사 하 캡슐화 및 셀 또는 화학 물질 (, 9)의 작은 볼륨의 조작에 대 한 고. 미세 장치는 또한 그들의 물리적으로 특히 (대 한 훌륭한 리뷰 참조 10 , 11), 미생물학의 분야에서 점점 인기 되 고 흐름 속성은 자연 미생물 틈새12울린. 예를 들어, 마이크로 최근에 의해 고용 되었다 미생물학 같은 목적을 위해 정확 하 게 측정 하는 셀과 성장13,14,15, 병원 체의 운동16, 분석으로 쿼럼 감지17 및 생리 적 전환18, 모니터링 및 단백질에 대 한 세19, 다른 많은 보기 사이에서. 여기에 제시 된 방법은 긴장 또는 종의 조합 보다는 오히려 단일 세균성 세포 계보의 분석을 위해 특별히 설계 되었습니다. 여기 설명 미세 장치 활용 한 변형 "어머니 기계" 디자인4, 셀 단일 파일을 재배는 닫힌된 한쪽과 한쪽 오픈; 미세 트렌치 내 세포 성장 및 사단 푸시합니다 자손 세포 오픈 엔드에서 유체 흐름으로. 우리의 분석은 일반적으로 골짜기의 닫힌된 끝에 국한 "어머니" 세포에만 초점. 우리는 이전 가벼운 현미경 검사 법 기반 단일 셀 분석 기법, 셀 immobilization agarose 패드에 등 위에 전진으로이 메서드를 고려합니다. B. subtilis 여기 모델 사용 된다, 방법은 또한 다른 세균 종에 적용 (대장균 다른 일반적인 모델 이며 다른 셀 크기 또는 형태학 일부 종 신제품의 제조를 요구할 수 있습니다 다른 치수)와. 셀을 표시 하 고 시각화 유전자 발현에 변화를 형광 기자 사용 하려면 유전자 온순한 종;의 사용 그러나, 세포 성장 및 형태학의 분석은 형광 마커 없이 가능.

현재 프로토콜 사용 하 여 사진 평판, 다른 곳에서 광범위 하 게 설명 되었습니다5; 실리콘 마스터를 조작 하는 과정 제외 마스터 제작 시설에서 쉽게 아웃소싱 수 있습니다. PDMS 장치 강화 실리콘 마스터;에서 성형을 포함 하 고 있습니다. 커버 유리;의 장치 결합 중간 스위칭; 허용을 포함 한 핀치 밸브 미세 입구 및 출구 배관 조립, 장치 passivating 세균성 세포를 준비 하 고 세균성 세포; 장치 로드 장치에 배관 및 평형 셀; 그리고 영상에 대 한 형광 현미경에 장치를 로드. 때문에 많은 다른 이미지 수집 및 처리 소프트웨어 시각화 하 고 관심4,5의 다른 데이터 분석 도구를 사용할 수 있습니다, 예를 들어 이미지 표시 됩니다, 하지만 이미지 캡처 방법이이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.

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Protocol

1. PDMS 장치 캐스팅

  1. 먼지 없는 환경에서 PDMS 폴리머와 경화제 10:1 비율로 혼합 하 고 적어도 10 분 동안 진공에서 드.
  2. 실리콘 마스터 (또는 그 아니라는 에폭시 또는 폴리우레탄 복제) 연속적인된 알루미늄 호 일의 조각에 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 놓습니다. 붓는 다 degassed PDMS 혼합물 깊이 약 5 m m. 드가 페 트리 접시 적어도 10 분 사용에 대 한 마스터 공기 표면 거품을 휴식의 부드러운 스트림.
    참고: 사용 하는 2 계층 장치 크기에 제공 되는 동반 CAD 파일5 ( 보충 파일 1참조). 플라스틱 복제 마스터 수 있습니다 degassing; 하는 동안 부분적으로 플 로트 이 경우, 깨끗 한 플라스틱 주걱으로 복제 아래로 밀어.
  3. 60 ° C에서 오븐에 1 시간 이상에 대 한 PDMS를 치료 하 고 실내 온도에 냉각 하십시오. 페 트리 접시에서 마스터 및 치료 PDMS를 포함 하는 알루미늄 호 일을 제거 합니다. 조심 스럽게 껍질 마스터, 뒤쪽에서 알루미늄 호 일을 한 다음 마스터에서 PDMS를 신중 하 게 껍질.
    참고: 또는, PDMS 있습니다 완 치 될 하룻밤 실 온에서. 영구적으로 1/16 인치 웨이퍼 본드 에폭시 접착제를 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 마스터의 상대적 취약성을 극복할 수 있습니다-같은 웨이퍼 크기의 두꺼운 알루미늄 디스크.
  4. 웨이퍼는 일반적으로 약간 다른 크기 ( 보충 파일 1참조) 여러 미세 장치 포함, 단일 장치는 깨끗 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 크기를 잘라.
    참고: B. subtilis 작업 루틴에 대 한 C 또는 F 동반 CAD 파일에 표시 된 1.0 µ m 전체 셀 참호와 장치를 사용 합니다.

2입니다. 펀치 및 결합 장치

  1. 장소 반투명의 조각 패턴된 특징의 가시성을 향상 시키기 위해 소자의 패턴된 쪽 이상 ( 재료의 표참조) 테이프. 입구 및 출구 포트 (그림 1) 보이는 유체 채널의 반대 끝에 원형 지역으로 식별 됩니다. 펀치 구멍 입구 및 출구 핀 장치에 때 그들의 가시성을 개선, 뾰족한 마커를 사용 하 여 점 후미와 출구 표시 합니다.
    참고: 입구와 콘센트 핀은 혼잡 하지 있도록 모든 다른 채널은 구멍 뚫은 것, 바로 아래에 장치에 대 한 알파벳 지정자 채널 시작.
  2. 패턴된 측면, PDMS 장치를 대칭 이동 하 고 장치는 0.75 m m 생 검 펀치;를 사용 하 여 표시 된 점 들을 통해 펀치 punchings을 삭제 합니다.
    참고: 장치는 구멍 뚫은 것 아래로 꽃무늬 면 생 검 펀치에 의해 생성 된 구멍은 일반적으로 약간 flared 펀치는 폴리머를 입력 하기 때문에. 거꾸로 방향 장치 펀칭 패턴된 측면에 구멍 날카로운 테두리는 보장 합니다.
  3. stereomicroscope를 사용 하 여 천공된 구멍 장치 입구 및 출구 분야와 중복을 확인 합니다. 뾰족한 족집게를 사용 하 여 천공된 구멍에서 PDMS의 어떤 외부 조각을 제거.
  4. 접착 테이프를 사용 하 여 깨끗 한 폴리스 티 렌 페 트리 접시로 장치 및 장소의 양쪽에서 먼지를 제거 하. 100%가 소 프로필 알코올로 습윤 및 클린 룸 지우기;으로 문 지르고 22 m m x 40 m m 커버 유리를 준비 먼지가 없는 공기 또는 질소의 흐름과 함께 건조.
  5. 장소 천공된 PDMS 장치 기능 측면을 함께 청소 커버 유리는 산소 플라즈마에 청소기.
    1. 플라즈마 치료 다음 설정으로 장치: 진공, 70 mTorr; O2 압력, 200 mTorr; 기간, 15 s; 전원, W. 30 플라즈마 치료 기간 완료 후 즉시 제거 장치 및 커버 유리는 플라즈마에서 청소기.
    2. PDMS 반전 고 덮개 유리의 중심에 있도록 패턴된 측면 연락처 유리; (입구와 출구 사이 실행) 먹이 채널 덮개 유리의 긴 축에 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다. 유리에 대 한 PDMS 물개 되도록 매우 부드럽게 아래로 누릅니다.
  6. 60 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 조립된 장치 오븐에 구워 베이킹 후, 수동으로 PDMS 장치에의 한 모서리에 부드럽게 밀어 유리에 접착은 확인 합니다.
    참고: 장치가 결합 되 면 그것은 해야 사용할 수 24 시간 이내 폴리머 후 플라즈마 처리 시간을 증가 함께 점점 더 소수 될 것 이다.

3. 미세 배관 준비

  1. 폴리머 주사기 펌프 스위칭 장치 도달 하는 (사용) 하는 경우 적절 한 길이를 현미경에 장착 장치 (내경 (ID) 0.02 인치, 외경 (OD) 0.06 인치) 튜브의 길이 잘라. 미세 레인으로 많은 길이 잘라.
  2. 핀치 밸브에 대 한 Y 접속점 (사용) 하는 경우 절단 및 2 cm 길이의 유연한 실리콘 (0.03 인치 ID, 0.065 인치 OD) "Y"의 최고 barbs을 1 cm 길이 "Y"의 하단 바 브에 실리콘 튜브의 튜브를 연결 하 여 조립
  3. 잘라 10 cm (또는 적절 한) 길이의 중합체 튜브; 하단 바 브는 "Y"의 1 cm 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입 하 여 스위치 접점을 한 끝에 그들을 연결합니다 21g 바늘 그들의 플라스틱 주사기 어댑터와 굽은 약 90 ° 바늘 끝에서 약 9 mm에서 제거 된 다른 끝에 그들을 연결 합니다.
  4. 21 G 무딘 바늘 튜브에 바늘을 삽입 하 여 스위치 장비에 주사기에서 실행 되는 튜브 세그먼트의 한쪽 끝을 연결 합니다. Y 접속점에의 입구 미 늘에 실리콘 튜브 세그먼트로 각 길이의 튜브의 다른 끝을 삽입 합니다.
    참고: 장소; 핀치 밸브와 접합부를 기구의 어떤 종류를 사용 이 micropipette 팁 상자 (그림 2D)에서 쉽게 만들 수 있습니다.
  5. 휴대 장치의 콘센트에서 폐기물 비 커에 폐기물 중합체 튜브의 길이 잘라. 구부러진된 21 G 바늘 위에서 설명한 대로 준비를 한 끝에 그들을 연결 합니다. 폐기물 비 커에 튜브의 다른 쪽 끝을 테이프.
  6. 적절 한 양의 0.1 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함 하는 미디어를 준비 하 고 원하는 크기와 주사기의 번호를 작성. 준비 21 G 바늘 주사기 펌프에 유입 튜브와 로드 주사기에 부착 된 BSA 로드 주사기를 연결 합니다.
    참고: 대 한 전형적인 실험 장치의 5 채널 사용 됩니다 각각 20 mL 주사기. 매체 전환 실험 5 주사기의 2 뱅크를 요구할 것 이다. 여기, 펌프 포함 하는 첫 번째 은행을 1 단계 펌프 라고 하 고 사후 스위치 매체와 두 번째 은행을 포함 하는 펌프를 2 단계 펌프 라고.
  7. 높은 흐름 율에 주사기 펌프를 실행 하 여 입구 배관에서 공기를 제거 (> 500 µ L/min), 주사기 펌프 수직으로 동쪽으로 향하게 하 고 상단에 기포를가지고 주사기를 도청에 의해 시작. 일단 주사기에서 공기를 제거 주사기 펌프를 가로로 배치 및 점차적으로 누르거나 꺼내 려 하 고 공기 방울 제거 스위치 장비를 통해 주사기에서 폴리머 라인을 터치 합니다. (미디어 전환) 하는 경우에 주사기의 두 번째 은행에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
  8. 기포를 제거한 후 2 단계 주사기 펌프를 설정 (, 사용 될 매체와 두 번째, 스위치 후) 1.5 µ L/분, 흐름 일시 중지. 두 번째 중간 단계에 해당 하는 Y 접속점에의 분 지에 작은 바인더 클립 유연한 튜브의 세그먼트에 배치 합니다. 30 분 이상 두 번째 중간 입구 배관에서 제거에 대 한 겸손 한 흐름 속도 (예를 들어, 10 µ L/min)에서 단계 1 주사기 펌프를 실행 하려면 계속 Y 분기점의 하류.

4. 세포 문화 준비

  1. 하룻밤, 고정 단계 원하는 매체에 대 한 관심의 긴장의 preculture 성장. 세균성 긴장을 렌더링 하는 셀 움직이지 셀 소자의 채널에서 수영 하지 않는 변이 포함 해야 합니다.
    참고:이 프로토콜, 세균성 긴장은 B. subtilis 3610 포함 하는 노 파A233V 대체 (이 돌연변이 발생 헬리컬, 방지 세포 운동 성 보다 똑바로 되도록 편), PrsbV-mNeonGreen 셀 스트레스에 대 한 기자 그리고 제정 Phyperspank-mNeptune (레드) 기자 셀을 강조 표시 합니다. LB 레 녹 스 매체 예제 프로토콜에 사용 됩니다. 마이크로 실험에 대 한 일반적인 긴장 하나 이상의 형광 transcriptional 기자 및 constitutively 생산, 세포질 형광 단백질 셀의 자동된 감지를 포함 합니다. 성장 결함 하지 관찰 되었다 파운드 레 녹 스 풍부한 매체 사용 되었다, 하지만 분 비 때문에도 미세 조건 하에서 최소한의 미디어에 B. subtilis 성장 저해 수 있습니다 siderophores 중간 흐름에 의해 멀리 세척 된다. S750 중간11보고 이러한 상황에서 성장 매체, 제 2 철 염화 나트륨 시트르산의 추가 의해 복원 수 있습니다.
  2. B. subtilis 세포 실험의 아침 희석 성장 매체의 25 mL를 포함 하는 당황 하 게 250 mL 플라스 크에 1시 50분. 5-6 h 1 보다 큰 광학 밀도를 37 ° C에서 문화를 떨고에 대 한 세포 성장.
    참고: 고밀도 세포 배양 바람직합니다 정지 단계 B. subtilis 세포는 작은 고 덜에서 종종 발견된 셀 때문에 체인, 장치 로드를 촉진. 다른 세균 종 최적의 로드에 대 한 다른 매체 또는 성장 조건을 요구할 수 있습니다.
  3. 5 µ m 기 공 크기 필터를 장착 한 주사기를 사용 하 여 B. subtilis 셀 체인 ( 대장균 에 대 한 필요 하지 않습니다 그것과 다른 종으로 필요 하지 않을 수 있습니다)을 제거 하는 15 mL 원뿔 튜브에 세포 배양의 약 15 mL를 필터링 합니다.
    참고: 상대적으로 적은 세포를 제거 한다; 여과 액은 혼 탁 한 이어야 한다.
  4. 실 온에서 4000 x g에서 10 분에 대 한 필터링 된 문화 원심 상쾌한 오프와 신선한 매체의 약 500 µ L pipetting 세포 현 탁 액을 촉진 하는 데 필요한 추가 튜브에 남아 있는 잔여 표면에 뜨는 액체에서 셀 펠 릿 resuspend.

5. 장치 로드

  1. 부드럽게 장소 빈 얇은 젤 로드 micropipette 미세 장치 콘센트 구멍에 ( 재료의 표참조) 팁.
  2. 입구 구멍에 1 mg/mL BSA를 포함 하 여 미세 채널 (그림 2A)의 작성 모니터링 콘센트 구멍에 팁을 관찰 하는 매체를 주입 하 여 장치 passivate P200 micropipette와 얇은 젤 로드 팁을 사용 하 여. 약 5 분 동안 실내 온도에 장치를 품 어.
    참고: BSA 에이전트로 차단 또는 패 시 베이 션 PDMS 폴리머의 소수 성 표면에 바인딩하는 것입니다 그것의 화란을 증가 하 고 감소 셀 (세포 표면 분자)를 통해 또는 다른 단백질의 바인딩을 주로 사용 됩니다.
  3. 얇은 젤 로드 팁을 사용 하 여, (제 4)에서 resuspended 셀으로 각 채널 (그림 2B) 장치를 통해 셀의 진행률을 모니터링 하려면 콘센트 채널에 팁을 사용 하 여 로드 합니다.
    참고: 로드 P200 micropipette 최대 200 µ L 볼륨을 설정 하 고 다음 셀의 소량 (약 절반의 양을 피 펫 팁의 얇은 단면도)를 발음 하기 전에 공기의 쿠션을 발음에 의해 촉진 된다. Resuspended 셀의 볼륨 될 필요가 없습니다, PDMS 장치 볼륨은는 micropipette의 상대적으로 작은. 우리 알고 없다 상한선의 resuspended 세포의 밀도 셀 서 스 펜 션 장치에 pipetted 수 었 어 요. 셀 덩어리 장치를 방해할 수 있습니다 하 고 철저 한 pipetting 또는 소용돌이 혼합에 의해 피해 야 한다.
  4. 부드럽게 작동 장치 손상을 방지 하려면 한 번에 하나씩 콘센트 구멍에서 젤 로드 팁을 제거 합니다.
  5. 10 분 (그림 2C) 약 6000 x g에서 적절 한로 터 어댑터에 벤치 탑 microcentrifuge에서 장치 원심
    참고: microcentrifuge 회전자 (그림 2C)에 맞게 설계 된 사용자 정의 가공 알루미늄으로 터 어댑터 사용 되었다; 다른 분리기 모델은 적절 한로 터 어댑터와 함께 사용할 수 있습니다. 어댑터의 중요 한 기능은 측면 채널에 셀을 강요 함으로써 셀 참호의 닫힌된 끝의 방향으로 측면 힘을 제공 합니다.
  6. (그림 3) 현미경 성공적인 로드 확인 하지만 슬라이드 홀더/무대 장치를 부착 하지 않고 삽입.
    참고:이 프로토콜, 60 X, 1.4 나 Ph3 기름 침수 목표가이 단계에서 모두 확인 하 고 후속 이미징에 대 한 사용 됩니다.

6. 장치 조립, 평형, 및 장착

  1. 조심 스럽게 무대 삽입의 하단에 PDMS의 양쪽에 덮개 유리를 녹화 하 여 무대 삽입에 로드 된 장치를 탑재 (, 단계 삽입 장치를 부착 하기 전에 반전). 단계 삽입 장치 어셈블리를 반전 하는 PDMS 향하도록 하 고 먼지 무료 지우기 (그림 2D) 같은 부드러운 표면에 놓습니다.
  2. 단계-1 주사기 펌프 35 µ L/분의 유량을 조정 입구 바늘 그리고 콘센트 바늘 삽입 한 번에 한 차선을 사용, (, 폐기물 비 커;를 실행 그림 2E)입니다.
  3. 깨끗 한 먼지 무료 지우기와 어떤 초과 매체를 닦아 하 고 시각적으로 누수에 대 한 장치를 검사. 초과 셀 (일반적으로 혼 탁 한 줄으로 표시)과 폐기물 비 커를 향해 천천히 움직일 것 이다 중간 초승달 모양에 대 한 콘센트 튜브를 검사 합니다.
  4. 모든 연결 된 차선은 폐기물 비 커에 배출 될 때까지 약 15-30 분, 35 µ L/분에 실행 되도록 장치를 허용 합니다.
  5. 1.5 µ L/min로 1 단계 주사기 펌프를 설정 하 고 흐름을 일시 중지. (이 과정은 모두 압 연 장바구니에 그것을 배치 하 여도 왔) 현미경을 전체 펌프 및 장치 장치를 가져오고 위상-1 1.5 µ L/분에 중간 교류는 신중 하 게 탑재 단계 삽입 거꾸로 형광 현미경에 장치를 다시 시작 사용 하 여 입구와 출구 튜브를 라우팅하는 데 필요한 테이프.
  6. 이미징 장치에 원하는 위치를 찾아서 원하는 대로 이미징 시작. 세포는 일반적으로 정상 상태 지 수 단계 성장에 도달 하는 몇 시간 (약 10 세대) 필요로 하 고 이미지 수집의 발병으로 지연 될 수 있습니다 이미징 평형 기간 후 시작 하도록 원하는.
    참고: 지 수 단계에서 개최 하는 세포의 정상 성장 확인 되어야 한다 후속 이미지 분석 중 세포 분열 시간을 추적 하 고 그들은 일정 한 최소 값에 도달 했습니다 확인 하 여.

7. 매체 전환

  1. 영상의 연속 라운드, 사이 단계 1 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지 합니다. 2 단계 실리콘 튜브, 실리콘 튜브에 각각 Y 교차점의 위상-1 분기에 이동에서 바인더 클립 unclip 신중 하 게. 유엔-일시 중지 단계 2의 흐름 주사 통 펌프 (이 단계 3.8에서에서 1.5 µ L/min으로 설정 된) 하 고 이미지를 계속 합니다.
    참고: 폴리머 하류 배관의 10 cm 길이와 1.5 µ m/min에서 Y 접속점에의 두 번째 단계 매체 약 50 분에 장치에 도달. 장치에 시간은 형광 추적 입자를 포함 하는 미디어를 사용 하 여 실험적으로 테스트 수 있습니다.

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Representative Results

성공적인 초기 셀 로드, 미세 배관 장치에 연결 하기 전에 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 평가 모두 또는 거의 모든 미세 사이드 채널을 포함 하는 하나 이상의 세균 세포 ( 로 간주 될 것 이다 그림 3A). 최적의 로드 각 채널에서 여러 셀을 보여줄 것 이라고 하지만 채널 (그림 3B) 평형 기간 세포 성장으로 인해 셀과 그럼에도 불구 하 고 채울 것입니다. 가난한 로드, 있는 비교적 차선 몇 (< 50%) 측면 채널 셀와 함께 로드 됩니다 사용할 수 있습니다, 하지만 결과 데이터 밀도 각 영상 위치에 촬영 되 고 적은 세포 계보 인 낮은 것.

장치는 처음 로드 되 면, 미세 배관 연결 및 35 µ L/min의 상대적으로 높은 흐름 율에 장치를 통해 매체를 흐르는 equilibrated 이다. 평형 단계 장치에서 먹이 채널에 공기 거품과 과잉 세포를 제거 하 고 성장 하려면 사이드 채널에 세포를 격려를 제공 합니다. 있으 나 중간 흐름에 따라 장치에서 제거 된 셀 폐기물 컨테이너;으로 콘센트 튜브를 통해 이동 하는 밝은 색 밴드로 맨 눈으로 자주 관찰 될 수 있다 같은 밴드의 움직임 액체 배관 및 장치를 통해 정상적으로 흐르는 시각적 표시기 역할을 합니다. Equilibrated 장치의 현미경 검사 (그림 3B, 0 분) 측면 채널의 대부분에서 단일 파일에 몇 가지 셀을 계시 해야 한다.

일단 equilibrated 장치는 현미경에서 37 ° C에서 1.5 µ L/min 흐름 아래에 배치 됩니다, 셀 (그림 3B) 약 2 시간에 걸쳐 균일 하 고 일정 한 지 수 단계 성장을 재개 됩니다. 일정 한 지 수 성장 세포의 생성 시간에 고원의 모양으로 이미지 분석 후 직접 확인 한다. 이 시점에서, 세포 형광 또는 원하는 대로 이미징 명시에 대 한 준비가.입니다. 성공적으로 로드 하 고 equilibrated 장치 수 있습니다 일반적으로 될 안정적으로 몇 군데 이상 24 h (그림 4A, C)의 동안. 실험을 실시 될 수 있지만 또한 사건의 치명적인 세포 죽음 (그림 4D), 공기의 도입을 통해 아마도 주파수의 범위를 확장 중간 스위치 (그림 4A-C) 소개 튜브에서 성공적으로 제거 하지 했다 거품 치명적인 세포 죽음을 일으킬 수 있는 다른 이벤트는 입구에 있는 셀의 클러스터 제거 될 수 있습니다 먹이 채널을 통해 전달 그림 4D와 같이. 우리가 이해 하지 못하는 현재 왜이 치명적인 세포 죽음 장치에 원인과 우리가 아직 발생 등을 방지 하는 방법을 고안 하지.

Figure 1
그림 1: 미세 장치 회로도. 장치 회로도를 약 표시 됩니다. 알파벳 지정자는 무뚝뚝한 끝난 바늘을 연결 하는 구멍을 뚫은 입구 및 출구 영역에 함께 표시 됩니다. 일반적으로, 패턴화 된 채널의 절반은 사용 (회색 음영된). 셀 참호는 지정자 향하고 있습니다. 동반 CAD 파일 장치에 모든 기능을 보여줍니다 ( 보충 파일 1참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 미세 장치 패 시 베이 션, 로드 셀, 및 평형. (A) A BSA 포함 된 매체와 패 시 베이 션 후 보 세 장치. 젤 로드 팁 장치를 통해 매체와 셀의 흐름을 모니터링 하는 콘센트 구멍에 보관 됩니다. 중간 초승달 모양 젤 로드 팁 (화살표)의 얇은 부분에 표시 됩니다. 후 셀 (B) 장치. 셀 젤 로드 팁 (화살표)에서 반투명 흰색 레이어로 볼 수 있습니다. (C) 젤 로드 팁 사용자 정의 조작 원심 분리기 어댑터에 원심 분리 하기 전에 제거 됩니다. 의료 테이프 (블루) 쿠션 장치를 알루미늄 부품에 배치 됩니다. (D) 다음 원심 분리와 로드의 검증, 장치 현미경 단계 삽입을 녹화 및 입구와 출구 핀에 연결 된. 표시 된 이미지에서 중간 스위칭 가능한 의해 이루어집니다 핀치 밸브와 Y-커넥터 micropipette 팁 상자에서 만든 기구에 배열 하는. (E) 전체 조립된 장치, 폐기물 컨테이너에 주사기 펌프에서의 구조도 볼 수 있습니다. 콘센트 배관 작은 폐기물 비 커를 실행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 로드 및 미세 장치에서 성장 세포. (A) 왼쪽 오른쪽, 단계 대조 현미경 원심 후만 셀 로드 하기 전에 매체, 같은 셀 pipetting 통해 하지만 원심 분리, 전에 추가 된 후 장치와 같은 장치를 포함 하는 장치에서. (B) 셀 적응과 성장 장치 (LB, 37 ° C, 흐름 1.5 µ L/min)에서 시간 과정. 적응의 시작 부분에 고정 단계 세포는 비교적 짧고 좁은. 와 셀 적응 지 수 단계 성장 (60-120 분)에 반환, 그들은 길고 넓은 형태를 채택 한다. 120 분 후 장치에 있는 모든 세포는 균일 한 지 수 단계 성장 재개 되며 장치 이미징에 대 한 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 세포 성장 및 미세 장치에 전환 하는 중. (A) Kymographs 전과 성장의 중간 스위치 (회색 파선) 후 2% 에탄올으로 스트레스도 1000 분의 성장 550 분 보여주는. 이미지는 10 분 간격으로 점령 했다. 상단 패널 transcriptional mNeonGreen 기자 (녹색 채널) 스트레스 유도 유전자에 대 한 보여줍니다. 하단 패널 제정 mNeptune 기자 (빨강 채널) 자동화 된 셀 세분화에 대 한이 경우에 사용 되는 보여줍니다. (B) 클로즈업 보기 패널 A에에서 점선된 상자에서 kymographs의 부분의 중간 스위치 다음 녹색 채널에 과도 응답을 보여주는. 비록 에탄올의 존재 하면 짧은 되 고 약간 더 느린 걸음에 성장 세포 성장 스위치를 통해 계속 note. 시간 규모 가로 막대로 표시 되 고 거리는 세로 막대로 표시 됩니다. (C) 예제 에서처럼 패널 A. 실험에서 단일 셀 혈통의 형광 분석된 데이터의 흔적 파선된 수직선으로 스트레스 2% 에탄올으로 중간 스위치를 나타냅니다. (D) 실패 한 중간 스위치의 예입니다. 두 번째 중간에 셀을 도달 하면, 채널에 셀 lysed는. 스위치 (세탁 아웃 영역에 해당 다시 축소 이미지 바로 위에 표시 됩니다) 밝은 형광 신호를 일으키는 원인이 되는 주요 채널에 통과 하는 셀의 많은 수를 동반 된다. 후에 스위치를 어렴풋이 형광 세포 파편 채널에 남아 있지만 더 셀 관찰 된다. 시간 규모 가로 막대로 표시 되 고 거리는 세로 막대로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 마이크로 프로토콜이입니다 유연한 많은 단계 특정 종 또는 스트레인 또는 특정 목적에 대 한 그것의 사용을 최적화 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 실제로,이 프로토콜에 우리는 원래 "어머니 기계" 개념4 B. subtilis와 함께 그것의 사용을 최적화 하기 위해 수정을 만들었습니다. 종종, 셀 수감 된다 참호 반면이 프로토콜 사용 하 여 2 층 셀 참호, 셀을 둘러싼 얕은 채널 단일 레이어 기능을 구성 합니다. 2 층 디자인 긴 특히 영양분 및 B. subtilis 세포에서 대사 산물의 흐름을 극대화 하는 방법으로 소개 되었다 (> 75 µ m) 참호5; 그러나, 단일 레이어 기능 자주 최적의 세포 성장에 대 한 충분 하 고 특히 때 그들은 짧은 (25 µ m)4 대장균, 일반적으로 사용 됩니다. 우리는 B. subtilis 셀 체인, 확률론에서 발생 하는 주요 먹이 채널5에서 중간 흐름에 의해 그들의 참호에서 철수는 주파수를 줄일 그들은 일반적으로 긴 참호를 사용 합니다.

추가 수정, 다른 기능 차원 (예를 들어, 채널 폭) 또는 특성 (예를 들어, 모양, 열린 끝의 수) 장치를 사용 하 여 같은 적절 한 대체 수 있습니다. 예를 들어, 셀은 참호 열 (대신 현재 프로토콜에서 하나만 끝) 양쪽에의 사용은 다른 연구1,,2021에 사용 되었습니다. 그들은 끊임없이 되 고 채워진다 (반대로 어머니 기계, 어디 오래 된 셀을 추적 하 고 새로운 세포 채널에서 올려집니다), 신생아 셀 때문에 세포 노화를 방지 하는 양쪽 끝에 열려 있는 참호 있지만 사실 이전 셀 적용 됩니다 양쪽 끝으로 일반적으로 10 세대1,21보다 적은 그들의 관측 창을 제한합니다. 우리는 일반적으로 더 이상 관측 창 (수백 세대) 어머니 기계에 의해 제공 측정도 memoryless 프로세스는 대기 시간에는 수만을 가능 하 게 추구 또는 세대의 수백 긴5. 우리는 또한 포자 형성22의 우리의 분석에서 기 하 급수적으로 성장 하지 셀 관찰 하 어머니 기계 설계를 사용. 이러한 경우, 참호 의미 수 성장을 통해 추가 셀22분석.

많은 프로토콜의 단계 용 서는 상대적으로 그 프로토콜 결과 실질적으로 영향을 주지 않고 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다음 깨끗 한 물에 10 M 코 순차적 10 분 목욕 쥡니다 단계에 의해 커버 유리를 청소에 대 한 프로토콜의 이전 버전 이라고 하지만 우리는 좋은 장치 결합 및 운영 간단를 사용 하 여 달성 되었다 발견 소 프로 파 놀 기반 여기에 설명 된 단계를 청소. 본딩 문제 발생 덮개 유리의 청결에는 캐스트 의혹, 청소 하는 더 엄격한 프로토콜을 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 셀 셀 참호에 로드를 극대화 하기 위해 원심 분리 단계를 사용 하는 우리가 합리적으로 전체 로드 얻을 수 있습니다이 단계 없이 매우 집중된 셀 로드 단계에 사용 됩니다. 이 대체 전략 회전 장치를 쉽게 사용할 수 있는 원심 분리기 어댑터 없는 연구자에 대 한 특히 유용할 수 있었다. 또, 청/윤 활 에이전트 (이 프로토콜에 BSA)의 다른 농도 사용 될 수 있습니다; 우리는 정기적으로 1 mg/mL로 높은 농도 사용합니다. 어디 긴장 BSA에 민감한 있을 수 있습니다 경우에 받아들일 만한 결과 청 에이전트의 부재에도 달성 될 수 있습니다. 실제로, 미세 장치 포자 형성, 세포 기아를 요하는 검사를 사용 하 여 했다 우리가 우리 염려 했다 BSA는 셀에 대 한 잠재적인 영양 소스 역할을 수 있습니다 하 고 그래서 우리가 그것에서 생략 중간 교류 하지 않고 어떤 실질적인 관찰 불리 한 효과22.

특히, 장치를 통해 매체의 지속적인 흐름 세포 성장 술병 같은 닫힌된 시스템에 비해 약간 다른 고기를 유도 수 있습니다. 예를 들어 영양소 또는 복합 고갈 세포 중간 흐름에서 추적 화합물을 청소 자주 수 있습니다.로, 도전적 일 수 있습니다. 실제로, 우리는 기아를 통해 셀 포자 형성을 유도 하는 것이 플라스 크에 보다 미세 장치에 장시간에서는 관찰. 마찬가지로, 우리는 산화 인 산화 decoupler 카보닐기 시안 m chlorophenyl hydrazone (CCCP)를 사용 하 여 에너지 스트레스의 유도 플라스 크 문화에 보고 보다 미세 장치에 몇 높은 농도에서는 관찰 23. 따라서 일부 최적화 다른 중간 첨가제와 만족 스러운 결과 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 프로젝트는 GM018568에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 이 프로토콜 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 많은 감사 토마스 노먼과 네이 선 주 님 마음속 고 여기 고 기구의 원래 버전을 건물에 표시 된 장치를 위해 사용 하는 마스터 템플릿을 조작에 그들의 작품에 대 한 있습니다. 우리는 또한 그의 귀중 한 공동 조언을 요한 Paulsson 감사 하 고 그들의 조언과 세균 미세 기구를 지속적인된 개선에 대 한 그의 실험실의 구성원 감사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning (240)4019862 This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass VWR 48393 172
Plasma Etch PE-50 Plasma Etch Inc. PE-50 Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" Saint-Gobain PPL Corp. AAD04103 For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD HelixMark Standard Silicone Tubing 60-795-05 For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200) Molecular BioProducts 2155 For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane Pall Life Sciences 4560 For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1" McMaster-Carr 75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene Nordson Medical Y210-6005 The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope Nikon This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox Sigma-Aldrich L3022
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1 wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven VWR 414005-106 for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit 3M 2216 B/A may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width 3M to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope Nikon SMZ800N listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 To clean cover glass
Syring pump, 6 channel New Era Pump Systems Inc. NE-1600
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 a brand of dust-free wipes

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References

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