枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

Biology

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Summary

例として枯草菌を使用して個々 の細菌細胞系譜のマイクロ流体解析手法を提案します。メソッドは、しっかりと制御し、均一な生育条件下で細胞世代の何百もの観察を許可することで微生物学の伝統的な分析手法の欠点を克服します。

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Cabeen, M. T., Losick, R. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (131), e56901, doi:10.3791/56901 (2018).

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Abstract

マイクロ流体技術は、微生物学の伝統的な分析手法を制限の多くを克服します。単一セルの解像度との世代の数百に及ぶ時間長い観察併設して大量培養方法とは異なりアガロース パッドを用いた顕微鏡とは異なり厳密に管理することができる均一な生育条件があります。成長媒体の連続的な流れを分離細胞の増殖と代謝、増殖への応答と遺伝子発現の本格的な変化によって引き起こされるローカル化学環境で予測不可能な変化からマイクロ流体デバイスの細胞をから特定の刺激より自信を持って観察できます。枯草を使用ここでは「マザーマシン」を示すモデルの菌種として-細胞解析法を入力します。構築しマイクロ流体デバイスを垂直、細胞でそれをロード、顕微鏡イメージングを開始、1 つの成長媒体から別に切り替えることによって刺激する細胞を公開する方法を示します。ストレス応答の記者は、このメソッドによって得られるデータの種類を明らかにするための例として使用されます。我々 も簡単にさらに実験、細菌の胞子形成の分析などの他の種類のこのメソッドのアプリケーションを議論します。

Introduction

地球上の生命の最も顕著な特徴の 1 つは、偉大な回復力と様々 な。分子生物学の中心的な目標は、細胞の遺伝子そして蛋白質を最大限に使用彼らの成長とさまざまな環境条件下でフィットネス ロジックを理解します。この目標を達成するために科学者が、自信を持ってを確認できる必要がありますどのように個々 の細胞は、成長、分類し、特定の条件セットの下で彼らの遺伝子を表現、細胞がその後の環境の変化に反応する方法注意すること。しかし、微生物学の従来の分析方法は対処できる質問の種類に影響を与える技術的な限界にあります。たとえば、一括文化に基づく分析は長年にわたって非常に有用されているまだ意味のある細胞に変化または総人口の細胞の小さいサブ集団の行動を隠すことができる人口レベルのデータのみを提供します。光顕的観察に基づく生きた細菌の単一細胞解析は単一細胞の挙動を明らかにするも技術的に限られています。細菌成長培地を含む agarose パッドに固定されている通常細胞の成長と分裂の群衆ミクロな視点、、観測時刻1を実質的に制限するちょうど少数の細胞周期後利用できる栄養素を使い果たす 2。さらに、ローカル栄養素の枯渇と細胞増殖による代謝副産物の併用の蓄積は常に測定や予測が難しい方法でローカル セル成長環境を変化します。アガロースのパッドを使用してこのような環境変化の定常状態の動作または成長条件3の特定の変化に対する細胞応答の研究に課題があります。

マイクロ流体技術、微細加工素子を液体培地が継続的に受け渡される古典的な実験的限界への解決策を提供しています。マイクロ流体デバイスを成長媒体の流れは常に新鮮な栄養素と細胞を提供する、均一な成長を作成することにより、余分な細胞と代謝副産物を洗い流しながら、生細胞の顕微鏡検査のための位置に個々 の細胞を保つことができます。環境。一定の成長条件の下で細胞の挙動は細胞の内部ロジックの妨げられていないビューを許可する環境要因の影響から分離して観察できます。流体の流れは、マイクロ流体デバイスを防止細胞と混雑になっているから、数十または数百の世代のための単一細胞系譜の観察可能な4,5になります。このような長い観測時間は、そうでなければ検出できない長期的またはまれな細胞挙動の検出を許可します。最後に、デバイスを流れることができます変更する培地の組成は、細胞ストレスの発症に、導入、または特定の化合物の除去に対応する、観察することができます。

マイクロは、重要なアプリケーションの数をすでに楽しんでいます。例えば、それは組織、器官、または種類の人間の細胞は、生体内での条件6をシミュレートするために共培養体オンチップ デバイスで使用されています微細環境7の線虫の動きの研究のため細菌バイオ フィルム (例えば8); 間の相互作用を調べるしてカプセル化と細胞や化学物質 (例えば9) の小さなボリュームの操作。マイクロ流体デバイスが物理として特に (優秀なレビューを参照してください10および11) の微生物学の分野でますます人気のあるもになるし、流動性が自然微生物ニッチ12に似合い。例えば、マイクロ流体最近として採用されている微生物によってそのような目的の細胞成長と分裂13,14,15、病原体の動き16の分析を正確に測定監視クォーラム センシング17および生理学的転移18とタンパク質19、他の多くの例の中で数をカウントします。ここで紹介した方法の系統や種の組み合わせではなく、単一の細菌細胞系譜の解析設計されます。ここに示すマイクロ流体デバイスを利用して「マザーマシン」デザインの4細胞が単一ファイルを栽培されて 1 つのバリエーション 1 つクローズド エンドと 1 つのオープン エンド; マイクロ トレンチ内オープン エンドのうち上下にプッシュ子孫細胞成長と分裂をセル流体の流れにします。私たちの分析は、通常、海溝のクローズド エンドに限られている「母」のセルだけに集中します。我々 は以前光顕微鏡ベース単一細胞解析技術、アガロース パッドの細胞固定化などで進歩としてこのメソッドを考慮します。メソッドは他の細菌種に適用もここでモデルとして使用されますが、枯草(大腸菌は別の共通モデル; 異なるセルのサイズや形態のいくつかの種は、新しいデバイスの作製を必要があります異なる寸法)。細胞をマークし、遺伝子発現の変化を可視化する蛍光レポーターの使用遺伝子扱いやすい種の使用が必要です。しかし、細胞の増殖と形態の解析に蛍光マーカーがなくても対応可能です。

現在のプロトコルを除く5; 写真平版は、他の場所で広範囲にわたって記載されているを使用してシリコン マスターを製造する工程マスターズは、微細加工設備から簡単に外部委託も可能です。強化シリコン マスターから PDMS デバイスの成形が含まれていますカバー ガラスの部分にデバイスのボンディングマイクロ流体の入口と出口の配管の組み立て、含むピンチ弁中程度の切り替えを許可するにはデバイスを不動態化、細菌のセルの準備および細菌細胞とデバイスの読み込み配管をデバイスに接続して, 細胞;蛍光顕微鏡イメージングのためにデバイスを読み込みます。多くの別の画像集録および処理ソフトウェア ツールを使用して視覚化および金利45のさまざまなデータを分析することができます、例の画像を表示し、画像キャプチャ方法はこのプロトコルには含まれません。

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Protocol

1. PDMS 装置鋳造

  1. 埃のない環境で PDMS ポリマーと 10:1 の比率で硬化剤を混ぜるし、ドガの少なくとも 10 分のための真空の下で。
  2. ポリスチレン ペトリ板に切れ目のないアルミ箔の部分にシリコン マスター (またはのエポキシまたはポリウレタン レプリカ) を配置します。表面の泡を破るに空気の穏やかな流れの深さの約 5 mm. ドガ ペトリ プレートで少なくとも 10 分間使用するマスター シェイプの上脱 PDMS 混合物を注ぐ。
    注: 使用する 2 層デバイスの寸法に表示される付随 CAD ファイル5 (補足のファイル 1を参照してください)。プラスチック製レプリカ マスターが脱ガス; 中のフロートの一部このような場合は、きれいなプラスチック アプリケーター付きレプリカを押し下げます。
  3. 60 ° C のオーブンで 1 時間、少なくとも PDMS を治すし、室温に冷却します。ペトリ プレートからマスターと硬化 PDMS を含むアルミ箔を削除します。マスターの後ろからアルミ箔を慎重に剥がし、慎重にマスターから PDMS の皮をむきます。
    注: また、PDMS が治るかもしれない一晩室温で。シリコン ・ ウェハ マスターの相対的な脆弱性エポキシ接着剤を使用して 1/16 インチのウエハーを恒久的に結合することで解決できます-ウェハと同じサイズの厚いアルミ ディスク。
  4. ウェーハは通常 (補足ファイル 1参照) 寸法の違ういくつかのマイクロ流体デバイスを含む、クリーン、鋭いメスを使用してサイズを変更する 1 つのデバイスをカットします。
    注: ルーチン枯草の仕事、C または付属の CAD ファイルに F が付いている 1.0 μ m 全体セル塹壕でデバイスを使用します。

2. デバイス パンチと接合

  1. 半透明のオフィスのピースを配置はテープ パターン機能の可視性を高めるために装置のパターン側 (材料の表を参照してください)。入口と出口ポートは、(図 1) 表示されている流路の両端に円形の領域として識別されます。入口と出口のピンのデバイスに穴を開けるときは、視認性を向上させるため、細いマーカーを用いたドットの入口および出口をマークします。
    注: に入口と出口のピンが混雑してないことを確認、他のすべてのチャネルはパンチ、最初にデバイスのアルファベット指定子のすぐ下にチャネル。
  2. パターン側がダウンして、PDMS デバイスを反転し、0.75 mm 生検パンチ; を使用してマークのドットをデバイスを通してパンチpunchings を破棄します。
    注: 生検パンチによる穴は通常少しフレアのパンチがポリマーに入るために、デバイスが柄側を下とパンチをされています。逆向きでデバイスをパンチング穴パターン側がシャープな境界線を持っていることを保証します。
  3. 顕微鏡を使用して、デバイスの入口と出口の部分にパンチ穴が重なっているを確認します。パンチ穴から PDMS の任意の余分なフラグメントを削除するのにには、先の細いピンセットを使用します。
  4. きれいなポリスチレン ペトリ プレートにデバイスと場所の両側からほこりを削除するのにには、粘着テープを使用します。100% イソプロピル アルコールとぬれ性とクリーン ルームで拭きます; 摩擦によって 22 × 40 mm カバーガラスを準備します。乾燥した埃のない空気または窒素のストリーム。
  5. パンチ PDMS デバイス機能側を洗浄カバー ガラスと一緒に酸素プラズマ クリーナー。
    1. プラズマ治療以下の設定でデバイス: 真空、70 mTorr;O2気圧、200 mTorr;持続時間 15 秒。電源、w. 30 プラズマ治療期間が終了した直後にデバイスとカバーガラスから削除、プラズマ クリーナー。
    2. PDMS を反転し、カバーガラスのセンターに配置パターン側連絡先ガラス;(入口と出口の領域の間を実行する) 供給チャンネルがカバー ガラスの長い軸に整列することを確認します。ガラスに対して PDMS シールように非常に軽く押し込みます。
  6. 60 ° C で少なくとも 1 時間オーブンで組み立てられた装置を焼く焼成後、手動でデバイスの 1 つのコーナーにそっと押すことで、ガラス、PDMS が結合されるを確認します。
    注: デバイスを結合すると、一度それが使 24 h 内でポリマーがプラズマ処理後の時間の増加とともにますます疎水性になるので

3. マイクロ流体配管の準備

  1. ポリマー (内径 (ID) 外径 (OD) 0.06 インチ 0.02 インチ) を適切な長さに使用する場合、シリンジ ポンプからスイッチング装置に達すると顕微鏡に取り付けたときにデバイスにチューブの長さをカットします。マイクロ流体のレーンがあるので多くの長さをカットします。
  2. 切断および柔軟なシリコーンの管 (0.065 インチ OD 0.03 インチ ID) の"Y"のトップの棘、"Y"の下のバーブにシリコン チューブ 1 cm 長さ 2 cm 長さを割り当てることによって (使用する場合) ピンチ弁 Y 接合を組み立てる
  3. カット樹脂チューブ; の長さを 10 cm (または適切です)スイッチの接合部に 1 つの端を接続する"Y"の下のバーブに 1 cm シリコーン チューブ セグメントに挿入することにプラスチック注射器アダプターから曲がって約 90 ° 約 9 mm 針の端から削除されている 21 G 針にもう一方の端にそれらを接続します。
  4. 21 G 鈍針を注射器からスイッチ装置管に針を挿入することによって実行されますチューブ セグメントの一方の端に接続します。Y ジャンクションの入口バルビツール剤のシリコーン チューブ セグメント チューブの各長さの他の端に挿入します。
    注: 場所; でピンチ弁とジャンクションを保持する装置のいくつかの並べ替えを使用して、これは簡単にマイクロ ピペット チップ ボックス (図 2 D) から可能です。
  5. デバイスのプラグをコンセントから廃棄物を廃棄物を運ぶための樹脂チューブの長さをカットします。曲がった 21 G 針用意して上記のように一方の端にそれらを接続します。廃棄物ビーカーにチューブのもう一方の端をテープします。
  6. 0.1 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) を含むメディアの適切なボリュームを準備し、目的のサイズと注射器の数を入力します。インレット チューブと負荷の注射器にシリンジ ポンプに接続されている準備された 21 G 針に BSA ロードされた注射器を接続します。
    注: の各 20 mL 注射器でデバイスの 5 つのチャンネルを使用すると、典型的な実験。媒体が切り替えられる実験 5 シリンジの 2 銀行が必要になります。ここでは、最初の銀行を含むポンプ フェーズ 1 ポンプと呼ばれます、後のスイッチの中で、2 番目の銀行を含むポンプ フェーズ 2 ポンプと呼ばれます。
  7. 高流量でシリンジ ポンプを実行して、入口配管から空気をパージ (> 500 μ L/分)、シリンジ ポンプを垂直方向に定位と上部に空気の泡をもたらすため注射器をタップして開始します。空気が注射器からパージされて、一度シリンジ ポンプを水平方向に配置、徐々 にタップかの除去、空気の泡を削除にスイッチ装置を注射器から高分子線をフリックします。(メディアの切り替え) の場合は、注射器の 2 番目の銀行のこのプロセスを繰り返します。
  8. 空気の泡を削除後設定フェーズ 2 シリンジ ポンプ (すなわち、使用される媒体を第二に、スイッチの後) 1.5 μ L/分、流れを一時停止し。第 2 中期段階に対応する Y ジャンクションの分岐にフレキシブル チューブのセグメント上に小さなバインダー クリップを配置します。インレット チューブから 2 番目のメディアを削除するのには、少なくとも 30 分の適度なフロー率 (例えば、10 μ L/分) に相 1 シリンジ ポンプを実行し続ける Y ジャンクションの下流。

4. セル文化準備

  1. 固定相に必要な媒体の興味のひずみの清酒を一晩、成長します。細菌の緊張は、セルがデバイスのチャネルから泳ぐしないでください、不動、セルをレンダリングする突然変異を含める必要があります。
    注: このプロトコルでは、細菌株は枯草3610魔女A233Vの置換 (この突然変異を引き起こす螺旋状、防止の細胞の運動性ではなくまっすぐに鞭毛) を含む PrsbV- mNeonGreen細胞ストレスの記者と構成 Phyperspank- mNeptune (レッド) レポーターのセルを強調表示します。LB レノックス培地は、例のプロトコルで使用されます。マイクロ流体実験の代表的な菌株には、細胞の自動検出を容易にする 1 つ以上の蛍光転写記者と恒常生産、細胞質の蛍光タンパク質が含まれています。成長の欠陥は認められなかった LB レノックス豊富なメディアを使用した、しかし、分泌されるのでマイクロ流体条件下で最小限のメディアの枯草の成長が阻害されるかもしれないときシデロフォアは中型の流れによって洗い流されます。このような状況下では、S75011の報告として成長をクエン酸ナトリウムと、中に塩化第二鉄添加による復元があります。
  2. 実験の朝は、成長培地を 25 mL を含む困惑して 250 mL フラスコに 1:50枯草細胞を希釈します。1 より大きい光学密度 37 ° C で文化を振動で 5-6 時間細胞を成長します。
    注: 定常相細胞は小さく、頻繁に見られるセルを少なくするため高密度細胞培養が望ましいチェーン、デバイス読み込みを促進します。細菌種は、最適なローディングのための他の媒体または成長条件を必要があります。
  3. 枯草セル チェーン (エシェリヒア属大腸菌の必要はありません、他の種と必要ない場合があります) を削除する 15 mL コニカル チューブに細胞培養の約 15 mL をフィルター 5 μ m の孔径フィルターが装備する注射器を使用して。
    注: 比較的少数の細胞を削除する必要があります。濾液は混濁する必要があります。
  4. 室温で 4,000 x g で 10 分間のフィルター処理された文化を遠心します。上清を注ぎ、残りの細胞懸濁液をピペッティングを容易にする必要がある場合、新鮮な媒体の約 500 μ L を追加する管内残留液の上澄みで細胞ペレットを再懸濁します。

5. デバイス読み込み

  1. ゆっくりと空の薄いゲル読み込みマイクロ ピペットを置きます (材料の表を参照) をマイクロ流体デバイスのコンセント穴にヒントします。
  2. マイクロ チャンネル (図 2 a) の充填を監視するコンセントの穴に先端を観察入口穴に 1 mg/mL BSA を添加した培地を注入することによってデバイスをパッシベーション P200 ピペットで薄いゲル ロード ヒントを使用して、します。約 5 分間室温でデバイスを孵化させなさい。
    注意: BSA はブロックまたは不活性化剤としては、PDMS 高分子の疎水性表面にバインドその親水性を増加し、他の蛋白質または細胞 (細胞表面分子) を経由してのバインドに使用されます。
  3. 薄いゲル ロード ヒントを使用して、(セクション 4) から再懸濁細胞 (図 2 b) デバイスを介して細胞の進行状況を監視するアウトレット チャネルでヒントを使用して各チャネルを読み込みます。
    注: 読み込みは最大 200 μ L のボリュームに P200 ピペットを設定し、セルの少量 (約ピペット チップの薄いセクションの半分の量) を吸引する前に空気のクッションを吸引によって促進されます。PDMS デバイスのボリュームが、マイクロ ピペットのそれと比較して小さい、再懸濁細胞量が正確には、する必要ではありません。細胞懸濁液はデバイスに戻ことができます限り、再懸濁細胞の密度に限度額なしのわかってください。細胞塊はデバイスを詰まらせることができ、徹底的なピペッティングおよび/または渦混合によって避けるべきであります。
  4. ゆっくり 1 つずつデバイスに損傷を防ぐための作業、コンセント穴からゲルの読み込みヒントを削除します。
  5. 10 分 (図 2) の約 6,000 x g で適切なローター アダプターでベンチトップ遠心機でデバイスを遠心します。
    注: 遠心ローター (図 2) に収まるように設計されたカスタム加工アルミニウム ローター アダプターは使用された;異なる遠心モデルを使用して、適切なローター アダプターで可能性があります。アダプターの重要な特徴は、サイド チャンネルにさせ細胞細胞トレンチのクローズド エンドの方向の水平力を提供することです。
  6. 顕微鏡 (図 3) の下でロードの成功を確認、挿入なしでスライド ホルダー ・ ステージにデバイスを送れます。
    注: このプロトコルは、60 X で 1.4 NA Ph3 油浸対物レンズがこの段階で両方の検証とその後のイメージングのために使用されます。

6. デバイス アセンブリ、平衡、および取り付け

  1. 慎重にステージの挿入の下に PDMS の両側にカバーガラスをテーピングによってステージの挿入に読み込まれるデバイスをマウント (すなわちデバイスを取り付ける前にステージの挿入を反転)。PDMS を向いているので、ステージ挿入デバイス アセンブリを反転し、埃のないワイプ (図 2 D) などのソフト面に配置。
  2. フェーズ 1 シリンジ ポンプ 35 μ L/分の流量を調整する入口針し、口針を挿入、時に 1 つの車線を操作、(すなわち、廃棄物ビーカー; を実行して図 2 e)。
  3. クリーン無塵ワイパーで任意の過剰の中を拭いて、リークのためのデバイスを目視で確認します。余分なセル (通常濁ったストライプとして表示される) および廃棄物ビーカーに向かってゆっくりと移動中のメニスカスの外観のアウトレット チューブを調べます。
  4. 廃棄物ビーカーに接続されているすべてのレーンを排出しているまで 35 μ L/分約 15-30 分で実行するデバイスを許可します。
  5. フェーズ 1 シリンジ ポンプを 1.5 μ L/分に設定し、流れを停止します。(このプロセスはローリング カートにすべて配置することによって助け) 顕微鏡に全体のポンプと装置の器具を持参し、1.5 μ L/分で中型の流れは慎重に倒立蛍光顕微鏡にデバイスとステージの挿入をマウント フェーズ 1 を再起動を使用してインレットとアウトレット チューブをルートに必要なテープ。
  6. イメージング デバイス上の目的の位置を検索し、必要に応じて画像を開始します。細胞は通常数時間 (約 10 世代) 定常状態指数段階成長に到達するを必要とは、画像集録の開始が遅れる、イメージングの平衡期間後開始を希望します。
    注: 指数段階で開催された細胞の定常成長は、細胞分裂時間を追跡し、彼らが最小値は定数に達していることを確認それに続く画像解析時に確認する必要があります。

7 媒体の切り替え

  1. イメージングの連続ラウンドの間には、フェーズ 1 シリンジ ポンプの流れを一時停止します。フェーズ 2 シリコーン チューブ、シリコン チューブにそれぞれの Y ジャンクションのフェーズ 1 の分岐に移動からバインダー クリップを慎重に外します。国連-休止フェーズ 2 の流れはシリンジ ポンプ (これは 3.8 の手順で 1.5 μ L/分に設定された) とイメージングを続けます。
    注: ポリマー チューブ下流の 10 cm の長さで 1.5 μ m/分で第 2 フェーズ中 Y ジャンクションの約 50 分のデバイスに到達します。デバイスには、蛍光トレーサー粒子を含むメディアを使用して経験的テストことができます。

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Representative Results

すべてまたはほぼすべてを含む 1 つまたは複数の細菌細胞 (マイクロ流体側チャンネルの読み込み、デバイス、マイクロ流体配管を取り付ける前に位相差顕微鏡により評価した成功の最初のセルと見なされる3 a を図)。各チャンネル内の複数のセルを表示する最適な読み込みが、チャンネルはそれにもかかわらず平衡期間 (図 3 b) 細胞の増殖により細胞を詰めます。貧しい人々 を読み込むで比較的車線数 (< 50%) チャンネルがセル搭載側は使用されるかもしれませんが、結果のデータ密度が少ないセル血統各画像の位置に描画されるため低くなります。

デバイスが読み込まれる最初、マイクロ流体配管を取り付けると、中を流れる比較的高い 35 μ L/分の流量でデバイスによって平衡です。平衡のステップでは、デバイスから供給チャネルの空気の泡や余分なセルを削除して成長を開始する側のチャネルの細胞を奨励するを提供しています。廃棄物コンテナーに向かってアウトレット チューブを介して移動色の薄いバンドとして、中型の流れに応じてデバイスから削除されるセルの肉眼で観測できるしばしばこのようなバンドの動きは、流体、配管とデバイスを通常流れる視覚的なインジケーターとして機能します。平衡デバイスの顕微鏡検査 (図 3 b、0 分) 側のチャネルのほとんどで単一のファイルに閉じ込められたいくつかのセルが表示されます。

37 ° C で 1.5 μ L/分で流れの下で顕微鏡の平衡デバイスが配置されると、細胞は (図 3 b) 約 2 時間にわたって均一かつ一定の指数段階成長を再開します。定数の指数関数的成長は、細胞の生成時間で高原の出現による画像解析後直接検証すべき。この時点でセルは蛍光および/または必要に応じてイメージング明視野の準備ができています。正常に読み込まれ、平衡デバイスは通常 (図 4 a, C)、少なくとも 24 時間の期間のため確実にイメージすることができます。行うことができるが、壊滅的な細胞死イベント (図 4)、おそらく空気の導入の頻度が増加する実験の範囲を拡大中スイッチ (図 4 a-C) を導入気泡をチューブから正常に削除できませんでした。壊滅的な細胞死を引き起こす可能性があります別のイベントは、入口に位置するセルのクラスター外れになる可能性があります供給チャンネルを通過する図 4に示すように。我々 理解していない現時点ではなぜこれは、デバイスの致命的な細胞死を引き起こすし、我々 はまだこのようなイベントが発生するを防ぐ方法を考案したないです。

Figure 1
図 1: マイクロ流体デバイスの概略図。スケールにおよそデバイスの概略図が表示されます。アルファベットの指定子は、鈍終了針を接続するパンチが入口と出口ゾーンと共に表示されます。パターン化されたチャンネルの半分は、通常使用 (灰色)。セル トレンチ指定子に向かって配向しています。付属の CAD ファイル (補足のファイル 1を参照してください) デバイス上のすべての機能を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: マイクロ流体デバイスの不活性化、セルの読み込みおよび平衡します。(A) A BSA 含有培地でパッシベーション後接合デバイス。ゲルの読み込みヒントは、デバイスを通して培地および細胞の通路を監視するためのコンセント穴に保持されます。中間のメニスカスはゲルの読み込みヒント (矢印) の薄い部分に表示されます。セル読み込み後 (B) デバイスです。細胞がゲルの読み込みヒント (矢印) 半透明の白いレイヤーとして表示されます。(C) ゲルの読み込みヒントは、遠心分離機のカスタム作製アダプターで遠心分離する前に削除されます。医療用テープ (青) は、デバイスをクッションにアルミ部品に配置されます。(D) 遠心分離と負荷の検証、デバイスは顕微鏡ステージの挿入をテープで固定、入口と出口のピンに接続されています。示されているイメージの中の切り替え可能ですピンチ弁、Y 型コネクタ マイクロ ピペット チップ ボックスから作られた装置で配置されています。(E) 廃棄容器に注射器ポンプから、全体の組み立てられたデバイスの模式図。小さな廃棄物ビーカーにアウトレット チューブが実行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 読み込みとマイクロ流体デバイスの成長のセルします。(A) 遠心力荷重後セル読み込みの前にだけ媒体、ピペッティングを経由、遠心分離の前にセルを追加した後は、同じデバイスと同じデバイスを含むデバイスの右、位相差顕微鏡に左から。(B) 細胞適応と成長 (LB、37 ° C、流量 1.5 μ l/min) デバイスの時間コース。適応の初めには、定常期の細胞は比較的短く、狭いです。セル適応し、成長指数段階 (60-120 分) に戻り、彼らは長く、広い形態を採用します。120 分後にデバイスのすべてのセルが制服の指数段階成長を再開とデバイスは画像の準備ができて。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 細胞成長およびマイクロ流体デバイスの切り替え中です。(A) Kymographs 前に、ストレスとして 2% エタノールに中間スイッチ (灰色の破線) の後の成長の 1,000 分 550 分の成長を示します。10 分間隔で撮影。上部のパネルは、ストレス誘導性遺伝子の転写 mNeonGreen レポーター (グリーン チャンネル) を示しています。下のパネルは、自動セル分割のため、この場合は使用構成 mNeptune レポーター (赤のチャネル) を示しています。(B) クローズ アップ表示のパネルは破線のボックスに kymographs の部分の中のスイッチに続く緑のチャネルの過渡応答を示します。エタノールの存在により短くなるし、わずかに遅いペースで成長する細胞が、スイッチを介して成長を続けることに注意してください。タイム スケールは、水平方向のバーで示され、の距離は、垂直バーで示されます。(C) の例をパネル A に示すように実験から単一細胞系列の蛍光分析データのトレースします。縦の破線は、ストレッサーとして 2% エタノールに中間スイッチを示しています。(D) 故障中スイッチの例です。2 番目の中のセルに達すると、チャネル内のセルが分離します。スイッチと一緒に伴われる明るい蛍光信号 (色あせた地域に対応する再スケーリングされたイメージがすぐ上に表示されます) を引き起こして、メイン チャンネルで通り過ぎる細胞数が多い。スイッチの後さらに細胞が観察されなく、チャネルにぼんやりと蛍光細胞の残骸が残っているものの。タイム スケールは、水平方向のバーで示され、の距離は、垂直バーで示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このマイクロ プロトコルは柔軟性手順の多くは、特定の種やひずみ、あるいは特定の目的のための使用を最適化するために変更する場合があります。確かに、このプロトコルでは我々 は枯草と使用を最適化するために元の「マザーマシン」コンセプト4に変更を加えました。多くの場合、セルの限定トレンチはこのプロトコルでセルを囲む浅いチャネルと 2 層セル トレンチを使用に対し単一レイヤー機能を構成します。2 層の設計は特に長いに栄養素や枯草の細胞からの代謝物質のフラックスを最大にする方法として導入されました (> 75 μ m) トレンチ5;ただし、単一レイヤー機能しばしば最適な細胞の成長のために足りるし、一般的用途エシェリヒア属大腸菌、特に短い (〜 25 μ m)4のとき。主な供給チャネル5の中型の流れによってのトレンチから引き出されている枯草セル チェーンは、確率的に発生する、頻度が少なく、私たちは通常長い塹壕を使用します。

さらに別の機能寸法 (例えばチャネル幅) または特性 (例えば形状、開口端の数) を持つデバイスの使用などの変更は必要に応じて代えることができます。例えば、他の研究1,20,21が塹壕を開く (現在のプロトコルのように、のみ 1 つの端ではなく) 両端のセルの使用が使用されています。彼らは常に (母のマシンで、最古のセルを追跡、新しい細胞は、チャネルからプッシュ) ではなく新生児セルに満たされているので、両端に開いている塹壕は細胞の老化を避けるため、古い細胞をプッシュするという事実両端を通常 10 世代1,21よりも少ないために観測のウィンドウが制限されます。我々 は通常長く観測窓 (数百世代) 母機によって提供される待ち時間が何十と、メジャーも無記憶プロセスに可能にするを求める、または世代の何百もの長い5。胞子形成22の私たちの分析のように指数関数的に成長していない細胞を観察するも母のマシン デザインを使いました。このような場合は、トレンチが意味深長にすることができます成長中で追加のセルは22を分析しました。

プロトコルの手順の多くは比較的プロトコル結果を大幅に与えずに変更することがあることを許しています。例えば、10 M コで、純粋な水、お風呂 10 分連続超音波処理の手順によってカバー ガラスを洗浄するためと呼ばれるプロトコルの以前のバージョンが、良いデバイス結合と操作は簡単を使用して達成されたとわかったイソプロパノール ベースここで説明する手順をクリーニングします。カバーガラスの清潔のキャスト疑いで接着問題が起きたより厳格なクリーニングのプロトコルに戻すことをお勧めします。同様に、遠心分離のステップを使用して、セル塹壕に読み込むセルを最大化する、合理的に全負荷は、荷重ステップの非常に集中されたセルが使用されるこのステップがなくても実現できます。この代替戦略は、特にスピン デバイスに容易に利用可能なの遠心分離機のアダプターを持っていない者の役に立つかもしれない。また、不動態化潤滑剤 (このプロトコルで BSA) の異なる濃度も使用できます。我々 は日常的に 1 mg/mL の高濃度を使用します。ひずみが BSA に敏感であることの場合、許容可能な結果は、パッシベーションのエージェントがない場合でも達成されるかもしれません。確かに、セル飢餓が必要です、分生胞子形成を検討するマイクロ流体デバイスを使用していたとき私たち BSA は細胞の潜在的な栄養源として可能性があります、だから我々 それを省略した中型の流れから任意の実質的な物を観察することがなく心配していた悪影響を及ぼす22

特に、デバイスを通してメディアの連続的な流れは、フラスコなどの閉鎖系で細胞の成長と比較してわずかに異なる表現型を引き出すことができます。たとえば、細胞はしばしば中型の流れから微量の化合物を清掃できるよう、栄養や化合物の枯渇に挑戦することができます。確かに、飢餓を介して細胞胞子形成を誘導するよりもマイクロ流体デバイスをフラスコの中で長い時間を必要とする我々 が観察しています。同様に、我々 は、酸化的リン酸化デカプラー カルボニル シアン m-クロロフェニル ヒドラゾン (CCCP) を利用したエネルギー応力の誘導必要マイクロ流体デバイス フラスコ培養で報告されたよりも数倍高い濃度であることを観察しています。23します。 したがって、いくつかの最適化を別の培地添加物で満足な結果を達成するために必要があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

このプロジェクトは、GM018568 の下で健康の国民の協会によって賄われていた。このプロトコルで行われた一部中心ナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているの。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。多くのおかげでは、妊娠とここと装置の元のバージョンのビルドに示されるデバイスに使用されるマスター テンプレートを加工で自分の仕事のトーマス ・ ノーマンとネイサンの主原因です。また、ヨハン ・ アンデルセンと彼の貴重なコラボレーション アドバイスをありがとう、彼らのアドバイスや細菌マイクロ流体装置の継続的な改善の彼の研究室のメンバーに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning (240)4019862 This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass VWR 48393 172
Plasma Etch PE-50 Plasma Etch Inc. PE-50 Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" Saint-Gobain PPL Corp. AAD04103 For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD HelixMark Standard Silicone Tubing 60-795-05 For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200) Molecular BioProducts 2155 For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane Pall Life Sciences 4560 For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1" McMaster-Carr 75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene Nordson Medical Y210-6005 The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope Nikon This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox Sigma-Aldrich L3022
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1 wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven VWR 414005-106 for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit 3M 2216 B/A may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width 3M to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope Nikon SMZ800N listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 To clean cover glass
Syring pump, 6 channel New Era Pump Systems Inc. NE-1600
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 a brand of dust-free wipes

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References

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