Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

Biology

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Summary

Presentiamo un metodo per l'analisi di microfluidica di lignaggi di singola cellula batterica utilizzando Bacillus subtilis come esempio. Il metodo sormonta le imperfezioni dei tradizionali metodi analitici in microbiologia, consentendo l'osservazione di centinaia di generazioni di cellulari in condizioni di crescita uniforme e ben controllabile.

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Cabeen, M. T., Losick, R. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (131), e56901, doi:10.3791/56901 (2018).

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Abstract

Tecnologia microfluidica supera molte delle limitazioni ai tradizionali metodi analitici in microbiologia. A differenza dei metodi di cultura di massa, offre risoluzione cella singola e lunga osservazione volte spanning centinaia di generazioni; a differenza dell'agarosi basati su pad microscopia, ha condizioni di crescita uniforme che possono essere strettamente controllate. Perché il flusso continuo di crescita medio consente di isolare le cellule in un dispositivo microfluidico da imprevedibili variazioni nell'ambiente chimico locale causato dalla crescita delle cellule e del metabolismo, autentici cambiamenti nell'espressione genica e la crescita delle cellule in risposta a stimoli specifici possono essere osservati con maggiore sicurezza. Bacillus subtilis è utilizzato qui come una specie batterica di modello per dimostrare una "macchina madre"-digitare metodo per analisi cellulare. Vi mostriamo come costruire e scandagliare un dispositivo microfluidico, caricarlo con cellule, avviare la formazione immagine microscopica e di esporre le cellule ad uno stimolo di commutazione da una coltura a altra. Un reporter lo stress-sensible a reagire è utilizzato come esempio per rivelare il tipo di dati che possono essere ottenuti da questo metodo. Inoltre brevemente discutiamo ulteriori applicazioni di questo metodo per altre tipologie di esperimenti, quali l'analisi di sporulazione batterica.

Introduction

Una delle caratteristiche più sorprendenti della vita sulla terra è la sua ottima resilienza e varietà. Un obiettivo centrale della biologia molecolare è di capire la logica con cui le cellule usano geni e proteine per massimizzare la loro crescita e fitness sotto un'ampia varietà di condizioni ambientali. Per raggiungere questo obiettivo, gli scienziati devono essere in grado di osservare con fiducia come crescono le singole celle, dividono ed esprimono loro geni sotto un dato insieme di condizioni, notando come le cellule rispondono alle successive modifiche nel loro ambiente. Tuttavia, i tradizionali metodi analitici in microbiologia hanno limitazioni tecniche che interessano i tipi di domande che possono essere affrontate. Ad esempio, analisi basati sulla cultura di massa sono stati molto utili nel corso degli anni, ma offrono solo dati a livello di popolazione che possono mascherare significative variazioni di cellula--cellula o i comportamenti di più piccole sottopopolazioni di cellule nella popolazione totale. Analisi unicellulare di batteri viventi basati su microscopia chiara rivelano unicellulare comportamento ma anche tecnicamente limitati. Batteri in genere sono immobilizzati su agarosi pastiglie contenenti terreno di coltura, ma folle crescita e divisione di cella la vista al microscopio e impoverisce i nutrienti disponibili dopo pochi cicli cellulari, sostanzialmente limitando il tempo di osservazione1, 2. Inoltre, lo svuotamento locale di sostanze nutritive e la concomitante formazione di sottoprodotti metabolici a causa della crescita delle cellule sono costantemente l'ambiente di crescita delle cellule locali in modi che sono difficili da misurare o prevedere. Tali cambiamenti ambientali usando agarosio rilievi rappresentano una sfida agli studi dei comportamenti stazionario o delle risposte cellulari agli specifici cambiamenti nella crescita condizioni3.

Tecnologia microfluidica, in cui un mezzo liquido è attraversato continuamente i dispositivi microfabbricati, offre una soluzione al classici limiti sperimentali. Un dispositivo microfluidico può mantenere singole celle in posizione per microscopia di cellule vive, mentre il flusso del mezzo di crescita costantemente cellule fornisce i nutrienti fresche e lava via i sottoprodotti metabolici e cellule in eccesso, creando così una crescita altamente uniforme ambiente. In condizioni di costante crescita, i comportamenti delle cellule possono essere osservati in isolamento dall'influenza di fattori ambientali, permettendo una vista ai confini della logica interna delle cellule. Come il flusso del fluido impedisce che il dispositivo microfluidico diventando affollato con le cellule, osservazione dei lignaggi di singola cellula per decine o centinaia di generazioni diventa possibile4,5. Tali tempi di osservazione lungo consentono la rilevazione di comportamenti non altrimenti rilevabili rari o a lungo termine delle cellule. Infine, la composizione del mezzo che attraversa il dispositivo può essere modificato a volontà, permettendo che le cellule devono essere rispettate come rispondono all'insorgenza di uno stress o per l'introduzione o la rimozione di un particolare composto.

Microfluidica ha già goduto di un numero di importanti applicazioni. Per esempio, è stato utilizzato in tessuto, organo o dispositivi di corpo-on-a-chip, in cui più tipi di cellule umane sono co-coltivati per simulare un in vivo condizione6; per lo studio del movimento del nematode in ambienti microstrutturata7; per esaminare le interazioni tra i biofilm batterici (ad es., 8); e per l'incapsulamento e la manipolazione di piccoli volumi di cellule o sostanze chimiche (ad es., 9). Dispositivi microfluidici sono diventati sempre più popolari nel campo della microbiologia (per recensioni eccellenti, Vedi 10 e 11), soprattutto come loro fisico e proprietà di flusso sono ben abbinati a nicchie microbiche naturali12. Per esempio, microfluidica è stato recentemente impiegato da microbiologi per tali scopi come misura precisamente cella crescita e divisione13,14,15, analizzando patogeno movimento16, monitoraggio di quorum sensing17 e transizioni fisiologico18e per la proteina contando19, fra molti altri esempi. Il metodo presentato qui è specificamente progettato per l'analisi dei lignaggi di singola cellula batterica piuttosto che combinazioni di specie o ceppi. Il dispositivo microfluidico dimostrato qui utilizza una variante di "macchina madre" design4, in cui le cellule sono coltivate file singolo all'interno di una trincea di microfluidica con un'estremità chiusa e una aperta; divisione e crescita delle cellule spinge le cellule progenie e fuori l'estremità aperta nel flusso del fluido. Le nostre analisi in genere concentrano solo sulla cella "madre" che si limita all'estremità chiusa della trincea. Consideriamo questo metodo come un avanzamento sopra precedente leggeri basato su microscopia unicellulare tecniche analitiche, quali immobilizzazione delle cellule su agarosio pastiglie. Mentre b. subtilis è utilizzato come un modello di qui, il metodo è applicabile ad altre specie batteriche (Escherichia coli è un altro modello comune; alcune specie con celle di diverse dimensioni o morfologie possono richiedere la realizzazione di nuovi dispositivi con dimensioni diverse). L'uso di reporter fluorescenti per contrassegnare le celle e di visualizzare i cambiamenti nell'espressione genica richiede l'uso di specie geneticamente trattabili; Tuttavia, l'analisi della crescita delle cellule e la morfologia sono possibili anche senza marcatori fluorescenti.

Il presente protocollo esclude il processo di fabbricare il maestro di silicio mediante fotolitografia, che è stato ampiamente descritta altrove5; Master può anche essere facilmente in outsourcing da strutture di microfabbricazione. Esso comprende lo stampaggio di un dispositivo PDMS da un maestro di silicone rinforzato; incollaggio al dispositivo di un pezzo di vetro di copertura; montaggio l'entrata di microfluidica e tubature di scarico, compreso pizzico valvole per consentire la commutazione medie; passivante del dispositivo, la preparazione delle cellule batteriche e caricamento della periferica con cellule batteriche; Collegare l'impianto idraulico al dispositivo ed equilibrare le cellule; e caricamento della periferica su un microscopio a fluorescenza per l'imaging. Perché molti diversi immagine acquisizione ed elaborazione software strumenti possono essere utilizzati per visualizzare e analizzare dati diversi di interesse4,5, immagini di esempio sono mostrate, ma metodi di acquisizione delle immagini non sono inclusi nel presente protocollo.

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Protocol

1. PDMS dispositivo Casting

  1. In un ambiente privo di polvere, mescolare polimero PDMS e agente indurente con un rapporto 10:1 e degassare sotto vuoto per almeno 10 min.
  2. Posizionare un maestro di silicio (o di una resina epossidica o poliuretano replica della stessa) su un pezzo di carta stagnola ininterrotta in una piastra di Petri in polistirolo. Versare il composto PDMS degassato sopra il padrone ad una profondità di circa 5 mm. Degas la piastra di Petri per almeno 10 min. uso un leggero getto d'aria per rompere le bolle superficiali.
    Nota: Le dimensioni del dispositivo due-tiered utilizzato sono disponibili in accompagnamento5 file CAD (Vedi supplementari File 1). Un master in plastica replica parzialmente può galleggiare durante il degasaggio; in questo caso, spingere verso il basso la replica con un applicatore di plastica pulito.
  3. Curare il PDMS per almeno 1 ora in forno a 60 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. Rimuovere il foglio di alluminio contenente il PDMS master e curata dalla piastra di Petri. Rimuovere con cautela il foglio di alluminio dalla parte posteriore del Maestro, quindi rimuovere con cautela il PDMS dal master.
    Nota: In alternativa, PDMS, possono essere curate durante la notte a temperatura ambiente. La relativa fragilità di un maestro di wafer di silicio può essere superata utilizzando adesivo epossidico per legare definitivamente la cialda di un 1/16 di pollice-disco di alluminio di spessore della stessa dimensione come la cialda.
  4. Come un wafer in genere include diversi dispositivi microfluidici con dimensioni leggermente diverse (vedere 1 File supplementari), taglia una singola periferica a misura con un bisturi affilato, pulito.
    Nota: Per b. subtilis lavoro di routine, usare dispositivi con trincee 1.0-µm a livello cellulare, che sono segnate con una C o F nel file CAD associato.

2. dispositivo di punzonatura e incollaggio

  1. Posto un pezzo di traslucido ufficio nastro (Vedi Tabella materiali) sul lato disegnato del dispositivo per migliorare la visibilità delle feature. Le porte di ingresso e di uscita sono identificate come aree circolari alle estremità opposte dei canali fluidici visibile (Figura 1). Per migliorare la loro visibilità quando forando il dispositivo per i pin di ingresso e uscita, contrassegnare gli ingressi e le uscite con i puntini con un pennarello a punta fine.
    Nota: Per garantire che i pin di ingresso e di uscita non sono affollati, ogni altro canale è perforato, cominciando con il canale appena sotto la designazione alfabetica per il dispositivo.
  2. Capovolgere il dispositivo PDMS, in modo che il lato disegnato è giù e perforare attraverso il dispositivo per i punti contrassegnati usando un punzone per biopsia 0,75 mm; scartare le punzonature.
    Nota: I dispositivi sono perforati con lato disegnato verso il basso perché il buco generato dal Punzone biopsia in genere è leggermente svasato dove il pugno entra il polimero. Il dispositivo in un orientamento invertito di punzonatura assicura che il foro sul lato disegnato ha un bordo tagliente.
  3. Utilizzando un microscopio stereoscopico, assicurarsi che i fori si sovrappongono con le aree di ingresso e di uscita del dispositivo. Utilizzare una pinzetta punta fine per rimuovere eventuali frammenti estranei di PDMS da fori perforati.
  4. Utilizzare nastro adesivo per rimuovere la polvere da entrambi i lati del dispositivo e del luogo in una piastra di Petri pulita in polistirolo. Preparare un vetro di copertura 22 x 40 mm bagnando con 100% di alcol isopropilico e strofinando con un panno di camere sterili; asciugare con un flusso di aria priva di polvere o azoto.
  5. Posizionare il perforato PDMS dispositivo funzionalità lato fino insieme con il vetro di copertura pulito in un plasma ad ossigeno pulitore.
    1. Plasma-trattare il dispositivo con le seguenti impostazioni: vuoto, mTorr 70; O pressione2 , 200 mTorr; durata, 15 s; potenza, 30 w. immediatamente al termine del periodo di trattamento al plasma, rimuovere il dispositivo e copertura in vetro dal plasma pulitore.
    2. Invertire il PDMS e posizionarlo al centro del vetro di copertura, in modo che contatti lato disegnato il vetro; Assicurarsi che i canali di alimentazione (in esecuzione tra le aree di ingresso e uscita) siano allineati con l'asse lungo il vetro di copertura. Premere molto delicatamente per assicurarsi che le guarnizioni PDMS contro il vetro.
  6. Cuocere il dispositivo assemblato in un forno per almeno 1 h a 60 ° C. Dopo la cottura, verificare manualmente che il PDMS è incollato al vetro spingendo delicatamente su un angolo del dispositivo.
    Nota: Una volta che il dispositivo è legato, è consigliabile utilizzarla entro 24 h, come il polimero diventerà sempre più idrofobo con l'aumento di tempo dopo il trattamento al plasma.

3. impianto idraulico microfluidici preparazione

  1. Tagliare lunghezze di polimero tubi (diametro interno (ID) 0,02 pollici, diametro esterno (OD) 0,06 pollici) per lunghezze adeguate per raggiungere da pompa a siringa all'apparato di commutazione (se utilizzato) e il dispositivo quando è montato sul microscopio. Tagliare lunghezze come molti come ci sono corsie di microfluidica.
  2. Montare Y giunzioni per valvole a manicotto (se usando) taglio e collegando 2 cm lunghezze di silicone flessibile tubazione (0.03 pollici ID, 0,065 pollici OD) per le barbe superiore del "y" e lunghezze di 1 cm di tubo in silicone per la sbavatura di fondo del "y".
  3. Lunghezza di 10 cm (o appropriato) taglio di tubi di polimero; collegarli ad un'estremità fino al bivio di interruttore inserendo i segmenti di tubo in silicone 1 cm su barb inferiore del "y". Collegarli a altra estremità per aghi G 21 che sono stati rimossi dal loro piegato circa 90 ° circa 9 mm dall'estremità dell'ago e siringa di plastica adattatori.
  4. Collegare aghi smussato 21G a un'estremità dei segmenti di tubo che verrà eseguito dalle siringhe all'apparato interruttore inserendo gli aghi nel tubo. Inserire l'altra estremità di ogni tubo lunghezza i segmenti di tubo in silicone sugli strali di ingresso delle giunzioni Y.
    Nota: Utilizzare una sorta di apparecchio per tenere le valvole a manicotto e giunzioni sul posto; Questo può essere fatto facilmente da una casella di punta della micropipetta (Figura 2D).
  5. Tagliare lunghezze di tubo di polimero per trasportare rifiuti dalla presa del dispositivo in un recipiente di scarico. Collegarli ad una estremità ad aghi piegati 21G preparato come descritto sopra. L'altra estremità dei tubi del nastro in un becher da rifiuti.
  6. Preparare volumi appropriati di supporto contenente 0,1 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e riempire la dimensione desiderata e il numero delle siringhe. Collegare le siringhe BSA-caricati gli aghi 21G preparato allegati per le siringhe di tubazione e carico di ingresso in pompe a siringa.
    Nota: per tipici esperimenti 5 canali del dispositivo vengono utilizzati, ciascuno con una siringa da 20 mL. Un esperimento in cui il mezzo è commutato richiederà 2 banchi da 5 siringhe. Qui, la pompa contenente la prima banca è indicata come la pompa di fase 1 e la pompa contenente la seconda banca, con il mezzo di post-interruttore, è indicata come la pompa di fase-2.
  7. Spurgare l'aria dall'impianto idraulico ingresso eseguendo le pompe siringa ad un'alta portata (> 500 µ l/min), inizio orientando le pompe siringa verticalmente e toccando le siringhe per portare le bolle d'aria verso l'alto. Una volta che l'aria è stata eliminata dalle siringhe, posizionare la pompa a siringa orizzontalmente e progressivamente tocca o scorri verso l'alto le linee di polimero dalle siringhe attraverso l'interruttore dell'apparecchio sloggiare ed eliminare le bolle d'aria. Ripetere questo processo per la seconda banca di siringhe (se media di commutazione).
  8. Dopo le bolle d'aria vengono eliminate, impostare la pompa a siringa di fase-2 (cioè, con il mezzo che verrà utilizzato secondo, dopo l'interruttore) a 1,5 µ l/min, quindi sospendere il flusso. Piccolo raccoglitore posto aggancia i segmenti di tubi flessibili sul ramo delle giunzioni Y corrispondente alla seconda fase media. Continuare a eseguire la pompa a siringa di fase-1 ad una modesta portata (per esempio, 10 µ l/min) per almeno 30 min eliminare il mezzo secondo dal tubo dell'aspirazione a valle della giunzione Y.

4. cellula cultura preparazione

  1. Crescere una coltura del ceppo di interesse per il mezzo desiderato durante la notte, alla fase stazionaria. Il ceppo batterico dovrebbe contenere una mutazione che rende immobile, le cellule che le cellule non nuotare fuori i canali del dispositivo.
    Nota: In questo protocollo, il ceppo batterico è Bacillus subtilis 3610 contenente un hagA233V sostituzione (questa mutazione causa il flagello dritto piuttosto che di motilità cellulare elicoidale, prevenendo), un PrsbV- mNeonGreen Reporter per stress cellulare e costitutiva reporter Phyperspank- mNeptune (rosso) per evidenziare le celle. LB Lennox mezzo è usato nel protocollo di esempio. Tipici ceppi per esperimenti di microfluidica contengono uno o più reporter fluorescenti trascrizionale e una proteina fluorescente citoplasmica, costitutivamente prodotta per facilitare la rilevazione automatizzata delle cellule. Difetti di crescita non sono stati osservati quando mezzo ricco LB Lennox è stato usato, ma crescita di b. subtilis in media minima può essere inibita in condizioni di microfluidica perché secreto siderofori vengono lavati via dal flusso medio. In tali circostanze, crescita può essere ripristinato mediante l'aggiunta di citrato di sodio e cloruro ferrico al medium, come segnalato per S750 media11.
  2. La mattina dell'esperimento, diluire le cellule di b. subtilis 01:50 in una beuta da 250 mL sconcertato contenente 25 mL di terreno di coltura. Crescere le cellule per 5-6 h in agitazione la coltura a 37 ° C per una densità ottica di maggiore di 1.
    Nota: È preferibile una coltura cellulare denso perché la fase stazionaria Bacillus subtilis cellule sono più piccole e meno cella spesso trovata in catene, facilitando il caricamento del dispositivo. Diverse specie batteriche possono richiedere altre condizioni medie o crescita per un carico ottimale.
  3. Usando una siringa graduata con un filtro di dimensioni dei pori di 5 µm, filtrare circa 15 mL di coltura cellulare in una provetta conica da 15 mL per togliere le catene delle cellule di b. subtilis (è inutile per e. coli e potrebbe non essere necessario con altre specie).
    Nota: Relativamente poche cellule devono essere rimosso; il filtrato deve essere torbido.
  4. Centrifugare la cultura filtrata per 10 min a 4.000 x g e a temperatura ambiente. Versare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nel sovranatante residuo rimanente nel tubo, eventualmente facilitare la sospensione cellulare di pipettaggio, aggiungendo circa 500 µ l di terreno fresco.

5. il dispositivo caricamento

  1. Posizionare delicatamente vuota sottile gel-caricamento micropipetta punte (Vedi Tabella materiali) nei fori di uscita del dispositivo microfluidico.
  2. Utilizzando sottile gel-caricamento suggerimenti con una micropipetta P200, passivare il dispositivo iniettando mezzo contenente 1 mg/mL BSA nei fori d'ingresso, osservando i suggerimenti nei fori di uscita per monitorare il riempimento dei canali microfluidici (Figura 2A). Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per circa 5 min.
    Nota: BSA è comunemente usato come un agente blocco o passivazione che si legherà alla superficie idrofoba del polimero PDMS, aumentando la sua idrofilia e riducendo l'associazione di altre proteine o di cellule (via molecole di superficie delle cellule).
  3. Utilizzando sottile gel-caricamento suggerimenti, caricare ogni canale con le cellule del sedimento (dalla sezione 4), utilizzando i suggerimenti nel canale di uscita per monitorare l'avanzamento delle cellule attraverso il dispositivo (Figura 2B).
    Nota: Il caricamento è facilitato impostando la micropipetta P200 al suo volume massimo 200-µ l e quindi aspirare un cuscino d'aria prima aspirando un piccolo volume (circa la metà del volume della sezione sottile della punta della pipetta) delle cellule. Il volume di sedimento cellule non deve essere preciso, poiché il volume del dispositivo PDMS è piccolo rispetto a quello della micropipetta. Sappiamo di nessun limite superiore per la densità delle cellule del sedimento, fino a quando la sospensione delle cellule può essere dispensata nel dispositivo. Grumi di cellule possono intasare il dispositivo e dovrebbero essere evitati da pipettaggio approfondita e/o vortice di miscelazione.
  4. Rimuovere delicatamente le punte di gel-caricamento dai fori di uscita, lavorando uno alla volta per evitare danni al dispositivo.
  5. Centrifugare il dispositivo in una microcentrifuga banco in un adattatore appropriato rotore a circa 6.000 x g per 10 min (Figura 2).
    Nota: È stato utilizzato un adattatore di rotore di custom-lavorati in alluminio che è stato progettato per adattarsi in un microcentrifuga rotore (Figura 2); centrifuga diversi modelli possono essere utilizzati con adattatori appropriati rotore. La caratteristica importante dell'adattatore è che esso fornisce forza laterale in direzione delle estremità chiuse delle trincee cella, costringendo le cellule nei canali laterali.
  6. Verificare caricamento riuscito sotto il microscopio (Figura 3), ma senza il dispositivo alla diapositiva titolare/fase di apposizione inserire.
    Nota: In questo protocollo, un 60 X, 1,4 obiettivo a immersione in olio NA Ph3 è usato per entrambi verifica in questa fase e per formazione immagine successiva.

6. montaggio, equilibratura e montaggio del dispositivo

  1. Attentamente montare il dispositivo caricato su un inserto di fase toccando il vetro di copertura su entrambi i lati di PDMS alla parte inferiore dell'inserto fase (cioè, invertire l'inserto di fase prima di fissare il dispositivo). L'Assemblea di inserto-dispositivo di fase il PDMS è rivolto verso l'alto e posizionarlo su una superficie morbida, come un panno privo di polvere (Figura 2D).
  2. Regolare la portata della pompa, phase-1 siringa per 35 µ l/min lavorando con una corsia per volta, inserire l'ago di aspirazione e quindi l'ago di presa (cioè, in esecuzione per il contenitore dei rifiuti; Figura 2E).
  3. Spazzare via ogni eccesso del prodotto con un panno pulito privo di polvere e ispezionare visivamente il dispositivo di tenuta. Esaminare il tubo di uscita per la comparsa di cellule in eccesso (in genere che appare come una striscia torbida) e il menisco medio, che si sposta lentamente verso il contenitore dei rifiuti.
  4. Consentire al dispositivo di eseguire a 35 µ l/min per circa 15-30 min, fino a quando tutte le corsie collegate sono drenante nel contenitore dei rifiuti.
  5. Impostare la pompa a siringa di fase-1 a 1,5 µ l/min e sospendere il flusso. Portare l'intero apparato di pompa e dispositivo al microscopio (questo processo è aiutato mettendolo tutto su un carrello dei Rolling Stones) e riavviare la fase-1 flusso medio a 1,5 µ l/min con attenzione montare l'inserto di fase con il dispositivo su un microscopio a fluorescenza invertito, utilizzando nastro come necessario per instradare l'ingresso e il tubo di uscita.
  6. Individuare posizioni desiderate sul dispositivo per l'imaging e iniziare la formazione immagine come desiderato. Si noti che le cellule richiedono in genere un paio d'ore (circa 10 generazioni) per raggiungere allo steady-state fase esponenziale crescita, e l'insorgenza di acquisizione delle immagini può essere ritardata come desiderato in modo che la formazione immagine inizia dopo il periodo di equilibrazione.
    Nota: La crescita di stato stazionario delle cellule tenuto in fase esponenziale deve essere verificata durante l'analisi di immagine successiva da rilevamento tempi di divisione cellulare e garantire che essi hanno raggiunto un valore minimo costante.

7. media di commutazione

  1. Tra successivi turni di imaging, mettere in pausa il flusso della pompa siringa di fase-1. Attentamente e sganciare la clip di legante da fase-2 silicone tubing, ciascuno per la tubazione del silicone in movimento sul ramo della giunzione Y fase-1. ONU-pausa il flusso della fase-2 siringa pompa (che è stata impostata su 1,5 µ l/min al punto 3.8) e continuare la formazione immagine.
    Nota: A 1,5 µm/min con una lunghezza di 10 cm del polimero della tubazione a valle delle giunzioni Y, il mezzo di seconda fase raggiunge il dispositivo in circa 50 min. Il tempo per il dispositivo può essere verificato empiricamente utilizzando supporti che contengono particelle di tracciante fluorescente.

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Representative Results

Successo iniziale delle cellule di carico, come valutato da microscopia di contrasto di fase prima di collegare l'impianto idraulico di microfluidica al dispositivo, sarebbe considerato come avendo tutti o quasi tutti i canali di lato di microfluidica contenente uno o più cellule batteriche ( Figura 3A). Carico ottimale avrebbe mostrato diverse celle in ogni canale, ma canali comunque si riempiranno di cellule a causa della crescita delle cellule durante il periodo di equilibrazione (Figura 3B). Corsie con caricamento poveri, in cui relativamente pochi (< 50%) lato canali vengono caricati con le cellule, può essere utilizzato, ma la densità di dati risultante sarà inferiore a causa di linee cellulari meno essere imaged in ogni posizione di imaging.

Una volta che il dispositivo viene inizialmente caricato, esso è equilibrata collegando l'impianto idraulico di microfluidica e attraversante medio il dispositivo ad una relativamente alta portata di 35 µ l/min. Il passo di equilibrazione serve per rimuovere le bolle d'aria e le cellule in eccesso nel canale di alimentazione dell'apparecchio e per incoraggiare le cellule nei canali laterali per iniziare a crescere. Le cellule che vengono rimossi dal dispositivo su flusso medio spesso possono essere osservate ad occhio nudo come una banda di colore chiaro si muove attraverso il tubo di uscita verso il contenitore dei rifiuti; il movimento di tali bande serve come un indicatore visivo che fluido scorre normalmente attraverso l'impianto idraulico e il dispositivo. Ispezione al microscopio di un dispositivo equilibrato dovrebbe rivelare alcune cellule confinate in unico file nella maggior parte dei canali laterali (Figura 3B, min 0).

Una volta che un dispositivo equilibrato è posizionato sul microscopio sotto flusso a 1,5 µ l/min a 37 ° C, le cellule riprenderà uniforme e costante crescita esponenziale-fase nel corso di circa 2 h (Figura 3B). Costante crescita esponenziale deve essere verificata direttamente dopo l'analisi di immagine dall'aspetto di un altopiano nel tempo di generazione delle cellule. A questo punto, le cellule sono pronte per fluorescenza e/o il campo chiaro imaging come desiderato. Un dispositivo correttamente caricato ed equilibrato in genere possa essere imaged in modo affidabile per periodi di almeno 24 h (Figura 4A, C). L'introduzione di un interruttore medio (Figura 4AC) amplia la gamma degli esperimenti che possono essere condotte, ma aumenta anche la frequenza di eventi catastrofici di morte delle cellule (Figura 4), presumibilmente attraverso l'introduzione di aria bolle che non sono state eliminate correttamente dal tubo. Un altro evento che può causare morte cellulare catastrofica è che aggregati di cellule situate all'ingresso possono diventare sloggiati e passano attraverso il canale di alimentazione, come mostrato in Figura 4. Non attualmente capiamo perché questo causa morte cellulare catastrofico nel dispositivo, e non abbiamo ancora inventato un metodo per impedire tali eventi.

Figure 1
Figura 1: schema del dispositivo microfluidico. Un dispositivo schematico è mostrato in scala approssimativa. La designazione alfabetica è etichettata con le zone di ingresso e di uscita sono perforate per collegare gli aghi smussato-conclusa. In genere, la metà dei canali a motivi vengono utilizzata (ombreggiata grigio). Le trincee di cella sono orientate verso il designatore. Il file CAD (Vedi supplementari File 1) Mostra tutte le funzioni sul dispositivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: microfluidici passivazione del dispositivo, il caricamento di cella ed equilibrazione. (A) A dispositivo legato dopo passivazione con medium contenente BSA. Consigli di gel-caricamento sono tenuti nei fori di uscita per monitorare il passaggio dei media e delle cellule attraverso il dispositivo. Il menisco medio è visibile nella parte sottile delle punte gel-caricamento (freccia). (B) dispositivo dopo il caricamento di cella. Le cellule sono visibili come uno strato bianco traslucido del gel-caricamento suggerimenti (freccia). (C) il gel-caricamento suggerimenti vengono rimossi prima centrifugazione in un adattatore personalizzato-fabbricato centrifuga. Nastro medico (blu) è posizionato sulle parti in alluminio per attutire il dispositivo. (D) a seguito di centrifugazione e di verifica del carico, il dispositivo è registrato da un inserto di fase di microscopio e collegato ai pin di ingresso e di uscita. Nell'immagine riportata, medie di commutazione è reso possibile da valvole a manicotto e Y-connettori disposti in un apparato fatto da una casella di punta della micropipetta. (E) rappresentazione schematica di un intero dispositivo assemblato, dalle pompe siringa nel contenitore dei rifiuti. Il tubo di uscita viene eseguito in un piccolo bicchiere dei rifiuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: cella di carico e crescita nel dispositivo microfluidico. (A) da sinistra a destra, micrografi di contrasto di fase di un dispositivo contenente medio solo prima del caricamento delle cellule, lo stesso dispositivo dopo che le cellule sono state aggiunte tramite pipettaggio ma prima centrifugazione e lo stesso dispositivo dopo carico centrifugo. (B) corso di tempo di adattamento delle cellule e la crescita nel dispositivo (LB, 37 ° C, portata 1,5 µ l/min). All'inizio di adattamento, le cellule di fase stazionaria sono relativamente corto e stretto. Come le cellule adattano e tornare alla fase esponenziale crescita (60-120 min), essi adottano una morfologia più lunga e larga. Dopo 120 min, tutte le celle nel dispositivo sono ripresa uniforme fase esponenziale crescita e il dispositivo è pronto per l'imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: crescita delle cellule e medio d'interruzione nel dispositivo microfluidico. Chimografi (A) risultati 550 min di crescita prima e 1.000 min di crescita dopo un cambio medio (linea tratteggiata grigia) in 2% etanolo come un fattore di stress. Immagini sono state catturate a intervalli di 10 min. Il pannello superiore mostra un reporter mNeonGreen trascrizionale (canale verde) per un gene indotto da stress. Il pannello inferiore mostra un reporter di mNeptune costitutiva (canale rosso) che viene utilizzato in questo caso per la segmentazione delle cellule automatizzato. Primo piano (B) Mostra delle porzioni di chimografi nella casella tratteggiata nel pannello A, mostrando una risposta transitoria nel verde del canale segue il parametro medio. Si noti che la crescita continua attraverso l'interruttore, anche se la presenza dell'etanolo induce le cellule a diventare più breve e crescono a un ritmo leggermente più lento. Scala temporale è indicata dalla barra orizzontale, e la distanza è indicata dalla barra verticale. Esempio (C) le tracce dei dati analizzati di fluorescenza di una stirpe di singola cellula dall'esperimento mostrato nel pannello A. Le linee tratteggiate verticali indicano l'interruttore medio in 2% etanolo come un fattore di stress. (D) esempio di un interruttore di media non riuscito. Quando il secondo mezzo raggiunge le cellule, le cellule nei canali vengono lisate. L'interruttore è accompagnata da un gran numero di cellule che passano nel canale principale, causando un segnale luminoso fluorescente (un'immagine nuovamente in scala corrispondente alla regione slavata è mostrata proprio sopra di esso). Dopo il passaggio, ulteriori cellule non sono osservate, anche se detriti cellulari scarsamente fluorescente rimane nei canali. Scala temporale è indicata dalla barra orizzontale, e la distanza è indicata dalla barra verticale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo di microfluidica è flessibile in quanto molti dei passaggi possono essere modificate per ottimizzarne l'uso con una particolare specie o ceppo o per uno scopo specifico. In questo protocollo, infatti, abbiamo fatto modifiche al concetto "macchina madre" originale4 per ottimizzarne l'uso con Bacillus subtilis. Spesso, le trincee in cui le cellule sono confinate costituiscono una caratteristica di monostrato, considerando che in questo protocollo usiamo trincee di due-strato cellulare, con un canale poco profondo che circonda le cellule. Il design di due-strato è stato introdotto come un modo per massimizzare il flusso di nutrienti e metaboliti dalle cellule di b. subtilis , soprattutto a lungo (> 75 µm) trincee5; Tuttavia, single layer caratteristiche spesso è sufficiente per la crescita ottimale delle cellule e sono comunemente utilizzati per e. coli, soprattutto quando sono più brevi (~ 25 µm)4. Generalmente utilizziamo più lungo trincee, poiché riducono la frequenza con cui catene di cella di Bacillus subtilis , che si presentano casualmente, sono tirate fuori di loro trincee dal flusso medio in alimentazione principale canale5.

Ulteriori modifiche, come l'uso di dispositivi con dimensioni diverse funzionalità (ad es., larghezze di canale) o caratteristiche (ad es., forma, numero delle estremità aperte) possono essere sostituite a seconda dei casi. Per esempio, l'uso della cella trincee che sono aprire su entrambe le estremità (piuttosto che su un'estremità, come nel presente protocollo) è stato utilizzato in altri studi1,20,21. Trincee che sono aperte su entrambe le estremità evitare invecchiamento cellulare perché sono costantemente essendo pieni di cellule neonate (al contrario di macchine di madre, dove la più antica cella viene registrata e cellule più recenti vengono spinti fuori del canale), anche se il fatto che le cellule vecchie vengono spinti su entrambe le estremità in genere limita la loro finestra d'osservazione a meno di 10 generazioni1,21. In genere cerchiamo il più d'osservazione windows (centinaia di generazioni) offerti da una macchina di madre, che rendono possibile ai processi anche senza memoria di misura per cui i tempi di attesa sono decine o centinaia di generazioni lunghi5. Abbiamo anche utilizzato il design della macchina madre per osservare le cellule che non stanno crescendo in modo esponenziale, come nelle nostre analisi di sporulazione22. In tali casi, ulteriori cellule durante la crescita trincee possono essere chiaramente analizzato22.

Molti dei passaggi nel protocollo sono relativamente indulgente in quanto possono essere modificate senza alterare sostanzialmente il risultato di protocollo. Per esempio, una versione precedente del protocollo chiamato per pulizia del vetro di copertura di passaggi di sonicazione sequenziale 10 min bagno in acqua quindi pura e 10 M di KOH, ma abbiamo trovato che buon dispositivo incollaggio e funzionamento è stata ottenuta utilizzando il più semplice basato su isopropanolo fase di pulizia descritte qui. Se un problema di incollaggio ha presentato quel sospetto di cast per la pulizia del vetro di copertura, tornando a un protocollo di pulizia più severi è raccomandato. Allo stesso modo, mentre usiamo un passo di centrifugazione per massimizzare la cella di carico in trincea cella, ragionevolmente completo caricamento può essere raggiunto anche senza questo passaggio, purché molto concentrate cellule sono utilizzate per la fase di caricamento. Questa strategia alternativa potrebbe essere particolarmente utile per i ricercatori che non hanno un adattatore di centrifuga prontamente disponibile a girare il dispositivo. Ancora una volta, possono essere utilizzate differenti concentrazioni di agente passivante, lubrificazione (BSA in questo protocollo); Utilizziamo abitualmente concentrazioni alte quanto 1 mg/mL. In casi dove un ceppo può essere sensibile a BSA, risultati accettabili possono essere ottenuti anche in assenza di un agente passivante. Infatti, quando stavamo usando un dispositivo microfluidico per esaminare la sporulazione, che richiede inedia delle cellule, eravamo preoccupati che BSA potrebbe agire come una potenziale fonte di nutrienti per le cellule, e così abbiamo omesso dal flusso medio senza osservare alcun sostanziale effetti negativi22.

In particolare, il flusso continuo del mezzo attraverso il quale il dispositivo può suscitare leggermente diversi fenotipi confrontati con la crescita delle cellule in un sistema chiuso, come ad esempio un pallone. Ad esempio, lo svuotamento nutriente o composto può essere difficile, come cellule possono pulire spesso composti in traccia dal flusso medio. Infatti, abbiamo osservato che indurre la sporulazione delle cellule via fame richiede un tempo più lungo in un dispositivo microfluidico rispetto in un fiasco. Allo stesso modo, abbiamo osservato che induzione di stress di energia mediante la fosforilazione ossidativa decoupler Carbonil cianuro m-clorofenil idrazone (CCCP) richiede molteplici concentrazioni più elevate nel dispositivo microfluidico rispetto a quanto indicato nella cultura del pallone 23. Pertanto, qualche ottimizzazione potrebbe essere necessario conseguire risultati soddisfacenti con additivi differenti medi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo progetto è stato finanziato dal National Institutes of Health, sotto GM018568. Questo protocollo è stato effettuato in parte al centro per sistemi su scala nanometrica (CNS), un membro della nazionale nanotecnologia coordinato infrastruttura rete (NNCI), che è sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio NSF n. 1541959. CNS è parte dell'Università di Harvard. Molte grazie sono dovuti Thomas Norman e Nathan Lord, per il loro lavoro nella ideazione e realizzazione del modello master utilizzato per i dispositivi mostrati qui e nella creazione della versione originale dell'apparato. Inoltre ringraziamo Johan Paulsson per i suoi preziosi consigli collaborativo e ringraziare i membri del suo laboratorio per i loro consigli e continue migliorie agli apparati di microfluidica batterica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning (240)4019862 This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass VWR 48393 172
Plasma Etch PE-50 Plasma Etch Inc. PE-50 Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" Saint-Gobain PPL Corp. AAD04103 For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD HelixMark Standard Silicone Tubing 60-795-05 For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200) Molecular BioProducts 2155 For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane Pall Life Sciences 4560 For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1" McMaster-Carr 75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene Nordson Medical Y210-6005 The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope Nikon This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox Sigma-Aldrich L3022
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1 wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven VWR 414005-106 for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit 3M 2216 B/A may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width 3M to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope Nikon SMZ800N listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 To clean cover glass
Syring pump, 6 channel New Era Pump Systems Inc. NE-1600
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 a brand of dust-free wipes

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References

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