En fælles kultur metode til at undersøge krydstale mellem X-ray bestrålet Caco-2-celler og PBMC

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Vi præsenterer en protokol for at undersøge krydstale mellem X-stråle-bestrålet Caco-2 og perifert blod mononukleære celler (PBMC). Protokollen starter med Caco-2 bestråling og opsætning af fælles kultur med PBMC; efterfølgende måles trans-epitelial elektriske modstand jævnligt over 48 h og vestlige skamplet udført i både Caco-2 og PBMC.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Babini, G., Morini, J., Barbieri, S., Baiocco, G., Ivaldi, G. B., Liotta, M., Tabarelli de Fatis, P., Ottolenghi, A. A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC. J. Vis. Exp. (131), e56908, doi:10.3791/56908 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protokollen vedtaget i dette arbejde sigter optrevling hvordan røntgenstråler forurolige funktion af den intestinale barriere, med fokus på samspillet mellem kolorektal tumorceller og immunsystemet. Colorectal karcinom er blandt de mest almindelige form for kræft, typisk behandles med kirurgi, kemoterapi og strålebehandling. Fordele ved strålebehandling i rettet mod svulsten er velkendt. Dog er endnu begrænset eksponeringer af sunde væv til stor bekymring, navnlig med hensyn til virkningerne på den intestinale barriere og immunsystemet. Den vedtagne konfiguration giver mulighed for at studere samspillet mellem to cellepopulationer i en betingelse mere ligner den fysiologiske, sammenlignet med normale cellekulturer. Til dette formål, vi ty til forskellige teknikker og vi brugte en in vitro- co kultur model baseret på Caco-2 celler opdelte som éncellelag og PBMC, deler det samme næringssubstratet. Denne protokol er blevet udviklet til at fokusere på både makroskopisk effekter, dvs cellernes levedygtighed og Trans-epitelial elektrisk modstand (TEER), og gennem vestlige skamplet, molekylære ændringer, dvs. aktivering af inflammatoriske pathway i immunceller og tight junction protein udtryk i Caco-2 celler. Indledende vurdering af stråling virkninger på Caco-2 cellernes levedygtighed blev vurderet via 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) og Trypan blå assays, mens TEER blev målt til faste tidsintervaller gennem et ohmmeter specialdesignet til fælles kultur systemer. På denne måde, kan virkninger på grund af stråling, tilstedeværelse af perifert blod mononukleære celler (PBMC), og i sidste ende deres synergistisk effekt påvises. Gennem disse supplerende teknikker observeret vi en høj radio-resistens af Caco-2 inden for 2-10 Gy af x-stråler og en øget Caco-2 éncellelag permeabilitet når PBMC blev tilføjet. Især blev PBMC tilstedeværelse fundet for at være forbundet med variation i tight junction stillads proteiner udtryk.

Introduction

Den metode, der blev vedtaget i dette arbejde var designet til at undersøge samspillet mellem kolorektal kræftcellerne og immunsystem, at udnytte en set-up tættere til den fysiologiske tilstand i forhold til normale 2-dimensionelle cellekulturer.

Colorectal karcinom (CRC) betragtes som den tredje mest hyppige form for kræft, med mere end en million tilfælde på verdensplan (Global Cancer Observatory, internationale agentur for forskning i kræft, World Health Organization, http://gco.iarc.fr). Forvaltning af CRC er rutinemæssigt udføres gennem enten kirurgi, kemoterapi eller strålebehandling1. Sammenlignet med invasive teknikker som kirurgi eller kemoterapi, undgår strålebehandling stort set de typiske skader Systemiske reaktioner fra disse kliniske metoder, takket være den lokaliserede levering af stråledosis. Dog kan der opstå bivirkninger i de omkringliggende raske væv, udløser inflammation med direkte skade på sunde celler og skader medieret af ikke-øremærket virkninger2,3,4. Med fokus på de negative virkninger som følge af bestråling under behandling af kolorektal cancer, skal to aspekter undersøges. Først, de mekanismer, der er ansvarlige for intestinal uigennemtrængelighed kunne ændres af stråling levering forårsager, til gengæld muligheden for bivirkninger på grund af en ændret indeslutning af bakteriel befolkning og paracellular passage af molekyler og opløste stoffer. Andet, tilstedeværelsen af gut-associerede lymfatiske væv (GALT) fungerer som en forpost for immunsystemet, med funktionen for at kontrollere bakteriel vækst og mægle generelle immunrespons5,6,7. For at opfylde disse funktioner, holdes tarm uigennemtrængelighed på grund af funktionen af junctional komplekser mellem celler membraner. Af disse grunde, blev de inducerede negative konsekvenser på grund af forskellige doser af x-stråler undersøgt i Caco-2 celler alene og i samarbejde kulturer med PBMC.

Selv om undersøgelser på cellekulturer er den første setline af undersøgelsen i biomedicinsk forskning, kan manglende detaljeret kendskab til mekanismerne kørsel celle biologi og gensidige interaktioner mellem forskellige celletyper blive kritiske når nærmer studiet af fysiologi af organer, systemer og apparater, der nemt ikke kan genskabes i laboratoriet. Vi besluttede derfor, at vedtage en fælles kultur set-up, så både studiet af to cellepopulationer sammen og dissektion af aspekter relateret til intercellulære og ekstracellulære mekanismer.

Fælles kultur er en teknik, udnyttes når man studerer epitelial funktioner og samspillet mellem forskellige celletyper. Især, bliver brugen af en sådan teknik obligatorisk i vores tilfælde, fordi epitheler består af celler karakteriseret ved polaritet. I tilfælde af den intestinale barriere, enterocytes vise en veldefineret polarisering, med apikale og basolateral polakker adskilt normalt på grund af tilstedeværelsen af stram vejkryds-oprettelse af adhæsionsmolekyler. Denne opdeling er nødvendig for væv fysiologi, undgå paracellular handel og tillader passage af beslutsomme molekyler kun. Denne funktion er selvfølgelig umuligt at genskabe med en normal celle dyrkning set-up. Desuden gengiver vedtagelsen af fælles kultur set-up tilstedeværelsen af immunceller kun i basolateral overfladen, mens den apikale overflade (svarende til tarm lumen) ikke er direkte kontakt med andre celler.

For nylig, Caco-2 cellelinjer fået større betydning som en in vitro- model af intestinal barriere. Selvom stammer fra menneskelige kolon adenocarcinom, Caco-2 celler opretholde muligheden for differentiering og skabe en funktionel polariseret éncellelag8, som giver mulighed for undersøgelse af cellemembranen egenskaber når der dyrkes i en fælles kultur indsætte.

Da Caco-2 dyrkning på en porøse membran er en veletableret i vitro model af tarm éncellelag, blevet en forbedring Co kulturen mellem Caco-2 og andre celler. Dette set-up er blevet vedtaget ofte til foranstaltning krydstale mellem forskellige celle typer9 og kan bruges til at optrævle Caco-2 desorienterede svar på udefra kommende stimuli i fælles kultur, med hensyn til Caco-2 kulturperler alene.

Mange undersøgelser har behandlet Caco-2 opførsel når Co kulturperler med både ikke-sygdomsfremkaldende bakterier og perifert blod mononukleære celler, at belyse især krydstale med immunsystemet10. Pozo-Rubio et al. 11 studerede udtryk af adskillige cytokiner i en fælles kultur, Caco-2/PBMC med bifidobakterier stimulere Caco-2 celler. Deres arbejde fremhævet væsentlig ændring at cytokin udtryk profiler afhængig af bakteriel stimulation udført i tilstedeværelse eller mangler PBMC. Deres resultater fører til den konklusion, at tilstedeværelsen af PBMC sensitizes Caco-2 til bifidobakterier.

Forskellige svar af Caco-2 celler til ikke-patogene og patogene bakterier er blevet vurderet af forskellige forskerhold. Parlesak mfl. 12 demonstreret Caco-2 celler immunosuppressive påvirkning Escherichia coli-stimuleret PBMC. Derudover Haller mfl. 13 studerede svar af Caco-2 celler stimuleret med både LPS (LPS) fra enteropathogenic E. coli spp. eller ikke-enteropathogenic bakterier i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., styrke den formodninger, Caco-2 cellernes reaktion strengt afhænger af tilstedeværelsen af leukocytter i co kultur set-up.

Udfører forskellige supplerende laboratorium assays (f.eks. vestlige skamplet, trans-epitelial elektrisk modstand, MTT, etc.), ud over analysen af forskellige celletyper vokset i fælles kultur, den hel metode lover resultater, der kan betragtes som mere repræsentativ for hvad der virkelig sker in vivo. Desuden, dette set-up giver mulighed for adskillelse af de forskellige fælles kultur rum, giver ikke kun undersøgelsen af de involverede celletyper, men også intercellulære signaling molekylerne udgivet i øverste vs lavere rum eller i tilstedeværelse vs manglende fælles kultur.

Protocol

Følgende protokol indebærer menneskeblod tilbagetrækning fra raske frivillige. Donorerne givet skriftlig informeret samtykke før tilmelding. Denne procedure er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og blod udbetalinger blev udført af en professionel healthcare assistent.

1. celle kultur og fælles kultur Set-up

  1. En uge før bestråling, forberede en Caco-2 cellesuspension indeholdende 2,5 × 105 celler/mL i friske RPMI1640 medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.
  2. Frø 2 mL cellesuspension i sterile 1 µm-pore diameter cellekultur skær til 6-godt plader og sætte indsatsen ind i en 6-godt plade.
    Bemærk: Celle kultur skær skal aktiveres ved inkubering med steril komplet medium før celle såning. I dette tilfælde bør dyrkningsmedier kasseret og erstattet med celle suspension medier.
  3. Tilføj 3 mL frisk RPMI1640 medium suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 IE/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin i hvert nederste rum, og kultur celler ved 37 ° C i en inkubator med fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
  4. Den samme dag af Caco-2 celle bestråling, indsamle humant fuldblod i kommercielt tilgængelige lithium-heparin belagt 6 mL rør (tube størrelse: 13 x 100 mm).
  5. Efterfølgende, isolere perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved hjælp af Ficoll forløb. At adskille PBMC, sætte 25 mL af Ficoll i en 50 mL konisk centrifugeglas og lag et lige saa stort volumen af fuldblod fortyndet 1:1 med RPMI1640 på Ficoll overflade.
    Bemærk: En normal sund donor normalt har ca 4-10 × 106 PBMC/mL.
  6. Der centrifugeres 50 mL rør ved 400 x g i 30 min. ved stuetemperatur.
  7. Forsigtigt indsamle PBMC ved grænsefladen mellem Ficoll og plasma ved aspiration med Pasteur pipette og læg dem i en 15 mL konisk slange.
  8. Afvaske PBMC to gange ved tilsætning af 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og centrifugering PBMC ved 250 x g i 10 min.
  9. Kultur PBMC i højst 3-5 h i T25 cm2 flasker i komplet RPMI1640 media, som beskrevet før, ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
    Bemærk: Indsamle PBMC på dagen af forsøget og frø 2 × 106 celler/brønd, ophængt i 3 mL af komplet RPMI1640 medium, i bunden rum af fælles kultur. Skær med Caco-2 celler overføres i PBMC-holdige wells 30 min efter deres bestråling. PBMC indsamlet fra fuldblod kan ikke være fastholdt i kultur til mere end ca. 72 h, hvis ikke stimuleret med fx. phytohaemagglutinin (PHA), hvorefter cellernes levedygtighed er tabt.
    Forsigtig: Kvaliteten og sikkerheden af alle blod og blodprodukter skal sikres gennem hele processen.

2. bestråling Set-up

Bemærk: Bestråling af Caco-2-celler blev udført ved strålebehandling Institut for Istituto di Ricovero e Cura en Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia i Italien) med en lineær accelerator rutinemæssigt anvendes til behandling af forskellige typer af kræft.

  1. Indstil foton x-stråler energi til 6 MV peak. Lineær accelerator opererer i en pulserende regime (tid mellem to på hinanden følgende pulser ca af 4 ms, varigheden af en enkelt puls om 5 µs med en dosis Vurder op til 1 × 10-3 Gy/p).
  2. Placer de 6-godt plader der indeholder skær med Caco-2 på bane af x-stråler på en 1,4 cm tykt Plexiglas ark (svarende til en lidt større end opbygning af den anvendte stråling afstand) på 100 cm fra kilde af stråling.
  3. Placer en 0,5 cm tykke bolus på hver prøve før bestråling sker for at sikre komponenten backscattered stråling og ladede partikler ligevægt.
  4. Bestråle cellerne (doser i området 2-10 Gy) med en flad og symmetrisk (± 2%) 20 x 20 cm2 strålingsfelt og en dosering på 3 Gy/min.
    NOTE: Kontrol "fingeret"-bestrålede celler gennemgik de samme proceduremæssige betingelser af de bestrålede, uden at indtaste bestråling værelse (modtagne dosis: 0 Gy).
    Forsigtig: ioniserende stråling-producerende enheder skal anvendes kun af specialiseret personale.

3. celle levedygtighed Assay (MTT Assay)

Bemærk: Caco-2 cellernes metaboliske aktivitet blev vurderet gennem 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) assay14.

  1. Frø 2 × 105 Caco-2 i en 24-godt plade 24 h inden bestråling i 1,25 mL af komplet medium.
  2. Bestråle cellerne som beskrevet i trin 2.1-2.4 derefter inkuberes celler ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
  3. 21 h efter bestråling, Tilsæt 100 µL af 5 mg/mL MTT løsning og holde cellerne ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 til 3 h.
  4. Supernatanten og cellerne vaskes med 1 mL PBS.
  5. Opløs formazankoncentrationen krystaller ved at tilføje 500 µL af dimethylsulfoxid (DMSO) i hver brønd og evaluere absorbans med en multi godt Pladelæser ved λ = 570 nm.
  6. Gentag trin 3.3-3.4 - 3.5-3.6 på 45 h efter bestråling.
    Bemærk: Resultater er vist som en undertrykkelse af netbårne fra den tilsvarende sham betingelse, som er normaliseret til 100%.
    Forsigtig: DMSO er brandfarlige og irriterende agent for hud, øjne og luftveje (GHS07, GHS08). I tilfælde af kontakt med øjnene, skylles straks med rigeligt vand og søge læge. MTT er irriterende agent for hud, øjne og luftveje (GHS07, GHS08). I tilfælde af kontakt med øjnene, skylles straks med rigeligt vand og søge læge.

4. procentdelen af levedygtige celler bestemmelse (Trypan blå farvestof udstødelse Assay)

NOTE: Procentdel af levedygtige celler blev vurderet af Trypan blå farvestof udstødelse assay.

  1. Frø 2 × 105 Caco-2 i 24-godt plade 24 h inden bestråling i 1,25 mL af komplet medium.
  2. Bestråle cellerne med doser i området 0 - 10 Gy (Se trin 2.1-2.4) derefter inkuberes celler ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 i 24-48 timer.
  3. Efter de to valgte tidspunkt punkter, vaske cellerne med PBS, kassere det, hvorefter der tilsættes 100 µL af Trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA) løsning. Sætte celler ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 for 2 min og derefter tilføje komplet medium for at anholde enzymatisk reaktion.
  4. Indsamle cellerne i et 1,5 mL-rør og centrifugeres tube på 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes celler i 50 µL af PBS.
  5. Bland cellesuspension med 50 µL af Trypan blå farvestof løsning og inkuberes blanding til 3 min. ved stuetemperatur.
  6. Tælle de farvede (ikke-levedygtige) og unstained (levedygtige) celler med en Bürker kammer.

5. Trans-epitelial elektrisk modstand (TEER)

  1. Frø 5 × 105 Caco-2 celler en uge før bestråling i 6-godt plade Co kultur skær (polyethylenterephthalat (PET), 2 x 106 porer/cm2).
  2. 1 h inden bestråling, måle TEER med et voltmeter/ohmmeter.
  3. Bestråle cellerne, som beskrevet i trin 2.1-2.4.
  4. Inkuber Caco-2 celler i tilstedeværelse/manglende fælles kultur med PBMC ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
  5. For de første par timer efter bestråling, måle TEER hver time, og efterfølgende hvert 3 h til 48 h.

6. Western Blot analyse af Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB, og XIAP

  1. Frø 5 × 105 celler 1 uge før røntgenstråler eksponering i 6-godt plade Co kultur indsætter (PET, 2 x 106 porer/cm2) og bestråle cellerne som beskrevet i trin 2.1-2.4.
  2. Inkuber Caco-2 celler i tilstedeværelse/manglende fælles kultur med PBMC ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
  3. 48 timer efter bestråling, forberede Caco-2 og PBMC cellelysater ved behandling af celler med celle lysis buffer og gemme prøver på-20 ° C.
    Bemærk: protokollen kan pause her.
  4. Kvantificere total protein beløb af bicinchoninic syre (BCA) metode.
    Bemærk: protokollen kan pause her.
  5. Bland lige mængder af samlede proteiner med Laemli prøvebuffer tilføjet med β-mercaptoethanol (endelig koncentration af β-mercaptoethanol er 5%), opvarme prøverne ved 95 ° C i 5 min og spin dem på 10.000 x g.
  6. Belastning prøver i en 4-20% præfabrikerede gel og udføre elektroforese på 120 V for 1 h. overførsel proteiner på en polyvinildiene fluorid (PVDF) membran.
  7. Blokere ikke-specifik binding ved at inkubere PVDF membran ved stuetemperatur med 5% fedtfrit tørt mælk (NFDM) i PBS tilføjet med 0,2% Tween-20 (PBT). Vaske membran tre gange med 10 mL 0,2% PBT i 5 min.
  8. Inkuber membran med blid agitation i 1 time ved stuetemperatur før lægges natten over ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: anti-claudin-1, anti-ZO-1, anti-ZO-2, anti-afadin, anti-occludin, anti-NF-kB, anti-XIAP og anti-actin. Vaske membran tre gange med 10 mL 0,2% PBT i 5 min.
  9. Inkuber membraner med peberrod Peroxidase HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur med blid agitation. Vaske membran tre gange med 10 mL 0,2% PBT i 5 min.
  10. Ved stuetemperatur, udvikle fotografisk film ved at inkubere membraner med forbedret kemo-selvlysende kit.
  11. Erhverve fotografisk film med en scanning system og kvantificere de opnåede bands med passende billede analyse software.
    Bemærk: Evaluering af Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 og ZO-2 er udført i Caco-2 celler. Evaluering af NF-kB og XIAP udføres i PBMC.
    Forsigtig: β-mercaptoethanol er giftigt (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Ikke tilladt at indånde dampe, undgå udsætning i miljøet og bære individuelle beskyttelsesanordninger og åndedrætsværn. Ved indtagelse, straks bede om lægehjælp.

7. statistisk analyse

  1. For at afgøre, om stråling og fælles kultur fremkalde en statistisk signifikant undertrykkelse af netbårne, udføre en to-vejs variansanalyse (ANOVA) test med flere sammenligninger for gentagne målinger (med Bonferroni post-hoc test til at sammenligne kopiere betyder).
  2. Hvis ikke andet er angivet, skal du beregne den statistiske signifikans (p) af tosidede Student's t-test. Hver værdi er middelværdien for ≥3 uafhængige forsøg ± standardafvigelse for mener (SEM).

Representative Results

En uge før eksperimentet, er celler sået på den porøse membran af indsatsen og lov til at vokse i de følgende dage. Niveau af sammenløbet kan kontrolleres enten ved hjælp af en omvendt mikroskop eller via måling af TEER værdier. Faktisk, under vækstfase, TEER holder stigende indtil alle porøse membran er blevet dækket af celler og de danner en differentieret celle éncellelag. Hvis celler formere sig hurtigere/langsommere, kunne eksperimentet starte på tidligere/senere tidspunkt punkter efter at blive seedet. Når på sammenløbet, celler er derefter bragt til bestrålingsanlægget, minimere den formidles miljømæssige stress (temperatur eller pH), før du starter fælles kultur med/uden PBMC, seedet i bunden rum (fig. 1A), eller evaluering af spredning af Caco-2 celler. I betragtning af den indledende seeding tæthed, på dag bør 0 celler nå 100% sammenløbet og oprette en differentieret éncellelag af epitelceller, som kan observeres ved plateau i TEER vist i figur 1B. Når cellerne kommer til denne status, holdes TEER værdi relativt konstant over den følgende uge, så længe de gamle næringssubstratet erstattes med frisk medium, mindst en gang om ugen (figur 1B). Som vist i figur 1C, viser MTT analysen ikke statistisk signifikant ændring af Caco-2 celler proliferativ status, hverken på 24 h eller på 48 h, uafhængigt af den dosis, der modtages (op til 10 Gy).

Et andet resultat blev observeret vedrørende den kortsigtede dødelighed af Caco-2 celler. På begge tidspunkter, Trypan blå farvning Vis en dosisafhængig stigning i celle dødelighed. Disse resultater viser en klar effekt af stråling, selv om procenter af døde celler forekommer at være meget lave, især når de overvejer at den højeste leverede dosis (10 Gy) producerer kun omkring 20% af celledød (fig. 1D).

Prøver var Co kulturperler, med eller uden PBMC i det nedre rum. I betragtning af at PBMC ikke modtog nogen ekstern stimulus at formere sig, en 48 h eksperiment blev betragtet som ideel til at undgå bias indført af PBMC begyndt at dø. Derfor, fra umiddelbart før bestråling, TEER blev regelmæssigt målt for 48 h, for at holde styr på mulige forbigående virkninger forårsaget af bestråling protokol. Som vist i figur 1 E-F, TEER værdier er præsenteret som relative variationer med hensyn til den forbehandlet betingelse (som var ca. 1200-1500 Ω·cm2) for bedre at fremhæve den undertrykkelse af netbårne induceret af X-ray bestråling og / eller tilstedeværelse/fravær af PBMC i fælles kultur. I begge tilfælde kan en indledende forbigående peak tydeligt ses på det første tidspunkt, efter bestråling, som kan tilskrives bestråling proceduren.

Når ikke i fælles kultur med PBMC (figur 1E), TEER værdier er næsten konstant op til 48 timer, efter 10 Gy af røntgenstråler, celler viser et længerevarende fald i TEER begynder kl 3 h efter bestråling. Tilstedeværelsen af PBMC ændrer fuldstændig TEER tidsmæssige dynamics (figur 1F). For alle doser er en reduktion i TEER klart observerbare fra 3 h op til ca 30 h efter bestråling, når TEER ser ud til at bosætte sig på en konstant værdi (figur 1F).

Tight junction komplekser udtryk niveauer blev undersøgt i Caco-2 celler lysates gennem western blot analyse. CaCO-2-celler blev udsat for ioniserende stråling (med doser på 0, 2 og 10 Gy) og efterfølgende dyrkes alene eller i fælles kultur med PBMC i bunden rum for 48 h (som vist i figur 2A-F). Claudin-1 og Occludin (figur 2A, 2B) blev fundet ændres ikke væsentligt ved røntgen og/eller fælles kultur med PBMC. Store udsving i stedet observeret i stillads proteiner ZO-1, ZO-2 og Afadin (figur 2C, 2D, 2E). Især overholdes en reduktion i ZO-2 udtryk niveauer allerede efter 2 Gy når i fælles kultur med PBMC mens kun på 10 Gy når Caco-2 voksende alene. Afadin udtryk niveauer i stedet påvirkes kun efter 10 Gy af røntgenstråler, med en yderligere reduktion når Caco-2 er co kulturperler med PBMC.

PBMC Co kulturperler med Caco-2 blev analyseret med hensyn til den inflammatoriske tilstand, især den nukleare transkriptionsfaktor kB (NF-kB) og X-linked hæmmer af apoptose Proteinniveau (XIAP) er blevet undersøgt (figur 2 G-jeg). NF-kB samlede beløb var ikke berørt af fælles kultur med Caco-2 udsættes for forskellige doser (fig. 2G). Tværtimod, var XIAP niveauer, bukkes 4 gange op-reguleret i både de 2 Gy og 10 Gy Co kulturer, selv om de store variationer kræver et højere antal prøver analyseret for at reducere sådanne udsving og få en bedre statistiske magt.

Som vist i figur 2F og 2I, kan nogle ikke-specifikke bands vises ved siden af den forventede molekylvægt af protein af interesse. Medmindre sand og ikke specifikke bands er let identificerbar, bør forskellige antistof og/eller BSA eller NFDM koncentrationer overvejes.

Figure 1
Figur 1 . Total eksperimentel opsætning og makroskopiske virkninger af stråling og/eller PBMC Co kultur. A) Skematisk visning af modellens Co kultur. B) TEER værdier målt dagligt fra den oprindelige frø af Caco-2 celler til at vurdere den rette vækst og differentiering tilstand af éncellelag. C) cellernes levedygtighed og D) dødelighed i Caco-2 udsat for stråler (0, 2, 5 og 10 Gy). E) TEER målinger i Caco-2 celler bestrålet med 0, 2 og 10 Gy af x-stråler kulturperler uden eller F) med PBMC. Hver værdi er middelværdien for ≥3 uafhængige forsøg ± SEM. * p-val < 0,05; ** p-va l < 0,01; p-val < 0,001. Grafer tilpasset fra Morini mfl. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2Western Blot resultaterne af Caco-2 og PBMC lysates. Udtryk niveau af stram vejkryds proteiner (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) og Afadin (E)) i Caco-2 efter 0, 2 og 10 Gy af x-stråler og tilstedeværelsen/manglende PBMC i fælles kultur. Værdierne normaliseres på Actin niveau. Illustrative film for hver tight junction protein og betingelser, der er vist i panelet (F). Udtryk niveau af NF-κB (G) og XIAP (H) i PBMC Co kulturperler med Caco-2 celler. Repræsentative film til NF-kB, XIAP og Actin er vist i panelet. Hver værdi er middelværdien for ≥3 uafhængige forsøg ± SEM. grafer tilpasset fra Morini mfl. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kolorektal cancer, med dens høje forekomst i de udviklede lande, er en af de hyppigste årsager til sygelighed og dødelighed i befolkningen. Det er normalt styres af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling1. Inden for rammerne af strålebehandling behandlinger, der skal lægges særlig vægt til virkningerne af sunde væv eksponering4; Derudover er systematiske undersøgelser om forholdet mellem stråling og immunsystemet grundlæggende for udviklingen af strategier for radio-immunterapi3.

Den metode, som vi har vedtaget i dette arbejde har været skræddersyet til undersøgelse af Caco-2-celler og PBMC krydstale. Vi fokuserer på effekten af røntgenstråler eksponering af tumorceller, men samme protokol kan tilpasses til undersøgelser med farmakologiske midler. At være tættere på fysiologiske betingelser med hensyn til standard celle dyrkning, er stærk fordelen ved denne metode muligheden for en komplet dissektion af et komplekst system, får mulighed for at analysere både forskellige celletyper og frigivelse af signalmolekyler i de to rum af fælles kultur, selv. På denne måde kan rutinemæssigt anvendt biologiske metoder hjælpe forståelsen af cellulære samspil relaterede mekanismer.

Den første karakterisering af X-stråle-inducerede effekter på Caco-2-celler var baseret på to komplementære målinger, MTT kolorimetriske analysen og Trypan blå farvestof udstødelse test dvs . De tilsyneladende inkonsistente resultater kan forklares ved de forskellige fokus i disse to assays. MTT vurderer oxidoreductase enzymer aktivitet, mens de Trypan blå farvestof er baseret på en levende-celle udstødelse farvestof mekanisme.

Undersøgelsen af Caco-2-PBMC samspillet kræver oprettelsen af en epitel éncellelag stand til at føre til en fuldstændig adskillelse mellem de to rum af fælles kultur. Muligheden for såning Caco-2 celler i fælles kultur indsætte tillader bestråling af kun denne celle population. Da fælles kultur starter efter bestråling, er der ingen bias på grund af enhver utilsigtet bestråling af PBMC. Dette set-up skal håndteres omhyggeligt for at undgå skader (eller forurening) til de cellulære éncellelag under bevægelser af indsatsen fra en 6-godt plade til den anden. Når omhyggeligt udført, er TEER målinger en enkel og ikke-invasiv metode til at undersøge éncellelag permeabilitet. Denne analyse er strengt relateret til fælles kultur set-up, og det er ikke det eneste valg for undersøgelsen af éncellelag permeabilitet. Det giver mulighed for en god reproducerbarhed af foranstaltninger, når det er godt kalibreret med friske komplet medium. Fælles assays fokus på udbredelse af kemiske farvestoffer fra den øverste "apikale" rum til bunden "basolateral" en (fx fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran assay)16. Men da PBMC er til stede i basolateral rum i denne undersøgelse, besluttede vi at undgå indførelsen af kemiske reagenser i eksperimenter.

Blandt de forskellige teknikker i dette arbejde, er TEER måling den eneste, der kræver fælles kultur set-up17,18. Men andre fælles laboratoriemetoder give mere informative resultater, når de anvendes på celler i fælles kultur, som de giver mulighed for undersøgelse af en setup tættere på fysiologiske forhold og dataene, der har en stærkere biologiske betydning. På den anden side skal det bemærkes, at brugen af celler dyrkes på et porøst bærestof kunne føre til vanskeligheder i de operationer, der er nødvendige for at forberede prøverne, såsom celle lysis for forberedelse af cellulære ekstrakter skal analyseres gennem western blotting.

Systemet blev vedtaget i denne undersøgelse har potentiale til at blive yderligere forbedret, fx med anvendelsen af stoffer, der er stand til at genskabe den ekstracellulære matrix milieu. Dog, dette vil også resultere i en øget kompleksitet af systemet, og en komplet dissektion af set-up vil være vanskeligere at opnå.

Opsætninger for Co cellekultur udgør helt sikkert et kraftfuldt værktøj til udvikling af in vitro- forskning, og for forståelsen af komplekse systemer. Denne teknik har potentiale til at øge viden om grundlæggende mekanismer, giver nye inputs til grundlæggende forskningsundersøgelser på molekylære signalering og med mulige applikationer til modulering af aktiviteten af immunsystemet i forbindelse med onkologisk klinisk patienthåndtering.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgements

Italiensk Institut for kernefysik (INFN) finansieret delvist dette arbejde gennem INFN-MERIDIAN-projektet. Forfatterne anerkender Prof. Edoardo Milotti (fysik afdeling, Universitet i Trieste, Italien) til INFN-MERIDIAN projektkoordineringen; Dr. Roberto Chignola (bioteknologisk institut, universitetet i Verona, Italien) til at give Caco-2-celler, ohmmeter, og for hans værdifulde hjælp og uddannelse. Vi anerkender også Agnese Solari for teknisk bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates
Greiner Bio-one 657610 Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well  Greiner Bio-one 657160 Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well  Greiner Bio-one 662160 Plastic
RPMI 1640 without L-Glutamine Lonza 12-167F Reagents
Foetal Bovine Serum Lonza DE14-801 Reagents
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605C Reagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10K Lonza 17-602E Reagents
CO2 Incubator Heal Force HF240 Equipment
Ficoll Histopaque-1077 Sigma-Aldrich 10771 Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 227261 Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 188261 Plastic
Centrifuge ThermoScientific CL31R Equipment
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS Greiner Bio-one 690175 Plastic
Clinac 2100 Linear Accelerator Varian CLINAC 2100C/D Equipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Reagents
Multiwell Plate Reader GDV DV990BV6 Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 %  Amresco K940 Reagents
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049 Reagents
1.5 mL tubes Eppendorf 0030125150 Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter Millipore MERS 00001 Equipment
Cell Lysis Buffer (10x) Cell Signalling Technology #9803 Reagents
Bürker Hemocytometer Sigma-Aldrich BR719520 Equipment
BCA Protein Quantification Kit Abcam ab102536 Reagents
2x Laemmli Sample Buffer  BioRad #1610737 Reagents
2-Mercaptoethanol  BioRad #1610710 Reagents
Accublock Digital Dry Bath Labnet International Inc. D1100 Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL BioRad #4568093  Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel BioRad #1658004 Equipment
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad #1645052  Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards BioRad #1610385  Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer BioRad #1610732  Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BioRad #1704156 Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad #1704150 Equipment
Blotting-Grade Blocker  BioRad #1706404 Reagents
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773 Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #13255 Reagents
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906 Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #8193 Reagents
ZO-2 Antibody  Cell Signalling Technology #2847 Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb Cell Signalling Technology  #13531 Reagents
Anti-Occludin Antibody Millipore ABT146 Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] Abcam ab32536 Reagents
Anti-XIAP antibody  Abcam ab21278 Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare Life Sciences NA931V Reagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare Life Sciences NA934V Reagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL BioRad #1705060  Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher Sigma-Aldrich P7042 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher Sigma-Aldrich P7167 Reagents
Carestream Kodak BioMax light film Sigma-Aldrich Z370401 Reagents
Gel Doc EZ System BioRad #1708270  Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375, (9719), 1030-1047 (2010).
  2. Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105, (34), 12445-12450 (2008).
  3. Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4, (1), 29 (2016).
  4. Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105, (1), 79-85 (2012).
  5. Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
  6. Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16, (7), 742-743 (2015).
  7. Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9, (5), 351-360 (2009).
  8. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, (1), 1-26 (2005).
  9. Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166, (1-4), 165-169 (2015).
  10. Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237, (2), 146-153 (2009).
  11. Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106, (8), 1216-1223 (2011).
  12. Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60, (5), 477-485 (2004).
  13. Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47, (1), 79-87 (2000).
  14. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65, (1-2), 55-63 (1983).
  15. Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
  16. Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82, (22), 11273-11282 (2008).
  17. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20, (2), 107-126 (2015).
  18. Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84, (6), 467-486 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics