طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الحصول على جودة عالية المجينية الحمض النووي من أنسجة الورم خطوة أولى أساسية لتحليل التعديلات الوراثية باستخدام تسلسل الجيل القادم. في هذه المقالة، نحن نقدم طريقة بسيطة وسريعة لإثراء الخلايا السرطانية والحصول على الحمض النووي سليمة من لمس بصمة عنق العينات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

من المهم تحديد حالة حيث في السرطان قبل الإدارة والعلاج العقاقير المستهدفة جزيئية محددة لمرضى السرطان. في الإعداد السريرية، الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (FFPE) تستخدم على نطاق واسع للاختبارات الجينية. ومع ذلك، FFPE الحمض النووي عموما أضرار ومجزأة أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين. ولذلك، "فب الحمض النووي" ليس أحياناً كافية للاختبارات الجينية بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي. هنا نقدم طريقة للمس بصمة علم الخلايا (عرة) للحصول على الحمض النووي من الخلايا السرطانية، التي يمكن ملاحظتها تحت مجهر. يمكن تقييم أرقام الخلية مورفولوجيا وسرطان الخلية باستخدام عينات عرة. وعلاوة على ذلك، استخراج الحمض النووي من عينات التشنج يمكن أن تكتمل في غضون يومين. وكان إجمالي كمية ونوعية من "عرة الحمض النووي" التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب أعلى من "الحمض النووي فب". يسمح هذا الأسلوب السريع والبسيط الباحثين للحصول على الحمض النووي عالي الجودة للاختبارات الجينية (مثلتحليل تسلسل الجيل القادم، بكر الرقمية والوقت الحقيقي الكمي PCR) وتقصير المدة اللازمة للإبلاغ عن النتائج.

Introduction

الجيل القادم تكنولوجيا التسلسل وقدم الباحثون أوجه التقدم الكبير في تحليل المعلومات الجينوم في الاختلافات الوراثية والأمراض مندلية والاستعداد الوراثي والسرطان 1،2،3 . أطلس جينوم السرطان (تكجا)، واتحاد جينوم السرطان الدولية (إيكجك) اتبعت تحديد التعديلات الوراثية في عدة أنواع من السرطانات الشائعة4. مئات جينات سائق السرطان الأساسية قد حددت بنجاح، وبعض هذه الجزيئات مستهدفون للمخدرات التنمية1،،من56.

في الإعداد السريرية، يشيع استخدام العينات FFPE المرضية التشخيص والاختبارات الجزيئية للأمراض المختلفة، بما في ذلك السرطان. ومع ذلك، أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين، البروتين الحمض النووي أو الحمض الخلوي الصبغي DNA العابرة للربط يحدث وفعل تجزؤ الحمض النووي. وهكذا، عينات من "الحمض النووي فب" ليست دائماً مناسبة للتحليل الجيني بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي7،،من89. بالإضافة إلى ذلك، يستغرق عدة أيام لإعداد العينات فب، والمهارة التقنية اللازمة لإعداد دقة المقاطع. لذلك، من المستحسن لتطوير طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية سليمة الحمض النووي.

علم الخلايا طريقة بديلة لتشخيص المرضية. إعداد عينة الخلوية أبسط، أقل النهج باهظة الثمن، وأكثر سرعة بالمقارنة مع إعداد فب10. وقد أجريت تقنية تيك على الحارس الغدد الليمفاوية والأنسجة هامشية من مرضى سرطان الثدي للمضاعفات التشخيص السريع لبعض السنوات11،12. ومع ذلك، هناك عدد قليل من التقارير التي درست ما إذا كان يمكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة من العينات عرة، وتستخدم للتحليل الجيني اللاحقة. عينات الخلوية عادة ملطخة بابانيكولاو (Pap) أو تلطيخ جيمسى، وكنا ذكرت سابقا أن كمية ونوعية من الحمض النووي المستخرج من عينات عرة (لا سيما العينات الملطخة جيمسى) تعلو على العينات التي تم الحصول عليها من فب 13من الأنسجة. وبالمقارنة مع تلطيخ Pap، تلطيخ Giemsa لديه ميزة التي تتطلب إجراءات المصبوغة أقل. في تلطيخ Pap، بعد أن تم إصلاح العينات والملون، يجب تحميل مع تصاعد المتوسطة (مثلاً، مالينول) للتمييز بين محتويات نموذج، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية والخلايا الملتهبة تحت مجهر. إذا كانت العينة Pap مستعدة دون خطوة متصاعدة، من المستحيل تقريبا لمراقبة الخلايا تحت مجهر لأن العينة هو المجففة. وبالمقارنة، تلطيخ Giemsa يمكن ملاحظتها في الدولة المجففة، ولذلك الخطوة تصاعد ليس ضروريا للتقييم السريع الخلوية. ميكروديسيكشن، جيمسى تلطيخ أكثر ملاءمة لأنها تتطلب العينات الجافة.

في هذا التقرير، علينا الأخذ بطريقة بسيطة وسريعة لإعداد العينات التشنج مع تلطيخ Giemsa وتثبت أن التشنج أفضل مصدر للحمض النووي مقارنة مع العينات فب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تيك التحضير لتقييم مجهرية سريعة لاستخدام الزجاج العادي الشرائح

  1. تنفيذ إعداد عرة وقت ممكن بعد تتوفر مواد الأنسجة المرضية الإكلينيكية. إذا كان لا يمكن مباشرة إعداد العينات عرة، الحفاظ على هذه المواد الأنسجة مغطاة بالمياه المالحة مبلل شاش معقم وتخزينها في الثلاجة لمنع جفاف الأنسجة.
  2. إعداد3 5 ملم أنسجة المواد مثل الأورام الصلبة (مثلاً، والكبد والرئة وأنسجة الثدي) حصل سريرياً بالجراحة أو المناظير.
    1. بلطف يمسح الأنسجة مع مغلفة بالمحلول الملحي الفسيولوجي شاش معقم وإزالة الدم، إذا كان سطح الأنسجة لديها الكثير من الدم.
    2. للحصول على عينات مجهرية مثل المواد خزعة، تبقى العينة مبلل مع غارقة في المحلول الملحي الفسيولوجي شاش معقم.
  3. قص وتقليم أنسجة طبيعية بسكين تشذيب وتعريض سطح الآفة الورم، إذا لم تكن مرئية الجماهير ورم صارخ.
  4. لمس سطح الورم العينات ريسيكتيد إلى شريحة زجاج عادي عدة مرات مع الأيدي القفاز. بصريا وتؤكد المنطقة لمست هو ما يزيد على 80 في المائة الشريحة الزجاجية العادية.
  5. طفيفة اضغط على الشريحة الزجاجية العادية ضد شريحة غشاء (قلم) نافثالاتي البولي إيثيلين وفرك بلطف من 2-3 مرات مع الأيدي القفاز. تأكيد بصريا يتم نقل الخلايا من الشريحة الزجاجية العادية للشريحة غشاء القلم.
  6. أيردري كل من الزجاج والقلم غشاء الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. وصمة عار الشريحة الزجاجية العادية للفحص الخلوية مباشرة. تراجع الشرائح الزجاجية مع الحل مثبت ل 5 s، ووصمة عار ثم مع جيمسا تلطيخ الحل لمدة 15 ثانية.
  8. تقييم والشاشة محتويات الورم وسيلولاريتي على الشريحة الزجاجية العادية تماما مع مجهر للتقييم السريع. تقييم الخلايا السرطانية استناداً إلى عدة معايير؛ توسيع النووية، تناذر غير طبيعي، الكروماتين وفيرة، والتوزيع غير المتكافئ للخلايا، نسبة العنصر المكون/هيولى النووي وحجم الخلية، والخلية القطبية.

2-إعداد فيلم الشريحة غشاء القلم للاختبارات الجينية

  1. إذا كانت العينة يظهر الورم سيلولاريتي أكثر من 60% بتقييم سريع مجهرية (الخطوة 1.8)، قص الفيلم تطرق الورم الشرائح غشاء القلم لاستخراج الحمض النووي بسكين والقفاز الأيدي. نقل قطع الفيلم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة مع بينسيتي والأيدي القفاز.
  2. إذا كان تحديد cellularity الورم منخفضة (أقل من 60 في المائة محتويات الورم) بتقييم سريع مجهرية (الخطوة 1.8)، استخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن والحصول على عينات الورم.
    1. أداء Giemsa تلطيخ لتقييم الخلايا السرطانية باستخدام البروتوكولات القياسية.
    2. قص فيلم الشريحة الغشاء بيم بالليزر مناسبة القبض على ميكروديسيكشن.
    3. نقل قطع الفيلم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة مع بينسيتي والأيدي القفاز.
    4. تخزين أنبوب ميكروسينتريفوجي المحتوية على الفيلم في 4 درجات مئوية حتى استخراج الحمض النووي (البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا).

3. استخراج الحمض النووي

  1. القيام باستخراج الحمض النووي من عينات الأنسجة التشنج أو فب باستخدام مجموعة أدوات استخراج "الحمض النووي فب" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة. يتوفر مجموعة مكافئة لخطوة استخراج "الحمض النووي فب".
  2. إضافة ميليلتر 180 من المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة (pH = 8.3) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي المحتوية على الفيلم مع ماصة ميليلتر 200 يدوي. إضافة 20 ميليلتر من البروتيناز ك الماصة اليدوية 20-ميليلتر ومزيج من فورتيكسينج مع خلاط دوامة بأقصى سرعة ممكنة (حوالي 2,500 لفة في الدقيقة) ل 5 ق.
  3. احتضان هذه العينات في 56 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع حاضنة هواء.
  4. احتضان عينات فب والتشنج عند 90 درجة مئوية في كتلة حرارة لمدة 1 ساعة و 10 دقيقة، على التوالي. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب ميكروسينتريفوجي في 1,500 ز خ لل 5 s في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة.
  5. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل للعينة ماصة 200 ميليلتر ومزيج دقيق فورتيكسينج بأقصى سرعة ل 5 ق.
  6. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول (96-100%) مع ماصة 200 ميليلتر ومزيج دقيق من فورتيكسينج بأقصى سرعة ل 5 س. باختصار تدور أسفل أنبوب ميكروسينتريفوجي في 1,500 ز خ لل 5 s في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة.
  7. نقل كامل ليساتي بعناية لعمود الدوران مع ماصة 1,000 ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  8. ضع عمود الدوران في أنبوب جمع نظيفة 2 مل مع الأيدي القفاز، وتجاهل جمع الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر إلى مربع التخلص من بلاستيك.
  9. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي إلى عمود الدوران مع ماصة 1,000 ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  10. ضع عمود الدوران في أنبوب جمع نظيفة 2 مل مع الأيدي القفاز، وتجاهل جمع الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر إلى مربع التخلص من بلاستيك.
  11. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي إلى عمود الدوران مع ماصة 1,000 ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  12. تجاهل جمع الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر إلى مربع التخلص من بلاستيك. ضع عمود الدوران في أنبوب نظيف 1.5 مل ميكروسينتريفوجي بالأيدي القفاز والطرد المركزي في 20,000 ز x دقيقة 3 عند 25 درجة مئوية الجاف للغشاء.
  13. ضع عمود الدوران في أنبوب ملزمة منخفضة والحمض النووي مع الأيدي القفاز.
    1. إضافة 40-50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى مركز الغشاء مع ماصة 100 ميليلتر.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    3. تخزين عينات الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى الخطوة التالية (البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا).

4-تقدير جودة الحمض النووي بالوقت الحقيقي الكمي PCR

  1. إعداد مزيج الرئيسي في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة مع ماصة، على النحو التالي: 10 ميليلتر من 2 × الوقت الحقيقي بكر ماجستير المزيج، 1 ميليلتر من 20 x رناسي ف التحقيق التمهيدي "مزيج" (amplicon الحجم: 87 bp)، و 8 ميليلتر من الماء المعقم نوكلاس مجاناً.
  2. إعداد مزيج الرئيسي الثاني في أنبوب عقيم ميكروسينتريفوجي واحد على النحو التالي: 10 ميليلتر من 2 × الوقت الحقيقي بكر ماجستير المزيج، 1 ميليلتر من 20 x رناسي ف التحقيق التمهيدي "مزيج" (amplicon الحجم: 268 bp)، و 8 ميليلتر من الماء المعقم نوكلاس مجاناً.
  3. إجراء تخفيف المسلسل لسيطرة الإنسان الجينوم الحمض الخلوي الصبغي (المتوفرة في هذه المجموعة) 4 مرات لخمس نقاط منحنى قياسي وتحديد تركيزات الحمض النووي المطلق13.
  4. إضافة 19 ميليلتر من يمزج الرئيسي استعداد اثنين (تم إعداده في الخطوة 4، 1 و 4-2) في آبار منفصلة من صفيحة الضوئية 96، حسنا فعل مع 20-ميليلتر ماصة.
  5. أضف 1 ميليلتر FFPE الحمض النووي أو "الحمض النووي عرة" لفصل الآبار التي تحتوي على مزيج رد فعل مع ماصة 2-ميليلتر. أضف 1 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس في بئر منفصلة تحتوي على مزيج رد فعل للسيطرة على لا قالب.
  6. عقد الجانب غير لاصقة فيلم لاصق الضوئية وقشر الواقية دعم من مركز الفيلم مرة أخرى. بلطف اسحب قضيب فوق الفيلم، وختم الفيلم عبر لوحة 96-جيدا.
  7. المزيج بلطف لوحة 96-جيدا باستخدام خلاط لوحة 96-جيدا لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة 2,000 لفة في الدقيقة. الطرد المركزي في اللوحة بإيجاز في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. السلطة على الصك PCR الوقت الحقيقي، وإدراج لوحة 96-جيدا. تشغيل ردود فعل PCR باستخدام البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 45 من 95 درجة مئوية ل 1 s و 60 درجة مئوية 20 س. استخدام "المنحنى القياسي" و "الوضع السريع".
  9. تقييم تجزؤ الحمض النووي مع النسبة الحمض النووي (القياس الكمي النسبي؛ RQ) الحصول على أمبليكون طويلة (268 bp) إلى أمبليكون قصيرة (87 bp). RQ القيمة يعني قيمة amplicon قصيرة13يعني amplicon/فترة طويلة.

5-إعداد مكتبة الجيل القادم على التسلسل

  1. تعد المكتبة التسلسل لتسلسل الجيل القادم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. إعداد مزيج PCR رئيسي متعدد في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة كل عينة على النحو التالي: 4 ميليلتر من 5 × PCR متعدد رد فعل الحل، ميليلتر 4 من 5 × تجمع التمهيدي، ميليلتر دي سيكس التشنج أو فب الحمض النووي (1-100 نانوغرام)، وإضافة المياه خالية من نوكلاس ما يصل إلى 20 ميليلتر.
    1. إضافة مزيج PCR رئيسي متعدد أنبوب بكر والمزيج بلطف بالتنصت على الأنبوب.
    2. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب ميكروسينتريفوجي في 1,500 ز خ لل 5 s في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة.
  3. تشغيل ردود فعل PCR باستخدام البروتوكول التالي: 99 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها دورات 20 99 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية 4 دقيقة، وعقد الخطوة 10 ° C. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تحديد عدد الدورات على أساس العدد أزواج التمهيدي.
  4. فتح غطاء أنبوب PCR، وإضافة ميليلتر 2 إنزيم التقييد مع ماصة 2-ميليلتر. أغلق غطاء أنبوب بكر والمزيج بلطف بالتنصت على أنبوب PCR. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  5. تشغيل ردود فعل PCR استخدام بروتوكول التالية: 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وإجراء الخطوة 10 ° C. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة محول ربط مزيج الرئيسي إلى كل جيدا التي تحتوي على أمبليكونس بكر هضمها مع ماصة كالتالي: 4 ميليلتر من محول ربط الحل 0.5 ميليلتر من الرمز الشريطي، 0.5 ميليلتر لمحول، 2 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي و 2 ميليلتر من ليجاسى الحمض النووي. إغلاق غطاء أنبوب بكر والمزيج بلطف عن طريق التنصت. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  7. تشغيل ردود فعل PCR باستخدام البروتوكول التالي: 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد الخطوة 10 ° C.
  8. تنقية المكتبة التسلسل مع الخرز المغناطيسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  9. نقل الحل مكتبة محول متصلة في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي 1.5 مل. إضافة ميليلتر 45 من حبات مغناطيسية في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي لتنقيةش 1. المزيج بلطف بالتنصت على الأنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. ضع الأنبوب ملزمة منخفضة والحمض النووي في رف مغناطيسية، ثم احتضانها لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى الحل الواضح. عناية تجاهل المادة طافية مع ماصة 200 ميليلتر دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  11. إضافة 150 ميليلتر طازجة الإيثانول 70% مع ماصة 200 ميليلتر، ثم نقل في أنبوب إلى جنبا من المغناطيس لغسل الخرز. تجاهل المادة طافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  12. كرر الخطوة 5.11 ليغسل ثانية.
  13. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب مع ميني أجهزة الطرد المركزي في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، وتجاهل بعناية قطرات الإيثانول مع ماصة 10 ميليلتر.
  14. إضافة 50 ميليلتر من "الشركة المصرية للاتصالات المنخفضة" في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي المحتوية على بيليه الخرز المغناطيسي لتفريق الخرز. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  15. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة حتى يصبح الحل واضح.
  16. نقل 50 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي الجديد وإضافة ميليلتر 75 من حبات مغناطيسية مع ماصة 100 ميليلتر لتنقية 2nd . المزيج بلطف بالتنصت على الأنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  17. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، ثم احتضانها لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى الحل الواضح. عناية تجاهل المادة طافية مع ماصة 200 ميليلتر دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  18. إضافة 150 ميليلتر طازجة الإيثانول 70% مع ماصة 200 ميليلتر، ثم نقل في أنبوب إلى جنبا من المغناطيس لغسل الخرز. تجاهل المادة طافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  19. كرر الخطوة 5.18 ليغسل ثانية.
  20. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، وتجاهل بعناية قطرات الإيثانول مع ماصة 10 ميليلتر.
  21. إضافة 50 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات منخفضة في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي المحتوية على بيليه الخرز المغناطيسي لتفريق الخرز. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  22. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة حتى يصبح الحل واضح.
  23. نقل ميليلتر 45 من المادة طافية يحتوي على مكتبة المنقاة في أنبوب منخفض-ملزمة الحمض النووي الجديد مع ماصة 100 ميليلتر.

6-قياس تركيز مكتبة بالوقت الحقيقي الكمي PCR

  1. تحديد تركيز كل مكتبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة13.
    1. إعداد حل برنامج تخفيف على النحو التالي: مزيج 2 ميليلتر من مكتبة المنقي وميليلتر 38 من المياه خالية من نوكلاس في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي مع ماصة 2-ميليلتر و 100 ميليلتر.
    2. تخزن المكتبات غير مخفف في-20 درجة مئوية حتى الخطوة 7، 3.
  2. تعد حلاً تمييع 200-fold كما يلي: مزيج 5 ميليلتر من برنامج مكتبة المنقي المخفف (إعدادها في الخطوة 6، 1) و 45 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي.
  3. تعد حلاً تمييع 2,000-fold كما يلي: مزيج 5 ميليلتر مكتبة المنقي المخفف 200-fold (تم إعداده في الخطوة 6، 2) و 45 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي.
  4. إعداد مزيج الرئيسي في رد فعل على النحو التالي: مزيج 10 ميليلتر من 2 × الحل مزيج الرئيسي و 1 ميليلتر من 20 x الحل المقايسة التحقيق التمهيدي في أنبوب ميكروسينتريفوجي العقيمة مع ماصة، ثم تخلط بالتنصت على الأنبوب. إضافة 11 ميليلتر من رد فعل مزيج الرئيسي في الآبار من فعل 96-جيدا البصرية.
  5. إضافة ميليلتر 9 مكتبة المخفف 2,000-fold أو ميليلتر 9 لكل عنصر تحكم قياسي 9 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لكل بئر مع ماصة 10 ميليلتر.
  6. عقد الجانب غير لاصقة للفيلم لاصقة الضوئية وقشر الواقية دعم من مركز الفيلم مرة أخرى.
    1. بلطف اسحب قضيب فوق الفيلم، وختم الفيلم عبر لوحة 96-جيدا.
    2. المزيج بلطف لوحة 96-جيدا باستخدام خلاط لوحة 96-جيدا لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    3. الطرد المركزي في اللوحة بإيجاز في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. السلطة على الصك PCR الوقت الحقيقي، وإدراج لوحة 96-جيدا. تشغيل ردود فعل PCR استخدام بروتوكول التالية: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 1 s و 60 درجة مئوية 20 س. استخدام "المنحنى القياسي" و "الوضع السريع".
  8. حساب تركيز مكتبة غير مخفف بضرب تركيز يحددها 2,000 مع قبكر.

7-القادم جيل التسلسل

  1. خطة شرط التشغيل وتعيين المعلمة التشغيل داخل البرنامج.
    1. انقر فوق [الخطة التبويب] و [قالب]، وحدد طريقة التشغيل المناسبة.
    2. حدد نوع الأسلوب والتطبيق، وانقر فوق [التالي].
    3. حدد الصك، نموذج إعداد مجموعة أدوات (اختياري)، نوع مجموعة المكتبة، وطقم قالب، كيت التسلسل وقاعدة طريقة المعايرة، رقاقة نوع، التحكم في تعيين تسلسل (اختياري)، والرمز الشريطي، وانقر فوق [التالي].
    4. حدد الوظائف الإضافية وانقر فوق [التالي].
    5. حدد المشروع ثم انقر فوق [التالي].
    6. حدد مرجع الافتراضية وملفات سرير من المنطقة المستهدفة.
    7. اكتب اسم النموذج، حدد الرمز الشريطي، ثم انقر [خطة تشغيل].
  2. قم بإعداد قالب ورقاقة تحميل أداة مؤتمتة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. ذوبان الجليد خرطوشة الكاشف في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. تمييع المكتبة غير مخفف بالمياه خالية من نوكلاس طبقاً لتركيز مكتبة المحسوبة في الخطوة 6.8 وجعل 20 م المكتبات.
    1. تعد مكتبة مجمعة للتسلسل ومخزن على الجليد.
    2. إضافة 25 ميليلتر من مكتبة المجمعة مع 100 ميليلتر ماصة للجزء السفلي من أنبوب عينة. استخدام مكتبة المجمعة خلال 48 ساعة.
  4. على السلطة وفتح الغطاء الصك الآلي.
    1. مكان رقاقة التسلسل ومحول رقاقة وخرطوشه الإثراء، خرطوشة تلميح، لوحة بكر، بكر الإطار الختم، أنبوب الانتعاش، خرطوشة الحل وخرطوشه كاشف للموقف المناسب من أداة مؤتمتة.
    2. لمس [إعداد تشغيل] و [خطوة بخطوة] على الشاشة.
    3. أغلق الغطاء واللمس [بدء الفحص] على الشاشة.
    4. بعد على سطح المسح الضوئي عملية، لمس [التالي] على الشاشة.
    5. تحقق من محتويات العرض (مجموعة شرائح النوع رقاقة خطط معرف، معرف عينة،) وتعيين الوقت واللمس [موافق] على الشاشة.
  5. بعد الانتهاء من تحميل رقاقة:
    1. لمس [التالي] على الشاشة وفتح الغطاء.
    2. تم إلغاء تحميل رقاقة التسلسل من محول رقاقة مع الأيدي القفاز.
    3. ضع الرقاقة داخل الحاوية رقاقة، الراب مع بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية حتى رد فعل التسلسل.
    4. إزالة خرطوشة تخصيب، لوحة بكر، بكر الإطار الختم، أنبوب الانتعاش، خرطوشة الحل، وكاشف خرطوشة من الموقف المناسب صك الأيدي القفاز الآلي.
    5. نقل خرطوشة فارغة-تلميح إلى موقف نصيحة النفايات الصك الآلي مع الأيدي القفاز.
    6. لمس [التالي] وأغلق الغطاء.
    7. لمس [Start] وتنظيف أداة مؤتمتة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 4 دقائق.
  6. حل كمبيوتر لوحي كلوريت صوديوم في 1,000 مل من الماء عالي النقاوة والحل تصفية مع وحدة تصفية تدفق تصفية 0.22 ميكرومتر.
    1. السلطة على الصك التسلسل.
    2. لمس [Clean] و [التالية] على شاشة الصك التسلسل.
    3. تنظيف أداة التسلسل مع 250 مل من حل كلوريت الصوديوم تصفية تعقيم وبعد ذلك 250 مل من الماء عالي النقاوة.
  7. لمس [تهيئة] وحدد مجموعة التسلسل المناسب على الشاشة.
    1. تثبيت الشاحن رمادية في الموقع المناسب مع الأيدي القفاز.
    2. تهيئة أداة التسلسل مع الحل أغسل (المقدمة في الطقم)، والحل تعديل درجة الحموضة (التي تحتوي على 350 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم 100 ملم)، والحل القياسية الأس الهيدروجيني (المقدمة في الطقم).
  8. إضافة 20 ميليلتر من النيوكليوتيدات داتب، دجتب، دكتب ودتتب (المقدمة في الطقم) في أنابيب 50 مل (المتوفرة في مجموعة أدوات) مع ماصة 100 ميليلتر.
    1. تثبيت الشاحن رمادية في الموقع المناسب مع الأيدي القفاز.
    2. تحميل أنبوب 50 مل والمسمار على الصك التسلسل.
    3. لمس [التالية] على الشاشة لبدء الخطوة التهيئة، التي تستغرق حوالي 25 دقيقة.
  9. بعد الانتهاء من الخطوة التهيئة:
    1. لمس [تشغيل] على الشاشة، وحدد أداة إعداد المكتبة المناسبة.
    2. مسح الباركود ثنائي الأبعاد للرقاقة.
    3. إدراج شرائح التسلسل في الموقف المناسب.
    4. إغلاق الباب المشبك وصك رقاقة.
    5. لمس [رقاقة الاختيار]، [التالية]، و [موافق] على الشاشة لبدء تشغيل تسلسل.
  10. بعد رد فعل التسلسل، نقل البيانات وتنفيذ خط أنابيب تحليل البيانات على ملقم التسلسل13،17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 العملية برمتها من إعداد العينات عرة لاستخراج الحمض النووي. جدير بالذكر أن يستغرق الإجراء يومين فقط للحصول على الحمض النووي من عينات عرة. نحن تقييم أية آثار لتخزين الورم قبل تجهيز الشريحة. ووجدنا أن الخلايا السرطانية كانت تعلق على شريحة الزجاج عندما تم التطرق عينات الأنسجة مباشرة على الشريحة، وعندما الأنسجة وأبقى في المالحة ترطب العقيمة-شاش ح 1 (الشكل 2). ومع ذلك، عندما الأنسجة تم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة، خلايا السرطان لم تكن كذلك مرفقة إلى الشريحة. يمكن تخزين الشرائح المعدة عند 4 درجة مئوية لمدة ثلاثة أشهر. ولذلك، من المهم لا تسمح العينات الجافة.

دراسة جدوى أسلوبنا، ومقارنتها مع العينات التي تم الحصول عليها باستخدام فب. وأعدت عرة و FFPE عينات من عينات الورم 14، وأكدنا أنه يمكن تقييم محتويات الورم والنقاء من العينات عرة. بعد أن أجرينا صبغة جيمسا، يمكن تقدير عدد الخلايا السرطانية ومورفولوجيا الورم بالفحص المجهري. وهكذا تمكنا من تقييم الخلايا السرطانية بشكل روتيني، وبعد إجراء فحص نوعية الحمض النووي.

وقدرت كمية الحمض النووي ونوعية كمية الوقت الحقيقي بكر13،،من1415. علينا تحديد كميات الحمض النووي المطلق والقيمة RQ، ومؤشر لتدهور مستوى الحمض النووي. وأظهرت النتائج أن تحقق أعلى الحمض النووي عائد باستخدام العينات عرة مقارنة مع العينات FFPE (الجدول 1). وباﻹضافة إلى ذلك، قيم RQ "الحمض النووي عرة" كانت إلى حد كبير أعلى بالمقارنة "الحمض النووي فب" (الشكل 3، ف = 2.3 × 10-8، t الاختبارات التائي). ونحن أيضا بتقييم القيم RQ عرة و FFPE الحمض النووي المستخرج من أنواع مختلفة من الأورام، ووجد أن "الحمض النووي عرة" كان أعلى في الجودة بالمقارنة مع "الحمض النووي فب" (الشكل 3). هذه النتائج تشير إلى أن "الحمض النووي عرة" تجزئة أقل من "الحمض النووي فب".

التالي قمنا بتقييم ما إذا كان يمكن استخدام "الحمض النووي عرة" لتحليل تسلسل الجيل القادم. أعدت فب والتشنج الحمض النووي من الابتدائي سرطان القولون والمستقيم وسرطان الكبد المنتشر التي تم الحصول عليها من مريض (الشكل 4 أ). [بكر] تضخيم وإعداد مكتبة أجريت باستخدام "لوحة الساخنة السرطان" وتم إجراء تسلسل المستهدفة في وقت لاحق. نتيجة لذلك الجيش الشعبي الكونغولي Q1367 * حددت في كل من فب والتشنج الحمض النووي المستخرج من موقع 1 (الجدول 2). وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن الجيش الشعبي الكونغولي S1356 * و G12D كراس و TP53 M237I في كلا فب و "التشنج الحمض النووي" المستخرج من الموقع 2 و 3 و 4 (الجدول 2). واقترح هذه النتائج تم تحديد الطفرات الجسدية متطابقة في عينات فب والحمض النووي عرة إقران إعداد من نفس موقع الورم (الشكل 4 باء و الجدول 2). جدير بالذكر أن تم الكشف عن الطفرات الجسدية نفسها بين الابتدائي سرطان القولون والمستقيم (الموقع 2، لا موقع 1) وهما سرطان الكبد المنتشر العينات، مما يوحي بأن المستنسخين الورم من 2 موقع السرطاني للكبد (الشكل 4 باء و الجدول 2). وتوحي هذه النتائج معا أن الحمض النووي عرة عالية الجودة ومناسبة لمجموعة واسعة من الاختبارات الجينية بما في ذلك تسلسل الجيل القادم.

Figure 1
الشكل التخطيطي 1. للحصول على الحمض النووي من إعداد نموذج عرة. ورم الأنسجة هو تطرق الزجاج الشريحة لتحضير العينة عرة. بعد تقييم الورم مورفولوجيا والمحتويات تحت مجهر، يمكن استخراجه وتستخدم الاختبارات الجينية الحمض النووي الورم. باستخدام عرة، الورم الحمض النووي ويمكن الحصول من عينة مرضية سريرية في غضون يومين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. إعداد عينات عرة. عينات الورم ريسيكتيد فورا وتطرق إلى شريحة زجاج عادي (اللوحة اليمنى)، أبقى في المالحة ترطب العقيمة-شاش ح 1 (الأوسط)، وتحفظ في درجة حرارة الغرفة ح 1 (يمين). وكان نموذج #1 سرطانه الخلية الكبدية وعينه #2 كان سرطان الثدي. تم القبض على صور مجهرية باستخدام كاميرا رقمية محمولة مجهر. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. فحص الحمض النووي الجودة وتقدر الكمية تحليل PCR الوقت الحقيقي- التشنج والحمض النووي FFPE استخرجت من أنسجة الورم 14 من القولون والمستقيم (n = 8)، المعدة (n = 4)، وسرطان الكبد المنتشر (n = 2). مقارنة درجات القياس الكمي النسبي بين العينات عرة-جيمسى وهو فب. كانت القيم RQ "عرة الحمض النووي" من أعلى إلى حد كبير من "الحمض النووي فب". تم إجراء التحليل الإحصائي بين الفريقين و p-حسبت القيم ب t اختبار مزاوج-التائي باستخدام Excel. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. تسلسل الجيل القادم تحليل البيانات باستخدام التشنج والحمض النووي فب. (أ) Macroscopic والصور المجهرية. صور الممثل Giemsa تيك وأنه FFPE تلطيخ من سرطان القولون والمستقيم (الموقع 1 و 2) وسرطان الكبد المنتشر العينات (الموقع 3 و 4). شريط مقياس في الصور العيانية: 1 سم، شريط مقياس في الصور المجهرية: 100 ميكرومتر-(ب) الحرارة خريطة تبين توزيع الطفرات الجسدية لكل موقع الورم (n = 8). تم الكشف عن الطفرات متماثلة بين إقران عينات عرة والحمض النووي فب. يتم الإشارة إلى قيم كسور الاليلي في مقياس اللون تخرج من 1% (الخفيفة الوردي) إلى 100% (الوردي). وأظهرت أعمدة رمادية لا الطفرات التي تم تحديدها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

جيمسى تيك (n = 14) فب هو (n = 14)
مجموع الحمض الخلوي الصبغي (الحرس الوطني) مجموع الحمض الخلوي الصبغي (الحرس الوطني)
عينة موقع الورم قصيرة طويلة RQ قصيرة طويلة RQ
Site1 القولون 1495 1247 0.83 939 349 0.37
Site2 القولون 991 1057 1.07 556 204 0.37
Site3 الكبد 467 511 1.09 130 39 0.3
Site4 الكبد 2172 2115 0.97 488 127 0.26
Site5 القولون 749 598 0.8 529 205 0.39
Site6 المعدة 330 286 0.86 211 98 0.46
Site7 المعدة 636 499 0.78 154 84 0.55
Site8 المعدة 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 القولون 1986 1611 0.81 476 163 0.34
Site10 القولون 280 218 0.78 209 83 0.39
Site11 القولون 1546 575 0.37 366 159 0.43
Site12 المعدة 1501 1200 0.8 274 132 0.48
Site13 القولون 1556 1404 0.9 326 179 0.55
Site14 القولون 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

الجدول 1. بيانات نوعية الحمض النووي. "عرة إقران" (n = 14) والعينات FFPE (n = 14) أعدت من القولون، والكبد، وسرطان المعدة. عرة العينات كانت ملطخة جيمسى، وعينات FFPE كانت ملطخة الهيماتوكسيلين وويوزين (أنه). استخرجت عينات من الحمض النووي وكمياً بالكمي PCR الوقت الحقيقي مع اثنين من أزواج التمهيدي تضخيم موضع رناسيب (amplicon طويلة (268 bp) وأمبليكون قصيرة (87 bp)). تم حساب قيم RQ كما يلي: قيمة amplicon طويلة يعني تقسيم قيمة يعني bythe amplicon قصيرة. التنمية المستدامة، والانحراف المعياري؛ RQ، كوانتيتيشن النسبي

اسم العينة موقع إعداد رمز الجينات الطفرة موقف مرجع البديل الترميز التغطية كسر الاليلي
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 1 فب آسيا والمحيط الهادئ Q1367 * chr5:112175390 ج T c.4099C > T 1999 45%
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 1 عرة آسيا والمحيط الهادئ Q1367 * chr5:112175390 ج T c.4099C > T 1011 72%
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 2 فب آسيا والمحيط الهادئ S1356 * chr5:112175358 ج A c.4067C > A 1968 77%
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 2 فب كراس G12D chr12:25398284 ج T c.35G > A 1993 52 ٪
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 2 فب TP53 M237I chr17:7577570 ج A c.711G > T 1991 73%
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 2 عرة آسيا والمحيط الهادئ S1356 * chr5:112175358 ج A c.4067C > A 1967 89%
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 2 عرة كراس G12D chr12:25398284 ج T c.35G > A 1994 56%
الابتدائي سرطان القولون والمستقيم الموقع 2 عرة TP53 M237I chr17:7577570 ج A c.711G > T 1995 86%
سرطان الكبد المنتشر موقع 3 فب آسيا والمحيط الهادئ S1356 * chr5:112175358 ج A c.4067C > A 1974 92%
سرطان الكبد المنتشر موقع 3 فب كراس G12D chr12:25398284 ج T c.35G > A 1995 62%
سرطان الكبد المنتشر موقع 3 فب TP53 M237I chr17:7577570 ج A c.711G > T 1296 91%
سرطان الكبد المنتشر موقع 3 عرة آسيا والمحيط الهادئ S1356 * chr5:112175358 ج A c.4067C > A 1964 97%
سرطان الكبد المنتشر موقع 3 عرة كراس G12D chr12:25398284 ج T c.35G > A 1993 64%
سرطان الكبد المنتشر موقع 3 عرة TP53 M237I chr17:7577570 ج A c.711G > T 1998 95 في المائة
سرطان الكبد المنتشر الموقع 4 فب آسيا والمحيط الهادئ S1356 * chr5:112175358 ج A c.4067C > A 1965 93%
سرطان الكبد المنتشر الموقع 4 فب كراس G12D chr12:25398284 ج T c.35G > A 1992 60 في المائة
سرطان الكبد المنتشر الموقع 4 فب TP53 M237I chr17:7577570 ج A c.711G > T 1993 92%
سرطان الكبد المنتشر الموقع 4 عرة آسيا والمحيط الهادئ S1356 * chr5:112175358 ج A c.4067C > A 1960 94%
سرطان الكبد المنتشر الموقع 4 عرة كراس G12D chr12:25398284 ج T c.35G > A 1992 62%
سرطان الكبد المنتشر الموقع 4 عرة TP53 M237I chr17:7577570 ج A c.711G > T 1995 95 في المائة

الجدول 2. مقارنة بين الطفرات في إقران فب والحمض النووي عرة الكشف عنها بواسطة تحليل تسلسل المستهدفة. تم إعداد عينات عرة إقران وفب من سرطان القولون والمستقيم الرئيسي 2 (الموقع 1 و 2) وسرطان الكبد المنتشر 2 (موقع 3 و 4). تم إجراء تسلسل المستهدفة مع هذه عينات الحمض النووي، وحددت الطفرات الجسدية. ملامح الطفرة كانت متطابقة بين العينات المزدوجة عرة والحمض النووي فب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، وقد عرضنا طريقة بديلة للحصول على الورم الحمض النووي من العينات المرضية السريرية استخدام عرة. إعداد عرة بسيطة جداً وتحتاج إلى وقت أقل بالمقارنة مع أساليب فب، دون الحاجة إلى أدوات خاصة10. يمكن إكمال كافة الإجراءات من إعداد عرة لاستخراج الحمض النووي في غضون يومين (الشكل 1). ومن ثم يقصر هذا الأسلوب الزمنية اللازمة لإجراء الاختبارات الجينية. جدير بالذكر أن هذا يوفر ميزة كبيرة في تقصير عدد الأيام اللازمة للتحليل الجزيئي. هذا الزمنية قصيرة يتيح لنا أن نقدم فورا علاج مناسب لمرضى السرطان التقدمي الذين يحتاجون إلى العقاقير جزيئيا المستهدفة. وهكذا يوفر هذا الأسلوب فوائد لتحليلات للتعديلات الوراثية في الأورام وإدارة المخدرات تستهدف جزيئيا لعلاج السرطان.

وهناك بعض النقاط الرئيسية للنجاح استخدام "الحمض النووي عرة" للتحليل الجيني. قد يكون الورم أنسجة نخرية بسبب العلاج مثل العلاج الكيميائي أو العلاجات الأخرى. وهكذا، هو الحذر في إعداد العينات عرة لتجنب أخذ العينات من أقسام نخرية في الورم إلى أقصى حد ممكن. كذلك، التقييم المجهري الأولى مهم جداً للإجراءات اللاحقة. وباﻹضافة إلى ذلك، منع جفاف أنسجة الورم مطلوب للنجاح في إعداد نموذج عرة. إذا هي المجففة أنسجة الورم، هذه النتائج في الخلايا المرفقة أقل على الشريحة الزجاجية. أيضا أنه سيكون من الصعب على مراقبة الورم سيلولاريتي ومورفولوجيا لأن التجفيف يؤدي إلى ضمور أنسجة الورم.

وهناك بعض الفوائد المحتملة لاستخدام "الحمض النووي عرة". أولاً، يمكننا التحقق سيلولاريتي الورم من خلال التقييم الأولى مع الفحص المجهري. إذا كانت الخلايا الطبيعية، مثل الخلايا الليمفاوية والخلايا اللحمية، وفيرة في عينات الأنسجة، أن منع التلوث من هذه الخلايا الطبيعية القدرة على الكشف عن الطفرات الجسدية في الخلايا السرطانية. قد يساعد التقييم المجهري السريع للعينات تقييم سيلولاريتي الورم وتقدير ما إذا كان الورم كافية عينات الحمض النووي تم الحصول عليها من عينات عرة قبل استخراج الحمض النووي. ثانيا، لدينا نتائج أظهرت أن "الحمض النووي عرة" عالية النوعية والكمية على حد سواء. وقد استخدمت "فب الحمض النووي" للجيل القادم تسلسل التحليل بما في ذلك تسلسل المستهدفة وعزمي تسلسل الجينوم كله تسلسل16،17،18،،من1920. المحفوظات "من الحمض النووي فب" تستخدم بشكل روتيني أيضا للتحليل الجيني21،22، لكن يمكن تجزئة FFPE الحمض النووي أثناء التثبيت الفورمالين. وهذا يؤدي إلى مشاكل في [بكر] تضخيم أو استخراج الحمض النووي، مما تسبب في انعدام التغطية التسلسل، والتوحيد في المناطق المستهدفة، وتزيد من خطر تسلسل الخطأ23،24. وفي المقابل، "عرة الحمض النووي" لا مجزأ، الذي قد يكون بسبب تثبيت الكحول يحتوي على أقل من تأثير على الحمض النووي. كما هو ليس تجزئة "عرة الحمض النووي" مثل "الحمض النووي فب"، وهذه العينات سيكون أكثر ملائمة لتحليل تسلسل الجيل القادم، بكر في الوقت الحقيقي، وبكر الرقمية. وفي الواقع، أظهرنا سابقا أن "الحمض النووي عرة" من عينة ورم يمكن أن تستخدم في تحليل تسلسل الجيل القادم، طريقة تسمى "تيك-seq"، ويمكن التحديد التقاط النتائج الطفرات الجسدية الورم13. ثالثا، أن هذا الأسلوب ينطبق على طائفة واسعة من المواد. وفي التقرير الحالي، استخدمنا العينات الجراحية. بالإضافة إلى جراحة الأنسجة، العقدة الليمفاوية المنتشر، يمكن استخدام خزعة الشعب الهوائية أو المنظار لإعداد "عرة الحمض النووي".

وفي الختام، فإننا نعرض طريقة بسيطة وسريعة لإعداد الحمض النووي ورم عالية الجودة باستخدام عينات عرة. هذا الأسلوب سيتم توسيع إمكانيات جديدة في مجال التحليل الجيني وتساعد على تعزيز الطب الدقة في الإعداد السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر جميع الموظفين الطبية والتبعية للمستشفى والمرضى لموافقتها على المشاركة. ونحن نشكر "غابرييل الأبيض وولف"، دكتوراه، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذا التقرير. وأيد هذه الدراسة معونات "مشروع بحوث الجينوم" من محافظة ياماناشي (أي إتش ومو) ومنحة من ياسودا الطبية مؤسسة (أي إتش).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373, (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45, (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6, (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339, (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23, (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53, (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39, (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161, (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45, (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32, (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1, (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5, (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8, (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8, (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46, (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17, (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34, (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3, (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3, (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376, (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13, (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13, (7), 23 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics