Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Получение высококачественных геномной ДНК опухолевых тканей является важным первым шагом для анализа генетических изменений, с помощью следующего поколения последовательности. В этой статье мы представляем простой и быстрый способ обогатить опухолевых клеток и получить нетронутыми ДНК от прикосновения отпечаток цитологии образцов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Важно, чтобы определить мутационного статуса в рак до администрации и лечения конкретных молекулярной целевых препаратов для больных раком. В клинических условиях, формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) широко используются для генетического тестирования. Однако FFPE ДНК как правило повреждено и фрагментарный характер во время процесса фиксации с формалином. Таким образом FFPE ДНК иногда не достаточно для генетического тестирования из-за низкого качества и количества ДНК. Здесь мы представляем метод касания отпечаток цитологии (ИТК) для получения геномной ДНК от раковых клеток, которые можно наблюдать под микроскопом. Морфология и рак клеток числа клеток может оцениваться с помощью образцов TIC. Кроме того добыча геномной ДНК из TIC образцов может быть завершена в течение двух дней. Общее количество и качество TIC ДНК, полученные с помощью этого метода была выше, чем FFPE ДНК. Это быстрый и простой метод позволяет исследователям для получения высокого качества ДНК генетического тестирования (например, следующего поколения последовательности анализа, цифровой ПЦР и Количественная ПЦР в реальном времени) и сократить сроки для представления результатов.

Introduction

Следующее поколение технологии виртуализации предоставил исследователи значительных достижений в анализе генома информации в генетических вариаций и Менделевское болезни, наследственная предрасположенность, рака 1,2,3 . Атлас генома рака (TCGA) и международного консорциума рака генома (ICGC) проводил выявление генетических изменений в нескольких типов общих рака4. Сотни основных Рак генов драйвера были успешно выявлены, и некоторые из этих молекул предназначены для наркотиков развития1,5,6.

В клинических условиях, образцы FFPE часто используются для диагностики патологических и молекулярных тестирования для различных заболеваний, включая рак. Однако во время процесса фиксации с формалином, ДНК белковых или ДНК-ДНК cross-linking возникает и фрагментацию ДНК индуцируется. Таким образом образцы ДНК FFPE не всегда подходит для генетического анализа из-за низкого качества и количества ДНК7,8,9. Кроме того она занимает несколько дней, чтобы подготовить FFPE образцы, и технические навыки необходимо подготовить точно в разделах. Таким образом желательно разработать простой и быстрый метод для получения высокого качества нетронутыми ДНК.

Цитология является альтернативный метод для диагностики патологии. Цитологические пробоподготовки является более простой, менее дорогим и более быстрый подход по сравнению с FFPE подготовка10. ТИЦ техника была выполнена на дозорных лимфатические узлы и маргинальных тканей от больных раком молочной железы для интраоперационного быстрой диагностики для11,несколько лет12. Однако есть несколько докладов, которые изучили ли высокое качество геномной ДНК могут быть извлечены из образцов ТИЦ и используется для последующего генетического анализа. Цитологические образцов обычно окрашивали Папаниколау (Пап) или окрашивание Гимза, и мы ранее сообщали, что количество и качество ДНК, извлеченные из образцов TIC (особенно пятнами Гимза образцы) превосходят образцы, полученные из FFPE 13тканей. По сравнению с Pap окрашивание, Гимзы окрашивание имеет преимущество в требующих менее окрашивание процедур. В Пап окрашивание, после того, как образцы были исправлены и витражи, они должны устанавливаться с монтажными среднего (например, Malinol) для разграничения содержимое образца, например клетки тумора, нормальные клетки и воспалительных клеток под микроскопом. Если ППА образец подготовлен без монтажа шаг, это почти невозможно наблюдать клетки под микроскопом, потому что высушенный образец. В сравнении Гимзы окрашивания можно наблюдать в состояние сушеных, поэтому монтаж шаг не является необходимым для быстрой сотовой оценки. Для microdissection Гимзы окрашивание является более подходящим, потому что он требует сухих образцов.

В настоящем докладе мы представляем простой и быстрый метод для подготовки TIC образцов с Гимза окрашивание и продемонстрировать, что ТИЦ является лучшим источником для ДНК, по сравнению с FFPE образцами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TIC подготовка быстро микроскопических оценки с использованием обычных стекла слайды

  1. Выполните TIC подготовки как можно скорее после клинической патологической ткани материалы доступны. Если невозможно немедленно подготовить образцы TIC, держите ткани материалы, покрытые солевой раствор смачивают стерильную марлю и хранить в холодильнике для предотвращения высыхания тканей.
  2. Подготовьте 5 мм3 ткани материалы таких солидных опухолей (например, печени, легких и ткани груди) клинически полученные хирургии и эндоскопии.
    1. Аккуратно протрите ткани с покрытием с физиологического раствора стерильную марлю и удалить кровь, если поверхность ткани имеет много крови.
    2. Для микроскопических образцов, таких как биопсийного материала Держите образец, смоченным стерильной марли, пропитанной физиологического раствора.
  3. Вырезать и обрезать нормальной ткани с ножом обрезки и предоставлять на поверхности опухолевых поражений, если опухоль массы не видимы грубо.
  4. Коснитесь поверхности опухоли резецированный образцов на нормальное стекло слайд несколько раз в перчатках. Визуально убедитесь, что коснулся области составляет более 80% нормальное стеклянное скольжение.
  5. Слегка нажмите на нормальное стекло слайд против полиэтилен naphthalate (PEN) мембраны слайд и мягко руб 2 - 3 раза в перчатках. Визуально убедитесь, что клетки передаются от обычных стекла слайд слайд мембраны пера.
  6. Просушите стекла и перо мембраны слайды 5 мин при комнатной температуре.
  7. Пятно нормальное стеклянное скольжение для прямого цитологического исследования. Окуните стеклянных скольжениях фиксирующие раствором для 5 s, а затем пятно с Гимзы, окрашивание раствора для 15 s.
  8. Оценить и экран содержимое опухоли и клеточности на слайде нормальное стекло полностью с помощью микроскопа для быстрой оценки. Оценивать опухолевых клеток, основываясь на нескольких критериях; ядерные расширения, Аномальный кариотип, обильные хроматина, неравное распределение клеток, соотношение ядерного компонента/цитоплазматических компонента, размер ячейки и ячейки полярности.

2. Подготовка слайд фильма перо мембраны для генетического тестирования

  1. Если в примере клеточности опухоли более 60% быстрый микроскопических оценки (шаг 1.8), вырезать опухоль коснулся фильм перо мембраны слайды для экстракции ДНК с ножом и перчатках руки. Передать отрезока фильм стерильных microcentrifuge трубка с pincette и перчатках.
  2. Если опухоль клеточности определяется как низкий (менее 60% содержания опухоли) быстро микроскопических оценки (шаг 1.8), использование лазерной захватить microdissection и получить образцы опухоли.
    1. Выполняют Гимзы, окрашивание оценить опухолевых клеток с помощью стандартных протоколов.
    2. Вырежьте фильм слайд соответствующий лазерный захвата microdissection PEM мембраны.
    3. Передать отрезока фильм стерильных microcentrifuge трубка с pincette и перчатках.
    4. Храните пленкосодержащие пробки microcentrifuge на 4 ° C до экстракции ДНК (протокол может быть приостановлена здесь).

3. ДНК добыча

  1. Выполнения извлечения ДНК из ТИЦ или FFPE образцов тканей, с использованием комплекта экстракции ДНК FFPE согласно инструкциям производителя с незначительными изменениями. Эквивалент комплект доступен для извлечения шаг FFPE ДНК.
  2. 180 мкл буфера lysis ткани (рН = 8,3) фильм содержащих microcentrifuge пробирку с ручной 200 мкл пипетки. 20 мкл протеиназы K с ручной 20 мкл пипетки и микс на vortexing с вихревой смеситель на максимальной скорости (примерно 2500 об/мин) для 5 s.
  3. Проинкубируйте образцы на 56 ° C ночь с воздуха инкубатора.
  4. Проинкубируйте образцы FFPE и ТИЦ на 90 ° C в блоке тепла за 1 час и 10 минут, соответственно. Кратко вращаться вниз пробки microcentrifuge на 1500 g x 5 s при комнатной температуре с мини центрифуги.
  5. Добавить 200 мкл буфера lysis образца с 200 мкл пипетки и перемешать тщательно, vortexing на максимальной скорости, для 5 s.
  6. Добавить 200 мкл этанола (96-100%) с 200 мкл пипетки и тщательно перемешать, vortexing на максимальной скорости, для 5 s. кратко спин вниз пробки microcentrifuge на 1500 g x 5 s при комнатной температуре с мини центрифуга.
  7. Тщательно передать весь lysate столбце спин с 1000 мкл пипетки и центрифуги на 6000 x g 1 мин при 25 ° C.
  8. Разместите спин столбца в коллекции чистый 2-мл пробирку в перчатках и отбросить коллекции трубка, содержащая потока через в коробку пластиковых утилизации.
  9. Добавить 500 мкл буфера мытья в столбце спин с 1000 мкл пипетки и центрифуги на 6000 x g 1 мин при 25 ° C.
  10. Разместите спин столбца в коллекции чистый 2-мл пробирку в перчатках и отбросить коллекции трубка, содержащая потока через в коробку пластиковых утилизации.
  11. Добавить 500 мкл буфера мытья в столбце спин с 1000 мкл пипетки и центрифуги на 6000 x g 1 мин при 25 ° C.
  12. Удалить коллекцию трубка, содержащая потока через в коробку пластиковых утилизации. Столбце спина в чистой 1,5 мл microcentrifuge трубку в перчатках и центрифуги на 20000 x g 3 мин при 25 ° C для просушки мембраны.
  13. Место столбце спина в трубу связывания ДНК Лоу в перчатках.
    1. Добавьте 40-50 мкл буфера в центре мембраны с 100 мкл пипетки.
    2. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифуги на 20000 x g 1 мин при 25 ° C.
    3. Храните образцы ДНК при-20 ° C до следующего шага (протокол может быть приостановлена здесь).

4. Оценка качества ДНК путем количественной ПЦР в реальном времени

  1. Подготовить основной микс в стерильных microcentrifuge трубка с пипеткой, следующим образом: 10 мкл 2 x режиме реального времени PCR Мастер микс, 1 мкл 20 x РНКазы P праймер-зонд Mix (ампликон размер: 87 bp) и 8 мкл стерильной воды, свободной от нуклеиназы.
  2. Подготовить второй мастер смеси в одной трубке стерильные microcentrifuge следующим образом: 10 мкл 2 x режиме реального времени PCR Мастер микс, 1 мкл 20 x РНКазы P праймер-зонд Mix (ампликонами размер: 268 bp) и 8 мкл стерильной воды, свободной от нуклеиназы.
  3. Выполните серийных разведений геномной ДНК человеческого контроля (поставляется в комплекте) 4 раза для пяти пунктов калибровочной кривой и определения абсолютной концентрации ДНК13.
  4. Мкл 19 двух подготовленных мастер смесей (подготовленных на шаге 4.1 и 4.2) в отдельной скважины оптических 96-луночных реакции пластины с 20 мкл пипетки.
  5. 1 мкл FFPE ДНК или TIC ДНК для отдельных скважин, содержащие смесь реакции с пипетки 2 мкл. 1 мкл нуклеиназы свободной воды, в отдельную скважину, содержащие смесь реакции не шаблон элемента управления.
  6. Держите стороне не клей оптической клейкой пленки и отогните защитный бэк от центра фильма. Аккуратно перетащите аппликатор над фильмом и печать фильм над 96-луночных пластины.
  7. Аккуратно перемешать 96-луночных пластину с помощью пластины 96-луночных смеситель для 10 s при комнатной температуре при 2000 об/мин. Центрифуга пластину кратко на 1000 g x 3 мин при комнатной температуре.
  8. Мощность на реальном времени PCR документа и вставьте пластину 96-луночных. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 95 ° C 20 s, а затем 45 циклов 95 ° c для 1 s и 60 ° C для 20 s. Использование «стандартной кривой» и «быстрый режим».
  9. Оценить фрагментацию ДНК с соотношением ДНК (относительная количественной оценки; RQ) получены для долгого ампликон (268 bp) для коротких ампликон (87 bp). RQ-это среднее значение долго ампликон / среднее значение короткий ампликон13.

5. подготовка следующего поколения последовательности библиотеки

  1. Подготовьте библиотеку последовательности для следующего поколения последовательности согласно инструкциям производителя.
  2. Приготовляют следующим образом мультиплексной ПЦР мастер смесь в стерильных microcentrifuge трубку на сэмпл: 4 мкл 5 x мультиплексной ПЦР реакции раствора, 4 мкл 5 x грунтовка бассейн, ≤6 мкл ТИЦ или FFPE ДНК (1-100 нг) и добавить нуклеиназы свободной воды до 20 мкл.
    1. Добавьте мультиплексной ПЦР мастер смесь ПЦР-пробирку и смешайте нежно путем касания трубку.
    2. Кратко вращаться вниз пробки microcentrifuge на 1500 g x 5 s при комнатной температуре с мини центрифуги.
  3. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 99 ° C в течение 2 мин, после чего 20 циклов 99 ° C 15 s и 60 ° C для 4 мин и проведение шаг 10 ° C. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
    Примечание: Определите количество циклов, основанный на количество пар грунт.
  4. Откройте крышку ПЦР-пробирку и 2 мкл энзима ограничения с пипетки 2 мкл. Аккуратно закройте крышку ПЦР-пробирку и перемешать путем выстукивать ПЦР-пробирку. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
  5. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 50 ° C за 10 мин, 55 ° C за 10 мин, 60 ° C в течение 20 минут, и проведение шаг 10 ° C. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
  6. Добавить адаптер лигирование мастер смесь в каждой хорошо содержащие переваривается ампликонов ПЦР с пипеткой следующим: 4 мкл раствора перешнуровка переходник, 0.5 мкл штрих, 0.5 мкл адаптер, 2 мкл нуклеиназы свободной воды и 2 мкл ДНК лигаза. Аккуратно закройте крышку ПЦР-пробирку и перемешать путем выстукивать. Кратко вращаться вниз ПЦР-пробирку с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре.
  7. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 22 ° C в течение 30 мин, 68 ° C за 5 мин., 72 ° C за 5 мин, и проведение шаг 10 ° C.
  8. Очищайте библиотеки виртуализации с магнитной бусины согласно инструкциям производителя.
  9. Перевод адаптер лигируют библиотека решение на низкий связывания ДНК 1,5-мл. Мкл 45 магнитных шариков в ДНК низкой привязки трубку для очистки 1st . Осторожно перемешать путем касания трубку и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  10. Поместите трубки связывания ДНК Лоу в магнитной стойке, а затем проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Тщательно отбросить супернатант с 200 мкл пипетки не нарушая магнитные бусы.
  11. 150 мкл свежеприготовленные 70% этанола с пипеткой 200 мкл, затем переместите трубку--бокового магнита мыть бисер. Тщательно удалить супернатант не нарушая магнитные бусы.
  12. Повторите шаг 5.11 для второй мыть.
  13. Кратко вращаться вниз по трубе с мини-центрифуга для 5 на 1500 x g s при комнатной температуре. ДНК низкой привязка трубки в магнитной стойке и тщательно отмены этанола капельки с 10-мкл пипетки.
  14. 50 мкл низкой TE в трубу низким привязки ДНК, магнитные бусы Пелле разойтись бусы содержащих. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
  15. ДНК низкой привязка трубки в магнитные стойки и инкубации при комнатной температуре на 2 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
  16. Передача 50 мкл супернатант в новой трубки низкого привязки ДНК и 75 мкл магнитной бусины с 100 мкл пипетки для очистки 2nd . Осторожно перемешать путем касания трубку и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  17. Поместите трубки низкого привязки ДНК в магнитной стойке, а затем проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Тщательно отбросить супернатант с 200 мкл пипетки не нарушая магнитные бусы.
  18. 150 мкл свежеприготовленные 70% этанола с пипеткой 200 мкл, затем переместите трубку--бокового магнита мыть бисер. Тщательно удалить супернатант не нарушая магнитные бусы.
  19. Повторите шаг 5.18 для второй мыть.
  20. Кратко вращаться вниз по трубе с мини центрифуги на 1500 x g 5 s при комнатной температуре. ДНК низкой привязка трубки в магнитной стойке и тщательно отмены этанола капельки с 10-мкл пипетки.
  21. 50 мкл низкой TE, в пробирку низким привязки ДНК, магнитные бусы Пелле разойтись бусы содержащих. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
  22. ДНК низкой привязка трубки в магнитные стойки и инкубации при комнатной температуре на 2 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
  23. Перевести 45 мкл супернатанта, содержащих чистые библиотеки в новой низким привязки трубку ДНК с пипетки 100 мкл.

6. количественную оценку концентрации библиотеки по количественной ПЦР в реальном времени

  1. Определите концентрацию каждой библиотеки согласно инструкции производителя13.
    1. Приготовляют раствор кратной разрежения следующим: смешать 2 мкл очищенный библиотеки и 38 мкл нуклеиназы свободной воды в трубке низким связывания ДНК с 2-мкл и 100 мкл пипетки.
    2. Храните неразбавленном библиотек при-20 ° C до шага 7.3.
  2. Приготовляют раствор 200-fold разрежения следующим: смешать 5 мкл кратной разреженных очищенный библиотеки (подготовленных на шаге 6.1) и 45 мкл нуклеиназы свободной воды в трубе низкого привязки ДНК.
  3. Приготовляют раствор 2,000-fold разрежения следующим: смешать 5 мкл 200-fold разбавленным очищенный библиотеки (подготовленных на шаге 6.2) и 45 мкл нуклеиназы свободной воды в трубе низкого привязки ДНК.
  4. Приготовляют следующим образом реакция мастер смеси: смесь 10 мкл 2 x мастер смесь решение и 1 мкл 20 x праймер зонд пробирного решение в стерильных microcentrifuge трубки с пипеткой, а затем перемешать путем касания трубку. 11 мкл реакция мастер смеси в скважины оптических 96-луночных реакции.
  5. Добавьте 9 мкл разбавленного библиотеки 2,000-fold, 9 мкл каждого стандартного элемента управления или 9 мкл нуклеиназы свободной воды в каждой скважины с дозатор 10-мкл.
  6. Держите стороне не клей оптических самоклеющаяся пленка и отогните защитный бэк от центра фильма.
    1. Аккуратно перетащите аппликатор над фильмом и печать фильм над 96-луночных пластины.
    2. Аккуратно перемешать 96-луночных пластину с помощью пластины 96-луночных смеситель для 10 s при комнатной температуре.
    3. Центрифуга пластину кратко на 1000 g x 3 мин при комнатной температуре.
  7. Мощность на реальном времени PCR документа и вставьте пластину 96-луночных. Запустите ПЦР-реакции, используя следующий протокол: 50 ° C на 2 мин., 95 ° C 20 s, а затем 40 циклов 95 ° c для 1 s и 60 ° C для 20 s. Использование «стандартной кривой» и «быстрый режим».
  8. Рассчитайте концентрацию неразбавленном библиотеки путем умножения концентрация определяется 2000 с ПЦР.

7. следующее поколение последовательности

  1. План выполнения условие и установите для параметра запуска программного обеспечения.
    1. Нажмите кнопку [вкладку план] и [шаблон] и выберите соответствующий метод run.
    2. Выберите приложение и технику типа и нажмите кнопку [далее].
    3. Выберите инструмент, образца подготовка комплекта (опционально), Комплект тип библиотеки, шаблон комплект, Комплект последовательности, базовый режим калибровки, чип типа, последовательности (опционально) и штрих-кодов набора элементов управления и нажмите кнопку [далее].
    4. Выберите плагины и нажмите [Next].
    5. Выберите проект и нажмите кнопку [далее].
    6. Выберите ссылку по умолчанию и кровати файлы целевого региона.
    7. Введите имя образца, выберите штрих-код и нажмите кнопку [план выполнения].
  2. Выполните подготовку шаблона и чип, погрузка в автоматизированный инструмент согласно инструкциям производителя. Оттепель картридж реагента при комнатной температуре 45 мин перед использованием.
  3. Разбавить неразбавленном библиотека с нуклеиназы свободной воды по концентрации Библиотека, рассчитанные на шаге 6,8 и сделать 20 pM библиотек.
    1. Подготовьте Объединенный библиотека для секвенирования и магазин на льду.
    2. 25 мкл пуле библиотеки с 100 мкл пипеткой, в нижней части образца трубки. Используйте библиотеку пуле в течение 48 ч.
  4. Питания и откройте крышку автоматизированного инструмента.
    1. Место последовательности чип, чип адаптер, обогащения картриджа, наконечник картриджа, ПЦР пластины, ПЦР кадр печать, восстановления трубки, решение картриджа и реагента картридж для соответствующей позиции автоматизированного инструмента.
    2. Нажмите [Настройка запуска] и [шаг за шагом] на экране.
    3. Закройте крышку и нажмите [начать проверить] на экране.
    4. После палубе процесс сканирования, нажмите [Next] на экране.
    5. Проверьте содержимое дисплея (тип комплект, чип, чип ID, ID образца, планы), установить время и нажмите [OK] на экране.
  5. После окончания загрузки чип:
    1. Нажмите [Next] на экране и откройте крышку.
    2. Выгрузка последовательности чип от микросхема адаптер в перчатках.
    3. Поместите фишку в контейнер чип, rap парафина и хранить при 4 ° C до sequencing реакции.
    4. Удален обогащения картридж, ПЦР-планшете, ПЦР кадр печать, восстановления трубки, решение картриджа и реагента картридж из соответствующей позиции автоматизированного инструмента в перчатках.
    5. Передача пустой наконечник картриджа отходов Совет положение автоматизированного инструмента в перчатках.
    6. Нажмите [Next] и закройте крышку.
    7. Touch [Пуск] и очистите автоматизированный инструмент ультрафиолетовых лучей на 4 мин.
  6. Растворите таблетки хлорита натрия в 1000 мл ультрачистая вода и фильтр раствор с блоком фильтра фильтр потока 0,22 мкм.
    1. Включите инструмент виртуализации.
    2. Нажмите [Очистить] и [далее] на экране последовательности документа.
    3. Очищайте инструмент виртуализации с 250 мл раствора стерилизованное фильтр натрий хлорита и впоследствии 250 мл ультрачистая вода.
  7. Нажмите [Initialize] и выберите набор соответствующей последовательности на экране.
    1. Установите серый грузоотправителя в соответствующее место в перчатках.
    2. Инициализируйте инструмент виртуализации с промывочный раствор (поставляется в комплекте), регулировка рН раствора, (содержащий 350 мкл рабочего раствора натрия гидроксида 100 мм) и pH стандартного раствора (поставляется в комплекте).
  8. 20 мкл dATP, dGTP, дЦТФ и dTTP нуклеотидов (поставляется в комплекте), в 50-мл тюбиках (поставляется в комплекте), с 100 мкл пипетки.
    1. Установите серый грузоотправителя в соответствующее место в перчатках.
    2. Загрузите 50 мл трубки и винт на последовательности документа.
    3. Нажмите [Next] на экране, чтобы начать шаг инициализации, который занимает примерно 25 минут.
  9. После завершения этапа инициализации:
    1. Touch [Run] на экране и выберите инструмент подготовки соответствующей библиотекой.
    2. Сканировать двумерный штрих-код чипа.
    3. Вставьте последовательности чип на соответствующей позиции.
    4. Закройте дверцу чип зажим и инструмента.
    5. Touch [чип проверить], [далее] и [OK] на экране, чтобы начать запуск последовательности.
  10. После реакции, последовательности передачи данных и выполнения анализа данных конвейера на виртуализации сервера13,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1 показывает весь процесс от подготовки образцов ТИЦ до экстракции ДНК. В частности процедура занимает только два дня, чтобы получить геномной ДНК образцов TIC. Мы оценивали любые последствия опухоли хранения перед обработкой слайд. Мы обнаружили, что опухолевые клетки были прикреплены на стекло слайд, когда образцы ткани сразу же были затронуты на слайд, и когда тканей хранились в солевой смоченной-марлевый стерильный за 1 ч (рис. 2). Однако когда ткани хранились при комнатной температуре, опухолевые клетки были не хорошо прикреплены к слайду. Подготовленные слайды могут храниться при температуре 4 ° C на три месяца. Таким образом важно, чтобы не допустить образцов для просушки.

Мы изучили программу нашего метода и сравнить его с образцами, приобретенных с помощью FFPE. ТИЦ и FFPE образцы были подготовлены 14 образцов опухоли, и мы подтвердили, что от образцов TIC можно оценить содержание опухолевых и чистоты. После того, как мы провели Гимза окрашивание, количество опухолевых клеток и морфологию опухоли может быть оценена по микроскопии. Таким образом мы смогли регулярно оценивать опухолевых клеток и впоследствии выполнить проверку качества ДНК.

ДНК количество и качество оценивались по количественным реального времени PCR13,14,15. Мы определили абсолютного количества ДНК и значение RQ, которая является показателем уровня деградации геномной ДНК. Результаты показали, что более высокую доходность ДНК была достигнута с помощью образцов TIC, по сравнению с образцами FFPE (Таблица 1). Кроме того, RQ значения ТИЦ ДНК были значительно выше по сравнению с FFPE ДНК (рис. 3, p = 2.3 x 10-8, 2-Стьюдента t тесты). Мы также оценили RQ значения ТИЦ и FFPE ДНК, извлеченные из типов различных опухолей и обнаружил, что ТИЦ ДНК была выше в качества по сравнению с FFPE ДНК (рис. 3). Эти результаты указал, что ТИЦ ДНК менее раздробленной, чем FFPE ДНК.

Мы далее оценивать ли TIC ДНК могут быть использованы для следующего поколения последовательности анализа. FFPE и TIC ДНК были подготовлены от первичного рака прямой кишки и метастатическим раком печени, полученные из пациента (рис. 4A). Амплификации PCR и библиотека подготовки были проведены с использованием панели Hotspot рака и впоследствии целевые последовательности была выполнена. В результате APC Q1367 * было определено в FFPE и TIC ДНК, извлеченные из узла 1 (Таблица 2). Кроме того APC S1356 *, G12D крас и TP53 M237I были обнаружены в обоих FFPE и TIC ДНК извлечены из сайта, 2, 3 и 4 (Таблица 2). Эти результаты свидетельствуют о том, что идентичные соматические мутации были определены в паре FFPE и TIC ДНК образцов, подготовленных с того же сайта опухоли (Рисунок 4B и Таблица 2). В частности же соматические мутации были обнаружены между первичной колоректального рака (2 сайта, не сайт 1) и двух образцов метастатическим раком печени, предполагая, что опухоль клоны от сайта 2 метастазы в печени (рис. 4B и Таблица 2). Вместе эти результаты показывают, что ТИЦ ДНК высокого качества и подходит для широкого спектра генетического тестирования, включая секвенирование следующего поколения.

Figure 1
Рисунок 1. схема для получения ДНК пробоподготовки TIC. Опухолевой ткани коснут на стекле слайд подготовить образец TIC. После оценки содержания под микроскопом и морфологию опухоли ДНК опухолевых можно извлечь и использовать для генетического тестирования. С помощью TIC, опухоль ДНК могут быть получены клинической патологической образец в течение двух дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Подготовка образцов TIC. Resected опухоль образцов были немедленно коснулся на нормальное стекло слайд (левая панель), хранится в солевой смоченной-марлевый стерильный 1 h (в центре) и хранятся при комнатной температуре в течение 1 ч (справа). Пример #1 был гепатоцеллюлярной карциномы и образца #2 был рак молочной железы. Микроскопические фотографии были пойманы с помощью цифровой камеры крепится к Микроскоп. Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Проверки качества ДНК оценена на количественный анализ ПЦР в реальном времени. ТИЦ и FFPE ДНК были извлечены из 14 опухолевых тканей из прямой кишки (n = 8), желудка (n = 4) и метастатическим раком печени (n = 2). Сравнение относительной количественной оценки между образцами TIC-Гимза и FFPE-он. RQ значения ТИЦ ДНК были значительно выше, чем в FFPE ДНК. Проведен статистический анализ между двумя группами и p-значения рассчитывались путем непарных двух Стьюдента t -тест с помощью Excel. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Следующего поколения последовательности анализа данных с использованием ТИЦ и ДНК FFPE. (A) макроскопической и микроскопических изображений. Представитель образы TIC-Гимза и FFPE-он от колоректального рака (сайт 1 и 2) и метастатическим раком печени окрашивания образцов (сайт 3 и 4). Линейки в макроскопических изображений: 1 см, шкалы бар в микроскопических изображений: 100 µm. (B) тепла карта, показывающая распределение соматических мутаций для каждого сайта опухоли (n = 8). Идентичные мутации были обнаружены среди парных ТИЦ и FFPE ДНК образцов. Значения аллельные дроби указаны окончания цветовой шкале от 1% (светло-розовый) до 100% (розовый). Серый столбцы показал не выявленных мутации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ТИЦ Гимзы (n = 14) FFPE-он (n = 14)
Общая ДНК (НГ) Общая ДНК (НГ)
Пример Опухоли Короткие Длинный RQ Короткие Длинный RQ
Сайт 1 Колон 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Сайт 2 Колон 991 1057 1.07 556 204 0,37
Сайт3 Печень 467 511 1.09 130 39 0,3
Site4 Печень 2172 2115 0,97 488 127 0.26
Site5 Колон 749 598 0,8 529 205 0.39
Site6 Желудок 330 286 0,86 211 98 0.46
Site7 Желудок 636 499 0.78 154 84 0,55
Узле TechNet8 Желудок 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 Колон 1986 1611 0,81 476 163 0,34
Site10 Колон 280 218 0.78 209 83 0.39
Site11 Колон 1546 575 0,37 366 159 0,43
Site12 Желудок 1501 1200 0,8 274 132 0.48
Site13 Колон 1556 1404 0.9 326 179 0,55
Site14 Колон 1565 1210 0,77 680 295 0,43
За 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Таблицы 1. Качество данных ДНК. Паре TIC (n = 14) и FFPE (n = 14) были подготовлены из толстой кишки, печени и рака желудка. ТИЦ образцы были покрыт пятнами Гимза, и FFPE образцы окрашивали гематоксилином и эозином (он). Образцы ДНК были извлечены и количественно Количественная ПЦР в реальном времени с двумя парами грунт, усиливая RNaseP локус (длинный ампликон (268 bp) и короткие ампликон (87 bp)). RQ значения рассчитывались следующим: среднее значение длиной ампликон разделены bythe среднее значение короткие ампликонами. SD, стандартное отклонение; RQ, относительная количественный

Имя образца Местоположение Подготовка Джин символ Мутация Позиция Ссылка Вариант Кодирование Освещение Аллельные фракция
Первичный рак толстого кишечника Сайт 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 1 ТИЦ APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 2 FFPE КРАС G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 год 73%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 2 ТИЦ APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 года 89%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 2 ТИЦ КРАС G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
Первичный рак толстого кишечника Сайт 2 ТИЦ TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
Метастатическим раком печени Сайта 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
Метастатическим раком печени Сайта 3 FFPE КРАС G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
Метастатическим раком печени Сайта 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
Метастатическим раком печени Сайта 3 ТИЦ APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 год 97%
Метастатическим раком печени Сайта 3 ТИЦ КРАС G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
Метастатическим раком печени Сайта 3 ТИЦ TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
Метастатическим раком печени Сайт 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 года 93%
Метастатическим раком печени Сайт 4 FFPE КРАС G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
Метастатическим раком печени Сайт 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
Метастатическим раком печени Сайт 4 ТИЦ APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
Метастатическим раком печени Сайт 4 ТИЦ КРАС G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
Метастатическим раком печени Сайт 4 ТИЦ TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

В таблице 2. Сравнение мутаций в паре FFPE и TIC ДНК, обнаруженная целевые последовательности анализа. Паре ТИЦ и FFPE образцы были подготовлены от 2 первичного колоректального рака (сайт 1 и 2) и 2 метастатического рака печени (сайт 3 и 4). Целевые последовательности была выполнена с этими образцами ДНК и соматические мутации были определены. Мутация профили были идентичны между парными выборками ТИЦ и FFPE ДНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании мы представили альтернативный метод для получения опухоли ДНК от клинических патологических образцов, используя TIC. ТИЦ подготовка очень проста и требует меньше времени по сравнению с FFPE методами, без требования для специальных инструментов10. Все процедуры, от подготовки КРЕСТИКИ для экстракции ДНК может быть завершена в течение двух дней (рис. 1). Этот метод таким образом сокращает время обработки для выполнения генетического тестирования. В частности это обеспечивает значительное преимущество в сокращение числа дней, необходимых для молекулярного анализа. Это короткие сроки позволяет нам предложить немедленно соответствующей терапии для прогрессивного раковых больных, которые требуют молекулярно целевых препаратов. Таким образом, этот метод обеспечивает преимущества для анализа генетических изменений в опухоли и администрации молекулярно целевых препаратов для лечения рака.

Есть некоторые ключевые моменты для успешного использования ИТК ДНК для генетического анализа. Опухоль ткани может быть некротические из-за лечения, такие как химиотерапия или другие виды лечения. Таким образом осторожность необходима при подготовке TIC образцов чтобы избежать выборки от некротических участков в опухоли как можно больше. Кроме того, первоначальный микроскопических оценки является очень важным для последующих процедур. Кроме того предотвращение сушки тканей опухоли является обязательным для успешной подготовки образца TIC. Если опухоль ткани сушатся, это приводит к меньше прилагаемый клеток на стеклянное скольжение. Он также будет трудно наблюдать опухоли клеточности и морфологии, потому что сушки приводит к дегенерации тканей опухоли.

Есть некоторые потенциальные преимущества использования ИТК ДНК. Во-первых мы можем проверить клеточности опухоли в ходе первой оценки с помощью микроскопии. Если нормальных клеток, таких как лимфоцитов и стромальных клеток, были в изобилии в образцах тканей, загрязнение этих нормальных клеток будет препятствовать способности обнаруживать соматические мутации в опухолевых клетках. Быстрый микроскопических оценки образцов может помочь оценки опухоли клеточности и оценки ли адекватные опухоли образцы ДНК были получены из образцов ТИЦ до экстракции ДНК. Во-вторых наши результаты показали, что ТИЦ ДНК как высокое качество и количество. FFPE ДНК был использован для следующего поколения последовательности анализа, включая целевые последовательности, последовательность exome и весь геном последовательности16,,1718,19,20. Архивные FFPE ДНК также регулярно используется для генетического анализа21,22, однако FFPE ДНК могут фрагментироваться при фиксации формалин. Это может привести к проблемам в амплификации PCR или экстракции ДНК, вызывая отсутствие последовательности освещения, единообразие в целевых регионах и увеличить риск последовательности ошибка23,24. В противоположность этому TIC ДНК не фрагментирована, который может быть из-за фиксации алкоголя, который имеет меньше влияния на нуклеиновые кислоты. Как TIC ДНК не фрагментировать как FFPE ДНК, эти образцы будет более подходящим для следующего поколения последовательности анализа ПЦР в реальном времени и цифровой ПЦР. Действительно мы ранее показал, что ТИЦ ДНК от опухоли образца могут быть использованы в следующего поколения последовательности анализа, метод под названием «TIC-seq», и результаты могут точно захватить опухоли соматические мутации13. В-третьих этот метод применим для широкого спектра материалов. В настоящем докладе мы использовали хирургические образцов. В дополнение к хирургической тканей, метастатических лимфоузлов, бронхов или эндоскопической биопсия может использоваться для подготовки TIC ДНК.

В заключение мы представляем простой и быстрый метод для подготовки ДНК опухоли высокого качества с использованием образцов TIC. Этот метод будет расширять новые возможности в области генетического анализа и способствовать точности медицины в клинических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Мы благодарим всех медицинских и вспомогательных сотрудников больницы и пациентов за согласие участвовать. Мы благодарим Габриэль белый волк, PhD, Edanz группы (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта настоящего доклада. Это исследование было поддержано субсидий для исследовательского проекта генома из префектуры Яманаси (Y.H. и М.О) и Грант от ЯСУДА медицинский фонд (Y.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373, (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45, (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6, (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339, (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23, (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53, (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39, (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161, (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45, (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32, (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1, (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5, (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8, (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8, (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46, (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17, (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34, (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3, (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3, (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376, (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13, (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13, (7), 23 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics