用触印细胞学方法快速获得临床病理标本中高质量肿瘤 DNA

Cancer Research

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Summary

从肿瘤组织获得高质量的基因组 DNA 是利用下一代测序分析基因改变的重要第一步。本文提出一种简便、快速的方法来丰富肿瘤细胞, 从接触印记细胞学标本中获得完整的 DNA。

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

在癌症患者的特定分子靶向药物的治疗前, 确定肿瘤的突变状态是至关重要的。在临床环境中, 福尔马林固定石蜡 (FFPE) 组织广泛用于基因检测。然而, FFPE DNA 在福尔马林固定过程中通常会受到损伤和分裂。因此, 由于 dna 质量和数量的降低, FFPE dna 有时不足以进行基因检测。在这里, 我们提出了触摸印记细胞学 (TIC) 的方法, 以获得肿瘤细胞的基因组 DNA, 可以在显微镜下观察到。细胞形态学和癌细胞数量可以用 TIC 标本来评估。此外, 从 TIC 样品中提取基因组 DNA 可以在两天内完成。利用该方法获得的 TIC dna 的总量和质量均高于 FFPE dna。这种快速简便的方法使研究人员能够获得高质量的基因检测 DNA (例如、下一代测序分析、数字 pcr 和定量实时 pcr), 并缩短报告结果的周转时间。

Introduction

下一代测序技术为研究人员在基因变异、孟德尔病、遗传性倾向和癌症方面的基因组信息分析提供了重要的进展1,2,3.癌症基因图谱 (TCGA) 和国际癌症基因组联合会 (ICGC) 一直在寻找几种常见癌症的基因改变的鉴定4。数以百计的基本癌症驱动基因已被成功地确定, 其中一些分子被瞄准药物开发1,5,6

在临床环境中, FFPE 标本通常用于各种疾病, 包括癌症的病理诊断和分子检测。然而, 在福尔马林固定过程中, dna 蛋白或 dna dna 交联发生, 导致 dna 分裂。因此, FFPE dna 样本并不总是适合遗传分析, 因为质量和数量的 dna7,8,9。此外, 准备 FFPE 标本需要数天的时间, 技术技能是准确准备剖面的必要条件。因此, 建立一种简便、快速的获取高质量完整 DNA 的方法是可取的。

细胞学是病理诊断的一种替代方法。与 FFPE 准备10相比, 细胞学样品制备方法更简单、成本更低、更快速。采用 TIC 技术对乳腺癌患者的前哨淋巴结和边缘组织进行了一些年的术中快速诊断, 其方法为11,12。然而, 很少有报告研究了高质量的基因组 DNA 是否可以从 TIC 标本中提取, 并用于后续的遗传分析。细胞学标本通常染色阴道 (Pap) 或姬姆萨染色, 我们以前报告说, 从 TIC 标本 (特别是姬姆萨染色样品) 提取的 DNA 的数量和质量优于从 FFPE 获得的样本组织13。与 Pap 染色相比, 姬姆萨染色在要求较少染色的过程中具有优势。在 Pap 染色, 样品被固定和染色后, 必须安装在安装培养基 (例如, Malinol), 以区分样本内容, 如肿瘤细胞, 正常细胞和炎症细胞在显微镜下。如果在没有安装步骤的情况下制备 Pap 标本, 在显微镜下观察细胞几乎是不可能的, 因为试样是干的。相比之下, 姬姆萨染色可以观察到干燥状态, 因此, 安装步骤是不必要的快速细胞评估。对于显微切割, 姬姆萨染色更适合, 因为它需要干燥标本。

在本报告中, 我们介绍了一个简单快速的方法来制备 tic 标本与姬姆萨染色, 并表明 TIC 是一个更好的来源的 DNA 比较 FFPE 标本。

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Protocol

1. 利用普通玻片进行快速显微评估的 TIC 准备

  1. 在临床病理组织材料可用后, 尽快完成 TIC 的准备工作。如果 TIC 标本不能立即准备好, 保持用盐水湿不育纱布覆盖的组织材料, 并贮存在冰箱中, 以防止组织的干燥。
  2. 准备5毫米3组织材料, 如实体肿瘤 (, 肝, 肺和乳腺组织), 临床上通过手术或内窥镜获得。
    1. 如果组织表面有大量血液, 用无菌纱布涂上生理盐水并清除血液, 轻轻擦拭组织。
    2. 对于显微标本如活检材料, 保持样品湿润与消毒纱布浸泡在生理盐水。
  3. 切除和修剪正常组织与修剪刀和暴露表面的肿瘤病变, 如果肿块是不可见的严重。
  4. 用戴手套的手将切除标本的肿瘤表面接触到正常的玻璃滑梯上几次。直观地确认触摸区域是正常玻璃滑块的80% 以上。
  5. 轻轻按普通玻璃滑动对聚乙烯乙二醇 (笔) 膜滑动和摩擦轻轻 2-3 倍戴手套的手。目视确认细胞从正常的玻璃滑块转移到笔膜滑动。
  6. 空气干燥两个玻璃和笔膜在室温下滑动5分钟。
  7. 染色正常的玻璃滑块直接细胞学检查。用固定液蘸5秒的玻璃滑块, 然后用姬姆萨染色溶液染色十五年代。
  8. 用显微镜检查和筛查正常玻璃上的肿瘤含量和细胞构成, 并进行快速评估。根据多种标准对肿瘤细胞进行评价;核扩张, 异常核型, 丰富的染色质, 细胞分布不均, 核组分/细胞质组分的比例, 细胞大小和细胞极性。

2. 用于基因检测的笔膜滑动膜的制备

  1. 如果样本显示肿瘤细胞构成超过60% 通过快速显微评估 (步骤 1.8), 削减了用刀和戴手套的手 DNA 提取的笔膜幻灯片的肿瘤接触膜。用 pincette 和戴手套的手将切割膜转移到不育的离心管上。
  2. 如果肿瘤细胞构成通过快速显微评估 (步骤 1.8) 确定为低 (小于60% 的肿瘤含量), 则使用激光捕获显微切割和获得肿瘤样本。
    1. 执行姬姆萨染色, 以评估肿瘤细胞使用标准协议。
    2. 通过适当的激光捕获显微切割, 切下膜的 PEM 膜滑动。
    3. 用 pincette 和戴手套的手将切割膜转移到不育的离心管上。
    4. 将含膜的离心管存放在4摄氏度, 直到 DNA 提取 (该协议可以在此暂停)。

3. DNA 提取

  1. 根据制造商的指示进行小的修改, 使用 FFPE dna 提取试剂盒从 TIC 或 FFPE 组织样品中提取 dna。FFPE DNA 提取步骤中有一个等价的套件。
  2. 添加180µL 组织裂解缓冲液 (pH = 8.3) 到含膜离心管与手动200µL 吸管。添加20µL 的蛋白酶 K 与手动20µL 吸管和混合涡流与漩涡搅拌机在最大速度 (约 2500 rpm) 5 s。
  3. 用空气孵化器在一夜之间孵化56摄氏度的样品。
  4. 分别在热块中孵育90摄氏度的 FFPE 和 TIC 样品1小时和10分钟。在室温下用微型离心机将离心管在 1500 x g 处旋转5秒。
  5. 用200µL 的吸管将200µL 的溶解缓冲液添加到样品中, 并在5秒内以最大速度混合涡流。
  6. 添加200µL 乙醇 (96-100%) 与200µL 的吸管, 并彻底混合涡流在最大速度 5 s. 在室温下, 用迷你离心机在 1500 x g 处向下旋转离心管, 其 5 s。
  7. 小心地将整个裂解液转移到旋转柱上, 用1000µL 的吸管和离心机在 6000 x g 处, 1 分钟25摄氏度。
  8. 将旋转柱放在一个干净的2毫升收集管与戴手套的手, 并丢弃的收集管包含的流动进入一个塑料处理箱。
  9. 用1000µL 的吸管和离心机将500µL 的洗涤缓冲器添加到旋转柱上, 在25摄氏度时, 在 6000 x g 处为1分钟。
  10. 将旋转柱放在一个干净的2毫升收集管与戴手套的手, 并丢弃的收集管包含的流动进入一个塑料处理箱。
  11. 用1000µL 的吸管和离心机将500µL 的洗涤缓冲器添加到旋转柱上, 在25摄氏度时, 在 6000 x g 处为1分钟。
  12. 将包含流经的收集管丢弃到塑料处理箱中。将旋转柱放在干净的1.5 毫升离心管中, 用手套的手和离心机在 2万 x g 3 分钟在25°c, 以干燥膜。
  13. 将旋转柱放置在 DNA 低结合管中, 戴手套的手。
    1. 添加 40-50 µL 洗脱缓冲液的中心膜与100µL 吸管。
    2. 在室温下孵育5分钟, 离心机在 2万 x g 处为1分钟, 25 摄氏度。
    3. 将 DNA 样本存储在-20 摄氏度, 直到下一步 (该协议可以在此暂停)。

4. 定量实时 PCR 法估计 DNA 质量

  1. 用吸管制备无菌离心管中的主混合, 如下所示:10 µL 2x 实时 PCR 总混合, 1 µL 20x RNase P 底漆-探针混合 (扩增子尺寸:87 bp), 8 µL 无菌核酸酶水。
  2. 在一个无菌离心管中准备第二个主组合, 如下所示:10 µL 的2x 实时 PCR 主混合, 1 µL 20x RNase P 底漆-探针混合 (扩增子大小: 268 bp), 8 µL 无菌核酸酶水。
  3. 执行人类控制基因组 DNA 的串行稀释 (在试剂盒中提供) 4 次, 用于五点标准曲线并确定绝对 DNA 浓度13
  4. 将两个准备好的主混合 (在步骤4.1 和4.2 中准备) 的19µL 添加到具有20µL 吸管的光学96阱反应板的分离井中。
  5. 添加1µL 的 FFPE dna 或 TIC dna, 以分离含有与 2-µL 吸管的反应混合物的水井。将1µL 的无核酸酶水添加到一个单独的井中, 其中包含没有模板控制的反应组合。
  6. 保持光学胶膜的非粘接面, 并从胶片的中心剥离保护背衬。轻轻地将涂抹器拖到胶片上, 并将胶片密封在96井板上。
  7. 在十年代的室温下, 以2000转每分钟的温度, 用96井板式搅拌机轻轻地混合96井板。在室温下, 离心板以 1000 x g 为3分钟。
  8. 对实时 PCR 仪进行电源, 并插入96井板。使用以下协议运行 PCR 反应:95 °c 二十年代, 其次45周期95°c 为 1 s 和60°c 为二十年代. 使用 "标准曲线" 和 "快速模式"。
  9. 用 dna 比值 (相对量化) 评估 dna 碎片;RQ) 获得的长扩增子 (268 bp) 到短扩增子 (87 bp)。RQ 是长扩增子的平均值/短增子13的平均值。

5. 下一代测序库的编制

  1. 根据制造商的说明, 为下一代测序准备序列库。
  2. 在无菌离心管中制备多路 pcr 主混合体, 如下所示: 4 µL 的5x 多重 pcr 反应溶液, 4 µL 5x 引物池, ≤6µL TIC 或 FFPE DNA (1-100 ng), 并添加核酸酶免费水多达20µL。
    1. 将多路 pcr 主混合添加到 pcr 管中, 通过轻敲管轻轻混合。
    2. 在室温下用微型离心机将离心管在 1500 x g 处旋转5秒。
  3. 使用以下协议运行 PCR 反应:99 °c 为2分钟, 其次20个周期99°c 为十五年代和60°c 为4分钟和保持步骤10°c。在室温下, 用 1500 x g 的微型离心机将 PCR 管简单地旋转到5秒。
    注: 根据底漆对的数量确定循环次数。
  4. 打开 PCR 管的盖子, 并添加2µL 的限制酶与2µL 的吸管。闭上 pcr 管的盖子, 轻轻地用 pcr 管轻拌。在室温下, 用 1500 x g 的微型离心机将 PCR 管简单地旋转到5秒。
  5. 使用以下协议运行 PCR 反应:50 °c 为10分钟, 55 °c 为10分钟, 60 °c 为20分钟, 并且保持步骤10°c。在室温下, 用 1500 x g 的微型离心机将 PCR 管简单地旋转到5秒。
  6. 将适配器结扎主组合添加到包含已消化 PCR amplicons 的每个井中, 如下所示: 4 µL 适配器结扎液, 0.5 µL 条码, 0.5 µL 适配器, 2 µL 无核酸酶水, 2 µL DNA 连接酶。关闭 PCR 管的盖子, 轻轻地搅拌。在室温下, 用 1500 x g 的微型离心机将 PCR 管简单地旋转到5秒。
  7. 使用以下协议运行 PCR 反应:22 °c 为30分钟, 68 °c 为5分钟, 72 °c 为5分钟, 并且保持步骤10°c。
  8. 根据制造商的指示, 用磁性珠子净化测序库。
  9. 将适配器结扎的库解决方案转移到1.5 毫升的 DNA 低结合管中。在 1st纯化的 DNA 低结合管中添加45µL 磁性珠子。轻轻地搅拌, 在室温下孵化5分钟。
  10. 将 DNA 低结合管放置在磁性机架中, 然后在室温下孵化2分钟, 直到溶液清晰为止。在不干扰磁性珠子的情况下, 用200µL 吸管小心地丢弃上清液。
  11. 添加150µL 新鲜准备的70% 乙醇与一个200µL 的吸管, 然后移动管侧的磁铁, 以洗涤珠。小心丢弃上清, 不干扰磁性珠子。
  12. 重复步骤5.11 以进行第二次清洗。
  13. 在室温下, 用迷你离心机在 1500 x g 处向下旋转管, 5 秒。将 DNA 低结合管放置在磁性机架中, 用10µL 吸管小心地丢弃乙醇液滴。
  14. 将50µL 的低 TE 加入到含有磁性珠子颗粒的 DNA 低结合管中, 以驱散珠子。室温下孵育2分钟。
  15. 将 DNA 低结合管放置在磁性机架中, 在室温下孵育2分钟, 直到溶液清晰为止。
  16. 将50µL 的上清液转移到新的 DNA 低结合管中, 并在 2nd纯化中添加75µL 的磁性珠子和100µL 吸管。轻轻地搅拌, 在室温下孵化5分钟。
  17. 将 DNA 低结合管放置在磁性机架中, 然后在室温下孵育2分钟, 直到溶液清晰为止。在不干扰磁性珠子的情况下, 用200µL 吸管小心地丢弃上清液。
  18. 添加150µL 新鲜准备的70% 乙醇与一个200µL 的吸管, 然后移动管侧的磁铁, 以洗涤珠。小心丢弃上清, 不干扰磁性珠子。
  19. 重复步骤5.18 以进行第二次清洗。
  20. 在室温下, 用微型离心机在 1500 x g 处以5秒的温度旋转管子。将 DNA 低结合管放置在磁性机架中, 用10µL 吸管小心地丢弃乙醇液滴。
  21. 将50µL 的低 TE 加入到含有磁性珠子颗粒的 DNA 低结合管中, 以驱散珠子。室温下孵育2分钟。
  22. 将 DNA 低结合管放置在磁性机架中, 在室温下孵育2分钟, 直到溶液清晰为止。
  23. 将含有纯化库的45µL 的清液转移到新的 DNA 低结合管中, 用100µL 的吸管。

6. 定量实时 PCR 量化图书馆集中度

  1. 根据制造商的说明13确定每个库的集中程度。
    1. 准备一个20倍稀释溶液如下: 混合2µL 纯化的图书馆和38µL 核酸酶无水的 DNA 低结合管与2µL 和100µL 吸管。
    2. 将未稀释的库存储在-20 °c, 直到步骤7.3。
  2. 准备一个200倍稀释溶液如下: 混合5µL 的20倍稀释纯化库 (准备在步骤 6.1) 和45µL 核酸酶无水的 DNA 低结合管。
  3. 准备一个2000倍稀释溶液如下: 混合5µL 的200倍稀释纯化库 (准备在步骤 6.2) 和45µL 核酸酶无水的 DNA 低结合管。
  4. 准备反应大师组合如下: 混合10µL 2x 主混合溶液和1µL 20x 底漆探针检测溶液在无菌离心管与吸管, 然后混合通过攻丝管。将反应主混合的11µL 加入光学96阱反应的井中。
  5. 添加9µL 2000 倍稀释库, 每标准控制9µL, 或9µL 的核酸酶水, 每井与10µL 吸管。
  6. 保持光学胶膜的不粘接面, 并从胶片的中心剥离保护背衬。
    1. 轻轻地将涂抹器拖到胶片上, 并将胶片密封在96井板上。
    2. 在室温下, 在十年代用96井板式搅拌机轻轻混合96井板。
    3. 在室温下, 离心板以 1000 x g 为3分钟。
  7. 对实时 PCR 仪进行电源, 并插入96井板。使用以下协议运行 PCR 反应:50 °c 为2分钟, 95 °c 为二十年代, 跟随40个周期95°c 为 1 s 和60°c 为二十年代. 使用 "标准曲线" 和 "快速模式"。
  8. 通过将 qPCR 确定的浓度乘以 2000, 计算未稀释的库浓度。

7. 下一代测序

  1. 计划运行条件并在软件中设置运行参数。
    1. 单击 [计划选项卡] 和 [模板], 然后选择适当的运行方法。
    2. 选择应用程序和技术类型, 然后单击 [下一步]。
    3. 选择仪器、样品准备套件 (可选)、库套件类型、模板套件、排序工具包、基本校准模式、芯片类型、控制序列 (可选) 和条形码集, 然后单击 [下一步]。
    4. 选择插件, 然后单击 [下一步]。
    5. 选择项目并单击 [下一步]。
    6. 选择目标区域的默认参考和床文件。
    7. 键入示例名称, 选择条形码, 然后单击 [计划运行]。
  2. 根据制造商的指示, 在自动仪器中执行模板准备和芯片加载。使用前将试剂盒在室温下解冻45分钟。
  3. 根据步骤6.8 中计算的库集中度和晚上20点的图书馆, 稀释未稀释的图书馆与无核酸酶的水。
    1. 准备一个汇集库, 用于排序和储存在冰上。
    2. 增加25µL 的汇集图书馆与100µL 吸管在样品管的底部。在48小时内使用池库。
  4. 开启并打开自动仪器的盖子。
    1. 将测序芯片、芯片适配器、浓缩盒、尖端墨盒、pcr 板、pcr 框架密封、回收管、溶液盒和试剂盒放到自动仪器的适当位置。
    2. 在屏幕上触摸 [设置运行] 和 [逐步]。
    3. 在屏幕上关闭盖子并触摸 [开始检查]。
    4. 在甲板扫描过程之后, 触摸屏幕上的 [下一页]。
    5. 检查显示内容 (套件类型、芯片类型、芯片 id、样本 id、计划)、设置时间和触摸屏幕上的 [确定]。
  5. 完成芯片加载后:
    1. 触摸 [下一步] 在屏幕上打开盖子。
    2. 从芯片适配器卸下带手套的手的测序芯片。
    3. 将芯片放入芯片容器, 说唱与 parafilm 和存储在4°c, 直到排序反应。
    4. 从自动仪器的适当位置取出浓缩盒、pcr 板、pcr 框架密封、回收管、溶液盒和试剂盒, 戴手套的手。
    5. 将空尖端墨盒转移到自动仪器的废料尖端位置, 戴手套的手。
    6. 触摸 [下一步] 并关闭盖子。
    7. 触摸 [开始] 和清洁自动仪器的紫外线4分钟。
  6. 用0.22 µm 滤池过滤器将亚氯酸钠片溶解在1000毫升的超纯水和过滤液中。
    1. 在测序仪上通电。
    2. 在测序仪的屏幕上触摸 [清洁] 和 [下]。
    3. 用250毫升过滤灭菌的亚氯酸钠溶液和随后250毫升的超纯水清洗测序仪。
  7. 触摸 [初始化] 并在屏幕上选择适当的排序工具包。
    1. 安装一个灰色托运人在适当的位置戴手套的手。
    2. 用洗涤液 (套件中提供)、ph 调节溶液 (含350µL 100 毫米氢氧化钠) 和 ph 标准溶液 (在试剂盒中提供) 初始化测序仪。
  8. 在50毫升的试管中添加20µL 的 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 核苷酸 (在套件中提供), 用 100-µL 吸管。
    1. 安装一个灰色托运人在适当的位置戴手套的手。
    2. 将50毫升管和螺钉装入测序仪。
    3. 触摸屏幕上的 [下一页] 开始初始化步骤, 大约需要25分钟。
  9. 完成初始化步骤后:
    1. 在屏幕上触摸 [运行] 并选择适当的库准备工具。
    2. 扫描芯片的二维条码。
    3. 在适当的位置插入测序芯片。
    4. 关闭芯片钳和仪表门。
    5. 触摸 [芯片检查], [下一页] 和 [OK] 在屏幕上开始排序运行。
  10. 在排序反应之后, 在排序服务器1317上传输数据并执行数据分析管道。

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Representative Results

图 1显示了从准备 TIC 标本到 DNA 提取的整个过程。值得注意的是, 该手术仅需两天时间才能从 TIC 样品中获得基因组 DNA。我们评估了在滑动处理前肿瘤贮存的任何影响。我们发现, 当组织标本立即触及到幻灯片上时, 肿瘤细胞附着在玻璃滑梯上, 当组织被保存在生理盐水湿润的无菌纱布中时, 1 小时 (图 2)。然而, 当组织保持在室温下, 肿瘤细胞没有很好地附着在幻灯片上。准备好的幻灯片可以储存在4°c 三月。因此, 不允许试样干燥是很重要的。

我们研究了我们的方法的效用, 并与使用 FFPE 获得的标本进行比较。从14例肿瘤标本中制备了 tic 和 FFPE 样品, 证实了肿瘤的含量和纯度可以从 TIC 标本中得到评价。在我们进行姬姆萨染色后, 肿瘤细胞的数量和肿瘤形态学可以用显微学来评估。因此, 我们能够例行评估肿瘤细胞, 然后进行 DNA 质量检查。

DNA 数量和质量由定量实时 PCR 估计13,14,15。我们确定了绝对 dna 数量和 RQ 值, 这是基因组 DNA 降解水平的指标。结果表明, 与 FFPE 标本相比, 利用 TIC 标本获得较高的 DNA 产量 (表 1)。此外, TIC dna 的 RQ 值显著高于 FFPE dna (图 3、p = 2.3 x 10-8、两尾学生的t测试)。我们还评估了从不同肿瘤类型提取的 tic 和 FFPE dna 的 RQ 值, 发现 tic dna 的质量比 FFPE dna 高 (图 3)。这些结果表明, TIC dna 的碎片比 FFPE dna 少。

我们接下来评估 TIC DNA 是否可以用于下一代测序分析。FFPE 和 TIC DNA 是从原发性结直肠癌和转移性肝癌获得的患者 (图 4A) 中制备的。应用肿瘤热点组进行 PCR 扩增和文库制备, 并进行靶向测序。因此, 在从站点 1 (表 2) 中提取的 FFPE 和 TIC DNA 中都发现了APC Q1367。此外, 在从站点2、3和 4 (表 2) 中提取的 M237I 和 TIC DNA 中检测到APC S1356 *、 KRAS G12D 和TP53 FFPE。这些结果表明, 相同的躯体突变是在配对的 FFPE 和 TIC DNA 样本, 从同一肿瘤站点 (图 4B表 2) 中确定的。值得注意的是, 在原发性结直肠癌 (2 站点, 而不是站点 1) 和两个转移性肝癌样本之间发现了相同的体细胞突变, 这表明肿瘤克隆从2转移到肝脏 (图 4B表 2)。这些发现表明, TIC DNA 是高质量的, 适合广泛的基因测试, 包括下一代测序。

Figure 1
图1.Schematic 用于从 TIC 样品制备中获取 DNA.在滑动玻璃上接触肿瘤组织, 准备 TIC 样品。在显微镜下对肿瘤形态和含量进行评估后, 可提取肿瘤 DNA 并用于基因检测。利用 TIC, 可以在两天内从临床病理标本中获得肿瘤 DNA。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。TIC 样品的制备。切除的肿瘤标本立即触及正常的玻璃滑块 (左面板), 保存在盐水湿润无菌纱布1小时 (中间), 并保持在室温 1 h (右)。样本 #1 为肝癌, 样本 #2 为乳腺癌。显微图片是通过安装在显微镜上的数码相机捕捉到的。刻度条: 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。通过定量的实时 PCR 分析估计 DNA 质量检查.从大肠 (n = 8)、胃 (n = 4) 和转移性肝癌 (n = 2) 中提取14个肿瘤组织中的 TIC 和 FFPE DNA。姬姆萨与 FFPE 的相对量化评分比较。TIC dna 的 RQ 值明显高于 FFPE dna。对两组进行了统计分析, 并使用 Excel 对两尾学生的t测试计算了p值。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。下一代测序分析数据使用 TIC 和 FFPE DNA.(A) 宏观和微观图像。姬姆萨和 FFPE 的代表性图像-he 染色的大肠癌 (1 和 2) 和转移性肝癌样本 (站点3和 4)。缩放条在宏观图像: 1 厘米, 缩放条在显微图像: 100 µm. (B) 热图显示每个肿瘤部位的体细胞突变分布情况 (n = 8)。在配对 TIC 和 FFPE DNA 样本中检测到相同的突变。从 1% (浅粉色) 到 100% (粉红色), 在毕业色彩尺度上标明了等位分数的值。灰色列显示没有发现的变异。请单击此处查看此图的较大版本.

姬姆萨 (n=14) FFPE (n=14)
总 DNA (ng) 总 DNA (ng)
示例 肿瘤部位 长期 rq 长期 rq
Site1 结肠 1495 1247 0.83 939 349 0.37
Site2 结肠 991 1057 1.07 556 204 0.37
Site3 467 511 1.09 130 39 0。3
Site4 2172 2115 0.97 488 127 0.26
Site5 结肠 749 598 0。8 529 205 0.39
Site6 330 286 0.86 211 98 0.46
Site7 636 499 0.78 154 84 0.55
Site8 27 27 1.01 135 81 0。6
Site9 结肠 1986 1611 0.81 476 163 0.34
Site10 结肠 280 218 0.78 209 83 0.39
Site11 结肠 1546 575 0.37 366 159 0.43
Site12 1501 1200 0。8 274 132 0.48
Site13 结肠 1556 1404 0。9 326 179 0.55
Site14 结肠 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

表1。DNA 质量数据。配对 TIC (n = 14) 和 FFPE 标本 (n = 14) 是由结肠、肝脏和胃癌制备而成。TIC 样品染色姬姆萨, FFPE 样品染色苏木精和伊红 (he)。通过定量实时 PCR 技术提取和量化 DNA 样本, 并采用两个引物对放大 RNaseP 轨迹 (长扩增子 (268 bp) 和短扩增子 (87 bp))。RQ 值按如下方法计算: 长扩增子的平均值除以短扩增子的平均值。标准偏差;RQ, 相对定量

示例名称 位置 制备 基因符号 突变 位置 参考 变形 编码 覆盖 位基因分数
原发性大肠癌 网站1 FFPE apc Q1367 * chr5:112175390 c t c. 4099 > T 1999 45%
原发性大肠癌 网站1 tic apc Q1367 * chr5:112175390 c t c. 4099 > T 1011 72%
原发性大肠癌 网站2 FFPE apc S1356 * chr5:112175358 c 一个 c. 4067 > A 1968 77%
原发性大肠癌 网站2 FFPE kras G12D chr12:25398284 c t c. 35 g > A 1993 52%
原发性大肠癌 网站2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 c 一个 c. 711 克 > T 1991 73%
原发性大肠癌 网站2 tic apc S1356 * chr5:112175358 c 一个 c. 4067 > A 1967 89%
原发性大肠癌 网站2 tic kras G12D chr12:25398284 c t c. 35 g > A 1994 56%
原发性大肠癌 网站2 tic TP53 M237I chr17:7577570 c 一个 c. 711 克 > T 1995 86%
转移性肝癌 网站3 FFPE apc S1356 * chr5:112175358 c 一个 c. 4067 > A 1974 92%
转移性肝癌 网站3 FFPE kras G12D chr12:25398284 c t c. 35 g > A 1995 62%
转移性肝癌 网站3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 c 一个 c. 711 克 > T 1296 91%
转移性肝癌 网站3 tic apc S1356 * chr5:112175358 c 一个 c. 4067 > A 1964 97%
转移性肝癌 网站3 tic kras G12D chr12:25398284 c t c. 35 g > A 1993 64%
转移性肝癌 网站3 tic TP53 M237I chr17:7577570 c 一个 c. 711 克 > T 1998 95%
转移性肝癌 网站4 FFPE apc S1356 * chr5:112175358 c 一个 c. 4067 > A 1965 93%
转移性肝癌 网站4 FFPE kras G12D chr12:25398284 c t c. 35 g > A 1992 60%
转移性肝癌 网站4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 c 一个 c. 711 克 > T 1993 92%
转移性肝癌 网站4 tic apc S1356 * chr5:112175358 c 一个 c. 4067 > A 1960 94%
转移性肝癌 网站4 tic kras G12D chr12:25398284 c t c. 35 g > A 1992 62%
转移性肝癌 网站4 tic TP53 M237I chr17:7577570 c 一个 c. 711 克 > T 1995 95%

表2。靶向测序分析检测配对 FFPE 和 TIC DNA 突变的比较。配对 TIC 和 FFPE 标本由2例原发性结直肠癌 (站点1和 2) 和2转移性肝癌 (站点3和 4) 制备。对这些 DNA 样本进行了靶向测序, 并确定了体细胞突变。变异剖面在配对 TIC 和 FFPE DNA 样品之间是相同的。

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Discussion

在本研究中, 我们提出了一种从临床病理标本中获取肿瘤 DNA 的替代方法。TIC 准备是非常简单的, 需要较少的时间与 FFPE 方法相比, 没有特殊仪器的要求10。从 TIC 准备到 DNA 提取的所有程序都可以在两天内完成 (图 1)。因此, 这种方法缩短了进行基因检测的周转时间。值得注意的是, 这为缩短分子分析所需的天数提供了重要的优势。这一短暂的周转时间使我们能够立即为那些需要分子靶向药物的进步癌症患者提供适当的治疗。这种方法为肿瘤的基因改变和肿瘤治疗的分子靶向药物的管理提供了有益的结果。

利用 TIC DNA 进行遗传分析是成功的关键。肿瘤组织可能是坏死的, 因为治疗, 如化疗或其他治疗。因此, 在制备 TIC 标本时需要谨慎, 以避免尽可能多地从肿瘤坏死切片取样。此外, 初步的微观评估对后续程序非常重要。此外, 预防肿瘤组织的干燥是成功的 TIC 样品制备所必需的。如果肿瘤组织干燥, 这会导致玻璃滑动上的附着细胞减少。由于干燥导致肿瘤组织的变性, 也很难观察肿瘤的细胞构成和形态学。

使用 TIC DNA 有一些潜在的好处。首先, 我们可以检查肿瘤细胞构成在第一次评估与显微镜。如果正常细胞 (如淋巴细胞和基质细胞) 在组织样本中丰富, 这些正常细胞的污染将阻止检测肿瘤细胞中体细胞突变的能力。快速显微评估的样本可能有助于评估肿瘤细胞构成和估计是否有足够的肿瘤 dna 样本, 从 TIC 样本获得 dna 提取。第二, 我们的结果表明, TIC DNA 的质量和数量都很高。FFPE DNA 已用于下一代测序分析, 包括目标测序, exome 测序, 和整个基因组测序16,17,18,19,20。档案 FFPE dna 也经常用于基因分析21,22, 然而 FFPE dna 在福尔马林固定期间可能是零碎的。这可能导致 PCR 放大或 DNA 提取方面的问题, 导致序列覆盖率不足, 目标区域的一致性, 并增加序列错误的风险23,24。相比之下, TIC DNA 不是碎片, 这可能是由于酒精固定对核酸的影响较小。由于 TIC dna 不像 FFPE dna 那样支离破碎, 这些样本将更适合下一代测序分析、实时 pcr 和数字 pcr。事实上, 我们以前表明, 肿瘤标本的 TIC DNA 可以用于下一代测序分析, 一种叫做 "TIC 序列" 的方法, 结果可以精确地捕获肿瘤体细胞突变13。第三, 该技术适用于多种材料。在本报告中, 我们使用了外科标本。除手术组织外, 转移淋巴结、支气管或内镜活检可用于制备 TIC DNA。

总之, 我们提出了一种简单快速的方法, 以制备高质量的肿瘤 DNA 的 TIC 样品。这种方法将在遗传分析领域扩大新的可能性, 并有助于促进精确医学在临床的设置。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

我们感谢医院和病人的所有医务和辅助人员同意参加。我们感谢加布里埃尔白狼, 博士, 从 Edanz 集团 (www.edanzediting.com/ac) 编辑本报告草稿。这项研究得到了来自山梨州 (Y.H. 和作案手法) 的基因组研究项目的资助, 以及 YASUDA 医学基金会 (Y.H.) 的赠款。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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References

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