Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

Cancer Research

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Summary

L'ottenimento di DNA genomico di alta qualità dai tessuti del tumore è un primo passo essenziale per analizzare le alterazioni genetiche mediante sequenziamento di nuova generazione. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e rapido per arricchire le cellule del tumore e ottenere DNA intatto dal tocco impronta campioni citologici.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

È fondamentale per determinare lo stato mutazionale nel cancro prima amministrazione e trattamento di farmaci a bersaglio molecolare specifici per malati di cancro. In ambito clinico, formalina-fisso tessuti di paraffina (FFPE) sono ampiamente utilizzati per i test genetici. Tuttavia, FFPE DNA generalmente è danneggiata e frammentato durante il processo di fissazione in formalina. Di conseguenza, FFPE DNA non è a volte adeguata per test genetici a causa della bassa qualità e quantità di DNA. Qui presentiamo un metodo di citologia di impronta di tocco (TIC) per ottenere il DNA genomico da cellule tumorali, che può essere osservato sotto un microscopio. I numeri di cellulare delle cellule di morfologia e cancro possono essere valutati utilizzando campioni di TIC. Inoltre, l'estrazione del DNA genomico da campioni TIC può essere completato entro due giorni. Totale quantità e qualità di TIC DNA ottenuto utilizzando questo metodo era superiore a quella del DNA FFPE. Questo metodo rapido e semplice permette ai ricercatori per ottenere alta qualità DNA per test genetici (ad es., analisi di sequenziamento di prossima generazione, digital PCR e PCR quantitativa in tempo reale) e di abbreviare i tempi per riportare i risultati.

Introduction

Prossima generazione tecnologia di sequenziamento ha fornito i ricercatori significativi progressi nell'analisi delle informazioni sul genoma in variazioni genetiche, malattia mendeliana, predisposizione ereditaria e cancro 1,2,3 . Il Cancer Genome Atlas (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) hanno perseguito l'identificazione delle alterazioni genetiche in parecchi tipi di comuni tumori4. Centinaia di cancro essenziali driver geni è stati identificati correttamente, e alcune di queste molecole sono presi di mira per droga sviluppo1,5,6.

In ambito clinico, FFPE esemplari sono comunemente usati per la diagnosi patologica e la prova molecolare per varie malattie, compreso il cancro. Tuttavia, durante il processo di fissazione in formalina, cross-linking del DNA-proteine o DNA-DNA si verifica e viene indotta la frammentazione del DNA. Così, i campioni del DNA FFPE non sono sempre adatti per l'analisi genetica a causa della bassa qualità e la quantità di DNA7,8,9. Inoltre, ci vogliono diversi giorni per preparare i campioni FFPE e abilità tecnica è necessario preparare accuratamente le sezioni. Pertanto, è auspicabile sviluppare un metodo semplice e rapido per ottenere alta qualità DNA intatto.

La citologia è un metodo alternativo per la diagnosi patologica. Preparazione del campione citologico è un più semplice, meno costoso e più rapido approccio rispetto al FFPE preparazione10. La tecnica TIC è stata eseguita il linfonodo sentinella e marginali tessuti da pazienti di cancro al seno per la diagnosi rapida intraoperative per alcuni anni11,12. Tuttavia, ci sono pochi rapporti che hanno esaminato se il DNA genomic di alta qualità può essere estratto dai campioni TIC e utilizzato per la successiva analisi genetica. Campioni citologici sono comunemente macchiati con colorazione di Giemsa o di Papanicolaou (Pap), e precedentemente abbiamo segnalato che la quantità e la qualità del DNA estratto dagli esemplari TIC (soprattutto Giemsa-macchiata campioni) sono superiori a campioni ottenuti da FFPE tessuti13. Rispetto al Pap colorazione, colorazione Giemsa ha un vantaggio in che richiedono meno procedure di colorazione. In Pap colorazione, dopo i campioni sono stati fissati e macchiati, devono essere montati con montaggio medio (per esempio, Malinol) per distinguere i contenuti di esempio, come le cellule del tumore, le cellule normali e cellule infiammatorie sotto un microscopio. Se il campione di Pap è preparato senza la fase di montaggio, è quasi impossibile osservare le cellule al microscopio perché l'esemplare è asciugato. In confronto, colorazione Giemsa possono essere osservati nello stato secco, di conseguenza, il passo di montaggio non è necessario per la rapida valutazione cellulare. Per microdissezione, colorazione Giemsa è più adatto perché richiede campioni asciutti.

In questo rapporto, introduciamo un metodo semplice e rapido per preparare campioni TIC con colorazione Giemsa e dimostrare che il TIC è una fonte migliore per DNA rispetto agli esemplari FFPE.

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Protocol

1. TIC preparazione rapida valutazione microscopica utilizzando vetro normale diapositive

  1. Eseguire la preparazione di TIC più presto possibile dopo il tessuto patologico clinico materiali sono disponibili. Se i campioni TIC non possono immediatamente essere preparati, conservare il materiale di tessuto rivestito con soluzione fisiologica inumidito garza sterile e conservare in frigorifero per evitare l'essiccazione dei tessuti.
  2. Preparare 5 mm3 tessuto materiale come tumori solidi (ad es., fegato, polmone e tessuti del seno) clinicamente ottenuto dalla chirurgia o l'endoscopia.
    1. Delicatamente strofinare il tessuto con garza sterile rivestito con soluzione fisiologica e rimuovere il sangue, se la superficie del tessuto ha un sacco di sangue.
    2. Per campioni microscopici come materiale di biopsia, mantenere il campione inumidito con garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica.
  3. Tagliare e tagliare il tessuto normale con un coltello multiuso ed esporre la superficie della lesione tumorale, se le masse di tumore non sono grossolanamente visibile.
  4. Toccare la superficie del tumore degli esemplari resecati su una lastra di vetro normale parecchie volte con le mani guantate. Confermare visivamente che la zona toccata è oltre l'80% del normale vetrino.
  5. Leggermente premere il vetrino normale contro una diapositiva di membrana in polietilene naftalato (penna) e strofinare delicatamente 2 - 3 volte con le mani guantate. Confermare visivamente che le cellule sono trasferite dalla diapositiva vetro normale alla diapositiva di membrana di penna.
  6. Asciugare il vetro e la penna membrana diapositive per 5 min a temperatura ambiente.
  7. Macchia sul normale vetrino per esame citologico diretto. Immergere i vetrini con soluzione fissante per 5 s e quindi macchia con Giemsa colorazione soluzione per 15 s.
  8. Valutare e a schermo il contenuto del tumore e la cellularità della diapositiva vetro normale interamente con un microscopio per la valutazione rapida. Valutare le cellule del tumore sulla base di diversi criteri; ingrandimento nucleare, karyotype anormale, cromatina abbondante, ineguale distribuzione delle cellule, rapporto del componente componente/citoplasmico nucleare, dimensione delle cellule e polarità cellulare.

2. preparazione del penna membrana Slide Film per test genetici

  1. Se il campione presenta cellularità del tumore oltre il 60% di rapida valutazione microscopica (passo 1,8), tagliare la pellicola tumore-toccato le diapositive di membrana di penna per estrazione del DNA con un coltello e gloved mani. Trasferire la pellicola tagliata a un tubo del microcentrifuge sterile con un pincette e mani inguantate.
  2. Se la cellularità del tumore è stata determinata come basso (meno del 60% del contenuto del tumore) di rapida valutazione microscopica (passo 1,8), uso laser capture microdissection e ottenere i campioni del tumore.
    1. Eseguire Giemsa colorazione per valutare le cellule del tumore utilizzando protocolli standard.
    2. Tagliare la pellicola della diapositiva membrana PEM di microdissezione laser appropriato.
    3. Trasferire la pellicola tagliata a un tubo del microcentrifuge sterile con un pincette e mani inguantate.
    4. Conservare il tubo del microcentrifuge contenenti la pellicola a 4 ° C fino all'estrazione del DNA (il protocollo può essere sospesa qui).

3. DNA estrazione

  1. Eseguire l'estrazione del DNA dai campioni di tessuto TIC o FFPE utilizzando un kit di estrazione del DNA FFPE secondo le istruzioni del produttore con modifiche minori. Un equivalente kit è disponibile per la fase di estrazione del DNA FFPE.
  2. Aggiungere 180 µ l di tampone di lisi del tessuto (pH = 8,3) al tubo del microcentrifuge contenenti la pellicola con una pipetta manuale 200-µ l. Aggiungere 20 µ l di proteinasi K con una pipetta manuale 20-µ l e mescolare nel Vortex con un miscelatore vortex alla massima velocità (circa 2.500 giri/min) per 5 s.
  3. Incubare i campioni a 56 ° C per una notte con un'incubatrice di aria.
  4. Incubare i campioni FFPE e TIC a 90 ° C in un blocco di calore per 1 h e 10 min, rispettivamente. Brevemente girare giù per il tubo del microcentrifuge a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente con una mini centrifuga.
  5. Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi per il campione con una pipetta 200-µ l e mescolare accuratamente nel Vortex alla massima velocità per 5 s.
  6. Aggiungere 200 µ l di etanolo (96-100%) con una pipetta 200-µ l e mescolare nel Vortex alla massima velocità per 5 s. brevemente rotazione verso il basso il tubo del microcentrifuge a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente con una mini centrifuga.
  7. Trasferire con cautela l'intero lisato alla colonna di spin con una pipetta di 1.000-µ l e centrifugare a 6.000 x g per 1 min a 25 ° C.
  8. Posizionare la colonna di spin in un tubo pulito 2-mL collezione con le mani guantate e gettare la provetta di raccolta contenente il flusso continuo in un box di plastica smaltimento.
  9. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin con una pipetta di 1.000-µ l e centrifugare a 6.000 x g per 1 min a 25 ° C.
  10. Posizionare la colonna di spin in un tubo pulito 2-mL collezione con le mani guantate e gettare la provetta di raccolta contenente il flusso continuo in un box di plastica smaltimento.
  11. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin con una pipetta di 1.000-µ l e centrifugare a 6.000 x g per 1 min a 25 ° C.
  12. Gettare la provetta di raccolta contenente il flusso continuo in un box di plastica smaltimento. Posizionare la colonna di spin in un tubo del microcentrifuge pulito 1,5 mL con le mani guantate e centrifugare a 20.000 x g per 3 min a 25 ° C per asciugare la membrana.
  13. Sistemare la colonna di spin in un tubo di associazione DNA-basso con mano guantata.
    1. Aggiungere 40-50 µ l di tampone di eluizione al centro della membrana con una pipetta 100-µ l.
    2. Incubare a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a 20.000 x g per 1 min a 25 ° C.
    3. Conservare i campioni di DNA a-20 ° C fino al passaggio successivo (il protocollo può essere sospesa qui).

4. stima della qualità del DNA da PCR quantitativa in tempo reale

  1. Preparare il mix master in una microcentrifuga sterile con una pipetta, come segue: 10 µ l di 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µ l di 20 x RNasi P Primer-sonda Mix (dimensione amplicone: 87 bp) e 8 µ l di acqua sterile priva di nucleasi.
  2. Preparare il mix master secondo in una microcentrifuga sterile come segue: 10 µ l di 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µ l di 20 x RNasi P Primer-sonda Mix (amplicone dimensioni: 268 bp) e 8 µ l di acqua sterile priva di nucleasi.
  3. Effettuare diluizioni seriali del DNA genomico di controllo umano (fornito nel kit) 4 volte per una curva standard a cinque punti e di determinare l'assoluta di concentrazioni di DNA13.
  4. Aggiungere 19 µ l dei due preparati mix master (preparata al punto 4.1 e 4.2) in pozzetti separati di una piastra di reazione ottico a 96 pozzetti con una pipetta 20-µ l.
  5. Aggiungere 1 µ l di DNA FFPE o TIC DNA per separare i pozzetti contenenti la miscela di reazione con una pipetta 2-µ l. Aggiungere 1 µ l di acqua priva di nucleasi in un pozzo separato contenente la miscela di reazione per il nessun controllo del modello.
  6. Tenere il lato non adesivo di una pellicola adesiva ottico e togliere il film protettivo dal centro del film. Dolcemente trascinare l'applicatore sopra la pellicola e sigillare la pellicola sopra la piastra a 96 pozzetti.
  7. Mescolare delicatamente la piastra a 96 pozzetti utilizzando un mixer di piastra a 96 pozzetti per 10 s a temperatura ambiente a 2.000 giri/min. Centrifugare la piastra brevemente a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.
  8. Accendere l'in tempo reale strumento di PCR ed inserire la piastra a 96 pozzetti. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 95 ° C per 20 s, seguita da 45 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s. curva di utilizzo"standard" e "modalità veloce".
  9. Valutare la frammentazione del DNA con il rapporto del DNA (quantificazione relativa; RQ) ottenuta per l'amplicone lungo (268 bp) per l'amplicone breve (87 bp). RQ è il valore medio del valore medio lungo il amplicon del amplicon breve13.

5. preparazione della prossima generazione sequenziamento biblioteca

  1. Preparare la libreria di sequenziamento per il sequenziamento di nuova generazione secondo le istruzioni del produttore.
  2. Preparare il mix master di PCR multiplex in una microcentrifuga sterile per campione come segue: 4 µ l di soluzione di reazione di PCR Multiplex, 4 µ l di 5 x piscina primer, µ l di ≤ 6 FFPE DNA (1-100 ng), o TIC: 5x e aggiungere acqua priva di nucleasi fino a 20 µ l.
    1. Aggiungere il mix master di PCR multiplex a una provetta PCR e mescolare delicatamente toccando il tubo.
    2. Brevemente girare giù per il tubo del microcentrifuge a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente con una mini centrifuga.
  3. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 99 ° C per 2 min, seguiti da 20 cicli di 99 ° C per 15 s e 60 ° C per 4 min e tenendo un passo 10 ° C. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
    Nota: Determinare il numero di cicli in base al numero di coppie di primer.
  4. Aprire il coperchio del tubo PCR e aggiungere 2 µ l di enzima di restrizione con una pipetta 2-µ l. Chiudere il coperchio del tubo PCR e mescolare delicatamente toccando il tubo PCR. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
  5. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 50 ° C per 10 min, 55 ° C per 10 min, 60 ° C per 20 min, e che tiene un passo 10 ° C. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere il mix master di legatura di adattatore nell'ogni bene contenente gli ampliconi PCR digeriti con una pipetta come segue: 4 µ l di soluzione di legatura di adattatore, 0,5 µ l di codici a barre, 0,5 µ l di adattatore, 2 µ l di acqua priva di nucleasi e 2 µ l di DNA ligasi. Chiudere il coperchio della provetta PCR e mescolare delicatamente toccando. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
  7. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 22 ° C per 30 min, 68 ° C per 5 min, 72 ° C per 5 min, e che tiene un passo 10 ° C.
  8. Purificare la biblioteca di sequenziamento con biglie magnetiche secondo le istruzioni del produttore.
  9. Trasferire la soluzione della libreria adattatore-legati nella provetta da 1,5 mL DNA basso-associazione. Aggiungere 45 µ l di biglie magnetiche nel tubo basso-associazione del DNA per la purificazione dist 1. Mescolare delicatamente toccando il tubo e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  10. Posizionare il tubo di associazione DNA-basso in un rack magnetico, quindi incubare per 2 min a temperatura ambiente fino a quando la soluzione è limpida. Attentamente e scartare il surnatante con una pipetta 200-µ l senza disturbare i branelli magnetici.
  11. Aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% preparati al momento con una pipetta 200-µ l, quindi spostare il tubo lato a lato del magnete per lavare le perle. Con attenzione è possibile scartare il sopranatante senza disturbare i branelli magnetici.
  12. Ripetere il passaggio 5.11 per un secondo lavaggio.
  13. Brevemente rotazione verso il basso il tubo con mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e scartare con attenzione le goccioline di etanolo con una pipetta 10-µ l.
  14. Aggiungere 50 µ l di TE basso nel tubo di basso-associazione di DNA contenente il pellet di biglie magnetiche per disperdere le perline. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
  15. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la soluzione è limpida.
  16. Trasferire il 50 µ l del surnatante nel nuovo tubo basso-associazione DNA e aggiungere 75 µ l di biglie magnetiche con una pipetta 100-µ l per la purificazione di 2nd . Mescolare delicatamente toccando il tubo e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  17. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico, quindi incubare per 2 min a temperatura ambiente fino a quando la soluzione è limpida. Attentamente e scartare il surnatante con una pipetta 200-µ l senza disturbare i branelli magnetici.
  18. Aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% preparati al momento con una pipetta 200-µ l, quindi spostare il tubo lato a lato del magnete per lavare le perle. Con attenzione è possibile scartare il sopranatante senza disturbare i branelli magnetici.
  19. Ripetere il passaggio 5,18 per un secondo lavaggio.
  20. Brevemente rotazione verso il basso il tubo con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e scartare con attenzione le goccioline di etanolo con una pipetta 10-µ l.
  21. Aggiungere 50 µ l di TE basso nel tubo di basso-associazione di DNA contenente il pellet di biglie magnetiche per disperdere le perline. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
  22. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la soluzione è limpida.
  23. Trasferire il 45 µ l del supernatante contenente la libreria purificato nel nuovo tubo basso-associazione del DNA con una pipetta 100-µ l.

6. quantificare la concentrazione di biblioteca di PCR quantitativa in tempo reale

  1. Determinare la concentrazione di ogni libreria secondo istruzioni13 del produttore.
    1. Preparare una soluzione di diluizione 20 volte come segue: mescolare 2 µ l di libreria purificata e 38 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di basso-associazione di DNA con una pipetta 2-µ l e 100-µ l.
    2. Memorizzare le librerie non diluite a-20 ° C fino al punto 7.3.
  2. Preparare una soluzione di diluizione 200 volte come segue: 5 µ l della biblioteca purificata diluita 20 volte (preparata al punto 6.1) e 45 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di basso-associazione di DNA.
  3. Preparare una soluzione di 2,000-fold diluizione come segue: 5 µ l della biblioteca purificata diluita 200 volte (preparata al punto 6.2) e 45 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di basso-associazione di DNA.
  4. Preparare il mix master di reazione come segue: Miscelare 10 µ l di soluzione di mix master: 2x e 1 µ l di soluzione di saggio di primer-sonda nel tubo del microcentrifuge sterile 20x con una pipetta, quindi miscelare toccando il tubo. 11 µ l di mix master reazione nei pozzetti di una reazione di 96 pozzetti ottico.
  5. Aggiungere 9 µ l della 2,000-fold biblioteca diluita, 9 µ l di ogni controllo standard o 9 µ l di acqua priva di nucleasi ad ogni pozzetto con una pipetta 10-µ l.
  6. Tenere il lato non adesivo ottico pellicola adesiva e togliere il film protettivo dal centro del film.
    1. Dolcemente trascinare l'applicatore sopra la pellicola e sigillare la pellicola sopra la piastra a 96 pozzetti.
    2. Mescolare delicatamente la piastra a 96 pozzetti utilizzando un mixer di piastra a 96 pozzetti per 10 s a temperatura ambiente.
    3. Centrifugare la piastra brevemente a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.
  7. Accendere l'in tempo reale strumento di PCR ed inserire la piastra a 96 pozzetti. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 20 s, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s. curva di utilizzo"standard" e "modalità veloce".
  8. Calcolare la concentrazione di libreria non diluito moltiplicando la concentrazione determinata con qPCR di 2.000.

7. sequenziamento di nuova generazione

  1. Pianificare la condizione di esecuzione e impostare il parametro run all'interno del software.
    1. Fare clic su [scheda piano] e [modello] e selezionare il metodo di esecuzione appropriato.
    2. Selezionare l'applicazione e il tipo di tecnica e fare clic su [Avanti].
    3. Selezionare la strumento kit di preparazione del campione (opzionale), tipo di libreria kit, modello kit, kit di sequenziamento, modalità di calibrazione di base, tipo di chip, set di sequenza (opzionale) e codici a barre di controllo e fare clic su [Avanti].
    4. Selezionare plug-in e fare clic su [Avanti].
    5. Selezionare il progetto e fare clic su [Avanti].
    6. Selezionare riferimento predefinito e il file letto dalla regione di destinazione.
    7. Digitare il nome di esempio, selezionare il codice a barre e fare clic su [Esegui piano].
  2. Eseguire la preparazione del modello e chip caricamento in uno strumento automatizzato secondo le istruzioni del produttore. Scongelare la cartuccia di reagente a temperatura ambiente per 45 min prima dell'uso.
  3. Diluire la libreria non diluita con acqua priva di nucleasi secondo la concentrazione di biblioteca calcolata nel passaggio 6.8 e rendere 20 pM librerie.
    1. Preparare una libreria in pool per il sequenziamento e archivio sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 25 µ l della biblioteca in pool con una pipetta µ l 100 sul fondo della provetta del campione. Utilizzare la libreria riunita all'interno di 48 h.
  4. Accendere e aprire il coperchio dello strumento automatizzato.
    1. Posizionare il chip di sequenziamento, adattatore chip, cartuccia di arricchimento, cartuccia con punta, piastra PCR, guarnizione del telaio PCR, tubo di recupero, cartuccia di soluzione e la cartuccia di reagente nella posizione appropriata dello strumento automatizzato.
    2. Toccare [Set up Run] e [passo passo] sullo schermo.
    3. Chiudere il coperchio e toccare [Start casella] sullo schermo.
    4. Dopo il ponte di scansione processo, toccare [Avanti] sullo schermo.
    5. Verifica il contenuto del display (tipo di kit, tipo di chip, chip piani di ID, ID campione,), impostare l'ora e toccare [OK] sullo schermo.
  5. Dopo aver terminato il caricamento di chip:
    1. Toccare [Avanti] sullo schermo e aprire il coperchio.
    2. Scaricate il chip di sequenziamento dall'alimentatore a chip con le mani guantate.
    3. Inserire il chip nel contenitore del chip, rap con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando la reazione di sequenziamento.
    4. Rimosso la cartuccia di arricchimento, piastra PCR, guarnizione del telaio PCR, tubo di recupero, cartuccia di soluzione e la cartuccia di reagente nella posizione appropriata dello strumento automatizzato con mano guantata.
    5. Trasferire una cartuccia vuota-suggerimento per la posizione della punta dei rifiuti dello strumento automatizzato con mano guantata.
    6. Toccare [Avanti] e chiudere il coperchio.
    7. Toccare [Start] e pulire lo strumento automatizzato di raggi ultravioletti per 4 min.
  6. Sciogliere una tavoletta di clorito di sodio in 1.000 mL di acqua ultrapura e filtro soluzione con un'unità di filtro del flusso filtro da 0,22 µm.
    1. Accendere lo strumento di sequenziamento.
    2. Toccare [Clean] e [Avanti] sullo schermo dello strumento sequenziamento.
    3. Pulire lo strumento di sequenziamento con 250 mL di soluzione di clorito di sodio sterilizzati con filtro e successivamente 250 mL di acqua ultrapura.
  7. Toccare [Initialize] e selezionare il kit di sequenziamento appropriato sullo schermo.
    1. Installare un mittente grigio nella posizione corretta con le mani guantate.
    2. Inizializzare lo strumento di sequenziamento con la soluzione di lavaggio (fornito nel kit), la soluzione di regolazione del pH (contenente 350 µ l di idrossido di sodio 100 mM) e la soluzione standard di pH (fornito nel kit).
  8. Aggiungere 20 µ l di dATP, dGTP, dCTP e dTTP nucleotidi (fornito nel kit) in provette da 50 mL (fornite nel kit) con una pipetta 100-µ l.
    1. Installare un mittente grigio nella posizione corretta con le mani guantate.
    2. Caricare il tubo da 50 mL e avvitare lo strumento di sequenziamento.
    3. Toccare [Avanti] sullo schermo per iniziare la fase di inizializzazione, che prende circa 25 min.
  9. Dopo aver completato la fase di inizializzazione:
    1. Toccare [Run] sullo schermo e selezionare lo strumento di preparazione di libreria appropriata.
    2. Eseguire la scansione del codice a barre bidimensionale del chip.
    3. Inserire il chip di sequenziamento nella posizione appropriata.
    4. Chiudere lo sportello di morsetto e strumento di chip.
    5. Toccare [controllo Chip], [successivo] e [OK] sullo schermo per avviare l'esecuzione di sequenziamento.
  10. Dopo la reazione di sequenziamento, trasferire i dati ed eseguire analisi dei dati della pipeline sul sequenziamento server13,17.

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Representative Results

La figura 1 Mostra l'intero processo, dalla preparazione campioni TIC per estrazione del DNA. In particolare, la procedura richiede solo due giorni per ottenere il DNA di genomic dai campioni di TIC. Abbiamo valutato tutti gli effetti di deposito del tumore prima dell'elaborazione di diapositiva. Abbiamo trovato che le cellule del tumore erano attaccate su lastra di vetro quando gli esemplari del tessuto sono stati toccati immediatamente il vetrino, e quando i tessuti sono stati tenuti in Salina inumidito garza sterile per il-per 1 h (Figura 2). Tuttavia, quando i tessuti sono stati mantenuti a temperatura ambiente, le cellule del tumore non sono stati ben attaccate alla diapositiva. Vetrini preparati potrebbero essere conservati a 4 ° C per tre mesi. Pertanto, è importante non lasciare gli esemplari ad asciugare.

Abbiamo esaminato l'utilità del nostro metodo e confrontarlo con esemplari acquisiti utilizzando FFPE. TIC e FFPE campioni sono stati preparati da 14 esemplari del tumore, e abbiamo confermato che la purezza e il contenuto del tumore potrebbero essere valutati agli esemplari di TIC. Dopo che abbiamo effettuato la macchiatura di Giemsa, il numero di cellule del tumore e la morfologia del tumore potrebbe essere valutato da microscopia. Così siamo stati in grado di valutare sistematicamente le cellule del tumore e successivamente eseguire un controllo di qualità del DNA.

La quantità del DNA e la qualità sono stati stimati da quantitativa real time PCR13,14,15. Abbiamo determinato la quantità di DNA assolute e il valore RQ, che è un indicatore del livello di degradazione del DNA genomico. I risultati hanno mostrato che una maggiore resa di DNA è stata realizzata usando i campioni TIC rispetto con i campioni FFPE (tabella 1). Inoltre, i valori RQ del DNA TIC erano significativamente più alto rispetto con quello del DNA FFPE (Figura 3, p = 2,3 x 10-8, test t di Student a due code). Abbiamo anche valutato i valori RQ del TIC e FFPE DNA estratto dai tipi differenti del tumore e trovato che il DNA di TIC era superiore in termini di qualità rispetto al DNA FFPE (Figura 3). Questi risultati hanno indicato che il DNA di TIC era meno frammentato rispetto il DNA FFPE.

Abbiamo quindi valutato se il DNA di TIC potrebbero essere utilizzato per analisi di sequenziamento di prossima generazione. FFPE e DNA di TIC sono stati preparati da cancro colorettale primario e metastatico del fegato ottenuto da un paziente (Figura 4A). L'amplificazione di PCR e preparazione di libreria sono stati condotti utilizzando il pannello di Hotspot di cancro e successivamente mirata sequenziamento è stato effettuato. Di conseguenza, APC Q1367 * è stato identificato in entrambi FFPE e TIC DNA estratto dal sito 1 (tabella 2). Inoltre, APC S1356 *, G12D KRAS e M237I di TP53 sono stati rilevati in entrambi FFPE e TIC DNA estratto dal sito 2, 3 e 4 (tabella 2). Questi risultati hanno indicato che le mutazioni somatiche identiche sono state identificate in campioni accoppiati di FFPE e TIC DNA preparati dal sito del tumore stesso (Figura 4B e tabella 2). In particolare, le stesse mutazioni somatiche sono state individuate fra cancro colorettale primario (sito 2, non il sito 1) e due campioni di cancro del fegato metastatico, suggerendo che i cloni del tumore dal sito 2 riprodurrsi per metastasi al fegato ( tabella 2eFigura 4B ). Insieme, questi risultati suggeriscono che il DNA di TIC è di alta qualità ed è adatto per una vasta gamma di test genetici tra cui sequenziamento di nuova generazione.

Figure 1
Nella figura 1. Schema per ottenere il DNA da una preparazione del campione TIC. Il tessuto del tumore è toccato sul vetro diapositiva per preparare il campione TIC. Dopo la valutazione della morfologia del tumore e dei contenuti sotto un microscopio, il DNA del tumore può essere estratto e utilizzato per i test genetici. Utilizzando le TIC, il tumore DNA può essere ottenuto da un campione clinico patologico entro due giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Preparazione dei campioni TIC. Resected esemplari del tumore sono stati immediatamente toccati su un vetrino normale (pannello sinistro), tenuto in Salina inumidito garza sterile per il-per 1 h (al centro) e conservati a temperatura ambiente per 1 h (a destra). Esempio #1 era carcinoma epatocellulare e campione #2 era il cancro al seno. Immagini al microscopio sono stati catturati utilizzando una fotocamera digitale montata ad un microscopio. Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Controllo di qualità di DNA stimato dall'analisi PCR quantitativa in tempo reale. TIC e FFPE DNA sono stati estratti da 14 tessuti del tumore del colon-retto (n = 8), stomaco (n = 4) e cancro del fegato metastatico (n = 2). Confronto tra i punteggi di quantificazione relativa tra campioni TIC-Giemsa e lui FFPE. I valori RQ di TIC DNA erano significativamente superiori a quella del DNA FFPE. Analisi statistica tra i due gruppi è stato effettuato e p-valori sono stati calcolati dalla prova di t dell'allievo non accoppiati a due code utilizzando Excel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Prossima generazione sequenziamento analisi dati utilizzando TIC e DNA FFPE. (A) macroscopica e microscopiche immagini. Immagini rappresentative di TIC-Giemsa e lui FFPE colorazione dal cancro colorettale (sito 1 e 2) e carcinoma del fegato metastatico campioni (sito 3 e 4). Barra della scala in immagini macroscopiche: 1 cm, barra della scala in immagini microscopiche: 100 µm. (B) calore mappa mostra la distribuzione delle mutazioni somatiche per ogni sito di tumore (n = 8). Mutazioni identiche sono state rilevate tra campioni appaiati di TIC e DNA FFPE. I valori delle frazioni alleliche sono indicati nella scala di colori di graduazione da 1% (rosa chiaro) al 100% (rosa). Grigie colonne ha mostrato alcuna mutazione identificata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-HE (n = 14)
DNA totale (ng) DNA totale (ng)
Campione Sito del tumore Breve Lungo RQ Breve Lungo RQ
Sito1 Colon 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Sito2 Colon 991 1057 1.07 556 204 0,37
Site3 Fegato 467 511 1.09 130 39 0.3
Sito Microsoft4 Fegato 2172 2115 0,97 488 127 0,26
Site5 Colon 749 598 0,8 529 205 0.39
Site6 Stomaco 330 286 0.86 01s 98 0.46
Site7 Stomaco 636 499 0.78 154 84 0.55
Site8 Stomaco 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 Colon 1986 1611 0.81 476 163 0,34
Sito10 Colon 280 218 0.78 209 83 0.39
Sito Microsoft11 Colon 1546 575 0,37 366 159 0.43
Site12 Stomaco 1501 1200 0,8 274 132 0,48
Microsoft13 Colon 1556 1404 0.9 326 179 0.55
Site14 Colon 1565 1210 0,77 680 09W 0.43
Media ± DS 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tabella 1. Dati sulla qualità del DNA. TIC accoppiato (n = 14) e i campioni FFPE (n = 14) sono stati preparati da colon, fegato e tumori dello stomaco. Esempi di TIC sono stati macchiati con Giemsa e campioni FFPE erano colorati con ematossilina eosina (lui). Campioni di DNA sono stati estratti e quantificati mediante PCR quantitativa in tempo reale con due coppie di primer amplificando RNaseP locus (amplicone lungo (268 bp) e breve amplicone (87 bp)). Valori RQ sono stati calcolati come segue: il valore medio degli ampliconi lungo diviso il valore medio bythe degli ampliconi brevi. DS, deviazione standard; RQ, quantificazione relativa

Nome del campione Posizione Preparazione Sigla del gene Mutazione Posizione Riferimento Variante Codifica Copertura Frazione allelica
Cancro colorettale primario Sito 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
Cancro colorettale primario Sito 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
Cancro colorettale primario Sito 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
Cancro colorettale primario Sito 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1993 52%
Cancro colorettale primario Sito 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
Cancro colorettale primario Sito 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
Cancro colorettale primario Sito 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1994 56%
Cancro colorettale primario Sito 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
Cancro del fegato metastatico Sito 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
Cancro del fegato metastatico Sito 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1995 62%
Cancro del fegato metastatico Sito 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
Cancro del fegato metastatico Sito 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
Cancro del fegato metastatico Sito 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1993 64%
Cancro del fegato metastatico Sito 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
Cancro del fegato metastatico Sito 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
Cancro del fegato metastatico Sito 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1992 60%
Cancro del fegato metastatico Sito 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
Cancro del fegato metastatico Sito 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
Cancro del fegato metastatico Sito 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1992 62%
Cancro del fegato metastatico Sito 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

Tabella 2. Confronto delle mutazioni in accoppiato FFPE e TIC DNA rilevato dall'analisi di sequenziamento mirato. TIC accoppiato e FFPE campioni sono stati preparati da 2 cancri colorettali primari (sito 1 e 2) e 2 cancri metastatici del fegato (sito 3 e 4). Sequenziamento mirato è stato effettuato con questi campioni di DNA e mutazioni somatiche sono state identificate. Profili di mutazione erano identici tra campioni appaiati di TIC e DNA FFPE.

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Discussion

In questo studio, abbiamo presentato un metodo alternativo per l'ottenimento del tumore del DNA da campioni patologici clinici utilizzando le TIC. Preparazione di TIC è molto semplice e richiede meno tempo rispetto ai metodi FFPE, senza la necessità di strumenti speciali10. Tutte le procedure dalla preparazione TIC per estrazione del DNA possono essere completate entro due giorni (Figura 1). Questo metodo riduce così il tempo di turnaround per test genetici. In particolare, questo fornisce un vantaggio significativo nella riduzione del numero di giorni necessari per l'analisi molecolare. Questo poco tempo ci permette di offrire immediatamente una terapia adatta per i pazienti di cancro progressivo che richiedono farmaci a bersaglio molecolare. Questo metodo fornisce pertanto benefici per analisi delle alterazioni genetiche nei tumori e la somministrazione di farmaci a bersaglio molecolare per la terapia del cancro.

Ci sono alcuni punti chiave per il successo dell'utilizzo di TIC del DNA per l'analisi genetica. Tessuti del tumore possono essere necrotici a causa di trattamenti come la chemioterapia o altri trattamenti. Così, è necessaria cautela nella preparazione di campioni TIC di campionamento da sezioni necrotiche nel tumore per quanto possibile di evitare. Inoltre, la valutazione microscopica iniziale è molto importante per le procedure successive. Inoltre, prevenire l'essiccazione dei tessuti del tumore è necessaria per la preparazione del campione di successo TIC. Se i tessuti del tumore sono secchi, con conseguente meno cellule allegate su vetrino. Sarà anche difficile da osservare la cellularità del tumore e la morfologia perché conduce alla degenerazione dei tessuti del tumore di essiccazione.

Ci sono alcuni benefici potenziali di usando il DNA di TIC. In primo luogo, possiamo controllare la cellularità del tumore durante la prima valutazione con microscopia. Se le cellule normali, quali linfociti e cellule stromali, erano abbondanti in campioni di tessuto, la contaminazione di queste cellule normali impedirebbe la capacità di rilevare mutazioni somatiche nelle cellule del tumore. Rapida valutazione al microscopio dei campioni può aiutare la valutazione della cellularità del tumore e stima di se i campioni di DNA sufficiente del tumore sono stati ottenuti da campioni di TIC prima dell'estrazione del DNA. In secondo luogo, i nostri risultati hanno mostrato che il DNA di TIC è sia di alta qualità e quantità. FFPE DNA è stato utilizzato per analisi di sequenziamento di prossima generazione tra cui sequenziamento mirato, il sequenziamento dell'esoma e intero genoma sequencing16,17,18,19,20. Archival FFPE DNA viene utilizzata per l'analisi genetica21,22, anche regolarmente tuttavia FFPE DNA può essere frammentato durante la fissazione in formalina. Questo può provocare problemi di amplificazione di PCR o estrazione del DNA, causando una mancanza di copertura di sequenza, uniformità alle regioni dell'obiettivo e aumentare il rischio di sequenza errore23,24. Al contrario, DNA di TIC non è frammentato, che può essere dovuto la fissazione di alcool che ha meno di un'influenza sull'acido nucleico. Come DNA di TIC non è frammentato come il DNA di FFPE, questi campioni sarà più adatti per analisi di sequenziamento di prossima generazione, Real Time PCR e PCR digitale. Infatti, precedentemente abbiamo indicato che TIC DNA da un esemplare del tumore può essere usato nell'analisi di sequenziamento di nuova generazione, un metodo chiamato "TIC-seq", e i risultati potrebbero catturare precisamente il tumore mutazioni somatiche13. In terzo luogo, questa tecnica è applicabile per una vasta gamma di materiali. Nel rapporto corrente, abbiamo usato gli esemplari chirurgici. Oltre a tessuti chirurgici, linfonodo metastatico, biopsia bronchiale o endoscopica può essere utilizzata per la preparazione di DNA di TIC.

In conclusione, vi presentiamo un metodo semplice e veloce per la preparazione del DNA del tumore di alta qualità utilizzando campioni di TIC. Questo metodo verrà espandere nuove possibilità nel campo dell'analisi genetica e contribuire a promuovere la medicina precisione nella regolazione clinica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Ringraziamo tutto il personale medico ed accessorio dell'ospedale e i pazienti per acconsentire a partecipare. Si ringrazia Gabrielle White Wolf, PhD, dal gruppo di Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questa relazione. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione per il progetto di ricerca del genoma della Prefettura di Yamanashi (Y.H. e modus operandi) e una sovvenzione da The YASUDA Medical Foundation (YH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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