visualizing ल्युकोसैट रोलिंग और एन्जियोटेन्सिन द्वितीय में आसंजन-चूहों को भ्रमित: तकनीक और नुकसान

Immunology and Infection
 

Summary

इस पांडुलिपि ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों और एन्जियोटेन्सिन द्वितीय में फ्लोरोसेंट रंजक के विभिंन प्रशासन मार्गों के उपयोग का वर्णन-रक्त वाहिकाओं के intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण और उनके मूल्यांकन के लिए उच्च रक्तचाप प्रेरित रोल करने के लिए और endothelium का पालन करने की क्षमता ।

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Lagrange, J., Kossmann, S., Kiouptsi, K., Wenzel, P. Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls. J. Vis. Exp. (131), e56948, doi:10.3791/56948 (2018).

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Abstract

Epifluorescence intravital वीडियो माइक्रोस्कोपी (IVM) रक्त वाहिकाओं की प्रतिरक्षा कोशिकाओं और भूमिका करने के लिए उनकी क्षमता और endothelial परत का पालन करने के लिए सक्रियण का मूल्यांकन करने के लिए एक स्थापित विधि है । फ्लोरोसेंट रंजक या fluorophore-युग्मित एंटीबॉडी के इंजेक्शन द्वारा परिचालित कोशिकाओं के दृश्य सामांयतः प्रयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों इस्तेमाल किया जा सकता है । ल्यूकोसाइट्स की बातचीत, विशेष रूप से lysozyme M+ (LysM+) monocytes में, पोत दीवार के साथ संवहनी रोग और धमनी का उच्च रक्तचाप को बढ़ावा देने में निर्णायक भूमिका निभाते हैं । हम यहाँ एन्जियोटेन्सिन द्वितीय (AngII) में मन्या धमनियों में ल्युकोसैट रोलिंग और आसंजन कल्पना और यों तो तकनीक उपस्थित IVM द्वारा चूहों में उच्च रक्तचाप प्रेरित.

एक कैथेटर नुकसान संवहनी दीवार के आरोपण और बदल रक्त कोशिका प्रतिक्रियाओं की ओर जाता है । हम अलग इंजेक्शन तकनीक और प्रशासन मार्गों की तुलना में एक LysMCre+IRG+ माउस में ल्यूकोसाइट्स कल्पना लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन की व्यापक अभिव्यक्ति के साथ और LysM में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सशर्त अभिव्यक्ति + कक्ष । LysM+ सेल सक्रियण का अध्ययन करने के लिए, हम चूहों जिसमें रोलिंग और endothelium के लिए ल्यूकोसाइट्स के आसंजन बढ़ जाता है AngII संचार का इस्तेमाल किया । हम या तो इंजेक्शन acridine नारंगी एक jugular कैथेटर का उपयोग या सीधे हालांकि पूंछ नस और रोलिंग और कोशिकाओं का पालन की राशि की तुलना में । हमने पाया है कि jugular कैथेटर प्रत्यारोपण प्रति se रोलिंग और पालन की संख्या में वृद्धि हुई LysM+ कोशिकाओं में शम-संचार LysMCre+IRG+ चूहों नियंत्रण की तुलना में. इस सक्रियण AngII-संचार चूहों में संवर्धित किया गया था । दिलचस्प है, पूंछ नस के माध्यम से सीधे इंजेक्शन acridine नारंगी LysM+ सेल आसंजन या शम-संचार चूहों में रोलिंग नहीं बढ़ा था । हम इस तरह ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों के महत्व का प्रदर्शन के साथ प्रयोग करने के दौरान vivo प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप नहीं करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट खोजकर्ताओं की पूंछ नस इंजेक्शन jugular कैथेटर इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प हो सकता है ।

Introduction

धमनी का उच्च रक्तचाप हृदय रोग और मृत्यु का खतरा बढ़ जाता है और atherosclerosis, कोरोनरी हृदय रोग, और धमनी या शिरापरक thromboembolisms1के विकास को बढ़ावा देता है । उच्च रक्तचाप के विकास पर्यावरण, आनुवंशिक, अंत-स्रावी, और hemodynamic कारकों की बातचीत पर निर्भर करता है । वर्तमान में, प्रतिरक्षा और संबंधित सूजन उच्च रक्तचाप के एटियलजि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सराहना कर रहे हैं2.

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा, टी लिम्फोसाइटों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से monocytes और मैक्रोफेज के लिए कारण AngII-प्रेरित संवहनी सूजन और उच्च रक्तचाप में शामिल होने के लिए, अपने को प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को ट्रिगर करने की क्षमता से संबंधित भाग में पाया गया3। Macrophage कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर की कमी चूहों रक्तचाप वृद्धि और संवहनी सूजन के बारे में AngII के लिए कम प्रतिक्रिया दिखाई4. पिछले एक काम में, हम दिखा सकता है कि LysM + monocytes ड्राइव नाड़ी रोग और AngII-प्रेरित उच्च रक्तचाप में सूजन5. हाल ही में, हम एक उपंयास मार्ग जिसमें जमावट कारक ग्यारहवीं प्लेटलेट्स के साथ सहयोग और पोत दीवार thrombin-निर्भर संवहनी सूजन6प्रेरित बताया । उच्च रक्तचाप में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका के बारे में वर्तमान ज्ञान Rodriguez-Iturbe एट अलद्वारा हाल ही में संक्षेप और समीक्षा की गई थी । 7

उच्च रक्तचाप के विकास में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भागीदारी के बाद से स्पष्ट हो गया, मॉडल और तकनीक पोत और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हो गया । रक्त वाहिकाओं के Epifluorescence IVM संचार रक्त कोशिकाओं और endothelium8,9,10के बीच vivo बातचीत में निरीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । इस तकनीक के साथ, (जैसे acridine नारंगी) डीएनए के साथ intercalating रंगों के इंजेक्शन nucleated कोशिकाओं कल्पना कर सकते हैं (परिसंचारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से endothelium से). rhodamin-6G या dichlorofluorescein (डीसीएफ) के साथ पृथक प्लेटलेट्स दाग पूर्व vivo धमनी या शिरापरक चोट मॉडल में प्लेटलेट युक्त थक्का कल्पना करने के लिए इंजेक्शन किया जा सकता है ।

आमतौर पर, एक jugular नस कैथेटर tracers या चिह्नित प्लेटलेट्स इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । endothelium और जमावट झरना के बाद सक्रियण के परिवर्तन दोनों monocyte सक्रियण पर प्रभाव है करने के लिए जाना जाता है । Endothelial चोट तुरंत subendothelial मैट्रिक्स अणुओं के माध्यम से प्लेटलेट सक्रियण की ओर जाता है ऊतक सील, आगामी monocyte आकर्षण और सक्रियकरण के साथ11। इसके विपरीत, एक बरकरार endothelium के लिए थक्कारोधी गुण (जैसे, ऊतक कारक मार्ग अवरोध करनेवाला या thrombomodulin के माध्यम से जाना जाता है)12 और monocyte पर प्रत्यक्ष निरोधात्मक प्रभाव, जैसे, के स्राव के माध्यम से extracellular बुलबुले युक्त microRNAs13. Monocytes एक ऊतक कारक का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है, जमावट झरना और व्यक्त की बाह्य उत्प्रेरक-सक्रिय रिसेप्टर्स (पार्स) कि thrombin द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और monocyte सक्रियण में भाग लेने14,15 . इसलिए, प्लेटलेट्स या जमावट झरना के किसी भी सक्रियण संवहनी चोट के कारण monocyte सक्रियण पर अप्रत्याशित प्रभाव पड़ सकता है और मनाया घटना के साथ हस्तक्षेप. IRG ट्रांसजेनिक LysM Cre ट्रांसजेनिक चूहों की मदद के साथ, एक डबल फ्लोरोसेंट Cre रिपोर्टर माउस (LysMCre+IRG+), हम विस्तार से एक कैथेटर और LysM पर वैकल्पिक तरीकों के साथ इंजेक्शन के प्रभाव का अध्ययन करने का प्रस्ताव+ धमनी हाइपरटेंशन के एक माउस मॉडल में myelomonocytic कोशिकाओं को16.

Protocol

Rhineland-Palatinate (प्राधिकरण संख्या 23 177-07/G12-1-002 और 23 177-07/नैम-1-051) से पशु प्रयोग पर आचार समिति के अनुमोदन के तहत पुरुष चूहों उंर 8 से 12 सप्ताह पुरानी पर आयोजित किए गए प्रयोगों ।

1. माउस संज्ञाहरण और सर्जरी की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले, अच्छे स्वास्थ्य और जानवरों की हालत की पुष्टि करें । सर्जरी से पहले, अपने सामान्य स्थिति (उपस्थिति, आसन, सहज व्यवहार) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शरीर के वजन, भोजन, और पानी की खपत के लिए 2-3 दिनों के लिए प्रति दिन एक बार जानवरों की निगरानी ।
  2. मिडियाजोलम के साथ संज्ञाहरण के लिए मास्टर मिश्रण तैयार (5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन), medetomidine (०.५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन), और fentanyl (०.०५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) को intraperitoneally (आईएफसआई) एक 26 ग्राम सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज में २०० µ एल/30 जी माउस इंजेक्षन ।
  3. परासरणी पंप आरोपण और IVM प्रयोगों के लिए पशु तैयारी एक ३९ डिग्री सेल्सियस वार्मिंग मंच के साथ एक ऑपरेशन के मैदान पर प्रदर्शन कर रहे हैं । एक संक्रमण स्नान में सभी उपकरण निष्फल और वार्मिंग मंच को संक्रमित ।
  4. प्रक्रियाओं के दौरान, आंख मरहम के साथ पशु आंखों की रक्षा । परासरणी पंप आरोपण से पहले छुरा के साथ फर निकालें । IVM प्रयोगों में मन्या और jugular कैथेटर आरोपण के अलगाव के लिए एक बाल हटाने क्रीम और कपास झाड़ू का प्रयोग करें । दो त्वचा कीटाणुनाशक का उपयोग कर पशु त्वचा को संक्रमित: एक एंटीसेप्टिक और povidone आयोडीन युक्त एक त्वचा एंटीसेप्टिक और अल्कोहल आधारित समाधान में octenidine युक्त संक्रामक ।
  5. antagonize संज्ञाहरण के लिए मास्टर मिश्रण तैयार ("antisedan मिश्रण") atipamezol के साथ (०.०५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और flumazenil (०.०१ मिलीग्राम/kgbody वजन), और 1 एमएल सिरिंज में २०० µ एल माउस तैयार (एस॰सी॰) इंजेक्शन के लिए एक 26 ग्राम सुई के साथ.

2. परासरणी पंप तैयारी और आरोपण

नोट: चमड़े के नीचे AngII अर्क परासरणी पंपों का उपयोग लू एट अल द्वारा विस्तार से वर्णित किया गया था । 17

  1. बाँझ खारा के साथ lyophilized पाउडर का पुनर्गठन और पशु वजन और पंप की डिलीवरी दर के साथ एकाग्रता को समायोजित द्वारा AngII तैयार करें । प्लास्टिक ट्यूबों में गठित AngII रखें (ग्लास ट्यूबों का उपयोग न करें) ।
  2. 7 दिनों के लिए 1 मिलीग्राम/(kg · d) वितरित करने के लिए AngII समाधान के साथ पंपों को भरें । तैयारी के बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-6 एच न्यूनतम के लिए बाँझ खारा में पंपों रखें.
  3. रियर पैर सजगता के साथ संज्ञाहरण मिश्रण के इंजेक्शन के बाद माउस की पूरी संज्ञाहरण का परीक्षण करें और यह गर्म आपरेशन क्षेत्र पर जगह है । संज्ञाहरण प्रेरण लेता है 10-15 मिनट और बेहतर काम करता है अगर जानवरों एक अंधेरे वातावरण में रखा जाता है ।
  4. माउस के निचले हिस्से दाढ़ी और यह एक शराबी त्वचा एंटीसेप्टिक के साथ संक्रमित ।
  5. एक 1 सेमी कैंची का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी को सीधा चीरा बनाओ । एक स्ट्रेट hemostat का उपयोग कर पंप के लिए एक जेब बनाने के लिए और पंप (प्रवाह मॉडरेटर पहले) डालें । जेब घाव पर कोई दबाव के साथ पंप के मुक्त आंदोलन की अनुमति चाहिए ।
  6. सूजन को सीमित करने के क्रम में टांके, और नहीं क्लिप के साथ घाव बंद; फिर त्वचा एंटीसेप्टिक से संक्रमित ।
  7. antisedan मिश्रण के २०० µ एल के एस॰सी॰ इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण Antagonize और अपने पिंजरे में माउस वापस ।
  8. सर्जरी के बाद एक बार और पशु व्यवहार के आधार पर मांग पर buprenorphine (०.०७५ मिलीग्राम/kg एस॰सी॰) के साथ बाहर ले analgesia ।

3. Jugular कैथेटर आरोपण और मन्या तैयारी

  1. रियर खाद्य सजगता के साथ संज्ञाहरण मिश्रण के इंजेक्शन के बाद माउस की पूरी संज्ञाहरण परीक्षण और एक गुदा जांच के साथ ३९ ° c सर्जिकल प्लेट पर पृष्ठीय recumbence में anesthetized जानवर जगह के लिए तापमान बनाए रखने और मरहम लगाने पर आंखों उंहें प्रक्रिया के दौरान की रक्षा के लिए ।
  2. बालों को हटाने क्रीम का उपयोग गर्दन बाल निकालें । एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें प्रसार और 2 मिनट के लिए क्रीम रगड़ जब तक बाल बाहर गिर शुरू करते हैं । एक अतिरिक्त 2 मिनट के बाद, एक रंग के साथ क्रीम और बाल निकालें और एक शराबी त्वचा एंटीसेप्टिक के साथ त्वचा को संक्रमित ।
  3. एक stereomicroscope के तहत सर्जरी करते हैं । गर्दन, श्वासनली के बगल में 1 सेमी में त्वचा longitudinally में एक 1-1.5 सेमी लंबा चीरा बनाओ । फिर दो अन्य चीरा पहले चीरा के दोनों अंगों को सीधा कर.
  4. ध्यान से त्वचा के बगल में ऊतकों को हटा दें और बाईं jugular नस और श्वासनली को कवर त्वचा के टुकड़े को हटा दें ।
  5. ध्यान से कर्णमूल ग्रंथि को अलग; 2 घुमावदार संदंश के साथ ब्याज के क्षेत्र से मांसल और submaxillary ग्रंथियों । कटौती या ग्रंथियों को नुकसान नहीं है, उन्हें jugular नस और मन्याs के लिए सबसे अच्छा पहुँच की अनुमति देने के लिए जगह है ।
  6. jugular नस को अलग करने के लिए, पतली संदंश का उपयोग करें और धीरे से खुला और बंद करने के लिए धीरे आसपास के ऊतकों से पोत मुक्त. एक बार नस पूरी तरह से साफ है, पोत के तहत संदंश की स्थिति और 10 सेमी प्रत्येक इसके तहत दो 7-0 टांके जगह है ।
  7. दो समुद्री मील के साथ सिर करने के लिए सीवन समीपस्थ बंद करें । दूसरी सीवन पर, एक गाँठ तैयार है, लेकिन यह बंद नहीं है ।
  8. कैथेटर (०.२८ mm व्यास के अंदर, ०.६१ mm बाहरी व्यास) पकड़ो ३७ ° c बाँझ खारा साथ संदंश के साथ एक हाथ से भरा; जबकि दूसरे हाथ से, एक पतली कैंची या एक घुमावदार 26 जी सुई के साथ पोत में एक छोटा सा चीरा बनाओ । फिर jugular नस में कैथेटर डालें और दो बार गांठ बंद करें । पूरी तरह से स्थिरीकरण सुनिश्चित करने के क्रम में कैथेटर पर सिर करने के लिए सीवन समीपस्थ बंद करें ।
  9. मन्या धमनियों को अलग करने और तैयार करने के लिए, पतली घुमावदार संदंश का उपयोग करके श्वासनली को कवर करने वाले क्षेत्र को टुकड़े.
  10. एक बार मन्या आसपास के ऊतकों से मुक्त कर रहे हैं, वेगस तंत्रिका को हटाने (यह एक सफेद लाइन मन्या के निकट की तरह लग रहा है) पोत से (लेकिन यह कटौती नहीं है). पतली संदंश बंद किया जा सकता है और धीरे तंत्रिका जुटाने के लिए धीमी गति से खोला ।
  11. एक बार दोनों धमनियों पूरी तरह से साफ कर रहे हैं, पहले मन्या धमनी के नीचे जगह संदंश और पोत के तहत एक छोटे से काले 3 मिमी चौड़ा x २.५ सेमी लंबाई प्लास्टिक टुकड़ा जगह है । यह बहुत महत्वपूर्ण है पोत पर खिंचाव नहीं है और जांच करने के लिए कि रक्त का प्रवाह मौजूद है एक बार पोत धारक रखा गया है । दूसरी धमनी को पोत धारक के ऊपर रखें । यदि माउस सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे रखा नहीं है, श्वासनली पर ग्रंथियों वापस डाल दिया और क्षेत्र के सूखने से बचने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस बाँझ खारा लागू होते हैं ।

4. IVM के साथ रोलिंग और पालन ल्यूकोसाइट्स/LysM + कोशिकाओं का मूल्यांकन

  1. एक 2 मिलीग्राम/एमएल से acridine ऑरेंज तैयार स्टॉक समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और यह बाँझ खारा में 1:4 पतला (०.५ मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता) एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में ।
प्रकाश से सिरिंज की रक्षा और एक माउस के अनुसार २०० µ एल का उपयोग करें.
  1. विभिन्न स्थितियों का परीक्षण: (1) jugular कैथेटर के साथ acridine ऑरेंज के इंजेक्शन; (2) पूंछ पार्श्व नस में सीधे acridine ऑरेंज के इंजेक्शन (इस शर्त के साथ कोई jugular कैथेटर प्रत्यारोपित किया गया था); (3) acridine ऑरेंज के बिना माप प्रतिदीप्ति LysMCre+IRG+ चूहों का उपयोग (यहाँ फिर कोई jugular कैथेटर प्रत्यारोपित किया गया था).
  • एक बार कैथेटर जगह में है और दो मन्या अलग कर रहे हैं, माइक्रोस्कोप के तहत माउस की स्थिति. एक monochromator, एक बीम अलगानेवाला, और एक आरोप-युग्मित डिवाइस कैमरा के साथ एक लंबी दूरी संघनित्र और एक 10x (NA ०.३) पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर एक उच्च गति व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ माप प्रदर्शन. वास्तविक समय इमेजिंग प्रणाली के साथ छवि अधिग्रहण और विश्लेषण करते हैं ।
  • endothelium सतह पर मन्या धमनी के बीच में माइक्रोस्कोप उद्देश्य ध्यान केंद्रित. धीरे acridine नारंगी (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के ५० µ एल इंजेक्षन (खाते में पहले इंजेक्शन के लिए कैथेटर के मृत मात्रा ले) । सॉफ्टवेयर सेट छवि प्रति १२० मिलीसेकंड के एक जोखिम समय के साथ १०० छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए ।
  • मन्या धमनी के प्रति चार वीडियो बनाने (बाएँ और दाएँ) प्रत्येक वीडियो के लिए धमनी पर विभिन्न स्थानों पर. यदि प्रतिदीप्ति संकेत कम हो जाती है, acridine ऑरेंज के एक और ५० µ एल इंजेक्षन ।
  • सभी वीडियो रिकॉर्ड करने के बाद ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पशु euthanize ।
  • प्रति सेकंड 10 छवियों पर वीडियो गति सेट और एक २०० µm x २५० µm आयत दृश्य में रोलिंग और अनुयाई कोशिकाओं को यों तो प्रत्येक वीडियो के लिए पोत के बीच में रखा । रोलिंग और अनुयाई कोशिकाओं गिनती; अनुयाई कक्षों को उन कक्षों के रूप में परिभाषित किया जाता है जो 10 s वीडियो के भीतर endothelium से नहीं चलते या अलग होते हैं । ठहराव को सरल बनाने के लिए, लाल प्रतिदीप्ति के साथ चैनल को निकालें और रोलिंग और पालन कक्ष की गणना करने के लिए केवल हरी प्रतिदीप्ति का उपयोग करें ।
  • acridine ऑरेंज का उपयोग कर प्रयोगों के लिए, endothelial कोशिकाओं द्वारा बनाई गई पृष्ठभूमि को हटाने के क्रम में प्रतिदीप्ति की एक मैनुअल दहलीज बनाओ.
  • Representative Results

    LysMCre के मन्या+IRG+ चूहों AngII के साथ संचार IVM का उपयोग कर मनाया गया. Acridine ऑरेंज एक jugular कैथेटर का उपयोग कर इंजेक्शन था । हम सभी nucleated परिसंचारी कोशिकाओं की तुलना में संवहनी दीवार के साथ संपर्क में LysM+ कोशिकाओं के अनुपात को देखने के उद्देश्य से) (जो भी पोत के साथ बातचीत सेल प्रकार के भेदभाव के बाद से पोत के साथ बातचीत कर सकता है एक खुला हमारे पिछले काम से प्रश्न) । आधार रेखा से कम, एक jugular कैथेटर की उपस्थिति LysM+ कोशिकाओं (चित्रा 2a, डी) के आसंजन का कारण बनता है । acridine ऑरेंज इंजेक्शन के बाद, एक ही कोशिकाओं फ्लोरोसेंट थे, लेकिन यह भी endothelial कोशिकाओं फ्लोरोसेंट थे (चित्रा बी, ई). endothelial संबंधित प्रतिदीप्ति को सीमित करने के लिए पृष् ठभूमि की कमी के बाद, डेटा संकेत करता है कि सभी nucleated पालन कक्ष LysM+ (आकृति 2c, F) हैं; इन परिणामों AngII अर्क के बाद सच पकड़ हमारे पिछले परिणामों की पुष्टि और प्रदर्शन है कि LysMCre+IRG+ एक अच्छा मॉडल को LysM+ सेल सक्रियण पर AngII के प्रभाव का पालन है ।

    हम LysMCre में AngII अर्क के बाद LysM+ सेल सक्रियकरण पर acridine ऑरेंज के प्रशासन मार्गों की भूमिका का मूल्यांकन+IRG+। AngII अर्क के एक सप्ताह के बाद, LysMCre+IRG की मन्या धमनियों में ल्युकोसैट endothelium बातचीत+ चूहों छवि और IVM के साथ या एक acridine कैथेटर के माध्यम से या पूंछ नस के माध्यम से jugular ऑरेंज इंजेक्शन के बिना visualized थे । किसी भी कैथेटर या इंजेक्शन के बिना, LysM+ कोशिकाओं के रोलिंग काफी अनुपचारित चूहों की तुलना में AngII अर्क के बाद बढ़ गया था, और आसंजन एक वृद्धि (चित्रा 3) दिखाया. एक jugular कैथेटर के साथ acridine ऑरेंज के इंजेक्शन आसंजन बढ़ जाती है और AngII में एक अधिक से अधिक हद तक चूहों का इलाज एक कैथेटर (चित्रा 3) के बिना चूहों के साथ तुलना में रोलिंग. पूंछ नस में acridine ऑरेंज के इंजेक्शन समान आसंजन की ओर जाता है और चूहों कि acridine ऑरेंज (चित्रा 3) के इंजेक्शन प्राप्त नहीं किया की तुलना में रोलिंग ।

    Figure 1
    चित्र 1. एन्जियोटेन्सिन द्वितीय अर्क और चूहों में LysM+ कोशिकाओं रोलिंग और आसंजन के आकलन के लिए योजना । LysMCre+IRG+ चूहों AngII के साथ 7 दिनों से संचार कर रहे थे और पालन के साथ-साथ LysM+ कोशिकाओं के साथ-साथ या मात्रा एक acridine कैथेटर के माध्यम से या पूंछ नस के माध्यम से jugular ऑरेंज के इंजेक्शन के बिना या के साथ थे रोलिंग इंजेक्शन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2. LysM+ सेल आसंजन का आकलन और LysMCre+IRG+ चूहों की मन्या धमनियों में रोलिंग. LysMCre+IRG+ चूहों में LysM+ कोशिकाओं के आसंजन से पहले (ए, डी) और बाद (बी, ई) एक jugular कैथेटर के माध्यम से acridine इंजेक्शन. लाल और हरे प्रतिदीप्ति दर्ज किए गए, LysM+ कोशिकाओं (हरे रंग में) और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (लाल रंग में) दिखाई दे रहे थे । acridine ऑरेंज के इंजेक्शन के बाद, endothelial कोशिकाओं को भी हरे रंग में दिखाई दे रहे हैं, लेकिन हटाने पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति केवल परिसंचारी nucleated सेल दृश्य (C, F) की अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3. एन्जियोटेन्सिन द्वितीय में फ्लोरोसेंट रंगों के प्रशासन मार्गों का मूल्यांकन LysMCre+IRG+ चूहों संचार । रोलिंग () के ठहराव और पालन () LysM+ अन्तर्वासना में कोशिकाओं संचालित या AngII-संचारित पशुओं और के साथ या एक jugular कैथेटर या पूंछ नस इंजेक्शन का उपयोग कर acridine ऑरेंज के इंजेक्शन के बिना । विभिंन स्थितियों के प्रतिनिधि चित्र () । परिणाम अर्थ के ± मानक त्रुटि मतलब कर रहे हैं । 2-way ANOVA का प्रदर्शन किया गया और Bonferroni का पोस्ट हॉक परीक्षण, n = 3-12/ * & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Discussion

    LysM+ monocytes को पहले हाइपरटेंशन5के विकास में फंसाने के लिए दिखाया गया । यहां हम बताते है कि LysM+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं रोल और AngII अर्क के जवाब में endothelial परत का पालन करें । इस खोज का उपयोग कर प्राप्त किया गया था LysMCre+IRG+ चूहों हमारे पिछले अध्ययन से vivo में उच्च रक्तचाप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका खोज acridine ऑरेंज6के इंजेक्शन के साथ ल्यूकोसाइट्स visualizing द्वारा,10. इस प्रकार, endothelium का पालन करने वाले कोशिका प्रकारों का भेदभाव संभव नहीं था ।

    IVM संवहनी अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है और vasculature में सीधे कोशिकाओं की vivo टिप्पणियों में , लेकिन उच्च रक्तचाप के भड़काऊ संदर्भ में एक शल्य चिकित्सा डाला कैथेटर की मदद से रंजक इंजेक्शन के प्रभाव अज्ञात रहता है. कैथेटर और acridine ऑरेंज इंजेक्शन के संभावित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए हम LysMCre+IRG+ चूहों का लाभ लिया. AngII इन्फ्यूश़न रोलिंग LysM+ कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई endothelium । jugular नस में एक कैथेटर की प्रविष्टि प्रभाव और अधिक रोलिंग और पालन प्रवर्धित ल्यूकोसाइट्स AngII-भ्रमित चूहों कैथेटर प्रत्यारोपण के बिना चूहों की तुलना में एक कैथेटर के साथ साधन में पता लगाया गया । यह इंगित करता है कि एक मन्या कैथेटर के आरोपण का कारण बनता है कि उच्च रक्तचाप में देखा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ ओवरले कि घाव भरने के संदर्भ में एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया होती है18. इसके अलावा, मन्या धमनी के लिए jugular नस की निकटता के कारण एक अतिरिक्त प्रतिरक्षा सक्रियण jugular नस को प्रभावित करने से उत्पन्न हुई हो सकता है । इस प्रभाव के बाद से मौजूद नहीं था जब इंजेक्शन सीधे पूंछ नस में किए गए थे, हम मान सकते हैं कि प्रभाव डाई करने के लिए नहीं बल्कि कैथेटर डालने की प्रक्रिया के कारण किया गया था । हम यहां ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों के महत्व के प्रयोग के दौरान vivo प्रक्रियाओं में के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट खोजकर्ताओं की पूंछ नस इंजेक्शन jugular कैथेटर इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प हो सकता है ।

    प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम AngII अर्क है । पूंछ कफ रक्तचाप के आकलन के लिए पंप द्वारा AngII वितरण की प्रभावशीलता को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है । अर्क के 2 − 3 दिनों के बाद रक्तचाप में वृद्धि होनी चाहिए । सूजन है कि LysM+ कोशिकाओं सक्रियण, चीरा जहां पंप प्रत्यारोपित है के बजाय क्लिप के टांके के साथ किया जाना चाहिए बंद करने को प्रभावित कर सकता है सीमित करने के लिए । एक सीमा पूंछ नस इंजेक्शन के बारे में उल्लेख किया जाना चाहिए: सबसे अच्छा संभव डेटा अधिग्रहण करने के लिए, 4 वीडियो आमतौर पर प्रत्येक मन्या के लिए लिया जाता है. फ्लोरोसेंट संकेत कम हो जाती है, तो acridine ऑरेंज के ५० µ एल इंजेक्शन हैं, लेकिन पूंछ इंजेक्शन के साथ यह कई इंजेक्शन बनाने के लिए और खुर्दबीन उद्देश्य के तहत स्थिर मन्या रखने के लिए और अधिक मुश्किल है. jugular नस में एक कैथेटर की उपस्थिति की अवधि के बाद से यह प्लेटलेट में जमावट सक्रियण को प्रभावित कर रहा है प्रतिरक्षा कोशिकाओं सक्रियण मिलाना-अमीर प्लाज्मा तैयार 4 h कैथेटर आरोपण19के बाद । कैथेटर प्रत्यारोपण के इस पहलू आगे की जांच की जरूरत है ।

    अंत में, यहां तक कि अगर हम AngII अर्क के बाद LysM+ सेल सक्रियकरण पर jugular कैथेटर आरोपण के प्रभाव की सराहना करते हैं, हम पूरी तरह से तैयारी की भूमिका का अनुमान नहीं कर सकते, त्वचा हटाने, और एक संभावित LysM पर मन्या अलगाव+ सेल सक्रियण. हम निष्कर्ष है कि LysMCre+IRG+ माउस की तरह प्रतिदीप्ति रिपोर्टर चूहों के उपयोग के लिए vivo इमेजिंग में पशु तैयारी के दौरान पोत अखंडता के विघटन से बचने की सिफारिश की है ।

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

    Acknowledgements

    इस काम को जर्मन मिनिस्ट्री फॉर एजुकेशन ऐंड रिसर्च (BMBF 01EO1003 और BMBF 01EO1503) ने सपोर्ट किया था ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Midazolam Ratiopharm GmbH Anesthesia mix
    Medetomidine Pfizer Deutschland GmbH Anesthesia mix
    Fentanyl Janssen-Cilag GmbH Anesthesia mix
    Alzane Zoetis Antisedan mix
    Flumazenil Hikma pharma Antisedan mix
    Braunol B Braun
    Octeniderm Schülke
    Osmotic pumps Alzet 1007D Osmotic pump implantation
    Angiotensin II Sigma-Aldrich Osmotic pump implantation
    7-0 prolene suture Ethicon Osmotic pump implantation
    Acridine orange Sigma-Aldrich
    Catheter Smiths Medical Deutschland GmbH Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm
    Microscope Olympus BX51WI fluorescence microscope
    Beam Splitter Photometrics CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager
    Objective Olympus UMPLFLN10X Water immersion objective with a monochromator
    Camera Hamamatsu Photonics ORCA-R2
    Image acquisition and analysis software Olympus Realtime Imaging System eXcellence RT
    Mice The Jackson Laboratory Jax 008705 B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
    Mice The Jackson Laboratory Jax 004781 LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )

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    References

    1. Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
    2. Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
    3. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
    4. De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
    5. Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
    6. Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
    7. Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. Role of the Immune System in Hypertension. Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).
    8. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
    9. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
    10. Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
    11. Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
    12. Hinsbergh, V. W. Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
    13. Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
    14. Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
    15. Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
    16. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
    17. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. (2015).
    18. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).
    19. Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. (2017).

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