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फ्लेविन-युक्त Mitochondrial Dehydrogenases द्वारा सुपरऑक्साइड/हाइड्रोजन पेरोक्साइड और नध उत्पादन का एक साथ मापन

Biochemistry

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Summary

Mitochondria कई फ्लेविन निर्भर एंजाइमों कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का उत्पादन कर सकते होते हैं । mitochondria में व्यक्तिगत साइटों से ROS जारी निगरानी अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं के कारण चुनौतीपूर्ण है । हम शुद्ध flavoenzymes और microplate fluorometry का उपयोग ROS रिहाई के लिए देशी दरों के प्रत्यक्ष मूल्यांकन के लिए एक आसान, सस्ती विधि पेश करते हैं ।

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Mailloux, R. J., Young, A., O'Brien, M., Gill, R. M. Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases. J. Vis. Exp. (132), e56975, doi:10.3791/56975 (2018).

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Abstract

यह बताया गया है कि mitochondria प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के 12 एंजाइमी स्रोतों को शामिल कर सकते हैं । इन साइटों के बहुमत फ्लेविन निर्भर श्वसन परिसरों और dehydrogenases कि सुपरऑक्साइड (ओ2●-) और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच22) का एक मिश्रण का उत्पादन शामिल हैं । अलग mitochondria में व्यक्तिगत साइटों की ROS उत्पादन क्षमता का सटीक ठहराव एंटीऑक्सीडेंट रक्षा प्रणालियों और पक्ष प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि यह भी रूप में2●-/H2o2. mitochondrial को बाधित कर सकते हैं कि विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग भी उत्पादन के अन्य साइटों से ROS रिहाई में फेरबदल करके माप समझौता कर सकते हैं. यहां, हम एच22 रिलीज और nicotinamide adenine dinucleotide (नध) के उत्पादन के एक साथ माप के लिए एक आसान तरीका शुद्ध फ्लेविन-लिंक्ड dehydrogenases द्वारा प्रस्तुत करते हैं । हमारे यहाँ प्रयोजनों के लिए, हम उदाहरण के रूप में ketoglutarate हृदय उत्पत्ति के शुद्ध पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज परिसर (PDHC) और α-डिहाइड्रोजनेज KGDHC परिसर (सुअर का) का उपयोग किया है. इस विधि ROS और एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम के अंय संभावित स्रोतों को नष्ट करने के उत्पादन के व्यक्तिगत साइटों द्वारा देशी एच2हे2 रिलीज दरों के एक सटीक उपाय के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस विधि एच2हे2 रिलीज और एंजाइम गतिविधि और प्रभावशीलता और ROS उत्पादन के लिए अवरोधकों के selectivity की स्क्रीनिंग के बीच संबंधों की एक सीधी तुलना के लिए अनुमति देता है । कुल मिलाकर, इस दृष्टिकोण अलग mitochondria या permeabilized मांसपेशी फाइबर के साथ और अधिक परिष्कृत प्रयोगों के संचालन से पहले व्यक्तिगत एंजाइमों के लिए ROS रिहाई की देशी दरों की गहराई से मूल्यांकन के लिए अनुमति दे सकते हैं.

Introduction

पोषक चयापचय का अंतिम लक्ष्य adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) बनाना है । स्तनधारी कोशिकाओं में, यह mitochondria में होता है, डबल-झिल्ली organelles है कि ऊर्जा में परिवर्तित एटीपी में कार्बन संग्रहीत । एटीपी का उत्पादन तब शुरू होता है जब कार्बन दो इलेक्ट्रॉनक वाहक, नध और फ्लेविन adenine dinucleotide (फॊध)के गठन mitochondria द्वारा combusted जाता है. नध और फॊध2 तो बहु-उप इकाई श्वसन परिसरों मैं और द्वितीय क्रमशः, और मुक्त इलेक्ट्रॉनों परिसर में चतुर्थ1पर टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता आणविक ऑक्सीजन (ओ2) ferried कर रहे है द्वारा ऑक्सीकरण हो जाता है । इस श्रृंखला के अंत में के लिए इलेक्ट्रॉनों के "ढलान" डाउनहिल हस्तांतरण के लिए2 ओ, मैं, III, और चतुर्थ जटिल द्वारा झिल्ली अंतरिक्ष में प्रोटान के निर्यात के लिए युग्मित है । यह प्रोटान के एक transmembrane विद्युत ढाल बनाता है (प्रोटॉन-मकसद बल), गिब्स मुक्त ऊर्जा है कि जटिल वी द्वारा उपयोग के लिए एटीपी2बनाने के लिए एक अस्थाई रूप । mitochondria में इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रतिक्रियाओं पूरी तरह से एटीपी उत्पादन के लिए युग्मित नहीं कर रहे हैं । Krebs चक्र और श्वसन श्रृंखला में विभिन्न बिंदुओं पर, इलेक्ट्रॉनों समय से पहले ROS3फार्म करने के लिए हे2 के साथ बातचीत कर सकते हैं । mitochondria द्वारा सृजित सबसे जैविक रूप से प्रासंगिक ROS ओ2●- और एच22हैं । हालांकि ओ2●- अक्सर mitochondria द्वारा गठित समीपस्थ ROS माना जाता है, यह अब स्पष्ट है कि उत्पादन की साइटों ओ2●- और एच22का एक मिश्रण है, जो मुक्त के साथ जुड़ा हुआ है के रूप में फ्लेविन बनाव समूहों के कट्टरपंथी रसायन विज्ञान4,5। उच्च स्तर पर, ROS खतरनाक हो सकता है, ऑक्सीडेटिव संकट में जिसके परिणामस्वरूप सेल समारोह के लिए आवश्यक हानिकारक जैविक घटकों6। हालांकि, कम मात्रा में, mitochondrial ROS महत्वपूर्ण संकेतन कार्यों को पूरा । उदाहरण के लिए, एच22 रिलीज mitochondria से टी सेल सक्रियण, तनाव सिग्नलिंग (जैसे, Nrf2 संकेतन रास्ते की प्रेरण) को नियंत्रित करने में फंसाया गया है, सेल प्रसार और भेदभाव की प्रेरण, इंसुलिन संकेतन और रिलीज, और खिला व्यवहार7. काफी प्रगति ROS के संकेतन समारोह को समझने में किया गया है । हालांकि, महत्वपूर्ण सवाल अभी भी संबंध में जो mitochondria में एंजाइमों सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों और कैसे उत्पादन नियंत्रित किया जाता है के रूप में काम करते रहते हैं ।

उत्पादन की एक साइट द्वारा ROS रिलीज कई कारकों पर निर्भर करता है: 1) इलेक्ट्रॉन दान साइट की एकाग्रता, 2) साइट दान इलेक्ट्रॉन के redox राज्य, 3) ऑक्सीजन के लिए उपयोग, और 4) एकाग्रता और ऑक्सीकरण सब्सट्रेट के प्रकार3, 8 , . mitochondria में, नध की एकाग्रता और झिल्ली संभावित ताकत जैसे अन्य कारक भी ROS उत्पादन,१०को प्रभावित करते हैं. उदाहरण के लिए, o2की दर●-/H2o2 उत्पादन को शुद्ध PDHC या KGDHC के द्वारा बढ़ाने नध की उपलब्धता5,11के साथ बढ़ जाती है । इस परिदृश्य में, इलेक्ट्रॉनों नध से पीछे की तरफ बह रहे है सनक केंद्र में PDHC या KGDHC के ई3 उप इकाई, o2के लिए साइट●-/H2हे2 उत्पादन12। इसी प्रकार, णड+ के प्रावधान पर विपरीत प्रभाव पड़ता है, ROS KGDHC12से घट रही है । इस प्रकार, प्रवेश या ROS उत्पादन की साइटों से इलेक्ट्रॉनों के निकास को नियंत्रित कितना हे2●-/H22 गठन बदल सकते हैं । उदाहरण के लिए, सीपीआई-६१३, एक लाइपो एसिड अनुरूप, के साथ PDHC या KGDHC के ई2 उप इकाई को अवरुद्ध2ओ में लगभग ९०% कमी में परिणाम●-/H2हे2 उत्पादन13। इसी तरह के परिणाम रासायनिक एस-glutathionylation उत्प्रेरक, diamide और disulfiram के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो लगभग समाप्त हे2●-/H2o2 उत्पादन द्वारा PDHC या KGDHC द्वारा विकार के glutathione के माध्यम से ई 2 उपइकाई14. PDHC और KGDHC के ई उपइकाई के माध्यम से इलेक्ट्रॉनक प्रवाह को अवरुद्ध करने के लए व्यापार बंद नध उत्पादन में कमी आती है जो इलेक्ट्रॉनक परिवहन श्रृंखला (उदा., कॉम्प्लेक्स III) द्वारा ROS गठन को घटता है. यह भी इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला द्वारा एटीपी उत्पादन में कमी कर सकते हैं । कुल मिलाकर, ROS उत्पादन की साइटों को अवरुद्ध इलेक्ट्रॉन प्रविष्टि ओ2●-/H22 उत्पादन को नियंत्रित करने का एक बहुत प्रभावी साधन हो सकता है ।

Mitochondria 12 क्षमता ओ2●-/H22 सूत्रों6शामिल कर सकते हैं । इन साइटों के अधिकांश फ्लेविन-एंजाइमों जो ओ2●- और एच22का एक मिश्रण उत्पंन युक्त हैं । विभिंन सब्सट्रेट और अवरोधक संयोजनों के उपयोग की पहचान के लिए अनुमति दी है जो श्वसन परिसरों और mitochondrial dehydrogenases उच्च क्षमता के रूप में सेवा ओ2●-/H22 बनाने साइटों में विभिंन ऊतकों3। PDHC और KGDHC उच्च क्षमता ओ2●-/H22 मांसपेशी और जिगर mitochondria13,15में उत्सर्जक साइटों के रूप में सेवा करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि, कुछ कठिनाइयों की परीक्षा के संबंध में रहना हे2●-/H2o2 mitochondria में व्यक्तिगत साइटों के बनाने की क्षमता और प्रभाव है कि विभिन्न सब्सट्रेट और अवरोधक संयोजन पर है एंजाइमों की गतिविधियों । यह अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति के कारण है (जैसे, ओ2के गठन●-/H2हे2 ब्याज के एंजाइम के अलावा अन्य साइटों द्वारा), अंतर्जात पोषक तत्वों को दूषित (जैसे,फैटी एसिड) या organelles (जैसे, peroxisomes जो भी रूप ओ2●-/H2हे2), और अवरोधकों का उपयोग करें कि कमी selectivity, और/या यौगिकों कि पूरी तरह से ROS उत्पादन को बाधित नहीं का उपयोग करें । कुछ अवरोधकों को भी mitochondrialता और इलेक्ट्रॉन प्रवाह की दिशा में परिवर्तन कर सकते हैं, और यह उत्पादन के अंय साइटों से ROS रिलीज बदल और पाया परिणाम । के लिए निरपेक्ष दरों ओ2●-/H22 रिलीज mitochondria में व्यक्तिगत साइटों से भी मुश्किल हो जाता है की उच्च एकाग्रता की वजह से हे2●- और एच22 मैट्रिक्स और झिल्ली अंतरिक्ष में एंजाइमों को नष्ट करने. इसलिए, किसी भी प्रतिस्पर्धा प्रतिक्रियाओं कि ओ2●-/H2o2 रिलीज माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के उन्मूलन उपयोगी हो सकता है जब उच्च क्षमता की पहचान हे2●-/H2हे2 बनाने साइटें ।

यहां, हम एक सरल तरीका है कि ओ2के एक साथ परीक्षा के लिए अनुमति देता है●-/H2o2 उत्पादन और नध गठन शुद्ध फ्लेविन-निर्भर dehydrogenases द्वारा प्रस्तुत करते हैं । शुद्ध एंजाइमों, अवांछित ROS बनाने पक्ष प्रतिक्रियाओं और ROS अपमानजनक एंजाइमों का उपयोग करके देशी हे2●-/H22 उत्पादन दर के लिए व्यक्तिगत flavoenzymes के एक अधिक सटीक उपाय के लिए अनुमति समाप्त किया जा सकता है । इस विधि से सीधे ओ2●-/H22 अलग शुद्ध dehydrogenases के बनाने की क्षमता की तुलना करने के लिए या संभावित साइट के लिए विशेष अवरोधकों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हे2●-/H22 रिलीज । अंत में, मापने ओ2●-/H2o2 और नध उत्पादन एक साथ एंजाइम गतिविधि और ROS रिलीज क्षमता के बीच संबंधों के एक वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए अनुमति दे सकते हैं ।

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Protocol

1. रसायन और शुद्ध एंजाइमों

  1. निंनलिखित सामग्री की खरीद: PDHC और सुअर का दिल मूल के KGDHC (या एक और शुद्ध mitochondrial flavoenzyme); एच (३०% समाधान), पाइरूवेट, α-ketoglutarate, णड+, नध, CoASH, thiamine pyrophosphate (TPP), mannitol, HEPES, सुक्रोज, EGTA, 3-मिथाइल-2-oxo valeric अम्ल (KMV), सुपरऑक्साइड dismutase (वतन), सहिजन peroxidase (एचआरपी), 10-एसिटाइल-3, 7-dihydroxyphenoxazine रिएजेंट (AUR), और CPI-६१३ ।

2. परख और एजेंट की तैयारी की योजना बना

  1. एक ९६-अच्छी तरह से थाली में तालिका 1 के अनुसार परख सेट करें ।
    नोट: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए कुल मात्रा २०० µ एल स्टॉक सांद्रता है कि इस तरह के 20 µ एल रिएजेंट के एक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है समायोजित कर रहे हैं । यह अच्छी तरह से परख शुरू करने से पहले प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए cofactors और सब्सट्रेट के तेजी से इसके अलावा सुनिश्चित करता है ।
  2. २२० मिमी mannitol, ७० मिमी सुक्रोज, 1 मिमी EGTA, और 20 मिमी HEPES (एचसीएल के साथ पीएच ७.४) युक्त प्रतिक्रिया बफर तैयार करें ।
    नोट: यह अलग शुद्ध एंजाइमों के भौतिक गुणों के आधार पर बदल सकता है ।
  3. एंजाइम गतिविधि परख14,16,17 या द्वारा immunoblot या Coomassie दाग5का उपयोग कर संदूषण के लिए शुद्ध KGDHC या PDHC की जांचकरें
  4. सभी रिएजेंट्स प्रतिक्रिया बफ़र में तालिका 1में कार्य समाधान सांद्रता के अनुसार तैयार करें ।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots के रूप में सभी रिएजेंटों की दुकान । स्टोर पाइरूवेट और α-ketoglutarate में-८० ° c १००-µ एल aliquots में ऑटो ऑक्सीकरण और दोहराया रुक-गल के कारण सहज गिरावट को रोकने के लिए ।
  6. DMSO के 1 मिलीलीटर में और फिर रिएजेंट मास्टर शेयर तैयार करें और फिर प्रतिक्रिया बफर में १०० µ मीटर के लिए पतला । प्रकाश से सुरक्षित स्टोर ।
    नोट: यहां, १०० µ एम काम समाधान ताजा हर 2 से 3 सप्ताह और प्रकाश से संरक्षित किया जाता है ।

3. परख टेंपलेट की स्थापना

  1. दोहरी माप क्षमताओं के साथ एक रंग microplate रीडर पर परख प्रक्रिया की स्थापना की ।
  2. "प्रोटोकॉल" का चयन करके पढ़ने की प्रक्रिया को परिभाषित करें । फिर क्लिक करें "प्रक्रिया" ।
  3. "तापमान" को 25 डिग्री सेल्सियस (चित्र 1a) पर सेट करें ।
  4. पढ़ें शर्तें (चित्र 1a) सेट करने के लिए "प्रारंभ काइनेटिक" पर क्लिक करें. समय और पढ़ें अंतराल की संख्या/
  5. "पढ़ें" (चित्र 1b) क्लिक करें ।
    नोट: नमूने ५० के लाभ के साथ शीर्ष स्थान से पढ़ रहे हैं । समय: 5 मिनट, 30-s अंतराल पर पढ़ें । चैनल 1: Resorufin प्रतिदीप्ति-उत्तेजना/उत्सर्जन = ५६५ एनएम: 600 एनएम, १३.५ एनएम की तरंग दैर्ध्य चौड़ाई । चैनल 2: नध autofluorescence-उत्तेजना/उत्सर्जन = ३७६ एनएम: 450 एनएम, 20 एनएम की तरंग दैर्ध्य चौड़ाई ।
  6. "पढ़ें" के अंतर्गत, कुओं का चयन करें (उदा, A1-A4 और B1-B4) ।
  7. "अंत काइनेटिक" का चयन करें ।

4. मानक घटता

  1. जरूरत पड़ने तक बर्फ पर रिएजेंट और स्टोर गल ।
  2. नध मानक वक्र (चित्र 2a)
    1. प्रतिक्रिया बफ़र में 0.5-10 मिमी की एकाग्रता श्रेणी में नध के लिए कार्य समाधान तैयार करें.
    2. १८० µ l रिएक्शन बफर युक्त कुओं को प्रत्येक नध कार्य समाधान एकाग्रता से २० µ l aliquots जोड़ें. प्रत्येक कुआं में नध की अंतिम एकाग्रता 0.05-१ मि. ली.
    3. क्लिक करें "पढ़ें" और सेट उत्तेजना/उत्सर्जन = ३७६ एनएम: 450 एनएम, 20 एनएम की तरंग दैर्ध्य चौड़ाई ।
      नोट: यह है एक समापन बिंदु केवल पढ़ने के लिए-काइनेटिक पैरामीटर्स की आवश्यकता नहीं है ।
  3. AUR मानक वक्र (चित्र b)
    1. प्रतिक्रिया बफर में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के काम स्टॉक तैयार; शेयर सांद्रता 200-4000 एनएम से लेकर ।
    2. एक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया बफर के १२० µ एल जोड़ें ।
    3. Add 20 µ l of एचआरपी (कार्य शेयर एकाग्रता = 30 U/एमएल, खैर में अंतिम एकाग्रता = 3 u/एमएल), 20 µ वतन के एल (काम शेयर एकाग्रता = २५० u/एमएल, अच्छी तरह से = 25 u/एमएल) में अंतिम एकाग्रता, और 20 µ एल की और (कार्य स्टॉक एकाग्रता = १०० µ एम , खैर में अंतिम एकाग्रता = 10 µ एम) प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त प्रतिक्रिया बफर करने के लिए ।
    4. प्रत्येक एच22 के प्रत्येक अच्छी तरह से बफर और परख रिएजेंट के लिए काम कर स्टॉक समाधान के 20 µ एल जोड़ें । अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा २०० µ एल है और प्रत्येक कुआं में एच22 के अंतिम एकाग्रता 20-400 एनएम है ।
    5. प्लेट रीडर में 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए प्लेट्स की मशीन ।
    6. क्लिक करें "पढ़ें" और सेट उत्तेजना/उत्सर्जन = ५६५ एनएम/600 एनएम, १३.५ एनएम की तरंग दैर्ध्य चौड़ाई । ध्यान दें कि यह है एक समापन बिंदु केवल पढ़ें-काइनेटिक पैरामीटर्स की आवश्यकता नहीं है ।

5. माप o2●- /H22 जारी और नध उत्पादन द्वारा KGDHC और PDHC

  1. विभिन्न एजेंट, प्रत्येक कार्य समाधान की एकाग्रता, और प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा मात्रा के अलावा के आदेश के लिए तालिका 1 देखें ।
  2. एक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया बफर के ४० µ एल जोड़ें । KMV या भाकपा-६१३ का उपयोग परख के लिए, एक अच्छी तरह से बफर के 20 µ एल जोड़ें ।
  3. PDHC या KGDHC के 20 µ एल जोड़ें (1 यू/एमएल, अच्छी तरह से प्रति अंतिम एकाग्रता = ०.१ u/
  4. 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर PDHC और KGDHC की मशीन ।
  5. जोड़ें 20 µ l of KMV (कार्य स्टॉक = १०० mm, अंतिम एकाग्रता = 10 मिमी) या सीपीआई-६१३ के 20 µ l (कार्य स्टॉक एकाग्रता = १.५ mm, अंतिम एकाग्रता = १५० µ m) (तालिका 2) ।
    नोट: यदि अवरोधकों परख के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है यह कदम बाहर रखा जा सकता है ।
  6. 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: यदि अवरोधकों परख के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है यह कदम बाहर रखा जा सकता है ।
  7. एचआरपी के 20 µ एल जोड़ें (कार्य शेयर एकाग्रता = 30 इकाइयों/एमएल, अच्छी तरह से = 3 इकाइयों में अंतिम एकाग्रता/एमएल) और 20 µ वतन के एल (काम शेयर एकाग्रता = २५० इकाइयों/एमएल, अच्छी तरह से में अंतिम एकाग्रता = 25 इकाइयों/
  8. जोड़ें 20 µ एल के कोएंजाइम A (कार्य स्टॉक एकाग्रता = 1 मिमी, अंतिम एकाग्रता = ०.१ मिमी), TPP के 20 µ एल (कार्य शेयर एकाग्रता = 3 मिमी, अंतिम एकाग्रता = ०.३ मिमी), और 20 µ एल के णड+ (कार्य शेयर एकाग्रता = 10 मिमी, अंतिम एकाग्रता = 1 मिमी) प्रत्येक डब्ल्यू करने के लिए मनट.
  9. और सुरक्षात्मक टिनफॉईल से कवर और एक अच्छी तरह से 20 µ एल जोड़ने के लिए AUR एजेंट निकालें ।
  10. पाइरूवेट के 20 µ एल जोड़ें (काम शेयर एकाग्रता 1-100 mm से लेकर, परख के लिए अंतिम एकाग्रता = 0.1-10 मिमी) PDHC और α युक्त कुओं को ketoglutarate (कार्य शेयर 1-100 mM, परख के लिए अंतिम एकाग्रता = 0.1-10 मिमी से लेकर एकाग्रता) कुओं युक्त KGDHC.
  11. काइनेटिक मापन शुरू करने के लिए "पढ़ें" पर क्लिक करें.

6. डेटा विश्लेषण

  1. कुंजीपटल और क्लिक कुओं पर ' CTRL ' बटन नीचे पकड़ो एक ग्राफ सभी काइनेटिक 1 चैनल को इसी माप (चित्रा 3) युक्त उत्पंन करने के लिए ।
  2. अलग समय अंक (चित्र बी) पर मापा रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के लिए कच्चे मूल्यों के लिए ऊपरी दाएँ कोने में दृश्य आइकन में "डेटा" पर क्लिक करें.
  3. विश्लेषण के लिए मान निर्यात करें (तालिका 3) ।
  4. प्रतिदीप्ति चैनल 2 से जुड़े RFU मानों तक पहुंचने के लिए ऊपर दाईं ओर "ग्राफ़" ड्रॉप डाउन मेनू पर क्लिक करें (चित्र3).
  5. चरण ६.१ के लिए ६.३ चैनल 2 के लिए दोहराएँ ।

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Representative Results

चित्र 3 ए शुद्ध KGDHC द्वारा एच22 और नध उत्पादन के एक साथ माप के दौरान एकत्र RFU के लिए एक प्रतिनिधि ट्रेस प्रदान करता है । प्रत्येक समय अंतराल के लिए raw RFU डेटा चित्र बीमें दर्शाया गया है । कच्चे RFU डेटा तो विश्लेषण के लिए निर्यात कर रहे हैं । चित्रा 2में प्रस्तुत मानक curves से extrapolating द्वारा, 5-ंयूनतम अवधि में प्रत्येक मापन अंतराल पर गठित नध और H2O2 की निरपेक्ष राशि निर्धारित की जा सकती है । इस परिकलन का एक उदाहरण तालिका 3में प्रदान किया गया है । एक बार नध की मात्रा और एच द्वारा गठित KGDHC या PDHC द्वारा अलग अंतराल पर निर्धारित की गई है, मूल्यों की नकल की जाती है और आगे के विश्लेषण के लिए एक रेखांकन/ XY ग्राफ़-प्रकार विश्लेषण का उपयोग करके, KGDHC या PDHC द्वारा बनाई गई नध (µmol) और H2O2 (pmol) की राशि को समय (चित्र 4a) के कार्य के रूप में प्लॉट किया जा सकता है । इन मूल्यों का उपयोग करने से सब्सट्रेट ऑक्सीकरण के दौरान नध और एच के गठन की दर भी गणना की जा सकती है. जैसा कि चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, KGDHC और PDHC नध और एच बनाने की क्षमता के संदर्भ में विभिन्न विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं.

एक बार यह स्थापित हो गया है कि KGDHC और PDHC enzymatically सक्रिय हैं और नध और एच के गठन को एक साथ ट्रैक कया जा सकता है, ROS जारी गुणों और एंजाइम कार्यकलापों को मापा जा सकता है. हम KGDHC और PDHC तुलना के बाद से वे बुनियादी ढांचे में अत्यधिक मुताबिक़ है और ROS उत्पादन के लिए उच्च क्षमता साइटों हो प्रलेखित किया गया है5चुना है । चित्रा 5 और चित्रा 6 सब्सट्रेट एकाग्रता पर नध और एच22 उत्पादन की निर्भरता का प्रदर्शन. PDHC आसानी से सब्सट्रेट की दर के साथ कम मात्रा से संतृप्त है और एच22 उत्पादन में 0.1-0.5 mM पाइरूवेट पर अपनी अधिकतम तक पहुंचने । KGDHC, दूसरी ओर, नध और एच उत्पादन में बढ़ती α-ketoglutarate (चित्रा ५) के साथ प्रदर्शित नहिं बढ़ता है. यह दर्शाता है कि KGDHC और PDHC, हालांकि उच्च मुताबिक़ बुनियादी संरचना में, कितना सब्सट्रेट अधिक से अधिक ROS रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए आवश्यक है के मामले में अलग काइनेटिक गुण है. चित्र 5 यह भी दर्शाता है कि KGDHC से एच 22 रिलीज नध उत्पादन और सब्सट्रेट उपलब्धता के साथ दृढ़ता से संबद्ध है । दूसरे पर PDHC एक ही काइनेटिक विशेषताओं नहीं है । KGDHC और PDHC नध के संदर्भ में भी अलग है और ओ2●-/H22 बनाने की क्षमता जब णड+ एकाग्रता विविध है (आंकड़ा 6) ।

नध और एचके एक साथ माप का लाभ लेने से, ROS उत्पादन के लिए संभाव्य स्थल-विशिष्ट अवरोधकों को दिखलाई जा सकता है. यह अवरोधक की राशि है कि एच2हे2 रिलीज के अधिक से अधिक निषेध प्रेरित करने के लिए आवश्यक है निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं । इसके अलावा, नध उत्पादन को एक ही समय में मापने से, अवरोधक क्रिया के लिए स्थल के साथ-साथ ROS के स्रोत की पहचान की जा सकती है. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि α-ketoglutarate अनुरूप, KMV, KGDHC (≥ ९०% अवरोध)13,15से बाधा ROS जारी करने में अत्यधिक प्रभावी है । हम यह भी पता चला है कि भाकपा ६१३, एक लाइपो एसिड अनुरूप है कि ब्लॉक dihydrolipoamide के ई2 उप इकाई के PDHC और KGDHC, भी ROS रिलीज को बाधित कर सकते है या तो परिसर से ~ ९०%13,14। KMV और सीपीआई-६१३ के लिए कार्रवाई का स्थल चित्रा 7में दिखाया गया है । CPI-६१३ अणु युक्त सल्फर है और यह इसलिए सलाह दी जाती है कि thiol-अमीर कम करने वाले एजेंटों (dithiothreitol; डीटीटी) या प्रोटीन (एल्ब्युमिन) प्रक्रिया13से छोड़ी जाती हैं । चित्रा 7 यह दर्शाता है कि दोनों KMV और सीपीआई-६१३ दोनों नध और एच22 KGDHC द्वारा सीमित करने में दोनों अत्यधिक प्रभावी थे । इसी तरह सीपीआई-६१३ ने PDHC (चित्रा 7) से एच22 रिलीज को पूरी तरह से समाप्त कर दिया । सामूहिक रूप से, इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि KMV और सीपीआई-६१३ एच2हे2 रिहाई के लिए अत्यधिक प्रभावी अवरोधकों हैं और इस तरह अलग mitochondria के साथ प्रयोग करने के लिए लागू किया जा सकता है । इस तरह के एक स्क्रीन उच्च अंय संभावित ROS के लिए फायदेमंद होगा एंजाइमों के गठन के बाद से यह प्रभावशीलता और शुद्ध फ्लेविन युक्त dehydrogenases पर विभिंन अवरोधकों के selectivity का सीधा आकलन के लिए अनुमति देता है । नध का एक साथ मापन भी एक एंजाइम कॉम्प्लेक्स के भीतर ROS के संभावित स्रोत की प्रारंभिक पहचान की अनुमति देने का जोड़ा लाभ है. चित्र 7 KGDHC के लिए उत्प्रेरक तंत्र का चित्रण प्रदान करता है, जो PDHC को अत्यधिक मुताबिक़ है । निरीक्षण कि KMV और सीपीआई-६१३, जो KGDHC के ई1 और ई2 उपइकाई, लगभग पूरी तरह से दोनों एच22 और नध उत्पादन समाप्त, पुष्टि करता है कि ई3 उपइकाई, संभावना सनक, ROS स्रोत है 18. भाकपा-६१३ की पुष्टि PDHC पर एक समान प्रभाव डालती है कि एच22 रिलीज के लिए सिद्धांत साइट ई3 उपइकाई18है । एक समान दृष्टिकोण अंय dehydrogenases के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह अवरोधकों की पहचान की आवश्यकता होगी कि ब्लॉक इलेक्ट्रॉन एक एंजाइम परिसर के विभिंन भागों के माध्यम से प्रवाह ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रतिनिधि परख सेटअप के लिए स्क्रीन शॉट्स । () नध और resorufin प्रतिदीप्ति में परवर्तन के काइनेटिक मापन के लए निर्धारित प्रक्रिया का चित्रण. () परख के लिए प्रतिदीप्ति मानकों की स्थापना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : नध और resorufin प्रतिदीप्ति के लए प्रतिनिधि मानक घटता है. घटता नध की दर का अनुमान लगाने के लए उपयोग कया जाता है और ओ●-/H उत्पादन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : कच्चे RFU परख के दौरान एकत्र आंकड़ों के लिए प्रतिनिधि अंश । (A) एक अच्छी तरह से है कि परख के दौरान पढ़ा था के लिए घटता है । प्लेट दृश्य घटता नीचे CTL बटन पकड़ और एक अच्छी तरह से पढ़ा जा रहा है कि पर क्लिक करके उत्पन्न कर रहे हैं । (B) डेटा निर्यात के लिए, डेटा को देखने के तहत क्लिक किया जाता है जिसमें प्रतिनिधि RFU मानों वाली कोई तालिका जनरेट करें । स्प्रेडशीट निर्यात बटन फिर कच्चे परिणामों को निर्यात करने के लिए क्लिक किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : एच2 की प्रत्यक्ष तुलना हे 2 और नध के गठन की दरें KGDHC और PDHC. ( क) एच और KGDHC और PDHC की नध बनाने की क्षमता काएकसाथ मापन. (B) KGDHC और PDHC द्वारा एच और नध गठन की दर की गणना. दोनों फ्लेविन-युक्त एंजाइमों द्वारा नध और ROS उत्पादन की प्रत्यक्ष तुलना यह दर्शाती है कि KGDHC अधिक एच का उत्पादन करता है जो इसकी उच्च एंजाइमी क्षमता से संबंधित है. n = 4, मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : H का एक साथ मापन 2 हे 2 और KGDHC और PDHC ऑक्सीकरण विभिंन सब्सट्रेट सांद्रता द्वारा दर बनाने नध । प्रतिदीप्ति में परिवर्तन अंतिम सब्सट्रेट एकाग्रता को छोड़कर पहले वर्णित के रूप में मापा गया 0 मिमी से 10 मिमी के लिए विविध था. इस दृष्टिकोण KGDHC और PDHC की काइनेटिक संपत्तियों पर एच22 रिलीज की निर्भरता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । n = 4, मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : KGDHC और PDHC भी अलग एच2 प्रदर्शन हे 2 और नध बनाने के गुण जब णड + स्तर बदल रहे हैं. प्रतिदीप्ति में परिवर्तन णड की अंतिम एकाग्रता को छोड़कर पहले वर्णित के रूप में मापा गया+ 0 मिमी से 1 मिमी के लिए विविध था । इस दृष्टिकोण KGDHC और PDHC की काइनेटिक संपत्तियों पर एच22 रिलीज की निर्भरता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । n = 4, मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 : नध और ज2 के लिए अलग साइट-विशिष्ट अवरोधकों की स्क्रीनिंग हे 2 उत्पादन । () KGDHC के लिए उत्प्रेरक चक्र और KMV और सीपीआई-६१३ के लिए कार्रवाई की साइटों का चित्रण आरेख । ध्यान दें कि PDHC एक मुताबिक़ उत्प्रेरक चक्र है, सिवाय इसके कि KMV पाइरूवेट बाध्यकारी साइट के लिए प्रतिस्पर्धा नहीं करता है । E1: पाइरूवेट या α-ketoglutarate डिहाइड्रोजनेज, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide डिहाइड्रोजनेज. ( ) KMV और सीपीआई-६१३ के प्रभाव से KGDHC और PDHC द्वारा नध और एच उत्पादन पर. KMV (१० मि. मी.) या सीपीआई-६१३ (१५० µ मीटर) में नमूनों की दोबारा जांच की गई और इसके लिए परख की गई और एच22 उत्पादन । n = 4, मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अभिकर्मक कार्य शेयर एकाग्रता मात्रा में अच्छी तरह से जोड़ा अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता
KGDHC या PDHC 1 यूनिट/ 20 µ l ०.१ इकाइयां/
सुपरऑक्साइड dismutase २५० इकाइयां/ 20 µ l 25 यूनिट/
सहिजन peroxidase 30 यूनिट/ 20 µ l 3 यूनिट/
Thiamine pyrophosphate 3 मिमी 20 µ l ०.३ एमएम
कोएंजाइम एक 1 मिमी 20 µ l ०.१ एमएम
णड+ 10 एमएम 20 µ l 1 मिमी
10-एसिटाइल-3, 7-dihydroxyphenoxazine १०० µ m 20 µ l १० µ मी
सब्सट्रेट 1-100 एमएम 20 µ l 0.1-10 मिमी

तालिका 1: O की माप के लिए सेट किए गए किसी मूल प्रोटोकॉल का उदाहरण 2 - /H 2 हे 2 तथा शुद्ध नध द्वारा उत्पादन PDH या KGDH. प्रत्येक रिएजेंट के 20 µ एल के बाद से एक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और अंतिम मात्रा/प्रतिक्रिया २०० µ एल है, प्रत्येक एजेंट के अंतिम एकाग्रता 10-शेयर एकाग्रता से भी कम गुना है (जैसे, णड के अंतिम एकाग्रता+ प्रतिक्रिया मिश्रण में 1 मिमी है ). ध्यान दें कि एजेंट तालिका में प्रस्तुत क्रम में अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए ।

संकोचक लक्ष्य
3-मिथाइल-2-oxo valeric एसिड E1 KGDHC की उपइकाई
भाकपा-६१३ oxo एसिड dehydrogenases की E2 उपइकाई

तालिका 2: अवरोधकों की सूची और उनके लक्ष्य. कार्रवाई की साइटें भी चित्रा 8में चित्रित कर रहे हैं ।

नध autofluorescence
PDHC KGDHC
समय T ° ३७६,४५० a1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8
0:00:04 २४.४ ९९ ९९ ९१ ८८ ८५ ८२ ५८ ८८
0:00:34 २४.४ १२८ १०७ ९९ १०८ ८१ ८० ७७ ७८
0:01:04 २४.४ १२४ १२८ ११७ १३९ ९७ ८८ ९७ ७६
0:01:34 २४.४ १४६ १४२ १२९ १३२ ९१ ९७ ८४ ७८
0:02:04 २४.४ १६१ १५३ १४८ १४६ ९० १०७ ९५ ८८
0:02:34 २४.४ १७१ १६० १५६ १४५ ९७ १०३ १११ १२२
0:03:04 २४.४ १७६ १७६ १६१ १६९ १०९ १२० ९९ ११६
0:03:34 २४.४ १८६ १८० १७९ १६७ ११८ १२३ १२१ ११९
0:04:04 २४.४ २०१ १८२ १८७ १८३ १२७ १२४ ११९ १३१
0:04:34 २४.४ २२५ १९० १९५ १८६ १३६ १४३ १२४ १३२
0:05:04 २४.४ २२७ २२७ २०३ १९७ ११५ १४३ १२१ १४३
Resorufin प्रतिदीप्ति
PDHC KGDHC
समय T ° ५६५,६०० a1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8
0:00:00 २४.४ २०४ १७८ १६९ १५२ १४८ ११३ १०७ ९०
0:00:30 २४.४ २२४ १८८ १६७ १५२ १४४ ११६ १२४ ११२
0:01:00 २४.४ २१२ १८६ १७८ १६१ १५३ ११४ १२२ १२०
0:01:30 २४.४ २१२ १८८ १६५ १६४ १६० १३२ १२७ ११६
0:02:00 २४.४ २२२ २०३ १९० १६९ १५४ १२८ १३३ १२७
0:02:30 २४.४ २१७ १९८ १९३ १७९ १६५ १२९ १४७ १३०
0:03:00 २४.४ २२३ २१८ २०२ १७९ १८३ १४२ १४५ १३७
0:03:30 २४.४ २३९ २२३ २०८ १८८ १७९ १५० १५५ १४८
0:04:00 २४.४ २३६ २१९ २०२ १८३ १८० १६३ १५६ १५३
0:04:30 २४.४ २४९ २२० २१४ १७७ १९९ १४९ १५० १६७
0:05:00 २४.४ २५१ २३२ २२५ १९६ २११ १७० १६९ १६१

तालिका 3: प्रयोगों के सेट से एकत्रित परिणामों का स्प्रेडशीट दृश्य. प्रयोग से उत्पंन कच्चे RFU मूल्यों को आगे के विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट में निर्यात किया जाता है । प्रयोग करने से पूर्व उत्पन्न मानक वक्रों का उपयोग करते हुए, नध की दर और एचउत्पादन की गणना स्प्रैडशीट में की जा सकती है.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के बाद से लाभप्रद है, 1) यह किसी भी प्रतिस्पर्धा प्रतिक्रियाओं कि अंयथा एच2O2 का पता लगाने (जैसे, एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम या ROS के अंय स्रोतों) के साथ हस्तक्षेप कर सकते है समाप्त, 2) की मूल दर का प्रत्यक्ष मूल्यांकन प्रदान करता है एक फ्लेविन-mitochondrial डिहाइड्रोजनेज युक्त द्वारा ROS रिलीज, 3) दो या अधिक शुद्ध ROS आधारित फ्लेविन की मूल dehydrogenases रिलीज दरों की तुलना की अनुमति देता है, 4) ROS रिहाई और एंजाइम गतिविधि की दर की एक सीधी तुलना के लिए अनुमति दे सकते हैं, और 5) ROS रिहाई के लिए चयनात्मक प्रतियोगी अवरोधकों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है । हमारे समूह और दूसरों के पिछले प्रकाशनों में इस पद्धति का इस्तेमाल किया है allosteric और redox संकेतन तंत्र द्वारा ROS के विनियमन की जांच करने से पहले mitochondria या permeabilized मांसपेशी14,16के साथ प्रयोग के संचालन के लिए, 17,19,20.

संशोधन और समस्या निवारण:

यह कार्यविधि लगभग हर संस्था में उपलब्ध आधारभूत उपकरणों का उपयोग करती है । दृष्टिकोण भी कम लागत और विभिंन आपूर्तिकर्ताओं के माध्यम से उपलब्ध आम रसायनों का उपयोग करता है । बफर संरचना एंजाइम गुण के अनुसार भिन्न हो सकते हैं-हालांकि, हमने पाया है कि एक बुनियादी प्रतिक्रिया सुक्रोज, HEPES, mannitol से मिलकर बफर, और EGTA सबसे अनुप्रयोगों में अच्छी तरह से काम करता है. resorufin प्रतिदीप्ति के लिए कच्चे मूल्यों के लिए 50-500 RFU के आसपास आम तौर पर कर रहे है एक ROS जारी एंजाइम ०.१ यू के लिए पतला/ उच्च RFU मूल्यों का संकेत कर सकते है और एजेंट ऑटो-ऑक्सीकरण के कारण प्रकाश या दोहराया रुक-गल के लिए जोखिम के लिए किया गया है । इसलिए, और काम समाधान नियमित रूप से हर 2 से 3 सप्ताह (उपयोग की आवृत्ति के आधार पर) प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । एंजाइम तैयारी या विकार में अशुद्धियों सामान्य ROS और नध रीडिंग की तुलना में कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. एंजाइम शुद्धता जेल ट्रो द्वारा नियमित रूप से निगरानी की जानी चाहिए । काइनेटिक गुण (किमी और सब्सट्रेट और णड के लिए Vmax+) भी खरीद या एक एंजाइम की शुद्धि के बाद तुरंत मूल्यांकन किया जाना चाहिए और फिर नियमित रूप से इसके बाद नजर रखी । परख में इस्तेमाल किया एजेंट के अधिकांश स्थिर है और कई फ्रीज-गल चक्र के अधीन किया जा सकता है । पाइरूवेट और α-ketoglutarate ऑटो ऑक्सीकरण से बचने के लिए १०० µ एल में-८० डिग्री सेल्सियस के aliquots में संग्रहित किया जाना चाहिए । डीटीटी जैसे एजेंटों को कम करने का उपयोग करने से बचें क्योंकि यह फार्म ओ2●-/H22 सीधे PDHC और KGDHC (और संभावित अंय flavoenzymes)17में कट्टरपंथी गठन के माध्यम से । परख ३७ डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा सकता है; हालांकि, हमारे समूह ने पाया है कि 25 डिग्री सेल्सियस पर इन प्रयोगों का आयोजन अधिक सुसंगत डेटा प्रदान करने के लिए आदर्श है ।

तकनीक की सीमाएं:

इस तकनीक के साथ जुड़े एक प्रमुख बाधा शुद्ध फ्लेविन युक्त mitochondrial एंजाइमों के लिए उपयोग है । यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध KGDHC और PDHC का उपयोग करने के लिए प्रदर्शित करता है कि इस तकनीक को सीधे ROS रिलीज की क्षमता और फ्लेविन युक्त mitochondrial dehydrogenases की एंजाइम गतिविधि की तुलना किया जा सकता है । हालांकि, सबसे ROS उत्पादन फ्लेविन एंजाइमों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है और प्रयोगशाला में शुद्ध किया जाना चाहिए । यह इन एंजाइमों में से कुछ पर विचार चुनौतीपूर्ण हो सकता है झिल्ली बंधे या mitochondrial भीतरी झिल्ली को अवशोषित कर रहे हैं । झिल्ली के सफल शोधन के लिए नए प्रोटोकॉल-बाउंड फ्लेविन-एंजाइमों कि ROS उत्पादन अब उपलब्ध हैं । यह जटिल मैं, परिसर द्वितीय, और sn-ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज21,22,23के लिए शुद्धि तरीके शामिल हैं । इसलिए, भले ही सूचीबद्ध ROS जनरेटर के अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हो सकता है, प्रोटोकॉल उनके अलगाव और शुद्धि के लिए मौजूद हैं । शुद्ध फ्लेविन आधारित एंजाइमों का उपयोग कर एकत्र परिणामों की शारीरिक प्रासंगिकता भी एक सीमा है । इसलिए, शुद्ध एंजाइमों के साथ एकत्र निष्कर्षों अलग mitochondria या permeabilized ऊतक का उपयोग परख के साथ पालन किया जाना चाहिए । पांच अलग अध्ययन KGDHC और PDHC द्वारा ROS रिहाई के विनियमन के लिए तंत्र की जांच करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया14,16,17,19,20। ROS रिलीज को नियंत्रित करने में redox स्विच की भूमिका के लिए प्रारंभिक परिणाम शुरू में शुद्ध KGDHC और PDHC का उपयोग कर परीक्षण किया गया, और फिर विनियमन के लिए तंत्र आगे जिगर और हृदय mitochondria और मांसपेशी फाइबर में विश्लेषण किया गया14, 16,17,20.

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:

mitochondria में उत्पादन की व्यक्तिगत साइटों से ROS रिलीज को मापने प्रतिस्पर्धा पक्ष प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि यह भी उत्पादन ओ2●-/H2हे2 और एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम है कि अंयथा करने के लिए नेतृत्व कर सकते है देशी दरों का आंकलन । झिल्ली क्षमता भी विभिन्न साइटों और अवरोधकों के उपयोग से ROS रिलीज दरों में परिवर्तन कर सकते हैं इलेक्ट्रॉन प्रवाह में परिवर्तन कर सकते हैं, हे2●-/H22 गठन माप की स्थापना । यहां प्रस्तुत विधि व्यक्तिगत एंजाइमों से ROS रिलीज की क्षमता के प्रत्यक्ष मूल्यांकन जबकि एक साथ हे2●-/H2हे2 और एंजाइम गतिविधि की देशी दरों के बीच संबंधों का आकलन करने की अनुमति देता है । इस सस्ती विधि व्यक्तिगत फ्लेविन के लिए देशी ROS रिलीज दरों से युक्त mitochondrial एंजाइमों mitochondria, कोशिकाओं, या ऊतक के साथ और अधिक परिष्कृत प्रयोगों के संचालन से पहले की तुलना के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं । इसके अलावा, विधि यहां प्रस्तुत पूर्व के लिए उपयोग किया जा सकता है स्क्रीन प्रभावशीलता और ROS रिहाई के लिए अवरोधकों के selectivity अलग mitochondria के साथ परख आयोजित करने से पहले ।

भविष्य अनुप्रयोगों:

यहां प्रस्तुत विधि PDHC और KGDHC14,16,17,19,20से ROS रिलीज पर नियंत्रण की जांच के उद्देश्य से पांच अलग अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है । इन अध्ययनों में अवरोधकों की जांच की गई और ROS जारी की गई और नध के उत्पादन की दरों का उपयोग कर शुद्ध एंजाइमों का मूल्यांकन किया गया. परिणाम शुद्ध एंजाइमों के साथ एकत्र फिर पृथक mitochondria और permeabilized मांसपेशी फाइबर14,16,17,20का उपयोग कर सत्यापित किया गया । इसलिए, इस विधि mitochondria, कोशिकाओं, और मांसपेशी फाइबर से देशी ROS रिलीज दरों का अध्ययन करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययन के एक नंबर के लिए लागू किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण:

एंजाइम शुद्धता और इसकी काइनेटिक संपत्तियों पर नियमित नजर रखी जानी चाहिए. और काम कर रहे शेयर एजेंट भी अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करेगा एकत्र परिणाम संगत कर रहे हैं । एक सफल प्रयोग (तालिका 1) चलाने के लिए रिएजेंट के अतिरिक्त का क्रम महत्वपूर्ण है. अवरोधकों को ROS रिहाई के अधिकतम अवरोध को ध्यान में लाना आवश्यक एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए titrated होना चाहिए । इस अध्ययन में, हम 10 मिमी KMV और १५० µ एम सीपीआई-६१३ चुना जब से हम पहले से निर्धारित किया था कि इन सांद्रता KGDHC और PDHC द्वारा ROS रिहाई के अधिक से अधिक निषेध प्रेरित13

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (NSERC) द्वारा वित्त पोषित किया गया । वीडियो उत्पादन में नवाचार के लिए केंद्र के सहयोग से किया गया शिक्षण और अधिगम में (CITL) मेमोरियल विश्वविद्यालय में Newfoundland ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pyruvate dehydrogenase complex SIGMA P7032-10UN purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex SIGMA K1502-20UN purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution SIGMA HX0640-5 reagent, standard curves
NAD+ SIGMA N0632-1G reagent, activity/ROS release assay
NADH SIGMA N4505-100MG reagent, standard curves
pyruvate SIGMA P2256-5G reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate SIGMA 75892-25G reagent, activity/ROS release assay
CoASH SIGMA C3019-25MG reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate SIGMA C8754-1G reagent, activity/ROS release assay
mannitol SIGMA M4125-100G buffer component
Hepes SIGMA H3375-25G buffer component
sucrose SIGMA S7903-250G buffer component
EGTA SIGMA E3889-10G buffer component
KMV SIGMA 198978-5G reagent, ROS release inhibitor
CPI-613 Santa Cruz sc-482709 reagent, ROS release inhibitor
SOD SIGMA S9697-15KU reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase SIGMA P8375-1KU reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red Thermofisher A36006 reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader BioTek Instruments microplate reader for assays
Gen5 software BioTek Instruments software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism Graphpad software software, data analysis
Microsoft EXCEL Microsoft software, data analysis

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References

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