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含黄素线粒体脱氢酶同时测定超氧化物/过氧化氢和 NADH 生产

Biochemistry

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Summary

线粒体含有几种黄素依赖的酶, 可以产生活性氧 (ROS)。由于不需要的副作用, 监测线粒体中单个部位的 ROS 释放具有挑战性。我们提出了一种简单, 廉价的方法直接评估的本地率的 ROS 释放使用纯化 flavoenzymes 和微板块荧光。

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Mailloux, R. J., Young, A., O'Brien, M., Gill, R. M. Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases. J. Vis. Exp. (132), e56975, doi:10.3791/56975 (2018).

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Abstract

据报道, 线粒体可以包含多达12种酶源的活性氧 (ROS)。大多数这些网站包括黄素依赖的呼吸复合体和脱氢酶, 产生超氧化物的混合物 (O 2) 和过氧化氢 (H 2 O 2).由于抗氧化剂防御系统的存在和侧面反应, 也形成 O2/H2O2, 因此, 对孤立线粒体中单个站点的 ROS 产生潜能的准确量化可能会有挑战性。使用可破坏线粒体生物能学的非特异性抑制剂也可以通过改变其他生产场所的 ROS 释放来降低测量结果。在这里, 我们提出了一个简单的方法, 同时测量 H2O2释放和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 生产的纯化黄素链脱氢酶。为了我们的目的, 我们用纯化的丙酮酸脱氢酶复合物 (PDHC) 和αα-脱氢酶复合物 (KGDHC) 的猪心源为例。此方法允许通过消除其他潜在的 ROS 和抗氧化剂系统的来源, 精确测量本机 H2O2的发布速率。此外, 该方法还可以直接比较 H2O2释放与酶活性之间的关系, 以及筛选活性抑制剂对 ROS 生产的有效性和选择性。总的来说, 这种方法可以在进行更复杂的实验时, 对单独的线粒体或透肌纤维进行更精密的试验, 从而对个体酶的原生氧释放率进行深入评估。

Introduction

营养代谢的最终目的是使三磷酸腺苷 (ATP)。在哺乳动物细胞中, 这发生在线粒体, 双 membraned 细胞器, 将储存在碳中的能量转化为 ATP。ATP 的产生是在碳被形成两个电子载体、NADH 和黄素腺嘌呤二核苷酸 (FADH2)1的线粒体燃烧时开始的。NADH 和 FADH2分别由多亚基呼吸复合体 I 和 II 氧化, 并且被解放的电子被运到终端电子受体分子氧 (O2) 在复杂 IV1。热力学上有利的 "下坡" 转移电子到O 2 在链子的末端被结合对质子的出口入膜间隙空间由复合体 I, III 和 iv。这创造了质子的跨膜电化学梯度 (质子动力), 一种临时形式的吉布斯自由能, 被复杂的 V 挖掘, 使 ATP2。线粒体中的电子转移反应与 ATP 生产不完全耦合。在克雷布斯周期和呼吸链的不同点, 电子可以过早地与 O2相互作用, 形成 ROS3。线粒体产生的最生物相关的 ROS 为 O2和 H 2O2尽管 O2通常被认为是由线粒体形成的近端 ROS, 但现在明显的是, 生产地点形成了 O2和 H 2O2的混合物, 这与自由黄素假肢组的激进化学4,5。在高水平, ROS 可能是危险的, 破坏细胞功能所需的生物成分, 导致氧化窘迫6。然而, 在低数量, 线粒体 ROS 实现重要的信号功能。例如, 从线粒体释放的 H2O2被牵连到控制 T 细胞活化、应力信号 (例如、诱导 Nrf2 信号通路)、诱导细胞增殖和分化,胰岛素信号和释放, 和喂养行为7。在了解 ROS 信号功能方面取得了相当大的进展。然而, 对于线粒体中的酶作为最重要的来源和如何控制生产, 仍然存在重要的问题。

ROS 的释放由一个地点生产取决于几个因素: 1) 电子捐赠站点的集中, 2) 电子捐赠站点的氧化还原状态, 3) 获得氧气, 和 4) 氧化基底的浓度和类型3,8,9. 在线粒体中, 其他因素, 如 NADH 的浓度和膜电位强度也影响 ROS 生产8,10。例如, O2/H2O2生产的速率由纯化的 PDHC 或 KGDHC 增加, NADH 可用性5,11。在这种情况下, 电子从 NADH 向后流向 PDHC 或 KGDHC E3亚基中的时尚中心, O2/H2O2生产12的站点。同样, 提供的 NAD+具有相反的效果, 减少了 KGDHC12中的 ROS 释放。因此, 控制来自 ROS 生产场所的电子进入或退出可以改变多少 O2/H2O2的形成。例如, 用 CPI-613 (硫辛酸模拟) 阻止 PDHC 或 KGDHC 的 E2亚基, 在 O2/H2O2生产13中, 结果几乎减少90%。类似的结果可以获得与化学 s-glutathionylation 催化剂, 胍和双硫醒, 几乎废除O2/H2O 2 生产由 PDHC 或 KGDHC 通过共轭谷胱甘肽到 E2亚基14。通过 PDHC 和 KGDHC E2亚基阻断电子流的权衡是 NADH 产量的减少, 这降低了电子传输链 (例如, 复杂 III) 的 ROS 形成。这也可以减少电子传输链的 ATP 输出。总的来说, 阻止电子进入 ROS 生产场所可以是控制 O2/H2o2生产的高效方法。

线粒体最多可包含 12潜在 O2/H2O26。这些站点中的大多数都是黄素的酶, 它们生成了 O2和 H 2O2的混合物。使用不同的基质和抑制剂组合, 可以确定哪些呼吸复合体和线粒体脱氢酶作为高容量 O 2/H 2 O 2 形成站点在不同的组织3。PDHC 和 KGDHC 已被证明为高容量 O2/H2O2在肌肉和肝脏线粒体13,15发射站点。但是, 在检查 O2/H2O2形成线粒体中单个站点的潜力以及不同基质和抑制剂组合对其产生的影响方面仍存在一些困难酶的活性。这是由于存在不需要的副作用 (例如, 形成 O2/H2O2由非兴趣酵素以外的站点), 污染内源营养素 (例如,脂肪酸) 或细胞(例如,, 过氧化物酶体也形成O2-/H2O2), 使用缺乏选择性的抑制剂和/或使用不完全抑制 ROS 生产的化合物。某些抑制剂还能改变线粒体的生物能学和电子流的方向, 这就改变了 ROS 从其他生产场所释放出来的活性和混淆结果。o2/H2O2 从单个站点释放的绝对速率也难以量化由于 O2-和 H2o2消除基质中的酶和膜间隙空间。因此, 消除可能干扰 o2/H2O2发布测量的任何相互竞争的反应, 在识别高容量 O2/2o2 时, 都很有用。形成站点。

在这里, 我们提出一个简单的方法, 允许同时检查 O2/H2O2生产和 NADH 形成由纯化的黄素依赖脱氢酶。通过使用纯化的酶, 不需要的 ros 形成的副作用和 ros 降解酶可以消除, 允许更准确地测量本地 O2/H2o2生产率为个别 flavoenzymes。此方法可用于直接比较 o2/H2O2的不同纯化脱氢酶的形成能力, 或为 o 2-/h 2 o 筛选潜在的站点特定抑制剂。2版本。最后, 测量 O2/H2O2和 NADH 生产同时可以对酶活性与 ROS 释放能力之间的关系进行实时评估。

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Protocol

1. 化学物质和纯化酶

  1. 采购以下材料: 猪心源的 PDHC 和 KGDHC (或另一种纯化的线粒体 flavoenzyme);H2O2 (30% 解决方案), 丙酮酸、αα-、NAD+、NADH、CoASH、磷酸硫胺 (TPP)、甘露醇、HEPES、蔗糖、EGTA、3-甲基2羰基戊酸 (KMV)、超氧化物歧化酶 (SOD)、辣根过氧化物酶 (HRP)、10-乙酰基 37-dihydroxyphenoxazine 试剂 (AUR) 和 CPI-613。

2. 计划化验及试剂制备

  1. 根据96井板中的表 1设置检测。
    注: 每种反应的总容积为200µL. 调整库存浓度, 使20µL 试剂添加到每个井中。这确保了在开始试验之前, 快速添加辅助因子和基底对每个反应良好。
  2. 制备含有220毫米甘露醇、70毫米蔗糖、1毫米 EGTA 和20毫米 HEPES (pH 7.4 与 HCl) 的反应缓冲液。
    注意: 这可能会根据不同的纯化酶的物理特性而改变。
  3. 使用酶活性测定法检查纯化的 KGDHC 或 PDHC 的污染情况14,16,17或应用免疫印迹或考马斯着色5。
  4. 根据表 1中的工作溶液浓度, 准备反应缓冲器中的所有试剂。
  5. 将所有试剂贮存为1毫升整除数在-20 摄氏度。在 100-µL 整除数中储存丙酮酸和αα-, 以防止自氧化和反复冻融导致的自发降解。
  6. 在1毫升亚砜中制备 AUR 试剂, 然后在反应缓冲液中稀释至100µM。存储保护不受光照。
    注: 在这里, 100 µM 工作解决方案是新鲜的每2到3周, 并保护免受光。

3. 建立化验模板

  1. 在具有双测量能力的单色微板块阅读器上设置检测程序。
  2. 通过选择 "协议" 来定义阅读过程。然后单击 "过程"。
  3. 将 "温度" 设置为25°c (图 1A)。
  4. 单击 "启动动能" 以设置读取条件 (图 1A)。设置读取间隔/实验的时间和数量。
  5. 单击 "读取" (图 1B)。
    注: 样品从顶部的位置读取, 增益为50。时间: 5 分钟, 以30秒为间隔读取。通道 1: 试卤灵荧光激发/发射 = 565 nm:600 nm, 波长宽度 13.5 nm。通道 2: NADH 自发荧光-激发/发射 = 376 nm:450 nm, 波长宽度 20 nm。
  6. 在 "读取" 下, 选择要监视的水井 (例如、A1-A4 和 B1-B4)。
  7. 选择 "结束动能"。

4. 标准曲线

  1. 解冻试剂和储存在冰, 直到需要。
  2. NADH 标准曲线 (图 2A)
    1. 在反应缓冲液中, 为 0.5-10 毫米的浓度范围准备 NADH 的工作溶液。
    2. 将每个 NADH 工作溶液浓度的20µL 整除数添加到含有180µL 反应缓冲器的井中。NADH 在每个井中的最终浓度为0.05-1 毫米。
    3. 单击 "读取" 并设置激发/发射 = 376 nm:450 nm, 波长宽度为 20 nm。
      注意: 这是只读端点-不需要动能参数。
  3. AUR 标准曲线 (图 2B)
    1. 在反应缓冲器中制备过氧化氢的工作储存;库存浓度从 200-4, 000 nM 不等。
    2. 将反应缓冲器的120µL 添加到每个井中。
    3. 添加20µL (工作库存浓度 = 30 U/毫升, 最后集中在井 = 3 U/毫升), 20 µL SOD (工作存货集中 = 250 u/毫升, 最后集中在井 = 25 U/毫升) 和20µL AUR (工作存货集中 = 100 µM, 最后集中在井 = 10 µM) 对每个井包含反应缓冲。
    4. 将每个 H2O2工作库存解决方案的20µL 添加到每个包含缓冲区和检测试剂的井中。最终反应量为200µL, 每个井中 H2O2的最终浓度为 20-400 nM。
    5. 在25摄氏度的平板阅读器中孵化出1分钟的板材。
    6. 单击 "读取" 并设置激发/发射 = 565 nm/600 nm, 波长宽度为 13.5 nm。请注意, 这是只读端点-不需要动能参数。

5. 测量 O2/H 2 O2发布和 NADH 生产由 KGDHC 和 PDHC

  1. 有关不同试剂的添加顺序、每个工作解决方案的浓度以及每个井中添加的卷, 请参见表 1
  2. 每井加40µL 反应缓冲液。对于使用 KMV 或 CPI-613 的检测, 请在每个井中添加20µL 缓冲区。
  3. 添加20µL 的 PDHC 或 KGDHC (工作库存的 1 U/毫升, 最终浓度每井 = 0.1 U/毫升) 每个井。
  4. 孵育 PDHC 和 KGDHC 在25°c 2 分钟。
  5. 添加20µL 的 KMV (工作库存 = 100 毫米, 最终浓度 = 10 毫米) 或20µL CPI-613 (工作库存浓度 = 1.5 毫米, 最终浓度 = 150 µM) (表 2)。
    注: 如果抑制剂未用于化验, 则可排除此步骤。
  6. 孵育1分钟, 在25摄氏度。
    注: 如果抑制剂未用于化验, 则可排除此步骤。
  7. 添加20µL (工作库存浓度 = 30 单位/毫升, 最终浓度在井 = 3 单位/毫升) 和20µL 的 SOD (工作库存浓度 = 250 单位/毫升, 最终集中在井 = 25 单位/毫升) 对每个井。
  8. 添加20µL 辅酶 A (工作库存浓度 = 1 毫米, 最后集中 = 0.1 毫米), TPP 的20µL (工作存货集中 = 3 毫米, 最后集中 = 0.3 毫米) 和20µL 的 NAD+ (工作存货集中 = 10 毫米, 最后集中 = 1 毫米) 对每个 w告诉.
  9. 将 AUR 试剂从保护性锡纸覆盖物中取出, 并在每个井中加20µL。
  10. 添加20µL 丙酮酸盐 (工作存货浓度从1-100 毫米, 最后浓度为化验 = 0.1-10 毫米) 到含 PDHC 和αα-的水井 (工作库存浓度不等于1-100 毫米, 最终浓度为化验 = 0.1-10 毫米) 到含 KGDHC 的水井。
  11. 单击 "读取" 开始动态测量。

6. 数据分析

  1. 按住键盘上的 "CTRL" 按钮, 然后单击 "水井" 生成一个包含与1通道 (图 3A) 对应的所有动态测量的图表。
  2. 在不同时间点 (图 3B) 测量的相对荧光单元 (RFU) 的原始值, 单击右上角的视图图标中的 "数据"。
  3. 导出分析值 (表 3)。
  4. 单击右上方的 "图表" 下拉菜单 (图 3B) 可访问与荧光通道2关联的 RFU 值。
  5. 对通道2重复步骤6.1 到6.3。

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Representative Results

图 3A为在同时测量 H2O2和 NADH 生产过程中收集的 RFU 提供了一个具有代表性的跟踪。图 3B中描述了每个时间间隔的原始 RFU 数据。然后导出原始 RFU 数据以进行分析。通过从图 2中显示的标准曲线推断, 可以确定在 5 min 期间的每个测量间隔内形成的 NADH 和 H2O2的绝对量。在表 3中提供了此计算的一个示例。一旦确定了 KGDHC 或 PDHC 在不同时间间隔内形成的 NADH 和 H2O2的数量, 就会将值复制并输入到图形/统计软件中进行进一步分析。使用 XY 图类型分析, KGDHC 或 PDHC 形成的 NADH (µmol) 和 H2O2 (pmol) 的数量可以绘制为时间函数 (图 4A)。使用这些值, 还可以计算基板氧化过程中 NADH 和 H2O2形成的速率。如图 4B所示, KGDHC 和 PDHC 在 NADH 和 H2O2形成能力方面显示不同的特征。

一旦确定 KGDHC 和 PDHC 是酶活动的, NADH 和 H2O2的形成可以同时跟踪, ROS 释放性能和酶活性可以测量。我们选择比较 KGDHC 和 PDHC, 因为它们在基本结构上是高度同源的, 并且已被记录为 ROS 生产的高容量站点5图 5 图 6演示了 NADH 和 H2O2在基板浓度上的依赖性。PDHC 很容易饱和, 低量的基板率为 NADH 和 H2O2生产达到其最大值 0.1-0.5 毫米丙酮酸盐。另一方面, KGDHC 在 NADH 和 H2O2生产中显示增量增加, 并增加αα-(图 5)。这表明, KGDHC 和 PDHC, 虽然在基本结构高度同源, 有不同的动力学性质的条件下, 需要多少基板, 以诱导最大的 ROS 释放。图 5还演示了 H 2O2释放 KGDHC 与 NADH 生产和基板可用性密切相关。PDHC 的动力学特性不相同。KGDHC 和 PDHC 在 NADH 和 O2/H2O2形成容量时也有所不同 ( 图 6)。

通过利用同时测量 NADH 和 H2O2, 可以筛选出活性氧生产的潜在的站点特定抑制剂。这有助于确定导致 H2O2释放的最大抑制所需的抑制剂量。此外, 通过测量 NADH 的生产同时, 可以确定抑制剂作用的部位以及 ROS 的来源。以前的研究表明, αα-模拟, KMV, 是非常有效的抑制 ROS 释放从 KGDHC (≥90% 抑制)13,15。我们还表明, CPI-613, 一种硫辛酸模拟, 阻止 dihydrolipoamide 的 E2亚基 PDHC 和 KGDHC, 也可以抑制 ROS 释放从任何一个复杂的 90%13,14。KMV 和 CPI-613 的操作站点显示在图 7中。CPI-613 是含硫的分子, 因此建议富含硫醇的还原剂 (dithiothreitol;) 或蛋白质 (白蛋白) 从过程13中省略。图 7演示了 KMV 和 CPI-613 都非常有效地限制了 NADH 和 H2O2 KGDHC。同样, CPI-613 从 PDHC (图 7) 中完全取消了 H2O2发布。总的来说, 这些结果表明 KMV 和 CPI-613 是 H2O2释放的高效抑制剂, 因此可以应用于孤立线粒体的实验。这样的屏幕将是非常有益的其他潜在的 ROS 形成酶, 因为它可以直接评估不同抑制剂的有效性和选择性的纯化黄素含脱氢酶。同时测量 NADH 也有额外的好处, 允许初步鉴定的潜在来源的 ROS 在一个酶复合体。图 7提供了对 KGDHC 的催化机制的描述, 它与 PDHC 高度同源。观察到, 阻止 e1和 e2亚基 KGDHC 的 KMV 和 CPI-613 几乎完全取消了 H2O2和 NADH 生产, 证实 E3亚单位, 可能是时尚, 是 ROS 来源18. CPI-613 对 PDHC 施加了类似的影响, 确认 H2O2释放的原则站点是 E3亚基18。类似的方法也可以用于其他脱氢酶。这将需要识别抑制剂, 阻止电子流通过不同部位的酶复合体。

Figure 1
图 1: 用于检测设置的典型屏幕截图.(A) 描述为动态测量 NADH 和试卤灵荧光的变化而设置的过程。(B) 设置检测的荧光参数。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: NADH 和试卤灵荧光的典型标准曲线。曲线用于估计 NADH 和 O2/H2O2生产的速率。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 在检测期间收集的原始 RFU 数据的代表性跟踪.(A) 在检测过程中读取的每个井的曲线。通过按住 CTL 按钮并单击正在读取的每个井, 生成板视图曲线。(B) 对于数据导出, 在视图下单击数据以生成包含代表 RFU 值的表。然后单击 "电子表格导出" 按钮以导出原始结果。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 直接比较 H2 O2和 NADH KGDHC 和 PDHC 的形成速率。( A) 同时测量 H2O2和 NADH 形成 KGDHC 和 PDHC 的潜力。(B)通过 KGDHC 和 PDHC 计算 H 2O2和 NADH 组的速率。两种黄素酶对 NADH 和 ROS 的直接比较表明, KGDHC 产生的 H2O2与其较高的酶能力有关。n = 4, 意味着电子扫描电镜.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:同时测量 H2O2和 NADH 形成速率由 KGDHC 和 PDHC 氧化不同的基质浓度.荧光的变化被测量如前所述, 但最终基质浓度从0毫米到10毫米不等。此方法用于确定 H2O2释放对 KGDHC 和 PDHC 的动力学特性的依赖性。n = 4, 意味着电子扫描电镜.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: KGDHC 和 PDHC 也显示不同的 H2 O2NADH 时生成属性+级别已更改.荧光的变化是按照前面的描述进行测量的, 除了 NAD+的最终浓度从0毫米到1毫米不等。此方法用于确定 H2O2释放对 KGDHC 和 PDHC 的动力学特性的依赖性。n = 4, 意味着电子扫描电镜.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 筛选 NADH 和 H 的不同站点特定抑制剂2 O2生产.(A) 图, 描述 KGDHC 的催化循环和 KMV 和 CPI-613 的行动地点。注意, PDHC 有一个同源的催化循环, 只是 KMV 不竞争丙酮酸结合部位。E1: 丙酮酸或αα-脱氢酶, E2: dihydrolipoamide 酰基转移酶, E3: dihydrolipoamide 脱氢酶。( B) KMV 和 CPI-613 对 NADH 和 H2O2 KGDHC 和 PDHC 生产的影响。样品在 KMV (10 毫米) 或 CPI-613 (150 µM) 中 preincubated, 然后检测 NADH 和 H2O2生产。n = 4, 意味着电子扫描电镜.请单击此处查看此图的较大版本.

试剂 工作库存浓度 添加到井中的卷 最后集中在井
KGDHC 或 PDHC 1单位/毫升 20µL 0.1 个单位/毫升
超氧化物歧化酶 250个单位/毫升 20µL 25个单位/毫升
辣根过氧化物酶 30个单位/毫升 20µL 3个单位/毫升
焦磷酸硫胺 3毫米 20µL 0.3 毫米
辅酶 A 1毫米 20µL 0.1 毫米
NAD+ 10毫米 20µL 1毫米
10-乙酰基37基 dihydroxyphenoxazine 100µM 20µL 10µM
基体 1-100 毫米 20µL 0.1-10 毫米

表 1:用于度量 O 的基本协议示例2 - /小时2O2和 NADH 通过纯化的 PDH 或 KGDH 生产.由于每个试剂的20µL 添加到每一个井, 最终的体积/反应是200µL, 每个试剂的最终浓度是10倍小于库存浓度 (例如, 在反应混合物中的最终浓度的 NAD+是1毫米).请注意, 试剂应按照表中所列顺序添加到井中。

抑制剂 目标
3-甲基-2-羰基戊酸 KGDHC E1 亚基
CPI-613 羰基酸脱氢酶的 E2 亚基

表 2: 抑制剂列表及其目标.操作站点也在图 8中进行了描述。

NADH 自体荧光
PDHC KGDHC
时间 T°376450 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
0:00:04 24。4 99 99 91 88 85 82 58 88
0:00:34 24。4 128 107 99 108 81 80 77 78
0:01:04 24。4 124 128 117 139 97 88 97 76
0:01:34 24。4 146 142 129 132 91 97 84 78
0:02:04 24。4 161 153 148 146 90 107 95 88
0:02:34 24。4 171 160 156 145 97 103 111 122
0:03:04 24。4 176 176 161 169 109 120 99 116
0:03:34 24。4 186 180 179 167 118 123 121 119
0:04:04 24。4 201 182 187 183 127 124 119 131
0:04:34 24。4 225 190 195 186 136 143 124 132
0:05:04 24。4 227 227 203 197 115 143 121 143
试卤灵荧光
PDHC KGDHC
时间 T°565600 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
0:00:00 24。4 204 178 169 152 148 113 107 90
0:00:30 24。4 224 188 167 152 144 116 124 112
0:01:00 24。4 212 186 178 161 153 114 122 120
0:01:30 24。4 212 188 165 164 160 132 127 116
0:02:00 24。4 222 203 190 169 154 128 133 127
0:02:30 24。4 217 198 193 179 165 129 147 130
0:03:00 24。4 223 218 202 179 183 142 145 137
0:03:30 24。4 239 223 208 188 179 150 155 148
0:04:00 24。4 236 219 202 183 180 163 156 153
0:04:30 24。4 249 220 214 177 199 149 150 167
0:05:00 24。4 251 232 225 196 211 170 169 161

表 3: 从实验集收集的结果的电子表格视图.从实验生成的原始 RFU 值将导出到电子表格中以进行进一步分析。使用在试验之前生成的标准曲线, NADH 和 H2O2生产的速率可以在电子表格中计算。

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Discussion

该协议是有利的, 因为, 1) 它消除了任何可能干扰 H2O2检测 (, 抗氧化剂系统或其他 ROS 来源), 2) 的相互竞争的反应, 提供直接评估的本地率ros 释放的黄素线粒体脱氢酶, 3) 允许比较的本地 ros 释放率的两个或更多的纯化黄素脱氢酶, 4) 可以允许直接比较 ros 释放率和酶活性, 和 5)允许筛选活性氧释放的选择性竞争抑制剂。我们的小组和其他人在以前的出版物中使用这种方法来检查构和氧化还原信号机制在进行线粒体或透肌肉实验之前对 ROS 的调节14,16, 17,19,20

修改和疑难解答:

这个程序使用几乎所有机构都能获得的基本设备。这种方法也成本低廉, 并使用各种供应商提供的普通化学品。缓冲成分可能会因酶的性质而异--尽管我们已经发现, 在大多数应用中, 由蔗糖、HEPES、甘露醇和 EGTA 组成的基本反应缓冲剂工作良好。试卤灵荧光的原始值通常是大约 50-500 RFU 的活性氧释放酶稀释到 0.1 U/毫升。较高的 RFU 值可能表明 AUR 试剂由于暴露于光或反复冻融而自动氧化。因此, AUR 工作解决方案应例行更换每2至3周 (取决于使用频率)。在酶制剂或变性中的杂质会导致比正常的 ROS 和 NADH 读数低。酶的纯度应定期监测凝胶电泳。在对酶的购买或纯化后, 还应立即评估动力学特性 (Vmax 和基板的公里和底物和 NAD+), 然后在其后例行监测。该化验中使用的大多数试剂都是稳定的, 可以经受多次冻融循环。丙酮酸和αα-应存储在-80 摄氏度的100µL 的整除数, 以避免自动氧化。避免使用像德勤这样的还原代理, 因为它形成 O2/H2O2直接通过 PDHC 和 KGDHC (和潜在其他 flavoenzymes)17中的根本形成。测定可进行37摄氏度;然而, 我们小组发现, 进行这些实验在25°c 是理想的提供更一致的数据。

技术的局限性:

与此技术相关的一个主要障碍是获得纯化的含黄素线粒体酶。在这里, 我们使用商用 KGDHC 和 PDHC 证明, 这一技术可以用来直接比较的 ROS 释放能力和酶活性的黄素线粒体脱氢酶。然而, 大多数产生含黄素酶的 ROS 在商业上是不可用的, 必须在实验室中进行纯化。这可能是一个挑战, 考虑到这些酶是膜约束或吸收到线粒体内膜。新的协议, 以成功纯化膜束缚黄素酶, 产生 ROS 现在可用。这包括对复杂 I、复杂 II 和sn-glycerol-3-phosphate 脱氢酶21,22,23的净化方法。因此, 尽管大多数列出的 ROS 发生器可能不具备商业用途, 但它们的隔离和纯化也存在协议。用纯化的黄素酶收集的结果的生理相关性也是一个局限性。因此, 用纯化酶收集的研究结果应遵循使用分离的线粒体或透组织的化验。五单独的研究使用此方法调查 KGDHC 和 PDHC14,16,17,19,20管理 ROS 释放的机制。初步研究了氧化还原开关在控制 ROS 释放中的作用, 采用纯化的 KGDHC 和 PDHC, 并进一步分析了肝、心肌线粒体和肌纤维的调节机制14, 16,17,20

对于现有方法的意义:

测量线粒体中的单个生产部位的 ROS 释放可能会有挑战性, 因为同时产生 O2/H2o2和抗氧化剂系统可能导致低估了本地利率。膜电位也可以改变不同部位的 ROS 释放速率, 使用抑制剂可以改变电子流, 混杂 O2/H2O2地层测量。这里提出的方法可以直接评估单个酶的 ROS 释放能力, 同时评估 O2/H2O2和酶活性之间的关系。这种廉价的方法可以作为一个工具, 以比较的本地 ROS 释放率的个别黄素线粒体酶之前进行更复杂的实验, 线粒体, 细胞, 或组织。此外, 本文提出的方法可以用于预筛活性抑制剂的有效性和选择性, 在进行化验之前, 孤立的线粒体。

未来应用:

本文所介绍的方法已用于五项独立研究, 目的是调查 PDHC 和 KGDHC1416171920对 ROS 释放的控制。在这些研究中, 筛选抑制剂和 ROS 释放和 NADH 产生率的评价使用纯化酶。然后用分离的线粒体和透肌纤维 (14,16,17,20)验证纯化酶的结果。因此, 这种方法可以应用到一些未来的研究, 旨在研究当地的 ROS 释放率从线粒体, 细胞和肌肉纤维。

议定书中的关键步骤:

应定期监测酶的纯度及其动力学特性。AUR 工作库存试剂也应经常更换。这将确保收集的结果是一致的。添加试剂的顺序对于运行成功的实验 (表 1) 至关重要。抑制剂应滴定, 以确定所需的浓度, 以获得最大的抑制 ROS 释放。在这项研究中, 我们选择了10毫米 KMV 和150µM CPI-613, 因为我们以前已经确定这些浓度诱导最大抑制 ROS 释放的 KGDHC 和 PDHC13

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Disclosures

没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会 (NSERC) 资助。视频制作是与纽芬兰纪念大学教与学创新中心 (CITL) 合作进行的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pyruvate dehydrogenase complex SIGMA P7032-10UN purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex SIGMA K1502-20UN purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution SIGMA HX0640-5 reagent, standard curves
NAD+ SIGMA N0632-1G reagent, activity/ROS release assay
NADH SIGMA N4505-100MG reagent, standard curves
pyruvate SIGMA P2256-5G reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate SIGMA 75892-25G reagent, activity/ROS release assay
CoASH SIGMA C3019-25MG reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate SIGMA C8754-1G reagent, activity/ROS release assay
mannitol SIGMA M4125-100G buffer component
Hepes SIGMA H3375-25G buffer component
sucrose SIGMA S7903-250G buffer component
EGTA SIGMA E3889-10G buffer component
KMV SIGMA 198978-5G reagent, ROS release inhibitor
CPI-613 Santa Cruz sc-482709 reagent, ROS release inhibitor
SOD SIGMA S9697-15KU reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase SIGMA P8375-1KU reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red Thermofisher A36006 reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader BioTek Instruments microplate reader for assays
Gen5 software BioTek Instruments software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism Graphpad software software, data analysis
Microsoft EXCEL Microsoft software, data analysis

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References

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