Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

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Immunology and Infection

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Summary

Infecção de tecidos humanos com vírus de imunodeficiência humana (HIV) ex vivo fornece um valioso modelo 3D da patogênese do vírus. Aqui, descrevemos um protocolo para processar e infectar amostras de tecido da amígdalas humanas e mucosa genital feminina com HIV-1 e mantê-las em cultura em uma interface líquido-ar.

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Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (140), e57013, doi:10.3791/57013 (2018).

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Abstract

Histocultures permitem estudar interações intercelulares nos tecidos humanos, e eles podem ser empregados para interações patógeno-hospedeiro de modelo sob condições controladas de laboratório. Infecção ex vivo de tecidos humanos com vírus da imunodeficiência humana (HIV), entre outros vírus, tem sido utilizada com sucesso para investigar a patogênese precoce de doença, bem como uma plataforma para testar a eficácia e a toxicidade de medicamentos antivirais. No presente protocolo, vamos explicar como processar e infectar com o HIV-1 explantes de tecido humanas amígdalas e mucosa cervical e mantê-las em cultura em cima de esponjas de gelatina em uma interface líquido-ar por duas semanas. Esta definição de cultura não-polarizado maximiza o acesso aos nutrientes em meio de cultura e de oxigénio, embora progressiva perda da integridade do tecido e arquiteturas funcionais continua a ser sua principal limitação. Este método permite monitorar a replicação do HIV-1 e patogênese usando várias técnicas, incluindo os imunoensaios qPCR e citometria de fluxo. De importância, a variabilidade fisiológica entre doadores de tecidos, bem como entre explantes de áreas diferentes da mesma amostra, pode afetar significativamente os resultados experimentais. Para garantir a reprodutibilidade do resultado, é fundamental usar um número adequado de explantes, repetições de técnicas e condições de controle de doador compatível para normalizar os resultados dos tratamentos experimentais quando compilando dados de experimentos múltiplos (por exemplo ., conduzido usando tecidos de doadores diferentes) para análise estatística.

Introduction

Culturas de células bi-dimensional monotípico, aqui referidas como convencional, não em conta a comunicação funcional e espacial entre a grande variedade de tipos de células que compõem os tecidos e órgãos. Este aspecto é de suma importância para modelos experimentais da doença, como interferência com interações intercelulares homeostáticas é o fator determinante de todas as patologias. Explantes de tecido oferecem grandes vantagens para a modelagem de saúde e doença em seres humanos porque retêm o cytoarchitecture e muitos importantes aspectos funcionais dos órgãos, como eles estão em vivo, apesar de uma quantidade limitada de tempo1. Por exemplo, sobre o desafio de ex vivo com antígenos de recordação, como toxoides da difteria ou toxoide tetânico, tecido tonsilar responde com uma vigorosa produção de anticorpos antígeno-específicos2. Como qualquer outro ex vivo modelo, histoculture tem suas próprias limitações: variabilidade inter doador, polarização de tecido, sobrevivência de tecido limitada e dificuldade no acompanhamento células além da profundidade da microscopia confocal1. Não obstante, explantes de tecido humano continuam a ser um modelo de escolha para estudar processos imunológicos homeostáticos e patogênicos em humanos, incluindo interações patógeno-hospedeiro e possíveis intervenções terapêuticas3.

Os eventos críticos de patogênese do HIV-1 realizam-se nos tecidos. Infecção da mucosa genital é responsável pela maioria de todos os HIV-1 transmissão eventos em todo o mundo4. Tecido linfoide é o maior site de replicação de vírus durante a infecção aguda e abriga uma piscina significativa de células Latentemente infectadas5, e sua persistência constitui o principal obstáculo para alcançar uma cura6. O desafio de cultura e ex vivo dos tecidos linfoides e mucosa humanos oferecem algumas vantagens sobre os sistemas convencionais baseados em células isoladas para o estudo do HIV-1. Por exemplo, células do tecido-residente podem oferecer suporte a infecção HIV-1 na ausência de ativação exógena, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico1. A utilização de tecido linfoide explantes permitiu uma melhor compreensão de alguns mecanismos chaves subjacentes T CD4 celular depleçãoou seja, o espectador efeito7, qual é a marca da infecção aguda. A preservação de estruturas como folículos de células B no tecido linfoide8 e o epitélio na mucosa genital feminina explantes9 oferece a oportunidade única de integrar características espaciais e funcionais da infecção de HIV-1 nesses locais. Finalmente, histocultures foram usados com sucesso para o modelo e estudo de10,co-infecção HIV-1 e herpesvírus11, bem como para testes pré-clínicos de anti-retrovirais e multitarget microbicidas12, 13 , 14 , 15.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura do tecido humano explantes obtidos de amígdalas e tecido da mucosa do trato genital feminino inferior (colo do útero), cobrindo a dissecção de tecidos para explant desafio com HIV-1 em uma maneira não-polarizado. A cultura do tecido de explantes na interface líquido-ar, utilizando esponjas de gelatina como suporte, maximiza a exposição para o oxigênio do ar, proporcionando acesso aos nutrientes do meio de cultura através da esponja capilares, atrasando assim sua deterioração natural. A maneira mais imediata de avaliar a replicação do HIV-1 em nosso sistema é medir a quantidade de vírus lançado em meio de cultura de explant ao longo do tempo por imunoensaio ou qPCR. Infecção de HIV-1 e patogênese (EG., depleção de células T CD4) também pode ser avaliada em explantes de tecido pelo volume de extração de RNA/DNA e qPCR, em situ coloração ou célula única-análise mediante digestão do tecido por citometria de fluxo.

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Protocol

O protocolo para a coleção de tecidos humanos pode requerer a aprovação ética pelas autoridades locais competentes. Em caso de cirurgias indicadas como amigdalectomia e histerectomia, as amostras não são recolhidas especificamente para finalidade de pesquisa e o estudo não é considerado pesquisa seres humanos (National Institutes of Health. Pesquisa em seres humanos. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). No entanto, obtenção de dados pessoais e médicos de doadores para tecido (EG., sexo, idade, atual uso de drogas, história de infecções, etc.) que podem ajudar a interpretar resultados experimentais, poses preocupações sobre consentimento informado e privacidade que deve ser abordadas no protocolo para coleta de tecido.

Cuidado: Todo o procedimento deve ser realizado em uma câmara de segurança biológica. Todos os espécimes humanos, incluindo os de indivíduos 'saudáveis', podem abrigar de agentes infecciosos. O operador deve receber formação para trabalhar com sangue patógenos com segurança, lidar com amostras de tecido, mesmo que as experiências não envolvem o uso de HIV. Uma avaliação de risco do processo de dissecção de tecidos e infecção pelo HIV deve ser executada por pessoal treinado para garantir a segurança do operador e colegas de trabalho. O uso de infecciosa HIV requer ambientes de nível 2 ou 3 de biossegurança dedicado dependendo do país e normas específicas do Instituto em substâncias biológicas perigosas e patógenos transmitidos pelo sangue.

1. preparação de esponjas de gelatina

Nota: Embora não seja estritamente necessário para preparar esponjas de gelatina antes de dissecção de tecidos, é mais conveniente seguir a ordem descrita aqui, especialmente quando manipular uma grande quantidade de tecido e/ou de vários doadores.

  1. Preparar o meio de cultura (CM) e completá-lo com solução antibiótica (mistura de Tircacillin-Clavulanato) antes do uso para fazer o CMT (Tabela de materiais). Descarte qualquer sobra solução antibiótica.
    Nota: Ticarcillin e clavulanato no CMT são mal estáveis. Se necessário, re-suplemento CMT com solução antibiótica após cerca de 24 horas de preparação. Ele não é necessário adicionar solução antibiótica para explant médio cada 24 h durante a cultura.
  2. Encha uma 100 x 20 mm placa de Petri com cerca de 20 a 30 mL de CMT.
    Nota: Esta configuração é ideal para preparar suficiente esponjas de gelatina para duas placas de 6 boas ou uma placa de 12 no momento. Se muitas placas forem necessárias, use um mais amplo de Petri e maior volume CMT para acelerar a preparação.
  3. Transferi o sponge(s) de gelatina para o prato de Petri usando Pinças esterilizadas. Molhar as esponjas em ambos os lados e permitir que as esponjas absorver médio para 1 min. Pressione as esponjas contra a parte inferior da caixa de Petri para cerca de 2 min, usando uma espátula estéril.
    Nota: Este passo é fundamental porque a presença de bolhas de ar na esponja irá bloquear os capilares através dos quais nutrientes do meio de cultura atingir o tecido. Esponjas de gelatina são extremamente frágeis quando desidratado. Empurre suavemente para baixo sobre a esponja com a espátula, especialmente no início, para evitar quebrar a esponja.
  4. Uso estéril tesoura para cortar as esponjas rehidratado gelatina em pedaços de tamanho igual de cerca de 1 cm2. Transferi 1 pedaço de esponja usando fórceps em cada poço de uma placa de cultura. Adicione 3-4 mL de CMT em cada poço de uma placa de 6 (amígdalas) e 1 mL por bem em uma placa de 12 (colo do útero). Coloca as placas na incubadora, definida em 37 ° C, 5% de CO2, ≥ 90% umidade, até que os explantes de tecido estão prontos para ser carregado sobre as esponjas.
    Nota: O volume do CMT para adicionar a placa deve ser ajustada para a espessura da esponja para manter os explantes em uma interface líquido-ar.

2. dissecação de tecido tonsilar humano

Nota: As amígdalas devem ser processadas logo que possível após a cirurgia, idealmente no mesmo dia da cirurgia. Alternativamente, as amostras podem ser deixadas CMT submerso em uma noite a 4 ° C.

  1. Permitir que o CM tempo suficiente para atingir a temperatura (RT) ou colocá-lo num banho de água pré aquecido a 37 ° C. Complementar o CM com solução antibiótica (CMT) antes do uso. Descarte qualquer solução antibiótica que sobraram. Despeje a solução de etanol 70% em um recipiente limpo para embeber a pinça e bisturi, sempre que necessário durante o processo de dissecação. Limpar as ferramentas e mudar a lâmina de bisturi entre as dissecções dos espécimes provenientes de doadores diferentes.
  2. Transferi as amígdalas do contêiner de transporte para um 100 mm-placa de Petri contendo 10-20 mL de CMT usando Pinças esterilizadas.
    Nota: As amostras com áreas generalizadas de cauterizada, sangrento, ou tecido necrótico deve ser descartada.
  3. Use a tampa da caixa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido. Segurando o tecido suavemente com a pinça, corte cada tonsila em vários pedaços grandes usando lâminas e bisturi estéril.
    Atenção: A manipulação de ferramentas afiadas para dissecar espécimes humanos aumenta o risco de ferimentos e contaminação. O operador deve considerar usar metal, malha, luvas resistentes a corte como proteção adicional.
  4. Remover cauterizada, sangrento e tecido Fibroide e quaisquer partes que contenham tonsilólitos (material calcificada) e/ou com cor verde-acastanhado usando pinças e bisturi.
    Nota: Enquanto estiver trabalhando com um pedaço de tecido, é importante manter o resto do tecido submergido num meio para evitar a dessecação do tecido.
  5. Corte cada pedaço de tecido em fatias de cerca de 2 mm de espessura. Remova qualquer parte indesejado como na etapa anterior. Corte as fatias de tecido em tiras de 2 mm de espessura. Corte as tiras de tecido em blocos de 2 mm de espessura. Isto deve resultar em explantes de tecido de aproximadamente 8 mm3.
  6. Transferi os explantes para um novo 100 mm placa de Petri contendo 10 – 20 mL de CMT para evitar a dessecação do tecido enquanto prosseguir com a dissecação. No final de dissecação, agite a placa para randomizar a distribuição do explante. Lugar 9 tecido explants em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 6 usando fórceps, permitindo que o espaço entre eles. Entregue as chapas para a incubadora.
    Nota: Normalmente, explantes são cultivados durante a noite e a inoculação de culturas com HIV-1 é realizada no dia seguinte. Isto é ter a certeza de que não há contaminação bacteriana ou fúngica, desenvolve-se na cultura. Além disso, as células tendem a saída tecido tonsilar explantes após a dissecação. Esse processo é concluído em grande parte dentro as primeiras 24 horas de cultura1.
  7. Elimine todos os resíduos biológicos em recipientes apropriados de acordo com regulamentos do Instituto na manipulação de substâncias biológicas perigosas e a avaliação de risco específico.

3. infecção do tecido tonsilar Explants com HIV-1

Nota: Para reduzir a variabilidade do resultado entre experimentos independentes, a mesma preparação de vírus deve ser usada para um estudo inteiro. Vírus podem ser propagados em células mononucleares de sangue periférico exogenamente ativado e então a sobrenadante de cultura pode ser aliquotada para armazenamento a-80 ° C para evitar repetidos congelamentos e descongelamentos (Tabela de materiais).

  1. Colocar o CM num banho de água pré aquecido a 37 ° C. Complementar o CM com solução antibiótica (CMT) antes do uso. Descarte qualquer sobra solução antibiótica.
  2. Aspire o meio na s 6-poços com uma pipeta e descartá-lo em um recipiente com solução desinfectante. Incline o prato e empurre suavemente as esponjas de gelatina para a parte superior do poço para permitir que a médio e a reunir-se na parte inferior e aspirar e descartá-lo. Adicione 3-4 mL de CMT a cada poço.
  3. Descongelar a preparação do vírus HIV-1 em banho-maria a 37 ° C. Se necessário, dilua o estoque de vírus com CM (tabela 1).
    Nota: O estoque de vírus deve ser diluído para que o inóculo selecionado está contido em um volume de 5 – 8 µ. L (tabela 1). Para uma infecção eficiente, é fundamental usar o tempo mínimo necessário entre a descongelar a preparação de HIV-1 e infectar o tecido explantes.
  4. Pipete o inóculo de vírus diretamente em cima de cada um das 9 explantes em uma esponja de gelatina. Retorne as placas para a incubadora, assim como a infecção é concluída. Descarte qualquer preparação vírus residual. Continue a seção 5.
    Nota: Para fornecer com precisão o inóculo de vírus o operador deve considerar usando uma técnica de pipetagem reversa e alterando a ponta para cada poço. Isto envolve empurrando o pistão de pipeta para a posição de purga (segunda paragem) para elaborar a inoculação do vírus, e empurrando para a primeira parada para entregar o inóculo, que ajuda a minimizar formação de bolhas e o erro associado com amostragem repetida de pequenos volumes, ou seja, 5 – 8 µ l.

4. dissecção e infecção da Mucosa Cervical uterina

Nota: Para obter melhores resultados, explantes de mucosa cervical devem ser processadas e infectados, logo que possível após a cirurgia, idealmente no mesmo dia da cirurgia. Alternativamente, espécimes podem ser armazenados submerso em CMT a 4 ° C durante a noite e infectados imediatamente após a dissecação.

  1. Permitir que o CM tempo suficiente para chegar a RT ou colocá-lo num banho de água pré aquecido a 37 ° C. Complementar o CM com solução antibiótica (CMT) antes do uso. Descarte qualquer sobra solução antibiótica. Despeje a solução de etanol 70% em um recipiente limpo para embeber a pinça e bisturi, sempre que necessário durante o processo de dissecação. Limpar as ferramentas e mudar a lâmina de bisturi entre as dissecções dos espécimes de vários doadores.
  2. Usando a pinça estéril, transferi a amostra proveniente do recipiente de transporte em uma placa de Petri contendo 10 – 20 mL de CMT de 100mm.
  3. Use a tampa da caixa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido. Segurando o tecido suavemente com fórceps, separar a mucosa do ectocérvice e endocérvice / o por baixo do estroma e tiras de tecido muscular (submucosa) com um bisturi e lâmina para obter da mucosa.
    Nota: Enquanto estiver trabalhando com um pedaço de tecido, é importante manter o resto do tecido submergido num meio para evitar a dessecação do tecido.
  4. Corte a mucosa em tiras de 2 mm de largura, remova e descarte tanto submucosa possível, deixando apenas um camada 2 mm de espessura do tecido. Corte as tiras em blocos de 2 mm de espessura. Isto deve resultar em explantes de tecido de aproximadamente 8 mm3.
    Atenção: A manipulação de ferramentas afiadas para dissecar espécimes humanos aumenta o risco de ferimentos e contaminação. O operador deve considerar usar metal, malha, luvas resistentes a corte como proteção adicional.
  5. Explantes de tecido de transferência para uma nova placa de Petri 100 mm contendo 10 – 20 mL de CMT para evitar a dessecação do tecido enquanto prosseguir com a dissecação. No final de dissecação, agite a placa para randomizar a distribuição do explante.
  6. Com pinça estéril, transferi os explantes estéril 1,5 mL tubos cónicos (máximos 16 explantes por tubo). Remova qualquer meio no tubo com uma pipeta.
  7. Descongelar a preparação de HIV-1 em um banho-maria a 37 ° C. Se necessário, dilua o estoque de vírus com CM. transferência do vírus para os tubos contendo os explantes. Descarte qualquer preparação vírus residual.
    Nota: O estoque de vírus deve ser diluído para que o inóculo selecionado está contido em um volume mínimo 0,5 ml (tabela 1). Para reduzir a variabilidade do resultado entre experimentos independentes, a mesma preparação de vírus deve ser usada para um estudo inteiro (Tabela de materiais).
  8. Transferir os tubos em um thermo-shaker e incubar durante 2 h a 37 ° C, balançando a 300 rpm. Inverta suavemente os tubos algumas vezes a cada 30-60 min.
    Nota: Para uma infecção eficiente, é fundamental usar o tempo mínimo necessário entre a descongelar a preparação de HIV-1 e transferir os tubos para 37 ° C.
  9. Preencha uma placa de 6 com 3 – 4 mL por poço da solução salina tampão de fosfato estéril (PBS). No de incubação com HIV-1, elimine toda preparação de vírus nos tubos em um recipiente com solução desinfectante, usando uma pipeta. Transferi os explantes para a placa de 6 contendo PBS usando fórceps.
  10. Permitir que os explantes descansar em PBS por 1 min em RT e então lavá-los suavemente pipetando altos e baixos da PBS dentro do poço 2 - 3 vezes. Descarte a PBS em um recipiente com solução desinfectante, usando uma pipeta. Adicione 3-4 mL de PBS nova a cada poço. Repita mais duas vezes para um total de três lavagens. Descarte a PBS apenas antes de transferir os explantes para as esponjas para evitar a dessecação do tecido.
    Nota: Explantes de mucosa cervical e em particular endocérvice, liberar grandes quantidades de muco durante a infecção. É fundamental lavar e remover tanto muco quanto possível, porque retenção inespecíficas sobre explantes e posterior liberação do vírus em sobrenadante de cultura pode mascarar a replicação do vírus.
  11. Usando fórceps, transferência de 5-8 explantes em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 12. Devolve a chapa para a incubadora.
  12. Elimine todos os resíduos biológicos em recipientes apropriados de acordo com regulamentos do Instituto na manipulação de substâncias biológicas perigosas e a avaliação de risco específico.

5. Histoculture

  1. Mude o CM a cada 3 dias a partir do momento da infecção até dia pós infecção 12 – 15. O CM e/ou explantes podem ser degustadas em intervalos regulares ao longo do tempo de cultura para avaliar a replicação do HIV-1, entre outros parâmetros.
  2. Colocar o CM num banho de água pré aquecido a 37 ° C.
    Nota: Não é necessário para complementar o CM com solução antibiótica nesta fase.
  3. Recolher uma amostra de CM, com uma pipeta e transferi-lo para estéril 1,5 ou 2 mL tampa de rosca tubos para armazenamento a-80 ° C.
    Nota: O CM de replicar poços são agrupados na coleção.
  4. Colher os tecido explantes com pinça estéril, remover o excesso de meio de explantes, colocando-os em um pedaço de papel (opcional) e transferir explantes em estéril 1,5 ou 2 mL tampa de rosca tubos. Processar ou armazenar as amostras de tecido, conforme exigido pela experiência.
    Nota: Para citometria de fluxo, explantes imediatamente são digeridos com um coquetel enzimático para obter uma suspensão de célula única (para mais detalhes consulte as referências 1, 9, 16 e 17). Para a extração de RNA, explantes são mantidos em uma solução de estabilização de RNA a 4 ° C durante a noite antes de armazená-los a-80 ° C. Para extração de DNA ou em situ coloração (colo do útero), explantes podem ser snap-congelado no chorume líquido de nitrogênio ou gelo seco/etanol e armazenados a-80 ° C. Alternativamente, explantes das amígdalas podem ser corrigidos por submersão em uma solução de paraformaldeído PBS e 4% para em situ coloração.
  5. Aspirar o CM residual no poço com uma pipeta e descartá-lo em um recipiente com solução desinfectante. Incline o prato e empurre suavemente as esponjas de gelatina para a parte superior do poço para permitir que o meio reunir-se na parte inferior e em seguida, Aspire e descartá-lo.
  6. Adicione 3-4 mL de CM a cada poço. Usando a pinça estéril, retorne que qualquer tecido explants que caiu a médio e a esponja de gelatina. Devolve a chapa para a incubadora.
  7. No final da cultura, elimine todos os resíduos biológicos em recipientes apropriados de acordo com regulamentos do Instituto na manipulação de substâncias biológicas perigosas e a avaliação de risco específico.

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Representative Results

Várias técnicas podem ser usadas para avaliar a replicação do HIV-1 em explantes de tecido. Nossa leitura padrão é medir a quantidade de HIV-1 p24amordaçar lançado em CM ao longo do tempo com um imunoensaio18.

Explantes de tecidos provenientes de doadores diferentes, infectados com o mesmo inóculo do mesmo estoque de HIV-1, podem produzir quantidades diferentes de vírus (tabela 1). Isto é devido a vários fatores, tais como o número e status de HIV-1 nas células-alvo e a presença de co, infectando patógenos no tecido16,19. Na Figura 1, nós fornecemos um exemplo de infecção de HIV-1 abortivo e produtivo dos explantes de mucosa cervical, conforme definido pela quantidade de p24amordaçar lançado em CM em relação ao doador-combinadas explantes tratados com a droga de antiretroviral lamivudina (3TC) que suprime completamente a replicação do HIV-1. Embora este controle parece supérfluo para infecção de explantes de tecido do doador na, ajuda em discriminar abortivo (B) a partir de infecção produtiva (C) em explantes que rendem baixos níveis de replicação do HIV-1.

O uso de um medicamento anti-retroviral como uma condição de controle pode ser útil para estudar a infecção de HIV-1 em tecidos que abrigam o baixo número de células-alvo, como a mucosa do colo do útero e ao usar variantes HIV-1 lento-replicação, como alguns isolados primários. Além disso, para os tecidos infectados com esses vírus, é importante considerar o uso de métodos de detecção mais sensíveis, por exemplo qPCR.

Figure 1
Figura 1 : Replicação do HIV-1 em mucosa cervical explants de três doadores de tecido diferente. Tecido cervical explantes foram infectados com o mesmo inóculo de HIV-1BaL por submersão em estoque de vírus e cultivadas por 15 dias na presença ou ausência da droga de antiretroviral lamivudina (3TC) na concentração de 10 µM. meio de cultura foi amostrado cada 3 dias e amostras de poços replicar foram agrupadas na coleção para análise de replicação do HIV-1 por HIV-1 p24amordaçar imunoensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de tecido Vírus Inóculo por explante (pg de HIV-1 p24mordaça) Não. de explantes Volume de meio de cultura (mL) Não. dos poços (técnica Replica) Produção degag p24 do HIV-1 (ng/mL)
Tonsilar HIV-1BaL 350-500 9 3-4 2 – 3 1 – 10
HIV-1LAI.04 9 3-4 2 – 3 1 – 100
Do colo do útero HIV-1BaL 1.500-2.000 8 1 2 1 – 5
HIV-1LAI.04 8 1 2 indetectável

Tabela 1: valores de HIV-1 de inóculo para a infecção do tecido explantes e produção de vírus de referência. O valor de inóculo de HIV-1 por explante tecido individual refere-se aos estoques de vírus na concentração de 50-70 ng/mL: um volume de 7 µ l de estoque de vírus não diluído é usado para infectar cada explante tonsilar em cima de uma esponja de gelatina; um volume de 500 µ l do estoque de vírus não diluído é usado para infectar 16 explantes cervicais por submersão em um tubo de 1,5 mL. Explantes cervicais são extensivamente lavadas em PBS antes de transferi-los para esponjas de gelatina. O valor da produção do HIV-1 por tecido explantes refere-se a quantidade cumulativa de p24amordaçar lançado por 8 explantes em 1 mL (colo do útero), ou 9 explantes em 3-4 mL (amígdalas) do meio de cultura (CM) amostrado em 3 dias, mais de 12-15 dias de cultura. CM de replicar poços é agrupado na coleção para cada ponto de tempo antes de substituí-lo com CM fresco. O valor da concentração degag p24 medido no dia 3 foi excluído da análise porque é parcialmente responsável por absorção de vírus em explantes e posterior liberação em CM, ou seja, reporte de inóculo. Normalmente, a infecção do tecido cervical com HIV-1LAI.04 não conduz a replicação de HIV-1 detectável em nosso sistema experimental16.

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Discussion

A utilização de tecido humano explants para o estudo da infecção por HIV-1 fornece vantagens sobre os tradicionais sistemas experimentais bi-dimensional e a única espécie, tais como as células primárias ou linhas de células, devido a sua superior capacidade de reproduzir interações intercelulares e celular as funções (por exemplo, produção de citocinas) como eles são na vivo. No entanto, o tecido tonsilar e cervical diferem em muitos aspectos, incluindo o número e características fenotípicas e funcionais de HIV alvo células1,16. Pela mesma razão, as variantes do HIV-1 com tropismo do receptor co diferentes (por exemplo, CCR5-Trópico HIV-1BaL versus CXCR4-Trópico HIV-1LAI.04) executam diferente tanto nas amígdalas e colo do útero (tabela 1). A distribuição de coreceptors HIV em células-alvo no imunológico indutivo e efetoras sites apenas parcialmente contas para local susceptibilidade à infecção: células T CD4 carregando CXCR4 são mais abundantes do que as células CCR5-expressando no tecido tonsilar, assim explicando os mais elevados níveis de replicação do HIV-1LAI.04 do HIV-1BaL, mas os receptores são igualmente representados no mucosa cervical16. No entanto, raramente detectamos a replicação de vírus produtivo no tecido cervical desafiado com HIV-1LAI.04, que está em consonância com a transmissão preferencial das variantes de HIV-1 CCR5-tropic individuais observada na vivo20 . Isto sugere que o status de ativação e diferenciação de HIV-1 nas células-alvo, em última análise pode determinar sua capacidade de suporte de replicação do HIV-116.

Esponjas de gelatina são dispositivos hemostáticos obtidos de pele suína purificada (colágeno), que são projetados para ser completamente absorvido pelo corpo humano depois de algumas semanas. Nós recomendamos usar produtos que mostram a taxa de degradação lenta na cultura como eles melhor se adaptar a finalidade da manutenção de explantes de tecido em uma interface líquido-ar durante 2-3 semanas. Também recomendamos que teste diferentes lotes do mesmo produto para avaliar o desempenho consistente na cultura do explante.

Da mesma forma, o tipo e o monte de soro fetal bovino (FBS) podem afetar os níveis de replicação do HIV-1. Aconselhamos testar vários lotes de FBS para otimização de CM e usar o mesmo lote de FBS para um estudo inteiro. Nós rotineiramente testes FBS explantes de tecido de 10 doadores e selecione o lote que dá a maior replicação do HIV-1.

Para a maioria das experiências, dividimos explantes de endocérvice e ectocérvice para maximizar o número de condições experimentais. Se pode considerar que mantê-los separados por causa de suas diferentes características estruturais e imunológica21. Além disso, endocervical explants lançamento e continuam a produzir uma grande quantidade de muco na cultura que pode interferir com a análise a jusante. Visto que a área coberta pelo endocérvice é muito menor do que a ectocérvice, é difícil conduzir experimentos de infecção do HIV exclusivamente na mucosa endocervical usando um adequado número de explantes e técnica Replica.

Realizando a infecção HIV-1 por submersão de explantes cervicais maximiza as chances de obter uma infecção produtiva devido ao menor número de células T CD4 presentes na mucosa em comparação com o tecido linfoide. Pela mesma razão, o tecido cervical é mais sensível para armazenamento durante a noite e produz maior replicação do HIV-1 quando infectado logo após a cirurgia e imediatamente após a dissecação. Embora a infecção por submersão em estoque de vírus pode ser realizada também para tecido tonsilar assegurar exposição uniforme de explantes ao vírus, esta abordagem implica maior perda de célula e manipulação do tecido do que infecção de explantes em esponjas de gelatina conforme descrito no protocolo.

Polarizada sistemas de desafio de HIV-1 e cultura de tecidos da mucosa existem e são atualmente utilizados em outros laboratórios3,22,23,24,25. Embora estes sistemas são um modelo valioso de entrada do HIV-1 e penetração na mucosa, sua criação é geralmente mais demorada e pode exigir manipulação extensa de tecido. Modelos não polarizado de transmissão/patogênese da mucosa ainda oferecem uma plataforma válida para investigar a regulação da replicação do HIV-1 e a associação local de células infectadas com HIV por fatores endógenos e exógenos9,17 , 26, incluindo drogas12,13,14,15.

Variabilidade inter doador pode representar um grande problema para a reprodutibilidade de resultados entre experimentos independentes realizados utilizando amostras de vários doadores. Variabilidade na composição celular também pode afetar áreas dentro do mesmo modelo, ou seja, variabilidade intradoador. Para reduzir a variabilidade e interpretar corretamente os resultados, é fundamental para criar todas as condições dentro de um experimento usando um número adequado de explantes obtidos do mesmo doador (condições de doador-combinadas). Resultados podem ser normalizados para um controle interno quando compilando dados de vários experimentos para análise estatística. Para reduzir a variabilidade intradoador, recomendamos incluindo pelo menos 2 técnicas repetições para cada condição experimental, para um total de 18 explantes de tecido tonsilar (9/bem) e 10-16 explantes de mucosa cervical (bem/5-8) (tabela 1). A disponibilidade de registros médicos e a inclusão de análise adicional de material paciente e/ou condições experimentais, por exemplo, para o endereço o status inflamatório de um espécime, podem melhorar significativamente a interpretação do resultado (ver referência 9 para um exemplo).

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), a Fundação sueca médicos contra a AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) e da Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) para Andrea Introini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge  Pfizer NDC:  0009-0315-08 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge Ferrosan Medical Devices MS0002 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine ThermoFisher Scientific 21875034 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) ThermoFisher Scientific 11140035 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)  ThermoFisher Scientific 11360070 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)  ThermoFisher Scientific 15750037 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)  ThermoFisher Scientific 15290018 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)  To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt Sigma-Aldrich T5639-1G Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate Sigma-Aldrich 33454-100MG Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. 
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL NIH AIDS Reagent Program 510 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 NIH AIDS Reagent Program 2522 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC) NIH AIDS Reagent Program 8146 Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hello, I want to make a Timentin solution (Ticarcillin sodium and potassium clavulanate) for use it in cell culture. I see that you prepare it in sterile cell culture grade water BUT the safety information of the product for Potassium clavulanate says: "Reacts violently with water., Risk of explosion if heated under confinement." So How can I make the solution? Your indications are: To resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Did you have some problems with the Potassium clavulanate and the water?
    Thank you so much. Paula

    Reply
    Posted by: Paula L.
    October 29, 2018 - 3:22 PM
  2. Dear Paula
    Thank you for bringing this up. As you mentioned in your comment Timentin is the trademark name of a mixture of tircacillin disodium and potassium clavulanate that is reconstituted in water as per manufacturer instructions. This mix has been the antibiotic of choice for tonsil culture in the Margolis’ lab for many years, and it was also used by reconstituting individual antibiotics in water, as indicated in the material table, at the Karolinska Institutet to effectively control bacterial contamination in culture. I recommend that you check with the manufacturer about specific instructions for reconstituting potassium clavulanate, although I have never experienced a problem by preparing a solution of tircacillin disodium in water and then using that to reconstitute potassium clavulanate.
    In general, you may want to optimize your explant culture system by testing a number of antibiotics and select that is more convenient to use and works well for your specimens, depending on their nature, e.g. tonsillectomy for recurrent infection vs obstructive pathology, how clean the specimen is handled after surgery, etc. Be aware that you may experience seasonal variations in the rate of culture contamination through the year, especially with specimens from kids. Good luck!
    Andrea Introini

    Reply
    Posted by: Andrea I.
    November 2, 2018 - 12:53 PM

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