Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Immunology and Infection

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Summary

Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.

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Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (140), e57013, doi:10.3791/57013 (2018).

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Abstract

Histocultures erlauben Untersuchung interzelluläre Wechselwirkungen im menschlichen Gewebe, und sie können Modell Wirt-Pathogen Interaktionen unter kontrollierten Laborbedingungen eingesetzt werden. Ex-Vivo -Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV), unter anderen Viren hat erfolgreich zur frühen Pathogenese der Krankheit, sondern als Plattform zum Testen der Wirksamkeit und Toxizität von antiviralen Medikamenten untersuchen. In diesem Protokoll erklären wir, wie zu verarbeiten und mit HIV-1 Gewebe Explantaten aus menschlichen Tonsillen und Gebärmutterhalskrebs Schleimhäute infizieren und pflegen sie in Kultur auf Gelatine Schwämmen an der Air liquide-Schnittstelle für etwa zwei Wochen. Dieser unpolarisierte Kultureinstellung maximiert Zugang zu Nährstoffen in Kulturmedium und Sauerstoff, obwohl fortschreitenden Verlust von Gewebe Integrität und funktionale Architekturen die wichtigste Einschränkung bleibt. Diese Methode ermöglicht die Überwachung von HIV-1-Replikation und Pathogenese mit mehreren Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR und Durchflusszytometrie. Von Bedeutung kann die physiologische Variabilität zwischen Gewebespender sowie Explantaten aus verschiedenen Bereichen der gleichen Probe, experimentelle Ergebnisse erheblich beeinträchtigen. Um Ergebnis Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Explantaten, technische repliziert und Spender abgestimmt Kontrolle Bedingungen verwenden, um die Ergebnisse der experimentellen Behandlungen zu normalisieren, wenn Sie Daten aus mehreren Experimenten zu kompilieren (dh ., durchgeführt mit Gewebe von verschiedenen Spendern) zur statistischen Auswertung.

Introduction

Außerdem Bi-dimensionale Zellkulturen, hier bezeichnet als herkömmliche, entfallen nicht die räumliche und funktionale Kommunikation zwischen der Vielzahl von Zelltypen, die Gewebe zu komponieren und Organe. Dieser Aspekt ist von größter Bedeutung für experimentelle Modelle der Krankheit, wie Interferenz mit den homöostatischen interzelluläre Wechselwirkungen der treibende Faktor für alle Krankheiten ist. Gewebe-Explantaten bieten entscheidende Vorteile für die Modellierung von Gesundheit und Krankheit beim Menschen, weil sie die Cytoarchitecture und viele wichtige funktionale Aspekte der Organe behalten, wie sie in Vivo, obwohl für eine begrenzte Zeit1. Beispielsweise auf ex Vivo mit Recall-Antigenen, wie Diphtherie-Toxoid oder Tetanus-Toxoid, reagiert rachenabstrichen Gewebe mit einer starken Produktion von Antigen-Antikörper-2. Wie jedes andere ex Vivo Modell, Histoculture hat seine eigenen Grenzen: Inter Spender Variabilität, Gewebe Polarisation, begrenzte Gewebe überleben und Schwierigkeiten bei der Überwachung der Zellen über die Tiefe der konfokalen Mikroskopie1. Menschliches Gewebe Explantaten dennoch ein Modell der Wahl homöostatische und pathogene immunologische Prozesse im Menschen, einschließlich der Wirt-Pathogen Interaktionen und mögliche therapeutische Interventionen3zu studieren.

Die kritischen Ereignisse der Pathogenese der HIV-1 statt in Geweben. Infektion der genitalen Schleimhaut Konten für die Mehrheit aller HIV-1-Übertragung Veranstaltungen weltweit4. Lymphgewebe ist der Hauptaufstellungsort der Replikation des Virus während der akuten Infektion birgt einen erheblichen Pool von latent infizierten Zellen5und ihre Beharrlichkeit ist das Haupthindernis für eine Heilung6zu erreichen. Die Kultur und ex-Vivo Herausforderung der menschlichen lymphatischen und Schleimhaut-Gewebe bieten einige Vorteile gegenüber herkömmlichen Systemen auf Basis von isolierten Zellen für die Untersuchung von HIV-1. Gewebe-Resident Zellen können beispielsweise HIV-1-Infektion ohne exogene Aktivierung, im Gegensatz zu peripheren mononukleären Zellen1unterstützen. Die Verwendung von Lymphgewebe Explantaten erlaubt ein besseres Verständnis für einige wichtigen Mechanismen, die CD4-T Zelle Entleerungd. h., die Bystander Effekt7, das ist das Markenzeichen der akuten Infektion hat. Die Erhaltung der Strukturen wie B-Zell-Follikel im Lymphgewebe8 und das Epithel in weiblichen genitalen Schleimhaut Explantaten9 bietet die einzigartige Möglichkeit, räumliche und funktionelle Eigenschaften von HIV-1-Infektion an diesen Standorten zu integrieren. Schließlich wurden Histocultures erfolgreich Modell und Studie HIV-1 und Herpes-Co-Infektion10,11, verwendet sowie für präklinische Tests von antiretroviralen Medikamenten und Multitarget Mikrobizide12, 13 , 14 , 15.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Kultur der menschlichen Gewebe Explantaten aus Mandeln und Schleimhaut aus den unteren weiblichen Genitaltrakt (Zervix), gewonnen mit Gewebe Dissektion um Herausforderung mit HIV-1 in einer Weise unpolarisierte explant. Die Kultur der Gewebe Explantaten an der Air liquide-Schnittstelle, mit Gelatine Schwämmen als Unterstützung, maximiert die Exposition um Sauerstoff der Luft und bietet Zugriff auf Nährmedium Nährstoffe durch den Schwamm Kapillaren, verzögert ihre natürlichen Verfall. Die unmittelbarste Weise HIV-1-Replikation in unserem System zu bewerten ist, Messen Sie die Menge des Virus in das Kulturmedium Explant im Laufe der Zeit von Immunoassay oder qPCR freigegeben. HIV-1-Infektion und Pathogenese (zB., CD4 T Zelle Entleerung) können auch im Gewebe Explantaten durch Masse RNA/DNA-Extraktion und qPCR, in Situ Beflecken oder einzelne Zellanalyse auf Gewebe Verdauung durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden.

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Protocol

Das Protokoll für die Sammlung von menschlichem Gewebe kann von den zuständigen Kommunen ethische genehmigungspflichtig. Im Falle der angegebenen Operationen wie z. B. Tonsillektomie und Hysterektomie die Exemplare sind nicht speziell für Forschung Zweck gesammelt und die Studie gilt nicht menschlichen Probanden Forschung (National Institutes of Health. Forschung am Menschen. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Gewebespender persönlichen und medizinischen Daten jedoch zu erhalten (zB., Geschlecht, Alter, aktuellen Drogenkonsum, Geschichte von Infektionen, etc.) das kann helfen, interpretieren experimentelle Ergebnisse, Posen Bedenken hinsichtlich der Einwilligung nach Aufklärung und Privatsphäre, die sein muss in das Protokoll für Gewebe Sammlung behandelt.

Achtung: Das gesamte Verfahren sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Alle menschlichen Proben, einschließlich derjenigen aus "gesunden" Menschen können Infektionserreger beherbergen. Der Betreiber sollte mit Blut übertragbaren Krankheitserregern, Gewebeproben, sicher zu handhaben, auch wenn Experimente keine die Verwendung von HIV beinhalten Arbeiten geschult. Eine Risikobewertung des Verfahrens der Gewebe Dissektion und HIV-Infektion sollte durch geschultes Personal für die Sicherheit des Betreibers und Kollegen durchgeführt werden. Die Verwendung von infektiösen HIV erfordert engagierte Biosafety Level 2 oder 3 Umgebungen je nach Land und Institut-spezifische Vorschriften über gefährliche Biologicals und Blut übertragbaren Krankheitserregern.

1. Vorbereitung der Gelatine Schwämmen

Hinweis: Obwohl es nicht unbedingt notwendig, Gelatine Schwämmen vor Gewebe Dissektion vorzubereiten, ist es bequemer, die Reihenfolge beschrieben hier, vor allem im Umgang mit einer großen Menge des Gewebes und/oder von den vielen Spendern.

  1. Bereiten Sie Kulturmedium (CM) und ergänzen Sie es mit antibiotischen Lösung (Tircacillin-clavulanat Mix) vor Gebrauch zu CMT (Table of Materials). Alle übrig gebliebenen antibiotische Lösung zu verwerfen.
    Hinweis: Ticarcillin und clavulanat in CMT sind schlecht stabil. Bei Bedarf ergänzen Sie neu CMT mit antibiotischen Lösung nach ca. 24 h von der Vorbereitung. Es ist nicht erforderlich, antibiotische Lösung um Medium alle 24 h während Kultur explant hinzuzufügen.
  2. Füllen Sie eine 100 mm x 20 mm Petrischale mit etwa 20 – 30 mL CMT.
    Hinweis: Diese Einstellung ist optimal, um genügend Gelatine-Schwämme für zwei 6-Well-Platten oder ein 12-Well-Platte zur Zeit vorzubereiten. Wenn viele Platten erforderlich sind, verwenden Sie eine breitere Petrischale und größeres Volumen der CMT zur Beschleunigung der Vorbereitungsprozess.
  3. Übertragen Sie die Gelatine-Sponge(s) in der Petrischale mit sterilen Pinzette. Nasse Schwämme auf beiden Seiten und lassen Sie die Schwämme aufsaugen Medium für 1 min. Drücken die Schwämme gegen den Boden der Petrischale für ca. 2 min mit einem sterilen Spatel.
    Hinweis: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da das Vorhandensein von Luftblasen in den Schwamm der Kapillaren blockiert durch die Kulturmedium Nährstoffe das Gewebe erreichen. Gelatine-Schwämme sind extrem spröde, wenn dehydriert. Drücken Sie vorsichtig auf den Schwamm mit dem Spatel, besonders am Anfang, um zu vermeiden, den Schwamm zu brechen.
  4. Verwendung steriler Schere eingeweichtes Gelatine Schwämmen in ca. 1 cm2gleich große Stücke schneiden. 1 Schwamm Stück mit Pinzette in jede Vertiefung einer Kultur-Platte zu übertragen. 3 – 4 mL CMT in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte (Mandeln) und 1 mL pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte (Zervix) hinzugeben. Legen Sie die Platten in den Inkubator, eingestellt auf 37 ° C, 5 % CO2, ≥ 90 % Luftfeuchtigkeit, bis die Gewebe Explantaten auf die Schwämme geladen werden können.
    Hinweis: Die Lautstärke der CMT hinzufügen in die Platte sollte auf die Dicke des Schwammes, der Explantate an der Schnittstelle von Air liquide zu halten eingestellt werden.

2. Präparation von menschlichem Gewebe der Tonsillen

Hinweis: Mandeln sollte möglichst bald nach der Operation, im Idealfall am gleichen Tag der Operation verarbeitet werden. Alternativ können Exemplare über Nacht untergetaucht in CMT bei 4 ° c gelassen werden

  1. Ermöglichen die CM genug Zeit, um auf Raumtemperatur (RT) oder legen Sie sie in einem Wasserbad bei 37 ° c vorgewärmt Ergänzen Sie die CM mit antibiotischen Lösung (CMT) vor dem Gebrauch. Entsorgen Sie antibiotische Lösung übrig. Gießen Sie 70 % Ethanol-Lösung in ein sauberes Gefäß, Pinzette und Skalpell bei Bedarf während des Verfahrens der Dissektion einweichen. Reinigen Sie der Werkzeuge und ändern Sie der Skalpellklinge zwischen Sezierungen Exemplare von verschiedenen Spendern zu.
  2. Übertragen Sie die Mandeln aus dem Transport-Container in eine 100 mm-Petrischale mit 10-20 mL der CMT mit sterilen Pinzette.
    Hinweis: Die Proben mit weit verbreiteten Bereichen geätzt, blutigen oder nekrotischen Gewebes sollte verworfen werden.
  3. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als eine Schnittfläche, um Gewebe zu sezieren. Halten Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette, jedes Tonsillen in mehrere große Stücke mit sterilen Skalpell und Klinge schneiden.
    Achtung: Umgang mit scharfe Werkzeugen, menschliche Exemplare zu zergliedern erhöht das Risiko von Verletzungen und Verschmutzungen. Die Betreiber sollten Metall, Netz, schnittfeste Handschuhe als zusätzlichen Schutz zu tragen.
  4. Entfernen Sie verödet, blutig, und faserartiges Gewebe und alle Bauteile enthalten Tonsillensteine (verkalkte Material) und/oder mit grün-bräunliche Farbe mit Hilfe einer Pinzette und Skalpell.
    Hinweis: Während der Arbeit an einem Stück des Gewebes, ist es wichtig, dass den Rest des Gewebes untergetaucht in Mittel-und Gewebe Austrocknung zu vermeiden.
  5. Schneiden Sie jedes Gewebe in Scheiben von etwa 2 mm Dicke. Entfernen Sie unerwünschte Teile wie im vorherigen Schritt. Schneiden Sie die Gewebe-Scheiben in 2 mm dicke Streifen. Geschnitten Sie die Gewebe-Streifen in 2 mm Dicke Blöcke. Dies sollte dazu führen, dass Gewebe Explantaten von etwa 8 mm3.
  6. Übertragen Sie die Explantaten in eine neue 100 mm Petrischale mit 10 – 20 mL der CMT Gewebe Austrocknung während Sie mit der Dissektion zu vermeiden. Am Ende der Dissektion schwenken Sie die Platte, um die modellabhängigen Verteilung Randomisieren. Platz 9 Gewebe explants auf jede Gelatine Schwamm in einem 6-Well-Platte mit Pinzette, so dass der Raum zwischen ihnen. Die Platten in den Inkubator zurück.
    Hinweis: In der Regel Explantaten kultiviert über Nacht und Inokulation von Kulturen mit HIV-1 wird am nächsten Tag durchgeführt. Dies soll sicherstellen, dass keine bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination in der Kultur entwickelt. Darüber hinaus neigen Zellen, rachenabstrichen Gewebe Explantate nach Dissektion brandschutzzeichen. Dieser Prozess ist im Wesentlichen innerhalb der ersten 24 h Kultur1abgeschlossen.
  7. Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle in treffend Behälter gemäß den Vorschriften des Instituts zum Umgang mit gefährlichen Biologicals und die spezifische Risikobewertung.

3. Infektion von Rachenabstrichen Gewebe Explants mit HIV-1

Hinweis: Um Ergebnis Variabilität zwischen unabhängigen Experimenten zu verringern, sollte die gleiche Virus-Vorbereitung für eine gesamte Studie verwendet werden. Virus kann exogen aktiviert peripheren mononukleären Blutzellen vermehrt und dann die Kultur Überstand kann regelmäñig für die Lagerung bei-80 ° C zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen (Table of Materials).

  1. Setzen Sie die CM in einem Wasserbad bei 37 ° c vorgewärmt Ergänzen Sie die CM mit antibiotischen Lösung (CMT) vor dem Gebrauch. Alle übrig gebliebenen antibiotische Lösung zu verwerfen.
  2. Das Medium in der 6-Well Chicoréeblätter mit einer Pipette abzusaugen und in einem Behälter mit Desinfektionslösung zu verwerfen. Kippen Sie die Platte und schieben Sie die Gelatine-Schwämme, der obere Teil des Brunnens ermöglichen das Medium, versammeln sich an der Unterseite und Aspirieren und entsorgen es. 3-4 mL CMT in jede Vertiefung hinzugeben.
  3. Auftauen der HIV-1-Virus-Vorbereitung im Wasserbad bei 37 ° C. Bei Bedarf verdünnen Sie die Virus-Aktie mit CM (Tabelle 1).
    Hinweis: Der Virus bestand sollten verdünnt werden, damit das ausgewählte Inokulum in einem Volumen von 5 – 8 µL (Tabelle 1) enthalten ist. Für eine effiziente Infektion ist es wichtig, den minimalen Zeitaufwand zwischen Auftauen der HIV-1-Vorbereitung und infizieren Gewebe Explantaten zu verwenden.
  4. Pipette das Virus Inokulum direkt übereinander 9 Explantaten auf einem Gelatine-Schwamm. Die Chicoréeblätter in den Inkubator zurück, sobald die Infektion abgeschlossen ist. Entsorgen Sie alle verbleibenden Virus Vorbereitung. Weiter zu Abschnitt 5.
    Hinweis: Um genau dem Virus Inokulum die Betreiber liefern sollten eine umgekehrte pipettieren Technik verwenden und Ändern der Tipp für jeden gut. Dabei drücken die Pipette Kolben nach unten in die Säuberung Position (zweite Haltestelle) das Virus Inokulum aufzustellen und schieben bis zum ersten Anschlag auf das Inokulum zu liefern, das Minimierung Blasenbildung und der Fehler hilft im Zusammenhang mit wiederholten Probenahme von kleinen Volumen, d. h., 5 – 8 µL.

4. Präparation und Infektion der Gebärmutter zervikalen Schleimhaut

Hinweis: Für ein optimales Ergebnis Explantaten von Gebärmutterhalskrebs Schleimhäute sollte werden verarbeitet und infiziert so bald wie möglich nach der Operation, im Idealfall am gleichen Tag der Operation. Alternativ können die Proben in CMT bei 4 ° C über Nacht getaucht, und infizierte unmittelbar nach Dissektion gespeichert werden.

  1. Ermöglichen die CM genug Zeit zum erreichen RT oder legen Sie es in einem Wasserbad bei 37 ° c vorgewärmt Ergänzen Sie die CM mit antibiotischen Lösung (CMT) vor dem Gebrauch. Alle übrig gebliebenen antibiotische Lösung zu verwerfen. Gießen Sie 70 % Ethanol Lösung in einen sauberen Behälter die Pinzette und Skalpell bei Bedarf während des Verfahrens der Dissektion einweichen. Reinigen Sie die Werkzeuge und ändern Sie der Skalpellklinge zwischen Sezierungen Proben von mehreren Gebern.
  2. Mit sterilen Pinzette, übertragen Sie die Probe aus dem Transport-Container in ein 100 mm Petrischale mit 10 – 20 mL der CMT.
  3. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als eine Schnittfläche, um das Gewebe zu zergliedern. Hält das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette, die Schleimhaut der Ectocervix und/oder Endocervix von der Unterseite Stromazellen trennen und Muskelgewebe (Submukosa) mit einem Skalpell und Klinge zu Streifen der Schleimhaut.
    Hinweis: Während der Arbeit an einem Stück des Gewebes, ist es wichtig, dass den Rest des Gewebes untergetaucht in Mittel-und Gewebe Austrocknung zu vermeiden.
  4. Schneiden Sie die Schleimhaut in 2 mm breite Streifen, entfernen Sie und entsorgen Sie soviel Submukosa wie möglich, so dass nur eine 2 mm dicke Schicht des Gewebes. Geschnitten Sie die Streifen in 2 mm Dicke Blöcke. Dies sollte dazu führen, dass Gewebe Explantaten von etwa 8 mm3.
    Achtung: Umgang mit scharfe Werkzeugen, menschliche Exemplare zu zergliedern erhöht das Risiko von Verletzungen und Verschmutzungen. Die Betreiber sollten Metall, Netz, schnittfeste Handschuhe als zusätzlichen Schutz zu tragen.
  5. Transfer Gewebe Explantaten in eine neue 100 mm Petrischale mit 10 – 20 mL der CMT Gewebe Austrocknung während Sie mit der Dissektion zu vermeiden. Am Ende der Dissektion schwenken Sie die Platte, um die modellabhängigen Verteilung Randomisieren.
  6. Mit der sterilen Pinzette übertragen der Explantate in sterilen 1,5 mL konische Tube(n) (maximal 16 Explantaten pro Röhre). Entfernen Sie jedes Medium in das Rohr mit einer Pipette.
  7. Auftauen der HIV-1-Vorbereitung in einem Wasserbad bei 37 ° C. Bei Bedarf verdünnen Sie die Virus-Aktie mit CM bei der Übertragung des Virus in die Tube(n) mit der Explantate. Entsorgen Sie alle verbleibenden Virus Vorbereitung.
    Hinweis: Der Virus bestand sollten verdünnt werden, damit das ausgewählte Inokulum in einem Volumen von mindestens 0,5 mL (Tabelle 1) enthalten ist. Um Ergebnis Variabilität zwischen unabhängigen Experimenten zu verringern, sollte die gleiche Virus-Vorbereitung für eine gesamte Studie (Table of Materials) verwendet werden.
  8. Übertragen Sie die Rohre in einen Thermo-Shaker und 2 h bei 37 ° C rocken bei 300 u/min inkubieren. Invertieren Sie die Rohre sanft ein paar Mal alle 30 bis 60 Minuten.
    Hinweis: Für eine effiziente Infektion ist es wichtig, die minimale Zeit zwischen Auftauen der HIV-1-Vorbereitung und Übertragung der Rohre auf 37 ° c zu verwenden
  9. Füllen Sie eine 6-Well-Platte mit 3 – 4 mL pro Bohrloch von sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS). Bei der Inkubation mit HIV-1, verwerfen alle Virus-Vorbereitung in der Tube(n) in einen Behälter mit Desinfektionslösung mit einer Pipette. Übertragen Sie die Explantaten in der 6-Well-Platte mit PBS mit Pinzette.
  10. Explantaten mit PBS-Puffer für 1 min bei RT ruhen lassen und dann waschen Sie sie durch sanft pipettieren auf PBS in den Brunnen 2-3 Mal. Verwerfen Sie die PBS in einen Behälter mit Desinfektionslösung mit einer Pipette. 3 – 4 mL neue PBS in jede Vertiefung hinzugeben. Wiederholen Sie zwei weitere Male für eine Gesamtmenge von drei Wäschen. Verwerfen Sie die PBS kurz vor Übertragung der Explantate auf die Schwämme, Gewebe Austrocknung zu vermeiden.
    Hinweis: Explantaten der zervikalen Schleimhaut und in bestimmten Endocervix lassen große Mengen von Schleim während der Infektion. Es ist wichtig zu waschen und so viel Schleim wie möglich zu entfernen, weil unspezifische Bindung an Explantaten und anschließende Freisetzung des Virus in Kultur überstand Virusreplikation überdecken kann.
  11. Mit Pinzette, 5-8 Explantaten auf jede Gelatine Schwamm in einem 12-Well-Platte übertragen. Die Platte in den Inkubator zurück.
  12. Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle in treffend Behälter gemäß den Vorschriften des Instituts zum Umgang mit gefährlichen Biologicals und die spezifische Risikobewertung.

(5) Histoculture

  1. Ändern Sie die CM alle 3 Tage ab dem Zeitpunkt der Infektion bis Tag 12 – 15 nach der Infektion. CM und/oder Explantaten probieren Sie in regelmäßigen Abständen während der Kulturzeit, HIV-1-Replikation, neben anderen Parametern zu bewerten.
  2. Setzen Sie die CM in einem Wasserbad bei 37 ° c vorgewärmt
    Hinweis: Es ist nicht erforderlich, die CM mit antibiotischen Lösung in diesem Stadium zu ergänzen.
  3. Eine Probe von CM mit einer Pipette zu sammeln und in sterilen 1,5 oder 2 mL Schraubverschluss Tube(n) zur Lagerung bei-80 ° c zu übertragen
    Hinweis: Die CM aus replizieren Brunnen werden Sammlung zusammengefasst.
  4. Ernten der Gewebe-Explantaten mit der sterilen Pinzette Entfernen der überschüssigen Mittel auf Explantaten, indem sie auf ein Stück Papier (optional) und Explantaten in sterilen 1,5 oder 2 mL Schraubverschluss Tube(n) übertragen. Verarbeiten Sie oder speichern Sie die Gewebeproben nach Bedarf durch das Experiment.
    Hinweis: Für Durchflusszytometrie, Explantate sofort mit einem enzymatischen Cocktail zu einer einzelligen Suspension (für weitere Details siehe Referenzen 1, 9, 16 und 17) verdaut werden. Für RNA-Extraktion werden Explantaten in einer RNA-Stabilisierung-Lösung bei 4 ° C gehalten, über Nacht vor dem Speichern bei-80 ° C. Für DNA-Extraktion oder in Situ Färbung (Zervix) Explantate in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis/Ethanol Gülle Snap eingefroren und bei-80 ° c gelagert Alternativ können rachenabstrichen Explantaten durch Eintauchen in eine Lösung von PBS und 4 % Paraformaldehyd für in Situ Beflecken behoben werden.
  5. Die restliche CM in den Brunnen mit einer Pipette abgesaugt und in einen Behälter mit Desinfektionslösung zu verwerfen. Kippen Sie die Platte und schieben Sie die Gelatine-Schwämme, der obere Teil des Brunnens ermöglichen das Medium an der Unterseite, zu sammeln und dann abzusaugen Sie und entsorgen.
  6. 3 – 4 mL CM in jede Vertiefung hinzugeben. Mit sterilen Pinzette, zurück, dass jedes Gewebe, die in das Medium mit der Gelatine-Schwamm explants. Die Platte in den Inkubator zurück.
  7. Am Ende der Kultur entsorgen Sie alle biologischen Abfälle in treffend Behälter gemäß den Vorschriften des Instituts zum Umgang mit gefährlichen Biologicals und die spezifische Risikobewertung.

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Representative Results

Verschiedene Techniken lässt sich HIV-1-Replikation in Gewebe Explantaten zu beurteilen. Unsere standard Auslesen ist um die Menge des HIV-1-p24gag veröffentlicht im Laufe der Zeit mit einem Immunoassay18CM messen.

Gewebe-Explantaten von verschiedenen Spendern, infiziert mit der gleichen Inokulum der gleichen HIV-1 Aktie, können unterschiedliche Mengen des Virus (Tabelle 1) führen. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen, wie die Anzahl und Status der Zielzellen von HIV-1 und die Anwesenheit von Co infizieren Erreger im Gewebe16,19. In Abbildung 1bieten wir ein Beispiel für produktive und abortive HIV-1 Infektion der zervikalen Schleimhaut Explantaten definiert durch die Menge der p24gag veröffentlicht in CM im Vergleich zum Spender abgestimmt Explantaten behandelt mit antiretroviralen Medikamenten Lamivudin (3TC) völlig unterdrückt, die Replikation von HIV-1. Obwohl dieses Steuerelement aus der Spender in A für eine Infektion des Gewebes Explantaten überflüssig erscheint, hilft es bei Diskriminierung abortive (B) aus produktiven Infektion (C) in Explantaten, die geringe Mengen an HIV-1-Replikation zu liefern.

Die Verwendung von einer antiretroviralen Medikament als eine Kontrollbedingung kann nützlich sein, HIV-1-Infektion in den Geweben zu studieren, die geringe Zahl der Zielzellen, wie die Halswirbelsäule Schleimhaut und Verwendung von langsam-Replikation von HIV-1 Varianten, wie einige primärisolaten beherbergen. Darüber hinaus für Gewebe mit diesen Viren infiziert, ist es wichtig zu prüfen, mit empfindlicher Nachweisverfahren, z.B. qPCR.

Figure 1
Abbildung 1 : HIV-1-Replikation in zervikalen Schleimhaut explants aus drei verschiedenen Gewebespender. Zervikale Gewebe Explantate wurden mit der gleichen Inokulum von HIV-1BaL durch Untertauchen vorrätig Virus infiziert und für 15 Tage in das Vorhandensein oder Fehlen von antiretroviralen Medikament Lamivudin (3TC) in der Konzentration von 10 µM. Nährmedium kultiviert wurde gesampelt Alle 3 Tage und Proben aus replizieren Brunnen wurden Sammlung für die Analyse von HIV-1-Replikation von HIV-1-p24gag Immunoassay zusammengefasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Gewebetyp Virus Inokulum pro Explant (Pg von HIV-1-p24gag) Nein. der Explantate Kulturmedium Volumen (mL) Nein. der Brunnen (technische Wiederholungen) HIV-1-p24gag Produktion (ng/mL)
Tonsillen HIV-1BaL 350-500 9 3-4 2 – 3 1 – 10
HIV-1-LAI.04 9 3-4 2 – 3 1 – 100
Zervikale HIV-1BaL 1.500-2.000 8 1 2 1 – 5
HIV-1-LAI.04 8 1 2 nicht nachweisbar

Tabelle 1: Referenzwerte von HIV-1-Inokulum Gewebe Explantaten und Virus-Infektion. Der Wert des HIV-1-Inokulum pro einzelner Gewebe Explant bezieht sich auf Virus-Bestände bei der Konzentration von 50-70 ng/mL: ein Volumen von 7 µL unverdünnte Virus Lager wird verwendet, um infizieren jedes rachenabstrichen Explant auf einem Gelatine-Schwamm; ein Volumen von 500 µL unverdünnte Virus Bestand wird zum Eintauchen in eine 1,5 mL-Tube 16 zervikale Explantaten infizieren. Zervikale Explantaten werden ausgiebig mit PBS-Puffer gewaschen, vor der Übertragung auf Gelatine Schwämmen. Der Wert von HIV-1-Produktion durch Gewebe Explantaten bezieht sich auf die kumulative Menge an p24gag von 8 Explantaten in 1 mL (Zervix) oder 9 Explantaten in 3-4 mL Kulturmedium (CM) alle 3 Tage über 12-15 Tage Kultur abgetastet (Tonsillen) veröffentlicht. CM aus replizieren Brunnen wird bei Abholung für jeden Zeitpunkt bevor Sie ersetzen es mit frischen CM gebündelt. Der Wert der p24gag Konzentration gemessen am 3. Tag wurde von der Analyse ausgeschlossen, weil es Virus Absorption auf Explantaten und anschließende Freisetzung in CM, d.h., Inokulum Verschleppung teilweise entfallen. In der Regel führt die Infektion der zervikalen Gewebe mit HIV-1LAI.04 nicht nachweisbar HIV-1-Replikation in unser experimentelles System16.

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Discussion

Die Verwendung von menschlichem Gewebe explants für das Studium der HIV-1-Infektion Vorteile gegenüber den herkömmlichen zweidimensionalen und außerdem experimentellen Systemen wie Primärzellen oder Zell-Linien, durch ihre überlegene Fähigkeit zur Fortpflanzung interzelluläre Wechselwirkungen bietet und zelluläre Funktionen (z.B.Produktion von Zytokinen) sind in Vivo. Dennoch, Tonsillen und zervikalen Gewebe unterscheiden sich in vielerlei Hinsicht, einschließlich der Anzahl und phänotypische und funktionelle Eigenschaften von HIV Ziel Zellen1,16. Aus dem gleichen Grund führen HIV-1-Varianten mit verschiedenen ko-Rezeptor Tropismus (z. B.CCR5-Tropen HIV-1BaL vs. CXCR4-Tropen HIV-1LAI.04) unterschiedlich sowohl in Tonsillen und des Gebärmutterhalses (Tabelle 1). Die Verbreitung von HIV corezeptoren auf Ziel-Zellen im Immunsystem induktive und Effektor Websites nur teilweise entfallen lokale Infektanfälligkeit: CD4-T-Zellen tragen CXCR4 sind häufiger als CCR5 exprimierenden Zellen in rachenabstrichen Gewebe, damit erklären Replikation höhere HIV-1LAI.04 als HIV-1BaL, aber die Rezeptoren in den zervikalen Schleimhaut16gleichberechtigt vertreten sind. Trotzdem erkannt wir selten produktiv Virusreplikation im zervikalen Gewebe mit HIV-1LAI.04, die im Einklang mit der bevorzugte Übertragung von einzelnen CCR5-Tropen HIV-1 Varianten beobachtet in Vivo20 in Frage gestellt . Dies deutet darauf hin, dass die Differenzierung und Aktivierung Status der HIV-1-Ziel-Zellen letztlich ihre Fähigkeit zur Unterstützung von HIV-1-Replikation16bestimmen kann.

Gelatine-Schwämme sind blutstillende Geräte gewonnenen gereinigten Schweinehaut (Kollagen), die nach wenigen Wochen vollständig vom menschlichen Körper aufgenommen werden sollen. Wir empfehlen die Verwendung von Produkten, die langsam Abbaurate in Kultur zu zeigen, wie sie den Zweck der Aufrechterhaltung der Gewebe Explantaten an der Air liquide-Schnittstelle für 2-3 Wochen besser passen. Wir empfehlen auch verschiedene Chargen des gleichen Produkts gleichbleibende Leistung in Explant Kultur zu beurteilen.

Ebenso können die Art und Menge der fetalen bovine Serum (FBS) HIV-1-Replikation-Spiegel beeinflussen. Wir beraten, testen mehrere Lose von FBS für CM-Optimierung und verwenden die gleiche Menge FBS für eine gesamte Studie. Wir routinemäßig FBS auf Gewebe Explantaten von 10 Spendern zu testen und wählen Sie die Menge, die die höchste HIV-1-Replikation gibt.

Für die meisten Experimente bündeln wir Explantaten aus Endocervix und Ectocervix, die Anzahl der experimentellen Bedingungen zu maximieren. Man kann betrachten, halten sie wegen ihrer unterschiedlichen strukturellen und immunologischen Funktionen21getrennt. Endozervikale explants Version auch weiterhin eine große Menge an Schleim in Kultur zu produzieren die nachgelagerte Analyse beeinträchtigen könnten. Sehen, wie das Gebiet Endocervix viel kleiner als Ectocervix, es ist eine Herausforderung für HIV Infektion Experimente ausschließlich auf die endozervikaler Schleimhaut repliziert mit einer angemessenen Anzahl von Explantaten und technische.

Durchführung von HIV-1-Infektion durch Eintauchen des zervikalen Explantaten maximiert die Chancen auf eine produktive Infektion durch die geringere Anzahl der CD4-T-Zellen in der Schleimhaut gegenüber Lymphgewebe vorhanden. Aus dem gleichen Grund das zervikale Gewebe empfindlicher auf Lagerung über Nacht und liefert höhere HIV-1-Replikation, wenn kurz nach der Operation und unmittelbar nach Dissektion infiziert. Obwohl Infektionen durch Untertauchen in Virus bestand auch für rachenabstrichen Gewebe Sicherstellung einheitlicher Exposition von Explantaten gegenüber dem Virus durchgeführt werden kann, bringt dieser Ansatz höhere Manipulation und Zelle Gewebeverlust als Infektion der Explantate auf Gelatine Schwämmen wie beschrieben in das Protokoll.

Polarisierte Systeme von HIV-1-Herausforderung und Kultur der Schleimhaut-Gewebe existieren und sind derzeit in anderen Labors3,22,23,24,25verwendet. Obwohl diese Systeme ein wertvolles Modell von HIV-1 Eintrag und das Eindringen in die Schleimhaut sind, die Einrichtung ist in der Regel mehr Zeit in Anspruch und erfordern umfangreiche Gewebe Manipulation. Nicht-polarisierte Modelle der Schleimhaut Übertragung/Pathogenese bieten noch eine gültige Plattform zur Untersuchung der Regulierung von HIV-1-Replikation und die Badewelt von HIV-infizierten Zellen durch endogene und Exogene Faktoren9,17 , 26, Drogen einschließlich12,13,14,15.

Inter Spender Variabilität kann ein wichtiges Thema für Ergebnis Reproduzierbarkeit zwischen unabhängigen Experimenten mit Proben von mehreren Spendern darstellen. Variabilität in der zellulären Zusammensetzung kann auch Bereiche innerhalb der gleichen Probe, d.h., Intra-Spender Variabilität beeinträchtigen. Zur Reduzierung der Variabilität und Ergebnisse richtig zu interpretieren, ist es wichtig, alle Bedingungen in einem Experiment mit einer ausreichenden Anzahl von Explantaten erhalten vom selben Spender (Spender abgestimmt Bedingungen) einrichten. Ergebnisse können auf eine interne Kontrolle normalisiert werden, bei der Zusammenstellung der Daten aus mehreren Experimenten für statistische Analysen. Um Intra-Spender Variabilität zu verringern, empfiehlt es sich, darunter mindestens 2 Technische Wiederholungen für jede experimentelle Bedingung für insgesamt 18 Explantaten von rachenabstrichen Gewebe (9/na) und 10-16 Explantaten der zervikalen Schleimhaut (5-8/Well) (Tabelle 1). Die Verfügbarkeit von medizinischen Unterlagen und die Aufnahme für die weitere Analyse von Patientenmaterial und/oder experimentellen Bedingungen, zum Beispiel an Adresse der Entzündungsstatus eines Exemplars ERGEBNISINTERPRETATION deutlich verbessern können (siehe Referenz 9 für ein Beispiel).

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Stiftung Blanceflor Boncompagni Ludovisi geb. Bildt (http://blanceflor.se/), die Stiftung schwedische Ärzte gegen AIDS (http://www.aidsfond.se/, Ref. FOa2014-0006) und Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/), Andrea Introini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge  Pfizer NDC:  0009-0315-08 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge Ferrosan Medical Devices MS0002 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine ThermoFisher Scientific 21875034 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) ThermoFisher Scientific 11140035 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)  ThermoFisher Scientific 11360070 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)  ThermoFisher Scientific 15750037 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)  ThermoFisher Scientific 15290018 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)  To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt Sigma-Aldrich T5639-1G Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate Sigma-Aldrich 33454-100MG Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. 
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL NIH AIDS Reagent Program 510 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 NIH AIDS Reagent Program 2522 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC) NIH AIDS Reagent Program 8146 Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hello, I want to make a Timentin solution (Ticarcillin sodium and potassium clavulanate) for use it in cell culture. I see that you prepare it in sterile cell culture grade water BUT the safety information of the product for Potassium clavulanate says: "Reacts violently with water., Risk of explosion if heated under confinement." So How can I make the solution? Your indications are: To resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Did you have some problems with the Potassium clavulanate and the water?
    Thank you so much. Paula

    Reply
    Posted by: Paula L.
    October 29, 2018 - 3:22 PM
  2. Dear Paula
    Thank you for bringing this up. As you mentioned in your comment Timentin is the trademark name of a mixture of tircacillin disodium and potassium clavulanate that is reconstituted in water as per manufacturer instructions. This mix has been the antibiotic of choice for tonsil culture in the Margolis’ lab for many years, and it was also used by reconstituting individual antibiotics in water, as indicated in the material table, at the Karolinska Institutet to effectively control bacterial contamination in culture. I recommend that you check with the manufacturer about specific instructions for reconstituting potassium clavulanate, although I have never experienced a problem by preparing a solution of tircacillin disodium in water and then using that to reconstitute potassium clavulanate.
    In general, you may want to optimize your explant culture system by testing a number of antibiotics and select that is more convenient to use and works well for your specimens, depending on their nature, e.g. tonsillectomy for recurrent infection vs obstructive pathology, how clean the specimen is handled after surgery, etc. Be aware that you may experience seasonal variations in the rate of culture contamination through the year, especially with specimens from kids. Good luck!
    Andrea Introini

    Reply
    Posted by: Andrea I.
    November 2, 2018 - 12:53 PM

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