Systematische Bewertung des Wohlbefindens bei Mäusen für Verfahren mit Vollnarkose

Behavior

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Summary

Wir entwickelten ein Protokoll, um Wohlbefinden bei Mäusen bei Operationen mit Vollnarkose zu beurteilen. Eine Reihe von Verhaltensstörungen Parameter angibt Ebenen des Wohlbefindens sowie Glukokortikoid-Metaboliten analysiert wurden. Das Protokoll dient als eine allgemeine Hilfe, Schweregrad in einer wissenschaftlichen, Tier-zentrierte Weise zu schätzen.

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Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia. J. Vis. Exp. (133), e57046, doi:10.3791/57046 (2018).

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Abstract

Im Einklang mit der 3R Prinzip (Ersatz, Reduzierung, Verfeinerung) entwickelt von Russel und Burch, sollten wissenschaftlicher Forschung Alternativen zu Tierversuchen, wann immer möglich verwenden. Wenn es keine Alternative zu Tierversuchen, sollte die Gesamtzahl der Versuchstiere das Minimum benötigt, um wertvolle Daten zu erhalten. Darüber hinaus sollten entsprechende Verfeinerung Maßnahmen zur Minimierung von Schmerzen, leiden und Ängsten begleitet die Versuchsdurchführung angewandt werden. Die Kategorien verwendet, um den Grad der Schmerzen, leiden und Ängsten zu klassifizieren sind Nichteinziehung, leichter, mittelschwerer oder schwerer (EU-Richtlinie 2010/63). Um festzustellen, welche Kategorien im Einzelfall gelten, ist es wichtig, wissenschaftlich fundierte Werkzeuge einzusetzen.

Die gut-Wohlbefinden-Protokoll hier vorgestellten richtet sich an Verfahren, während die allgemeiner Anästhesie verwendet wird. Das Protokoll konzentriert sich auf die Heimat Käfig Aktivität, die Maus Grimasse Skala und Luxus Verhaltensweisen wie wühlen und Nestbau Verhalten als Indikatoren für das Wohlbefinden. Darüber hinaus nutzt das kostenlose explorative Paradigma für Trait Angst-Verhalten. Fäkale Corticosteron Metaboliten als Indikatoren von akutem Stress werden im 24-h Post-Narkose Zeitraum gemessen.

Das Protokoll bietet wissenschaftlich fundierte Informationen auf das Wohlbefinden von Mäusen nach der Vollnarkose. Aufgrund seiner Einfachheit kann in einer geplanten Studie des Protokolls leicht angepasst und integriert werden. Obwohl es keine Waage, um die Not in den Kategorien gemäß der EU-Richtlinie 2010/63 klassifizieren bereitstellt, kann es helfen, Forscher des Schweregrades eines Verfahrens mit wissenschaftlich fundierten Daten zu schätzen. Es bietet eine Möglichkeit, die Bewertung des Wohlbefindens in gewissem Sinne wissenschaftliche, Tier-zentriert zu verbessern.

Introduction

EU-Richtlinie 2010/631 besagt, dass das 3R-Prinzip (Ersatz, Reduction, Refinement) entwickelt von Russel und Burch2 ist anzuwenden, wenn Tierversuche notwendig sind. Das ultimative Ziel der EU-Richtlinie ist es, alle Tierversuche auslaufen, aber die Richtlinie räumt ein, dass vorerst, einige Tierversuche noch benötigt werden, zu forschen, die menschliche und tierische Gesundheit schützen. So, wenn ein Tierversuch durch irgendeine alternative Methode ersetzt werden kann, ist nur die minimale Anzahl von Versuchstieren verwendet werden, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Darüber hinaus sollte die Menge an Schmerzen, leiden und Ängsten begleitenden experimentelle Verfahren mit entsprechenden Verfeinerung Maßnahmen minimiert werden. EU-Richtlinie 2010/63 besagt, dass die schwere eines Verfahrens prospektiv als Nichteinziehung, leichter, mittelschwerer oder schwerer1einzustufen ist. Wie schwere Einstufung auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage entschieden wird, ist es wichtig, wissenschaftlich fundierte Werkzeuge, um den Schweregrad eines bestimmten Verfahrens zu schätzen.

Wertungsbögen von Morton und Griffith3 vorgeschlagenen sind ein wichtiges Instrument bei der Erkennung von Abweichungen vom Normalzustand, einschließlich negative Auswirkungen auf Wohlbefinden,4. Bewertungsbögen werden verwendet, um im Nachhinein festzustellen, Schmerzen, leiden, und Not verursacht durch ein Experiment und konzentrieren sich auf sichtbare Veränderungen in den körperlichen Zustand des jeweiligen Tieres (z.B.Körpergewicht, Fell, Gang). Obwohl Anhang VIII der EU-Richtlinie 2010/63 Beispiele für jede schwere Kategorie bietet, basierend Forscher noch fehlende Werkzeuge abzuschätzen Schweregrad eines bestimmten Verfahrens wissenschaftlich mit Daten.

Das Fehlen von Indikatoren, die negative Wohlbefinden ist nicht die einzige Möglichkeit, den Zustand des Tieres zu bestimmen; das Vorhandensein von Indikatoren, die auf positive Wohlbefinden ist auch wichtig,5,6,7,8. Zum Beispiel Tiere anzeigen Luxus Verhaltensweisen wie Graben und nisten Gebäude Verhalten nur, wenn ihre Grundbedürfnisse erfüllt sind. Wenn Wohlbefinden verringert wird, sind Luxus Verhaltensweisen die ersten5,7zurückgehen. Protokolle verwendet werden, bei der Beurteilung der Wohlbefinden gehören Indikatoren, die auf physikalischen, physiologischen/biochemische und psychische Zustände der Tiere um ihr Wohlbefinden in einer detaillierten und umfassenden Weise9zu bewerten.

Ein Protokoll wurde im Rahmen der Verfeinerung um diese Anforderungen zu erfüllen und um die Auswirkungen eines Verfahrens mit Vollnarkose auf das Wohlbefinden von Mäusen10entwickelt. Zur gleichen Zeit war das Ziel, zusätzlichen Stress zu ermöglichen die einfache Integration des Protokolls in einem bestimmten Experiment zu minimieren. Das Protokoll sieht wühlen Verhalten, nach Hause Käfig Verhalten wie Aktivität, Nahrungsaufnahme und Verschachtelung und Trait Angst-Verhalten. Darüber hinaus enthält es die Maus Grimasse Skala (MGS) und die nicht-invasive Analyse von Corticosteron Metaboliten im Kot. Das Protokoll ist entworfen, um die Bewertung des Wohlbefindens in gewissem Sinne wissenschaftliche und Tier-zentriert zu erleichtern und Informationen über Wohlbefinden, das die Einstufung des Schweregrades unterstützt. Neben Wertungsbögen können sie nützliche Informationen für die Einstufung der Schwere eines Verfahrens bereitstellen. Das Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert keine umfangreiche Ausrüstung, kann es in ein laufendes Experiment ohne Einfluss auf die Ergebnisse einer Studie integriert werden. Ist anzumerken, dass Animal Research: Berichterstattung von In Vivo Experimente (Ankunft) Leitlinie11 soll in allen Studien mit dem Ziel der Verbesserung von Design, Analyse und Berichterstattung tierexperimentelle beobachtet werden.

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Protocol

Die Studie wurde nach dem deutschen Tierschutzgesetz festgelegten Leitlinien durchgeführt und von der Berliner staatlichen Behörde genehmigt wurde ("Forschungsdefizite Für Gesundheit Und Landeserziehungsgeld", Genehmigung Nummer: G0053/15).

Hinweis: Das Hauptziel dieses Protokolls war die Wirkung der wiederholten Narkose auf Glukokortikoid-Metaboliten untersuchen. Eine Beispielrechnung Größe wurde durchgeführt, um festzustellen, die Zahl der Tiere verwendet werden: n ≥ 2 (s / µ1- µ2) ×2 × (Zα + Zβ)2. µ-1- µ2 ist der Unterschied zwischen Bevölkerung Mittel, bei denen Leistung und Probe Größe Berechnungen erfolgen (α = 5 %, β = 80 %); Zα = 1,96 und zβ = 0,84 sind die Quantile der Standardnormalverteilung. Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste dieses Protokolls. Ergibt ein Parameter des Protokolls einen Unterschied mit der Leitebene, das Tier sollten engmaschig überwacht, und der Parameter sollte wieder nach einem geeigneten Zeitraum gemessen werden. Zum Beispiel wenn Merkmal Angst Verhalten erhöht wird, sollte dieses Verhalten wieder eine Woche später getestet werden um festzustellen, dass der Zeitraum bis zur endgültigen Genesung. Zeitpunkte und Perioden, die in diesem Protokoll können für die Verwendung mit anderen Verfahren angepasst werden. Beim Wechsel von Zeitpunkten sollte Gewöhnung Perioden gehalten werden, wie im Protokoll beschrieben. Um Faktoren zu reduzieren, die die Mäuse Verhalten beeinflussen könnten, sollten Tests erfordern mehr Manipulation nach Tests durchgeführt werden, die das normale Verhalten von Mäusen nicht stören. Abbildung 2 fasst alle Tests des Protokolls mit einer Zusammenfassung Wertungsblatt. Abbildung 3 bietet vereinfachte Waagen der Klasse des Wohlbefindens, die geben einen Überblick über die Testergebnisse interpretieren.

(1) Mäuse zur Handhabung von Experimentator förderliche

  1. Können Sie Mäuse zu gewöhnen, das Tierhaus für mindestens 2 Wochen, nachdem sie von einer anderen Anlage oder Lieferanten vorliegen.
  2. Beherbergen Sie Mäuse in Gruppen und pflegen sie unter Standardbedingungen (Temperatur 22 ± 2 ° C; Relative Luftfeuchtigkeit 55 ± 10 %) auf einem hell: Dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr.
  3. Alle Gruppen mit einem Tunnel und Baumwolle Nestlets als standard Bereicherung bieten und liefern Nahrung und Wasser Ad Libitum.
  4. Gewöhnen Sie alle Mäuse, die Tunnel und/oder Behandlung mindestens eine Woche vor dem Test12Tasse.
    Hinweis: Abholung Mäuse am Schwanz induzieren kann, Stress oder Angst, die wiederum Auswirkungen auf Wohlbefinden und wirkt sich auch auf die Ergebnisse dieses Protokolls12.

2. Vorbereitung des Verhaltens Testraum und Apparate

Hinweis: Bieten Sie einen separaten Raum für die Prüfung, idealerweise in der Nähe der Zimmer, wo die Tiere gehalten werden. Transportieren Sie die Mäuse in ihren Hause Käfigen zum Test Zimmer mindestens 60 min., bevor das Verfahren durchgeführt wird. Wenn möglich, führen Sie alle Tests dieses Protokolls in der gleichen Testraum, wo der Eingriff durchgeführt wird.

  1. Bereiten Sie eine Beobachtung Käfig, grabende Verhalten8 zu testen und zu fotografieren für den Einsatz in der MGS-13 (Abbildung 4).
    1. Verwenden Sie ein Glaskasten mit einer Grundfläche von ca. 220 mm × 290 mm und einer Höhe von 390 mm.
    2. Bedecken Sie den Boden der Box mit ca. 0,5 cm Einstreu.
    3. Streuen Sie eine Handvoll gebrauchte Einstreu aus dem Hause Käfig auf die neuen Einstreu, Belastung durch die neue Umgebung zu reduzieren.
    4. Stellen Sie Lebensmittel, die gleiche Art, die normalerweise als Nahrung und Wasser versorgt wird.
      Hinweis: Wenn möglich, verwenden Sie Wasserflaschen, weil Mäuse Wasserschalen mit Einstreu füllen können.
  2. Bereiten Sie einen Käfig (Typ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) für die 24-h Beobachtungszeitraum für die Mäuse einzeln untergebracht sind (Abbildung 5).
    Hinweis: Um die Dauer der einzelnen Gehäuse zu minimieren, sammeln Sie Daten für Nestbau Verhalten, nach Hause Käfig Aktivität, Nahrungsaufnahme und fäkale Corticosteron Metaboliten (FCM) während dieser Periode.
    1. Statt neue Einstreu in den Käfig (ca. 0,5 cm tief) und streuen eine Handvoll gebrauchte Einstreu ohne Kot aus dem Hause Käfig auf das neue Material, um Stress zu reduzieren.
    2. Geben Sie eine standardisierte quadratische Baumwolle Nestlet von definiertem Gewicht, wie Umweltanreicherung nur (siehe Tabelle der Materialien)14.
      Hinweis: Kommerzielle Nestlets können in Gewicht abweichen. Daher wir das Gewicht der Nestlet von Diakon beschrieben geändert und 2,0 g statt 2,7 g14verwendet.
    3. Den Infrarot-Sensor auf der Oberseite des Käfigs zu montieren, wenn einen Infrarot-Sensor verwenden, um nach Hause Käfig-Aktivität zu messen (siehe Tabelle der Materialien).
    4. Nahrung, die gleiche Art, die normalerweise als Diät, angegeben ist und Wasser Ad Libitum.

3. Maus Grimasse Skala

Hinweis: Fotos für die MGS in den Käfig der Beobachtung zu drei Zeitpunkten getroffen werden: (i) 2 Tage vor dem Eingriff zu Rekord Ausgangswert MGS, (Ii) 30 min. nach dem Eingriff und (Iii) 150 min nach dem Eingriff. Wenn Wohlbefinden beeinträchtigt ist, erhöhen auf die MGS punktet. Wenn erhöhte MGS Noten nach 150 min noch beobachtet werden, fotografieren Sie zusätzliche zu einem späteren Zeitpunkt.

  1. Verwenden Sie eine High-Definition-Kamera für die Fotografie.
  2. Sanft übertragen Sie die Maus in den Käfig Beobachtung und lassen Sie die Maus, um auf die neue Umgebung für mindestens 30 min zu gewöhnen.
  3. Kontinuierlich dauert ca. 30-40 Fotos für jedes Mal zeigen innerhalb von 1-2 Minuten.
  4. Sortieren Sie alle Fotos, indem Sie die scharfen frontale oder seitliche Fotos auswählen und verwerfen von verschwommenen Fotos oder Fotografien, die Maus Gesichter aus anderen Perspektiven als frontale oder seitliche Ansicht zeigen.
  5. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie ein Foto aus jeden Zeitpunkt, (also 2 Tage vor der Prozedur, 30 min nach dem Eingriff und 150 min nach dem Eingriff) für jede Maus.
  6. Schneiden Sie die Fotos, um nur den Kopf der Maus zeigen, so dass die Körperposition nicht sichtbar13ist.
  7. Erstellen Sie eine Kalkulationstabellendatei mit ein Blatt für jedes Foto und fügen Sie eine Tabelle, einschließlich der fünf Gesichts Aktion Maßeinheiten der MGS, jedes Blatt.
    Hinweis: Die Datei enthält Baseline-Fotos sowie Fotos Post Verfahren.
  8. Variieren Sie die Reihenfolge der Blätter.
  9. Präsentieren Sie die Datei auf einem Computer-Bildschirm drei unabhängigen Personen, die zuvor trainiert wurden, verwenden die MGS von Langford Et Al. entwickelt und lassen die facial Action-Einheiten mit einem 3-Punkte-Skala Punkten (0 = nicht vorhanden, 1 = mäßig vorhanden, 2 = offensichtlich vorhanden).
    Hinweis: Scoring basiert auf folgenden Parameter13: Orbital anziehen ("Verengung des Bereichs orbital mit einem dicht geschlossenen Augenlid oder ein Auge Squeeze"); Nase Ausbuchtung ("gerundet Verlängerung der Haut sichtbar auf der Brücke der Nase"); Wange Ausbuchtung ("konvex Erscheinung von der Wange Muskel"); Ohr-Position ("Ohren auseinander gezogen und wieder von ihrer Grundlinienposition oder mit vertikalen Graten jene Form aufgrund der Spitzen der Ohren zurück gezogen"); Whisker Änderung ("Bewegung der Schnurrhaare von ihrer Grundlinie positionieren Sie entweder rückwärts, gegen das Gesicht oder nach vorne, als ob am Ende; Schnurrhaare können auch verklumpen").
  10. Analysieren von Partituren, wie folgt (adaptiert von Langford Et al. ( 13).
    1. Durchschnittlich alle facial Action-Einheiten für jedes Foto um die MGS Partitur zu generieren.
      Hinweis: Wenn eine Gesichtsbehandlung Aktion Einheiten nicht erzielt werden konnte, Durchschnitt die Resteinheiten facial Action.
    2. Subtrahieren Sie den Mittelwert für die Baseline-Fotos vom Mittelwert für die Fotos Post Verfahren für jede Maus ein MGS Unterschied Ergebnis zu erhalten.
    3. Test für Unterschiede in den Partituren MGS Unterschied zwischen den Personen (nichtparametrische Test für Verwandte Proben).
      Hinweis: Besteht ein signifikanter Unterschied (p < 0,05), festzustellen Sie, ob Resultate von allen Fotos oder nur Resultate von ein paar Fotos zwischen den Personen unterscheiden. Wenn Letzteres zutrifft, wiederholen Sie die Bewertung dieser Fotografien. Andernfalls sollten Personen wiederholen der MGS-Training und dann die Fotos wieder Punkten.
    4. Durchschnittlich erreicht die MGS Unterschied Noten aus den verschiedenen Torschützen für jede Maus, wenn Ergebnisse aller Personen nicht wesentlich unterscheiden.
    5. Verwenden Sie einen nichtparametrischen statistische Test der MGS Unterschied Kerben im Durchschnitt zwischen den Studiengruppen vergleichen.

(4) Graben Verhalten8,15,16

  1. Bereiten Sie Höhlen, indem man 140 ± 2 g Lebensmittel Pellets normalerweise als Ernährung in einem standard opaken Kunststoff Flasche Wasser (250 mL, 150 mm Länge, 55 mm Durchmesser, 45 mm Durchmesser der Flaschenhals)8geliefert.
    Hinweis: Da Mäuse große Röhren bevorzugen, Höhlen mit einem Durchmesser von 68 mm einsetzbar wie von Diakon16beschrieben.
  2. Ort der Höhle voller Lebensmittel Pellets im Hause Käfig 5 Tage vor dem Eingriff zum akklimatisieren.
    Hinweis: Die regelmäßige Essen-Abgabe Einheit im Käfig sollte nicht entleert werden aber sollte auch mit Essen Pellets gefüllt bleiben, da Mäuse verwendet werden dazu.
  3. Führen Sie den Test zweimal, 2 Tage vor dem Eingriff (Baseline); die letzten 30 min Post Verfahren durchführen.
    1. Lassen Sie die Maus für mindestens 30 min an der Beobachtung Käfig gewöhnen, wo für die MGS fotografiert wurden.
    2. Legen Sie die Plastikflasche Wasser gefüllt mit Essen Pellets parallel an der hinteren Wand des Käfigs Beobachtung.
    3. Wiegen Sie essen Pellets (g) noch in den Fuchsbau nach 2 h.
  4. Berechnen Sie das Gewicht von Essen Pellets aus der Höhle von Mäusen im Vergleich zu ursprünglichen Gewichts (%) entfernt.

(5) 24-h Beobachtungszeitraum

Hinweis: Mäuse sind individuell, wie unter 2.2 untergebracht. (Abbildung 5), für einen Zeitraum von 24 h, um Nahrung zu messen Aufnahme, nach Hause Käfig Aktivität nisten Gebäude Verhalten und FCM Ebenen. Die 24-h-Beobachtung findet zweimal statt: (i) 2 Tage vor dem Eingriff für Ausgangswerte, (Ii) am Tag des Eingriffs.

  1. Nahrungsaufnahme
    1. Wiegen Sie die Mäuse in regelmäßigen Abständen (z. B. 2 Tage vor der Narkose, unmittelbar vor der Narkose, 2 Tage nach der Narkose und wöchentlich nach der Narkose), um Änderungen des Körpergewichts (Bestandteil der Bewertungsbogen) zu bewerten.
      Hinweis: Körpergewicht ist erforderlich, um Nahrungsaufnahme pro Gramm Körpergewicht zu berechnen. Wasseraufnahme kann auch während des Beobachtungszeitraums von 24 h gemessen werden. Wenn Nahrungsaufnahme reduziert wird, kann Wohlbefinden beeinträchtigt werden.
    2. Bestimmen Sie das Ausgangsgewicht der standard Food Ernährung (Gramm) in der Lebensmitteleinheit des Käfigs (ca. 100 g) zur Verfügung gestellt.
    3. Bestimmen Sie das Gewicht der standard Food Ernährung am Ende des Beobachtungszeitraums 24-h.
    4. Scannen der Käfig-Seite unter das Essen Gerät sorgfältig auf Essen verschütten und fügen zusätzliche Nahrung Pellets gefunden, um das Gewicht der Lebensmittel Pellets bleiben in der Lebensmitteleinheit.
    5. Berechnen Sie Nahrungsaufnahme pro Einheit Körpergewicht.
  2. Home-Käfig-Aktivität
    Hinweis: Die folgenden Anweisungen beziehen sich auf die Nutzung eines Infrarot-Sensors (siehe Tabelle der Materialien), aber nach Hause Käfig Tätigkeit auch mit alternativen Programmen beurteilt werden kann. Abweichung nach Hause Käfig Aktivität von Gruppenstufen (z.B. Hypoaktivität, Hyperaktivität) kann ein Zeichen von Wohlbefinden beeinträchtigt sein.
    1. Starten Sie das Programm.
    2. Wählen Sie ein Probe-Intervall von 1 min und einer Erfassungszeit von 24 h, was bedeutet, dass Impulse pro Minute 24 Stunden aufgezeichnet werden.
      Hinweis: Wenn der Experimentator den Raum mehrmals betritt nach Aufnahme gestartet, nur verwenden Daten aus Zeiten, als die Mäuse nicht gestört waren (d.h. während der dunklen Periode).
    3. 10-min-Abständen Impulse zusammenzufassen.
    4. Berechnen Sie die Fläche unter der Zeitkurve (Impulse × min).
  3. Nest-Bau-Verhalten
    Hinweis: Komplexe und hochwertige Nester dienen als Indikator für Wohlbefinden.
    1. Legen Sie einen quadratischen Baumwoll-Nestlet (siehe Tabelle der Materialien) mit definiertem Gewicht (z.B. 2,0 g) in der Mitte des Käfigs.
    2. Punkten Sie das Nest auf einer 5-Punkte-Skala (siehe unten) nach Deacon14 am nächsten Morgen, ca. 2 h nach das Licht anmacht. Wiegen Sie alle Leistungs Nestlet Stücke, die mindestens 5 % des ursprünglichen Nestlet Gewichts. Die Nester folgendermaßen14 Punkte
      1. Weisen Sie Punktzahl "1", wenn 90 % der intakten Nestlet.
      2. Weisen Sie Score von "2", wenn es 50-90 % intakt ist.
      3. Weisen Sie Gäste "3", wenn 50-90 % der Nestlet zerkleinert ist.
      4. Weisen Sie Note "4", wenn mehr als 90 % vernichtet aber Nest flach ist und weniger als 50 % seines Umfangs höher als Maus Körpergröße ist wenn zusammengerollt.
      5. Weisen Sie "5" Punkte, wenn mehr als 90 % Nestlet zerkleinert und Nest ist hoch und mehr als 50 % seines Umfangs ist höher als die Körpergröße einer zusammengerollt Maus.
  4. Fäkale Corticosteron Metaboliten
    Hinweis: Erhöhungen der FCM über die Steuerungsebene spiegeln akute Stressbelastung im 24-h postanesthetic Zeitraum.
    1. Sammeln Sie alle trocken fäkal-Pellets aus dem Käfig mit Zange am Ende des Beobachtungszeitraums 24-h und beseitigen Sie feuchte Pellets mit Urin verschmutzt.
    2. Extrahieren der FCM nach Palme Et al. 17wie folgt.
      1. Trockenen Stuhlproben bei einer Temperatur von 60-70 ° C.
      2. Stuhlproben mit einem Mörser zu homogenisieren.
      3. Schütteln Sie ein Aliquot von 0,05 g mit 1 mL 80 % Methanol in ein Zentrifugenröhrchen für 30 min auf eine Multi-Vortex.
      4. Zentrifugieren Sie Proben bei 2500 X g für 15 Minuten.
      5. 0,5 mL Überstand in ein anderes Zentrifugenröhrchen Pipette.
      6. Lagern Sie Stuhlproben (und Extrakte) bei mindestens-18 ° c
      7. FCM mit einem 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one Enzym Immunoassay (EIA)18,19 oder einem anderen vollständig validierten UVP zu analysieren.
    3. Berechnen Sie die prozentuale Veränderung der FCM Konzentrationen bezogen auf die Grundlinie FCM-Konzentrationen.

6. kostenlose explorative Paradigma

  1. Nehmen Sie die Heimat Käfig aus dem Rack und legen Sie es auf einer Tischfläche am Ende des Beobachtungszeitraums 24-h.
  2. Legen Sie eine gerasterten Käfig-Spitze (ohne Nahrung oder Wasser in Flaschen) in den Käfig in einem Winkel von 45° zur längeren Seite des Käfigs.
    Hinweis: Zerstöre nicht das Nest, das dient als Versteck für die Maus, sondern legen Sie den Käfig oberen diagonal über das Nest.
  3. Monitor oder Video-Aufzeichnung der Mäuse für 10 min aus einer Entfernung von ca. 1,5 m.
    1. Der Timer gestartet wird.
    2. Beachten Sie alle Zeiten, wenn die Maus klettert auf den Käfig-Spitze (mit allen vier Pfoten auf den Käfig-Spitze) oder lässt die Käfig-Spitze (mit einer oder mehreren Pfoten auf den Boden).
      Hinweis: Einige Mäuse können der Käfig-Spitze hinauf und es zu verlassen, um zu Fuß entlang der Kante des Käfigs. Einige Mäuse auch hinten auf den Käfig-Spitze. Diese Fälle zu behandeln, als wären die Mäuse immer noch auf die Käfig-Spitze.
  4. Bewerten Sie Parameter nach Bert Et al. 20.
    1. Latenz zum ersten Exploration (in Sekunden) zu analysieren.
    2. Anzahl der Erkundungen zu analysieren.
    3. Gesamtdauer (Sekunden) der Exploration zu analysieren.
      Hinweis: Eine hohe Latenz erste Erforschung, eine geringe Anzahl von Erkundungen und einer geringen Gesamtdauer der Exploration kann höhere Trait Angst Ebenen angeben.

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Representative Results

Dieses Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um Wohlbefinden C57BL/6JRj Mäuse nach einer einzigen Erfahrungen mit Isoflurane Narkose zu bewerten (eine 45-min-Anästhesie-Sitzung, n = 13 Weibchen) oder wiederholte Isoflurane Narkose (sechs 45-min-Anästhesie-Sessions mit 3-4 Tage zwischen den Sitzungen Anästhesie, n = 13 Frauen) im Vergleich mit dem Wohlergehen der Kontroll-Mäusen (n = 6 Hündinnen)10, die keine Anästhesie erhielt aber wurden nach den gleichen Maßnahmen getestet. Wir beurteilen die Auswirkungen einer einzigen Erfahrung von Isofluran-Narkose und wiederholte Isoflurane Narkose auf das Wohlbefinden von C57BL/6JRj Mäusen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen. Hier repräsentative Ergebnisse der weiblichen Mäusen C57BL/6JRj, einschließlich einige Daten vorher veröffentlicht in Hohlbaum Et al. 10, als auch bisher unveröffentlichte Ergebnisse werden angezeigt.

Statistische Analyse

Explorative Datenanalyse und Tests auf Normalverteilung wurden für jeden Parameter durchgeführt. Unterschiede zwischen den Studiengruppen (d.h. Kontrolle, einzelne Isoflurane Narkose wiederholt Isoflurane Narkose wurden mit den jeweiligen Test analysiert, wie in der Abbildung Legenden erwähnt. Wenn Daten Normalverteilung Annahmen erfüllt, wurde 1-Way ANOVA durchgeführt. Non-normalerweise verteilte Daten wurden analysiert mit Hilfe der Kruskal-Wallis-Test Unterschiede signifikant p < 0,05 galten.

Ausgangswerte

Ausgangswerte, gesammelt, bevor das Verfahren durchgeführt wird, sind von entscheidender Bedeutung, um festzustellen, ob Behandlungsgruppen in den jeweiligen Parameter unterscheiden. Wie in Abbildung 6, Bild 7, Bild 8, Abbildung 9 und Abbildung 10veranschaulicht, Ausgangswerte für die MGS Punkte (p = 0.762, Kruskal-Wallis-Test), Luxus-Verhaltensweisen wie Graben (p = 0.896, Kruskal-Wallis-Test) und Verschachtelung (p = 0.723, Kruskal-Wallis-Test), Nahrungsaufnahme (p = 0.398, 1-Way ANOVA), und nach Hause Käfig Aktivität (p = 0,208, Kruskal-Wallis-Test) nicht signifikant zwischen den Gruppen unterscheiden. Darüber hinaus fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der Baseline FCM Konzentrationen (Median, interquartile Range in Klammern [ng/50 mg]: Kontrolle: 123.01 (82.70-193.46), einzelne Anästhesie: 118,31 (101.73-153.54), wiederholte Betäubung: 129.55 (92.58-139.48)) (p) (= 0,904, Kruskal-Wallis-Test). Wenn Unterschiede in der Baseline auftreten, können Delta-Werte berechnet werden.

Maus Grimasse Skala

Beim Vergleich der Mittelwerte der MGS wurden deutliche höhere Werte im Vergleich zu der Kontrolle nach den einzelnen Erfahrungen der Anästhesie gefunden (p = 0,001) und nach der letzten Narkose Sitzung wiederholt (p = 0,021) verursacht bei 30 min nach der letzten Narkose (Abb. 6A) . Bei 150 min nach der letzten Narkose, gab es keine Unterschiede zwischen den Gruppen (p = 0.910).

Um der Tatsache Rechnung tragen, dass Grundlinie MGS Partituren nicht in allen Fällen gleich 0 sind, wurde die MGS Unterschied Punktzahl berechnet, wie im Protokoll beschrieben. Beide eine einzige Erfahrung in der Anästhesie (p = 0,002) und wiederholte Anästhesie (p = 0,008) erhöht die MGS Unterschied Noten im Vergleich zu der Kontrolle bei 30 min nach der Narkose. Bei 150 min nach der letzten Narkose, alle Mäuse zu Gruppenstufen zurückgekehrt war (p = 0.617) (Abb. 6 b)10.

Grabende Verhalten

Wiederholte Anästhesie deutlich reduziert den Prozentsatz des Gewichts von Lebensmitteln pellets Mäuse aus der Höhle gegen das Steuerelement entfernt (p = 0,036, Kruksal-Wallis-Test) (Abbildung 7)10.

Nest-Bau-Verhalten

Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Partituren Nest zwischen einer einzigen Erfahrung der Anästhesie, wiederholte Betäubung und die Kontrolle (p = 0,240, Kruksal-Wallis-Test) (Abbildung 8)10.

Nahrungsaufnahme

1 Tag nach der letzten Narkose, Mäuse, die wiederholten Narkose zeigte deutlich unterzogen hatte reduziert Nahrungsaufnahme verglichen mit Mäusen, die einzigen Anästhesie erlebt hatte (p = 0,047, 1-Way ANOVA). Im Gegensatz dazu eine Woche später, Mäuse, die erhielten, hatte wiederholt Anästhesie verbraucht wesentlich mehr Nahrung als Steuerelemente (p = 0,012, 1-Way ANOVA) oder Mäuse, die eine einzelne Anästhesie erhalten hatte (p = 0,001, 1-Way ANOVA) (Abbildung 9)10.

Home-Käfig-Aktivität

1 Tag nach der letzten Narkose, nach Hause Käfig Aktivität während der dunklen Periode durch die Fläche unter der Kurve Aktivität angegeben deutlich unterschieden sich nicht unter den Mäusen, die eine einzelne Anästhesie, wiederholte Betäubung oder Kontrollbehandlung erhalten hatte (p = 0.498, Kruskal-Wallis-Test) (Abbildung 10)10.

Kostenlose explorative Paradigma

Alle Mäuse untersucht die Käfig-Spitze, wenn der Test durchgeführt wurde. Jedoch 1 Tag nach der letzten Narkose, Mäuse, die erhielten, hatte wiederholt Anästhesie (Median, interquartile Range in Klammern [s]: 78.00 (55,00-89,00)) erforscht die Käfig-Spitze deutlich später in der Zeit, als Steuerelemente haben (31,00 (18.25-42,75); p = 0.009, Kruskal-Wallis-Test) und Mäuse, die eine einzelne Anästhesie erhalten hatte (27.00 (21.00 Uhr-45,50); p = 0,001, Kruskal-Wallis-Test), wie bereits veröffentlicht10. Die Gesamtdauer der Parameter der Exploration (Abbildung 11A) und Anzahl der Erkundungen (Abbildung 11 b) sind analog zu der Latenz, erste Erkundung. Wiederholte Anästhesie deutlich reduziert die Anzahl der Erkundungen versus Kontrolle (p = 0,023, Kruskal-Wallis-Test) und die Gesamtdauer der Exploration (p = 0,032, Kruskal-Wallis-Test) im Vergleich zu einem einzigen Anästhesie am 1. Tag nach der letzten Narkose. 8 Tage nach der letzten Narkose, alle Parameter, d. h. Latenz zur ersten Erkundung (Kontrolle: 27,50 (13,50-47.25); einzelne Anästhesie: 18.00 Uhr (9.50-38,50); wiederholte Anästhesie: 20,00 (12,50-42,00); p = 0.722, Kruskal-Wallis-Test), Anzahl der Erkundungen (p = 0.057), und die Gesamtdauer der Exploration (p = 0.579), nicht mehr unterschieden zwischen den Studiengruppen (Abbildung 11).

Fäkale Corticosteron Metaboliten

Um berücksichtigen die Baseline-Werte erhalten, die prozentuale Veränderung relativ zur Grundlinie wurde berechnet und fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (p = 0,119, Kruskal-Wallis-Test) (Abbildung 12)10.

Figure 1
Abbildung 1 : Linie des Protokolls Zeit. Graue und weiße farbige Felder symbolisieren die Dunkelheit und Licht Perioden eines Tages bzw.. Je nach Verfahren kann dieses Protokoll angepasst werden. "Gewöhnung an den Fuchsbau" bedeutet, dass Mäuse akklimatisiert werden, mit der Plastikflasche Wasser als eine Höhle in ihrer Heimat Käfig, bevor die grabende Prüfung durchgeführt werden kann. B, Ausgangswert; FCM, fäkale Corticosteron Metaboliten. Diese Zahl wurde von Hohlbaum Et Al. modifiziert 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Zusammenfassung Wertungsblatt. Dieses Blatt enthält alle Tests und kann für jede einzelne Maus ausgefüllt werden. Datum und Uhrzeit sollte hinzugefügt werden, wenn der Test durchgeführt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Waagen der Klasse des Wohlbefindens. Die Skalen reichen von "unbeeinträchtigt Wohlbefinden" (grün), "Wohlbefinden beeinträchtigt" (rot) und Express die Bedeutung der Testergebnisse in vereinfachter Weise. In diesem Stadium des Wissens auf Indikatoren für Wohlbefinden kann nicht wir eine eindeutige Aussage über den Grad des Wohlbefindens für jeden Test, nur eine allgemeine Aussage machen. MGS, Maus Grimasse Skala. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Beobachtung Käfig. Dieser Käfig dient für den Test der grabende Verhalten und fotografieren nach Maus Grimasse Skala (MGS) analysiert werden. Die Vorderseite des Käfigs ist klar und je nach den Fellfarben der Mäuse, die anderen drei Wände gefärbt werden, entweder schwarz oder weiß zu kontrastieren mit den Mäusen. Der Boden der Glasbox ist mit ca. 0,5 cm einschließlich gebrauchte Einstreu aus dem Hause Käfig Einstreu bedeckt. Standard-Food und Wasser sind vorhanden. Wenn möglich, sollten Wasserflaschen anstatt Schalen verwendet werden, da Mäuse Schalen mit Einstreu füllen können. Nach kurzer Gewöhnung von mindestens 30 min wird der Fuchsbau hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : 24 h Beobachtungszeitraum. Nestbau Verhalten, nach Hause Käfig Aktivität und Nahrungsaufnahme zu beurteilen und Stuhlproben, fäkale Corticosteron Metaboliten (FCM) Messen sammeln, Mäuse sind einzeln für 24 h untergebracht (Käfig Typ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm; Einstreumaterial ca. 0,5 cm tief mit gebrauchte Einstreu aus dem Hause Käfig verstreut an der Spitze, eine Baumwolle Nestlet, Leitungswasser und standard-Food Ernährung Ad Libitum). Ein Infrarot-Sensor ist auf der Oberseite des Käfigs montiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Maus Grimasse Skala (MGS). Das Feld stellt den Interquartilbereich (IQR), Feld Kanten sind 25th und 75th Quartil. Die Schnurrhaare sind Werte, die nicht größer als 1,5 × IQR sind. Punkte sind Ausreißer mit Werten zwischen 1,5-3,0 × IQR. Farbigen Sternchen sind Ausreißer mit Werten größer als 3,0 × IQR. (A) bedeuten MGS zu erzielen. (B) bedeuten MGS Unterschied Partitur. p-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test berechnet: * p < 0,05; ** p < 0,01. Aufgrund einer technischen Störung (Kamera, Skala) hatte vier Mäuse in der einzigen Anästhesie-Gruppe von der Statistik ausgeschlossen werden. Diese Zahl wurde von Hohlbaum Et Al. modifiziert 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Graben Verhalten. Das Feld stellt den Interquartilbereich (IQR), Feld Kanten sind 25th und 75th Quartil. Die Schnurrhaare sind Werte, die nicht größer als 1,5 × IQR sind. Farbigen Sternchen sind Ausreißer mit Werten größer als 3,0 × IQR. p-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test berechnet: * p < 0,05. Vier Mäuse in der einzigen Anästhesie-Gruppe musste aufgrund einer technischen Störung (Kamera, Skala) aus der statistischen Analyse ausgeschlossen werden. Diese Zahl wurde von Hohlbaum Et Al. modifiziert 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Nestbau Verhalten. Das Feld stellt den Interquartilbereich (IQR), Feld Kanten sind 25th und 75th Quartil. Die Schnurrhaare sind Werte, die nicht größer als 1,5 × IQR sind. Punkte sind Ausreißer mit Werten zwischen 1,5-3,0 × IQR. p-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test berechnet; d, Tag. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9 : Nahrungsaufnahme. Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung. p-Werte wurden mit 1-Way ANOVA (Post-hoc-Tukey-HSD) berechnet: * p < 0,05; ** p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10 : Home Käfig Aktivität. Das Feld stellt den Interquartilbereich (IQR), Feld Kanten sind 25th und 75th Quartil. Die Schnurrhaare sind Werte, die nicht größer als 1,5 × IQR sind. Punkte sind Ausreißer mit Werten zwischen 1,5-3,0 × IQR. p-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test berechnet Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11 : Kostenlose explorative Paradigma. Das Feld stellt den Interquartilbereich (IQR), Feld Kanten sind 25th und 75th Quartil. Die Schnurrhaare sind Werte, die nicht größer als 1,5 × IQR sind. Punkte sind Ausreißer mit Werten zwischen 1,5-3,0 × IQR. Farbigen Sternchen sind Ausreißer mit Werten größer als 3,0 × IQR. (A) die Gesamtdauer der Exploration. (B) Anzahl der Erkundungen. p-Werte wurden mit Kruskal-Wallis-Test berechnet: * p < 0,05. Diese Zahl wurde von Hohlbaum Et Al. modifiziert 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12 : Fäkale Corticosteron Metaboliten (FCM). Das Feld stellt den Interquartilbereich (IQR), Feld Kanten sind 25th und 75th Quartil. Die Schnurrhaare sind Werte, die nicht größer als 1,5 × IQR sind. Farbigen Sternchen sind Ausreißer mit Werten größer als 3,0 × IQR. FCM waren 2 Tage und 1 Tag post-Verfahren gemessen. Die prozentuale Veränderung [%] der FCM-Konzentrationen im Vergleich zu entsprechenden Ausgangswert wurden berechnet. Daten wurden mittels Kruskal-Wallis-Test analysiert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um Wohlbefinden von Mäusen C57BL/6JRj zu ermitteln, die entweder eine einzelne Anästhesie oder wiederholtes Isoflurane Narkose erhalten. Die Ergebnisse bestätigen, dass Tests Luxus Verhaltensweisen sowie andere Maßnahmen (z. B. das kostenlose explorative Paradigma der MGS, grabende Nahrungsaufnahme) sensible Methoden wurden für die Beurteilung von Wohlbefinden. Wiederholtes Isoflurane Narkose verursacht kurzfristige Auswirkungen auf Merkmal Angst-Verhalten, MGS und grabende Verhalten. Darüber hinaus schien wiederholte Isoflurane Narkose Essen Aufnahme10beeinflussen.

Das kostenlose explorative Paradigma angegebenen reduzierten exploratives Verhalten und folglich höheren Merkmal Angstniveaus bei Mäusen, die wiederholt betäubt wurden verglichen mit Mäuse nur einmal betäubt und die Steuerelemente. Jedoch erforscht Mäuse aller Gruppen der gerasterten Käfig Top10,20. Bei der Untersuchung von Verhalten im Zusammenhang mit der Angst, ist es wichtig zu unterscheiden zwischen Merkmal und Staat Angst21,22. Platzieren des Cursors in einer fremden Umgebung induziert Zustand Angst. Im Gegensatz dazu das kostenlose explorative Paradigma ermöglicht die Tiere in ihren Käfigen zu Hause bleiben und so untersucht Trait Angst.

Der Rückgang der explorativen Verhalten bei Mäusen nach wiederholten Narkose durch verminderte motorische Aktivität erklärt werden kann. Nach Hause Käfig Aktivität während der dunklen Periode unterscheiden sich nicht signifikant zwischen den Studiengruppen. Dies bedeutet, dass Mäuse bereits physisch aus der Narkose erholt hatte, wenn die freie explorative Paradigma-Test durchgeführt wurde.

Die MGS wurde eigentlich entwickelt, um Schmerzen zu beurteilen, aber es gibt Beweise, dass die Mimik auch durch Stress und positive Emotionen13,23geändert werden. Die Fotos von der Maus Gesichtern angegeben, dass sowohl Einzel- und wiederholte Isofluran-Narkose Punktzahlen auf die MGS über die kurzfristigen in der Zeit unmittelbar nach dem Narkose erhöht. Die MGS Unterschied Partitur unter 1 blieb, schien das Niveau des Druckes zu milden10zu sein. Die Ergebnisse stimmen mit neueren Beobachtungen von Miller Et al. 24 , 25 und zeigten, dass Mäuse kehrte nach Level 150 min Steuern Anästhesie10Posten.

Luxus Verhaltensweisen wie wühlen und Nestbau Verhalten sind artspezifisch und können als Indikatoren für Wohlbefinden7 und gute allgemeine Gesundheit in Mäusen26dienen. Mäuse zeigen nur Luxus Verhaltensweisen, wenn ihre Grundbedürfnisse erfüllt sind. Wenn Wohlbefinden reduziert wird, sind Luxus Verhaltensweisen die ersten beeinträchtigt5,7sein. Frühere Studien haben gezeigt, dass wühlen und Nestbau werden, um Schmerzen und Qualen6,8 beeinträchtigt können, aber es auch Hinweise gibt, dass hippokampale Läsionen diese beiden Verhaltensweisen15,27 beeinflussen , 28 , 29 , 30 , 31.

Luxus Verhaltensweisen wurden in der frühen Post-Narkose (wühlen Verhalten) und bis zum Morgen des folgenden Tages (Nestbau Verhalten) untersucht. Der Test für das Verhalten von Diakon Et Al. entwickelt und von Jirkof Et Al. Graben wurde geändert in Bezug auf Akklimatisation (Gruppenhaltung statt individuelle Gehäuse) und Verhaltensstörungen Messdauer (nur 2 h statt 24 h) 8 , 15 , 16.

Es ist bemerkenswert, die wiederholte Anästhesie reduziert grabende Verhalten, was darauf hindeutet, dass gab es eine Beeinträchtigung des Wohlbefindens sofort buchen Anästhesie10, die auch von Jirkof Et Al. berichtet wurde 8. aber am Morgen des folgenden Tages, wenn Mäuse mehr Zeit hatten, um aus der Narkose zu erholen, die hohe und komplexe Nester, die sie gebaut hatte angedeutet, dass sie wohl10erlebten. Diese Ergebnisse unterscheiden sich von früheren Berichten, die Nester in eine frühere Zeit32erzielte. Daher ist es möglicherweise sinnvoll, zur Anpassung des Protokolls und Nester früher in der Zeit der Gäste. Allerdings müssen den zirkadianen Rhythmus der Nestbau Verhalten noch berücksichtigt werden, wie Mäuse neigen dazu, ihre Nester am Ende der Dunkelphase32vorzubereiten.

Nahrungsaufnahme war 1 Tag nach der wiederholten Narkose geringfügig zurückgegangen, aber es war eine Woche später erhöht. Da Mäuse nicht Körpergewicht verloren hat (siehe Hohlbaum Et Al. 10) eine Art Ausgleichsmechanismus kann auftreten und Beeinträchtigung des Wohlbefindens in Bezug auf Nahrungsaufnahme sollte als mild10eingestuft werden. Nahrungsaufnahme Einblick in postoperativen Not, Wohlbefinden und Appetit in Mäusen, die durch postoperative Übelkeit26 und postoperative Stress27beeinträchtigt werden kann.

FCM zuverlässig anzeigen Stress bei Mäusen33,34,35. Der FCM Konzentrationen in der Regel 8-10 h nach einem Stressor auftreten aber richten sich nach der Darmpassage Zeit18. Daher ist es entscheidend, auch zu Hause Käfig Aktivitäten zu überwachen, wie in diesem Protokoll enthalten. Aufgrund der zirkadianen Rhythmus Wirkung auf ausgeschiedenen FCM18ist es ratsam, Kotproben über einen Zeitraum von 24 Std. FCM Konzentrationen reflektierten akutem Stress im 24-h Post-Narkose Zeitraum sammeln. Da FCM Ebenen von Individuum zu Individuum unterschiedlich sind, wurde die prozentuale Veränderung der FCM Ebenen relativ zur Grundlinie berechnet. Die FCM-Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung darauf hingewiesen, dass weder eine Erfahrung der Narkose noch wiederholte Betäubung Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA) Achse Aktivität10deutlich erhöht.

Alles in allem zeigten die Ergebnisse, dass wiederholte Isoflurane Narkose verursacht kurzfristige milde Not und Wohlbefinden in der frühen postanesthetic Periode, die etwas mehr als eine einzige Erfahrung von Isoflurane Narkose10beeinträchtigt.

Ein Protokoll zum Wohlbefinden beurteilen sollten keine zusätzliche Belastung auf die Tiere vorschreiben. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass es individuelle Gehäuse während des Beobachtungszeitraums von 24 h, die bekanntlich Plasma Corticosteron Level36zu erhöhen. Individuelle Gehäuse ist jedoch notwendig, valide Daten für Einzelpersonen in Bezug auf home Käfig Aktivität, Nahrungsaufnahme, Nest Gebäude Verhalten und FCM Ebenen zu sammeln. Die Dauer der einzelnen Gehäuse minimiert wurde durch die Untersuchung dieser vier Parameter zur gleichen Zeit (d. h. während des Beobachtungszeitraums von 24 h). Damit die Ergebnisse nicht voreingenommen, durch individuelle Gehäuse, Kontroll-Mäusen die gleichen Tests unterzogen und die Ergebnisse berücksichtigt wurden. Wenn Methoden zur Messung dieser Parameter in einer Gruppenhaltung Umgebung zur Verfügung stehen, sollte sie verwendet (z. B.ein automatisierte Home-Käfig-Analysesystem für Zuhause Käfig Aktivität37 und Nahrungsaufnahme). Automatisierte home Käfig-Analyse-Systeme erfordern jedoch zusätzliche Ausrüstung, die möglicherweise nicht zur Verfügung. In Studien mit Schwerpunkt auf Gruppen von Tieren anstelle von Einzelpersonen, nach Hause Käfig Aktivität, Nahrungsaufnahme, nisten Gebäude Verhalten, und FCM Ebenen können auch für eine Gruppe von Mäusen ausgewertet werden. Das gleiche gilt für die kostenlose explorative Paradigma, das erfordert nur die Mäuse sichtbar markiert werden, so dass sie unterschieden werden können. Wohlbefinden in einer Gruppe reduziert wird, sollten alle Mäuse in der Gruppe sorgfältig geprüft werden (mit dem Notenblatt und der klinischen Untersuchung) besorgt, die Maus oder Mäuse zu identifizieren. Weitere Beobachtungen auf Konzernebene sind erforderlich, um die Empfindlichkeit der Gruppenwerte zu bestimmen.

Im Hinblick auf Raffinesse kann dieses Protokoll angepasst und integriert in laufenden Studien zur Bewertung der Auswirkungen eines besonderen Verfahrens auf das Wohlbefinden von Mäusen. Je nach den besonderen Verfahren und Studie Design sollte die am besten geeigneten Tests aus diesem Protokoll gewählt werden. Hier schien die wühlen und Nestbau Test, MGS, kostenlose explorative Paradigma und Messung der Nahrungsaufnahme besonders vorteilhaft. Verhalten von Mäusen Tagesrhythmus38folgt, ist es ratsam, Verhaltensstörungen Tests bei Mäusen aller Gruppen zu einem definierten Zeitpunkt durchführen. Mäuse sind am Morgen als nachmittags38aktiver. Jedoch wenn das Studiendesign für den Test am Morgen nicht zulässt, kann der Test zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass jede einzelne Prüfung zu den gleichen Zeitpunkten für alle Gruppen erfolgt. Andernfalls kann die Auswirkungen des zirkadianen Rhythmus der Parameter Intra- oder interfraktionellen Unterschiede ergeben. Darüber hinaus sollten Kontroll-Mäusen in der Studie vorhanden sein, damit die Ergebnisse von behandelten Mäuse und Kontroll-Mäusen verglichen werden können. Kontroll-Mäusen müssen zum gleichen Zeitpunkt als behandelten Mäuse getestet werden. Wenn das Protokoll zeigt, dass Wohlbefinden beeinträchtigt ist, sollte das Verfahren verfeinert werden, und das Protokoll wiederholt. Dieser Ansatz zeigt, ob die Bemühungen um das Verfahren zu verfeinern wirksam waren.

Dieses Protokoll dient als eine allgemeine Hilfe, Schweregrad, verursacht durch ein Verfahren zu schätzen. Daher hilft es, um den Schweregrad eines Verfahrens auf wissenschaftlich - und Tier-zentrierte Ebene zu klassifizieren. Allerdings bietet das Protokoll eine Skala keinen für die Klassifizierung eines Verfahrens als leichter, mittelschwerer oder schwerer. Um den Schweregrad eines Verfahrens zu klassifizieren, ist es notwendig, auf die Beispiele in Anhang VIII der EU-Richtlinie 2010/63 beziehen.

Abschließend unterstützt dieses Protokolls eine systematische Bewertung des Wohlbefindens bei Mäusen auf wissenschaftliche, Tier-zentrierten Weise folgt, in dem allgemeiner Anästhesie verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Dank Sabine Jacobs für die Unterstützung bei der Probenentnahme, Edith Klobetz-Rassam für Analyse der FCM PD Dr. med. vet. habil.. Roswitha Merle für die Unterstützung mit statistischer Auswertung und Wiebke Gentner für das Korrekturlesen der Handschrift. Die Studie ist Teil der Forschungsplattform Berlin-Brandenburg BB3R (www.bb3r.de) und wurde gefördert durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (Gewährungsnummer: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluran CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH 1214
InfraMot - Sensore Units TSE Systems 302015-SENS
InfraMot - Control Units TSE Systems 302015-C/16
InfraMot - Software TSE Systems 302015-S
Nestlet N Ancare - Plexx NES3600
Camera EOS 350D Canon

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References

  1. 2010 EU. Directive 2010/63/EU. Official Journal of the European Union. L276/33-L276/29 (2010).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. The principles of humane experimental technique. London: Methuen. (1959).
  3. Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116, (16), 431-436 (1985).
  4. Bugnon, P., Heimann, M., Thallmair, M. What the literature tells us about score sheet design. Lab Anim. 50, (6), 414-417 (2016).
  5. Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiol Behav. 92, (3), 375-397 (2007).
  6. Arras, M., Rettich, A., Cinelli, P., Kasermann, H. P., Burki, K. Assessment of post-laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate variability. BMC Vet Res. 3, 16 (2007).
  7. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. J Neurosci Methods. 234, 139-146 (2014).
  8. Jirkof, P., et al. Burrowing behavior as an indicator of post-laparotomy pain in mice. Front Behav Neurosci. 4, 165 (2010).
  9. Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 45, (1), 1-13 (2011).
  10. Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in C57BL/6JRj mice-Assessing the degree of distress. PLoS ONE. 12, (6), e0179588 (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8, (6), e1000412 (2010).
  12. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7, (10), 825-826 (2010).
  13. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, (6), 447-449 (2010).
  14. Deacon, R. M. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 1, (3), 1117-1119 (2006).
  15. Deacon, R. M., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12, (9), 2053-2057 (2001).
  16. Deacon, R. M. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat Protoc. 1, (1), 118-121 (2006).
  17. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M. F., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Wien Tierarz Monats. 100, (9-10), 238-246 (2013).
  18. Touma, C., Palme, R., Sachser, N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Horm Behav. 45, (1), 10-22 (2004).
  19. Touma, C., Sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. Gen Comp Endocrinol. 130, (3), 267-278 (2003).
  20. Bert, B., Schmidt, N., Voigt, J. P., Fink, H., Rex, A. Evaluation of cage leaving behaviour in rats as a free choice paradigm. J Pharmacol Toxicol Methods. 68, (2), 240-249 (2013).
  21. Lister, R. G. Ethologically-based animal models of anxiety disorders. Pharmacol Ther. 46, (3), 321-340 (1990).
  22. Belzung, C., Berton, F. Further pharmacological validation of the BALB/c neophobia in the free exploratory paradigm as an animal model of trait anxiety. Behav Pharmacol. 8, (6-7), 541-548 (1997).
  23. Finlayson, K., Lampe, J. F., Hintze, S., Wurbel, H., Melotti, L. Facial indicators of positive emotions in rats. PLoS ONE. 11, (11), e0166446 (2016).
  24. Miller, A., Kitson, G., Skalkoyannis, B., Leach, M. The effect of isoflurane anaesthesia and buprenorphine on the mouse grimace scale and behaviour in CBA and DBA/2 mice. Appl Anim Behav Sci. 172, 58-62 (2015).
  25. Miller, A. L., Golledge, H. D., Leach, M. C. The influence of isoflurane anaesthesia on the rat grimace scale. PLoS ONE. 11, (11), e0166652 (2016).
  26. Deacon, R. Assessing burrowing, nest construction, and hoarding in mice. J Vis Exp. (59), e2607 (2012).
  27. Felton, L. M., Cunningham, C., Rankine, E. L., Waters, S., Boche, D., Perry, V. H. MCP-1 and murine prion disease: separation of early behavioural dysfunction from overt clinical disease. Neurobiol Dis. 20, (2), 283-295 (2005).
  28. Deacon, R. M., Croucher, A., Rawlins, J. N. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviours in mice. Behav Brain Res. 132, (2), 203-213 (2002).
  29. Filali, M., Lalonde, R., Rivest, S. Subchronic memantine administration on spatial learning, exploratory activity, and nest-building in an APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Neuropharmacology. 60, (6), 930-936 (2011).
  30. Guenther, K., Deacon, R. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur J Neurosci. 14, (2), 401-409 (2001).
  31. Deacon, R. M., Reisel, D., Perry, V. H., Nicholas, J., Rawlins, P. Hippocampal scrapie infection impairs operant DRL performance in mice. Behav Brain Res. 157, (1), 99-105 (2005).
  32. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47, (3), 153-161 (2013).
  33. Atanasov, N. A., Sargent, J. L., Parmigiani, J. P., Palme, R., Diggs, H. E. Characterization of train-induced vibration and its effect on fecal corticosterone metabolites in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54, (6), 737-744 (2015).
  34. Voigt, C. C., et al. Hormonal stress response of laboratory mice to conventional and minimally invasive bleeding techniques. Anim Welf. 22, (4), 449-455 (2013).
  35. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260, (1), 65-69 (2012).
  36. Miyashita, T., et al. Social stress increases biopyrrins, oxidative metabolites of bilirubin, in mouse urine. Biochem Biophys Res Commun. 349, (2), 775-780 (2006).
  37. Bains, R. S., et al. Analysis of individual mouse activity in group housed animals of different inbred strains using a novel automated home cage analysis system. Front Behav Neurosci. 10, (106), (2016).
  38. Saibaba, P., Sales, G. D., Stodulski, G., Hau, J. Behaviour of rats in their home cages: daytime variations and effects of routine husbandry procedures analysed by time sampling techniques. Lab Anim. 30, (1), 13-21 (1996).

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