Evaluering av ekstracellulære Vesicle funksjonen under Malaria smitte

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I dette arbeidet beskriver vi for å undersøke hvilken rolle ekstracellulære blemmer (EVs) utgitt av Plasmodium falciparum infisert erytrocytter. Spesielt fokusere vi på EVs samhandling med endotelceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Malaria er en livstruende sykdom forårsaket av Plasmodium parasitter, med P. falciparum er den mest utbredte på det afrikanske kontinentet og ansvarlig for de fleste malaria-dødsfall globalt. Flere faktorer, inkludert parasite lagring i vev, vaskulære dysfunksjon og provoserende svar påvirke utviklingen av sykdom i malaria-smittede personer. P. falciparum-infiserte røde blod celler (iRBCs) slipper små ekstracellulære blemmer (EVs) med ulike typer Last molekyler som megle patogenesen og mobil kommunikasjon mellom parasitter og vert. EVs blir effektivt tatt opp av cellene der de modulerer sin funksjon. Her kan vi diskutere strategier for å håndtere EVs rolle i parasitten vert interaksjoner. Først beskriver vi en enkel metode for merking og oppsporer EV internalisering av endotelceller, bruke en grønn celle koblingsfunksjonalitet fargestoff. Andre rapportere vi en enkel måte å måle permeabilitet over en endothelial celle monolayer ved hjelp av en fluorescently merket dekstran. Endelig viser vi hvordan å undersøke rollen som små ikke-koding RNA molekyler i endothelial celle funksjon.

Introduction

Ifølge Verdens helseorganisasjon, det var 212 millioner nye tilfeller av malaria verden over i 2015 og rundt 429,000 mennesker døde, hovedsakelig barn under fem år av alderen1. Mekanismene fører til alvorlig sykdom, som er ofte forbundet med vaskulær dysfunksjon, fortsatt dårlig definerte2. Plasmodium- iRBCs skiller liten bi-lipid membran kuler kalles ekstracellulære blemmer (EVs). Det er kjent at disse EVs er potensielt relevant infeksjon prosessen og vert immun respons på infeksjon; men er lite kjent om den eksakte funksjonen til disse små blemmer under malaria smitte3. Det er mulig at de spiller to viktige rollene: på den ene siden de kan bidra til patogenesen ved å aktivere makrofager4,5; og på den annen side, de kan megle mobil kommunikasjon mellom parasitter og mellom parasitter og vert6,7. Faktisk kan parasitter overføre proteiner eller nukleinsyrer mellom hverandre via EVs. For eksempel Trypanosoma brucei rhodesiense EVs kan overføre virulens faktor Serum Resistance-Associated (SRA) og kan målrette både andre T. brucei og vert erytrocytter8. Videre kommunikasjon P. falciparum- iRBCs mellom hverandre ved å overføre nukleinsyrer innen EVs. Dette gjør parasites å optimalisere og synkronisere sin vekst. EVs kan faktisk være viktig regulator av gametocyte, og derfor bidra til regulering av overføring trinn7.

Ikke bare gjøre EVs regulere parasitter, de også megle parasitten vert interaksjoner. Vi har nylig oppdaget at EVs fra iRBCs inneholder vert-avledet microRNAs (miRNAs, liten RNA arter i området av 21-25 nukleotider9) som ble tatt opp av menneskelig endotelceller. MiRNAs i EVs utgjør en stall med Ago2 (medlem av RNA-indusert silencing komplekse), som en gang levert til mottakeren celler, er spesielt stanse genuttrykk og påvirker barriereegenskaper av celler10. Standard protokoller er utviklet for å undersøke funksjon EVs. Her beskriver vi først en protokoll som tillater fluorescerende merkingen av EVs å undersøke deres opptak av mottakeren celler. I tillegg bruker en AC confocal mikroskop, er det mulig å spore den EV skjebne i cellen. Flere fluorescerende fargestoffer kan brukes til å spore EVs. Amin-reaktive dye, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) og Calcein-AM bli fluorescerende når inne blemmer. Vi foretrekker å bruke amphiphilic etiketten, PKH, fordi det gir et lysere og mer ensartet signal. Denne tilnærmingen gir viktig informasjon for å forstå samspillet mellom EVs og mottaker celler. Mens i noen tilfeller EVs binde på overflaten av cellene, er noen blemmer raskt tatt. Ved opptak levere EVs deres Last på cellene, der de utøve deres juridiske funksjoner.

Her beskriver vi en protokoll for å måle funksjonen barriere av endotelceller i vitro kvantifisere overføring av en fluorescerende dekstran gjennom en cellulær monolayer. Mer følsomme tracers kan brukes som radiolabeled markører. Men krever de spesielle sikkerhetsforanstaltninger for bruk. Andre analyser eksisterer for å måle barriere i vitro funksjonen som transendothelial elektrisk motstand (TEER), som måler tett krysset integritet. Endelig visualisere ZO-1, en tett krysset protein, av immunofluorescence kan vurdering av tett krysset integritet som vel10. Siden EVs er komplekse og heterogene enheter som inneholder flere skipslaster med potensielle regulatoriske karakteristiske, er det nyttig å overexpress en bestemt RNA å studere sin effekt på mottaker cellen. Derfor definere vi også en protokoll som mål å stabil cellelinjer uttrykke miRNA rundt10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige RBCs ble innhentet fra blod sunn givere, i henhold til veiledning av Swissethics (swissethics.ch).

Merk: P. falciparum parasitten kulturer (3D 7) og produksjon var tidligere beskrevet i Mbagwu, et al. 11 P. falciparum er en human patogen, se lokale bestemmelser for håndtering. Kulturer bør holdes sterilt hele tiden.

1. fluorescens merking av EVs

Merk: Følgende utnytter den benevner teknologien å stabilt innlemme en grønn fluorescerende farge (PKH67) med stor alifatisk haler i lipid regionen EV membranen. Reaksjonen er utført i en 200 µL siste flekker volum som inneholder en 20 µM siste konsentrasjon av PKH67. Alle trinnene i romtemperatur (20-25 ° C)

  1. Sted 100 µg på Evens i 1 mL av PBS i et microcentrifuge rør.
  2. Sentrifuge EVs i et microcentrifuge rør med maksimal hastighet (20 000 x g) i 7 min til pellets.
    Merk: Siden hemozoin finnes i EVs, rød-mørk brun pellets bør være observert. Hvis nedbryting er rødlig, EVs har lysed.
  3. Etter sentrifugering, Sug opp nedbryting nøye, for å unngå fjerne alle EVs.
    Merk: Minimere mengden av gjenværende buffer før resuspending EVs i fortynningsmiddel C for å øke reproduserbarhet og effektiviteten av den flekker.
  4. Resuspend EV pellet i 100 µL fortynningsmiddel c (2 X EV suspensjon) og Pipetter forsiktig å sikre fullstendig spredning.
  5. Forberede en ny microcentrifuge tube og legge 4 µL av PKH67 ethanolic fargestoff løsningen til 100 µL av fortynner C. Vortex godt å blande. Klargjør denne 2 x fargestoff løsningen (40 µM) umiddelbart før flekker.
    Merk: For å unngå heterogene flekker, ikke legge PKH67 ethanolic fargestoff løsningen direkte til EV-pellets.
  6. Raskt, kombinere de 100 µL av 2 X EV suspensjon (trinn 1.4) med 100 µL av 2 X fargestoff stoppløsningen (trinn 1.5). Så, blande utvalget av pipettering opp og ned 10 ganger.
  7. Inkuber EV/fargestoff suspensjon fra trinn 1.6 for 5 min beskyttet fra lys og blanding av vortexing 3 - 4 ganger under 5 min incubation.
    Merk: Rugende EV/fargestoff suspensjon for lengre tidsrom gir ingen fordel, fordi den flekker er så rask.
  8. Stoppe flekker reaksjonen ved å legge en like volum (200 µL) av serum og ruge for 1 min å tillate binding av overflødig fargestoff.
    Merk: Før du stopper den flekker, tømmes serum fra EVs med sentrifugering 20.000 x g for 20 min.
  9. Vask 3 ganger med PBS og Nedspinning 20.000 x g for 5 min. Resuspend EVs i 100 µL av PBS nå en siste konsentrasjon av 1 µg/µL.

2. se opptaket av EVs av AC Confocal mikroskopi

Merk: Følgende protokollen beskriver sporing av EV internalisering av endotelceller dyrket på glass coverslips. Endotelceller er halvt udødeliggjort human benmarg endotelceller som beskrevet i12.

  1. Arbeid i et sterilt miljø, pels coverslips med et overskudd av 0,01% poly-L-lysin for 10 min ved romtemperatur (RT).
  2. Sug opp poly-L-lysine løsningen og la coverslips tørke helt.
  3. Utføre en levedyktig endothelial celle teller Trypan blå eksklusjon og en hemocytometer.
  4. Overføre 1 x 105 endotelceller i 1 mL av komplett Endothelial celle vekst Medium som inneholder Supplement blandingen til poly-L-lysin-belagt coverslips og la cellene vokse til en monolayer.
    Merk: Mediet inneholder vekstfaktorer at cellene å danne en monolayer og å danne tett veikryss.
  5. Når cellene danner en monolayer, nøye Sug opp mediet og legge 1 mL av fersk medium å vaske cellene. Gjenta vask igjen. Legg til 50 µg av PKH67-merket EVs og ruge 4 h.
    Merk: For å finne det optimale tidspunktet for opptak, en tid-kurs kan utføres.
  6. 4 h, Sug opp mediet og vaskes cellene 3 ganger med PBS fjerne overflødig og ubundne EVs. Fastsette cellene med 3% paraformaldehyde løsningen i PBS i 15 min.
    Merk: Metanol kan forstyrre begrepsordbok under fiksering prosessen; Derfor er det best å unngå noen metanol som inneholder fiksativene eller andre løsemiddelbaserte fiksativene. Det anbefales å bruke metanol uten formaldehyd som.
  7. Vask cellene 3 ganger med PBS. Legg nøye 250 µL på 0,1% Triton X-100 i PBS skal permeabilize cellene. Ruge på RT i 5 min.
  8. Vask 3 ganger med PBS. Legge til 400 µL blokkerer bufferen (5% BSA i PBS) for 30 min på RT blokkere ikke-spesifikk bindende.
  9. Vask cellene gang med PBS. Klargjør flekker løsningen ved utvannende 5 µL av phalloidin lager løsningen i 200 µL PBS/1% BSA per hver cover slip. Pipetter 200 µL av flekker løsningen på dekkglassvæske og Inkuber etter 20 min på RT.
  10. Vask 3 ganger med PBS. Counterstain DNA for 30 s med Hoechst 33342 i en endelig konsentrasjon av 2 µg/mL i 200 µL av PBS.
  11. Vask 2 x i dekkglassvæske ved å legge til 400 µL av PBS. Forsiktig ta dekkglassvæske med tang og invertere det på en dråpe antifade montering medier på et glass lysbilde. Fjern forsiktig overflødig media med en vev og forsegle hver side med neglelakk.
  12. Lagre lysbilder beskyttet mot lyset på 4 ° C.
  13. Visualisere celler ved hjelp av en AC confocal mikroskop laser excitations 405, 488 og 543 nm og en 63 X, 1,3 NA oljeobjektiv med fluorescerende utslipp på 450-470 nm (blå), 505-530 nm (grønn) og 620 nm.
    Merk: Typisk F-utgangen flekker resultater er vist i figur 1.

3. endothelial celle permeabilitet

Merk: Endothelial celle permeabilitet vurderes ved å måle overføring av rhodamine B isothiocyanate-dekstran (gjennomsnittlig MW 70.000) på endothelial celle monolayer. Dekstran gir et utmerket verktøy for å studere vaskulær permeabilitet.

  1. Telle levedyktig endotelceller med 0,4% Trypan blå eksklusjon og en hemocytometer.
  2. Plate endotelceller på en tetthet på 0,6 x 105 cellene samløpet i 24-og vev kultur inserts (0,4 µm porestørrelse) og la uforstyrret i minst 5 dager til ulike monolayers. Oppdater medium hver annen dag.
  3. Når cellene når en monolayer, laste EVs (50 µg i 1 mL) på den øvre kammeret. Legge til rhodamine-dekstran i øvre brønnen på en siste konsentrasjon på 20 mg/mL. Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2.
  4. Overvåke overføring av fluorescerende dekstran til bunnen bra ved å måle fluorescens utslipp fra 40 µL middels dele. Definere flerleddsnavn microplate leseren 544 nm eksitasjon og 590 nm utslipp for målinger.
    Merk: Mengden diffust dekstran kan kvantifiseres bruke kalibrering kurver etablert med lager løsningen. I tillegg kan kinetic eksperimenter utføres ved å fjerne små utvalg av ytre kammer mediet under en gang kurs (figur 2). Selv uten behandling, vil dekstran diffus gjennom celle monolayer.

4. Fastsett Puromycin følsomhet

Merk: Før transducing celle linjene med lentivirus, er det viktig å bestemme drepe kurven av et medikament for bestemt celle linjen. Å bestemme minimum av narkotika konsentrasjon nødvendig å drepe alle cellene, utføre en dose svar eksperimentere med trinnvis doser av valgt medikament. Fordi hver pattedyr cellen linje har en annen følsomheten, før eksperimentering, bør optimal konsentrasjon av antibiotikaet fastsettes ved å utvikle drepe kurve titrering som beskrevet nedenfor.

  1. Telle celler ved hjelp av hemocytometer. Resuspend endotelceller i en konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL i fullstendig Endothelial celle vekst Medium som inneholder Supplement Mix.
  2. Plate 1 x 104 celler i en 96-brønns plate i et siste volum på 100 µL av Endothelial celle vekst Medium.
  3. Legge til 100 µL av medium som inneholder antibiotika for å få en konsentrasjon av 0.1-10 µg/mL (se fig. 3).
  4. Undersøke celle levedyktigheten hver 2 dager under lys mikroskop med en 20 X-målet. Kultur cellene for 10-14 dager og erstatte mediet som inneholder puromycin hver 2-3 dager avhengig av cellevekst.
  5. Legg til 10 µL/godt MTS reagens til hver brønn, mix, og ruge 4 h på 37 ° C i standard kultur forhold.
  6. Riste platen kort i en shaker og måle absorbansen behandlet og ubehandlet celler likner en plate på 490 nm (Figur 3).

5. signaltransduksjon av endotelceller med Lentiviral vektor

  1. Plate 1 x 105 endotelceller i 1 mL av komplett medium dagen før signaltransduksjon. Utføre signaltransduksjon når cellene har nådd 50-80% confluency.
  2. Tine lentivirus på is, og gjøre dele viral aksjer å unngå fryse-Tin sykluser. Nedspinning materialet 200 x g for 30 s, i rør før åpning for å unngå søl over.
  3. Legge til hexadimethrine bromide cellene på en siste konsentrasjon av 8 µg/mL.
    Merk: Hexadimethrine bromide hjelper signaltransduksjon effektiviteten, men i noen tilfeller kan det være giftig for cellene. Derfor bør optimal konsentrasjon fastsettes ved å utføre en killing kurve før signaltransduksjon.
  4. Snurr den forsiktig å blande. Legger til riktig mengde virus partikler (mellom 0,5-2 x 106 partikler) et egnet mangfold av infeksjon (MOI) og snurr den forsiktig i 30 å blande.
  5. Sentrifuge celle-viral partikkel blandingen i en sentrifuge på RT for 45 min på 300 x g å effektivisere signaltransduksjon. Inkuber celle-viral partikkel blandingen på 37 ° C over natten.
  6. Fjern forsiktig viral partikkel som inneholder mediet og forkaste riktig. Erstatte den med friske, forvarmes fullstendig kultur medium.
  7. Start utvalget med puromycin på den andre dagen: fjerne mediet og erstatte den med ferske medium med riktig konsentrasjonen av puromycin som tidligere i avsnitt 4 (Figur 3).
  8. Høste celler etter puromycin utvalg og isolere RNA bruker en RNA isolere kit følge instruksjonene fra produsenten.
  9. Utføre cDNA syntese med valgt miRNAs bruker en omvendt transkripsjon kit (se Tabell for materiale).
  10. Definere qPCR reaksjonen etter sitert protokollen13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi for å undersøke EVs samhandling med vertsceller. Opptaket av fluorescently merket EVs overvåkes av AC confocal mikroskopi (figur 1). Endotelceller ta effektivt opp EVs, men inkubasjon tiden med EVs kan optimaliseres for å spore opptaket. En bedre lokalisering av EVs inne cellene, beis utgangen med phalloidin. Deretter bruker vi en filter membran på som en monolayer av endotelceller vokser. Rhodamine B isothiocyanate-dekstran brukes på den øverste kammeret av filteret membranen og deretter permeabilitet av endotelial monolayer måles ved å overvåke overføring av fluorescerende dekstran i bunnen kammeret (figur 2A). Vanligvis påvirkes permeabilitet av endotelceller på inkubasjon med et økende antall EVs (figur 2B). Det er viktig å vokse cellene i flere dager å sørge for at de vil danne en monolayer, ellers fargestoff vil raskt diffus gjennom brønnene. Det er viktig å merke seg at selv uten behandling, dekstran vil diffus sakte gjennom celle monolayer.

MicroRNAs er sentrale komponenter av EVs og etter overføring til mottakeren cellene, de regulerer genuttrykk. For å undersøke spesielt rollen som miRNAs, er det veldig nyttig for overexpress dem i mottaker cellen linje. Her beskriver vi hvordan du transduce miRNAs til endotelceller. Det første trinnet består i å bestemme konsentrasjonen av puromycin som dreper endotelceller for å velge stabilt transduced celler (figur 4A). Til slutt, hvilket uttrykk for miRNAs kan kontrolleres og godkjennes av qPCR (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: EVs tas av endotelceller. Renset EVs ble merket i grønn med PKH67, og inkubert 4 h med en monolayer av endotelceller. Ubehandlet endotelceller brukes som en negativ kontroll. Etter omfattende vask for å fjerne ubundet EVs, var cellene farget med phalloidin stain utgangen (rød) og Hoechst 33342 stain kjernen (blå). Cellene ble observert av AC confocal mikroskopi. Bildene ble tatt med laser AC confocal mikroskop og en 63 x 1.3 NA oljeobjektiv. Hoechst 33342 er opphisset ved 405 nm og med utslipp samlet på 450-470 nm (blå); PKH67 er spent på 488 nm, utslipp samlet på 505-530 nm (grønn); og Phalloidin-594 er spent på 543 nm, utslipp samlet på 620 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: effekten av EV opptak på endothelial barriere. (A) skjematisk av spredningen av rhodamine-merket dekstran: endotelceller dyrkes til samløpet på en filter-membran, fluorescerende dekstran brukes på toppen kammeret og diffunderer over tid gjennom membran. Effekten av EVs på permeabilitet vurderes etter tillegg av EVs til toppen kammeret ved å måle graden av spredningen av dekstran til bunnen kammer. (B) en økende mengde EVs er ruges med endotelceller. Overføring av rhodamine-merket dekstran over en trans-vel membran over tid gir permeabilitet målinger. Permeabilitet over endothelial laget er betydelig økt etter 2 timer med inkubering med 50 og 100 µg/mL EVs. Dataene representerer mean (± s.e.m.) fra 3 eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Serine puromycin. Lager løsning av puromycin (10 mg/mL) er utvannet i RPMI 1640 supplert med 10% inaktivert (56 ° C, 30 min) fetal kalv serum, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvate, 100 U/mL penicillin/streptomycin. Totalt 15 µL legges til 10 mL av medium i rør A. Deretter er 7,5 mL løsningen fra rør A blandet til 2,5 mL av RPMI til tube B. Til slutt, 100 µL av fortynning legges til 100 µL av celler å gi en endelig konsentrasjon av 7,5 µL/mL, 5.62 µL/mL og så videre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: generasjon av endotelceller overexpressing miR451a. (A) fastsettelse av drapet kurven av puromycin på endotelceller. Endotelceller ble inkubert med puromycin øke doser. Levedyktigheten ble målt ved MTS analysen etter 72 h. Dataene representerer gjennomsnittet (± s.e.m.) av et representativt eksperiment. (B) RNAs avledet fra endotelceller overexpressing miR451a eller en negativ kontroll ble høstet og miR451a transkripsjon ble kvantifisert ved Real-Time PCR. qPCR resultater er normalisert av 2-Ct metoden bruker U6 som en husholderske genet og uttrykt som betyr (± s.e.m.) (n = 3 eksperimenter). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere parasitter, inkludert Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania og Trichomonas utløse utgivelsen av EVs av infiserte vert cellen. Avhengig av patogener, kan de utgitte EVs modulerer immunrespons vert eller megle mobil kommunikasjon mellom parasitter6. Likevel er det lite bevis som tyder på hvordan disse små blemmer bidra til malaria sykdom. Her har vi beskrevet flere måter å undersøke funksjon EVs under Plasmodium infeksjon. For eksempel kan opptak av EVs av mottakeren celler i vivo effektivt overvåkes ved merking dem med PKH67 fluorescerende fargestoff. Flere kontroller må utføres for å garantere spesifisiteten av merkingen. Det er viktig å merke seg at når blandet med fortynningsmiddel C, PKH67 fargestoff tendens til skjemaet aggregat, og det er derfor nødvendig å inkludere en kontroll med fargestoff alene uten EVs å avgjøre ikke-spesifikk farging. AC confocal mikroskopi er metoden for valg til å skille mellom blemmer bundet til overflaten og virkelig internalisert mottaker cellene. Dessuten, gir det et utmerket verktøy for å spore og overvåke antallet blemmer tatt opp av cellene. Men det er fortsatt uklart hvordan EVs behandles i mottakerens celler14; Derfor utfører en tid-kurs bruker tidspunkt 2, 4 og 8 h, kan være svært nyttig for å bestemme optimale forhold for opptak. Tillegg av subcellular kupé markører kan brukes til å spore EVs innenfor cellene av AC confocal mikroskopi. EV opptak har vist skjer via membran fusion eller endocytose15. Fusion kan overvåkes ved merking EVs med octadecyl rhodamine B (R18). Fusjon av EVs mobilnettet membraner resultatene i fortynning av R18, som fører til en økning i fluorescens16. Opptak av EVs av endocytose kan studeres ved hjelp av bestemte hemmere av begrepsordbok, microtubule og dynamin10.

For å studere fysiologi av EVs, er det mulig å merke iRBCs direkte med PKH fargestoffer og co kultur iRBCs med endotelceller. Problemet her er at cellene krever forskjellige medier og gass komposisjoner og mengden EV overføring kan være lav. Videre kan vesicula proteiner smeltet sammen med en fluorescerende kode uttrykkes i donor cellene i vitro og i vivo. Men har så langt det ikke blitt testet med iRBCs

Infiserte RBCs er cytoadherent til microvasculature av hjernen, i en prosess som antas å være ansvarlig for å forårsake hjerne malaria17. Overføring av parasitten materiale via EVs er derfor sannsynlig å påvirke endotelceller og dermed vaskulær funksjonen18. I vitro analysen beskrevet her, gir en enkel måte å undersøke noen av de grunnleggende egenskapene for endotelceller, som for eksempel sin permeabilitet19. Ekstra test som TEER eller immunostai-ZO-1 kan gi mer informasjon om de tette krysset integritet10.

Videre viser i vitro modellen seg for å være et kraftig verktøy for å studere molekylære mekanismer bak mobilnettet kommunikasjonen mellom parasitter og vertsceller. Foruten opptak lar denne etterforskningen av molekylære mekanismer involvert i denne prosessen. Vi har for eksempel overvåket overføring av miR451a til acceptor cellene av Real-Time PCR og fluorescerende i situ hybridisering. I tillegg beskriver vi hvordan å generere linjer overexpressing en bestemt miRNA, for å direkte møte rollen disse små RNA i vaskulær funksjonen10. Imidlertid skal flere kontroller utføres inkludert testing ikke-transduced celler, siden signaltransduksjon selv kan påvirke den cellulære funksjonen. Videre kan miRNA hemmere brukes til å nøytralisere effekten av miRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble økonomisk støttet delvis av Novartis grunnlaget for medisinsk og biologisk forskning (til PYM), av Gottfried og Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (til MW og PYM) og forskning pool av det katolske universitetet i Fribourg (til PYM). Flere tilskudd inkluderer den sveitsiske regjeringen Excellence stipender for utenlandske forskere (til KAB og SM). Vi takker Isabelle Fellay og Solange Kharoubi Hess for kundestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher - Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. WHO Malaria Report 2015. (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16, (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6, (1), e1000744 (2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5, (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13, (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153, (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164, (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76, (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4, (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6, (7), e1001021 (2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25, (4), 501-515 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics