Utvärdering av extracellulära vesikler funktion under malariainfektion

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I detta arbete beskriver vi protokoll för att undersöka betydelsen av extracellulära blåsor (EVs) släpptes av Plasmodiumfalciparum infekterade erytrocyter. I synnerhet fokuserar vi på samspelet mellan EVs med endotelceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Malaria är en livshotande sjukdom som orsakas av Plasmodium parasiter, med P. falciparum är den mest utbredda på den afrikanska kontinenten och ansvarar för de flesta malaria dödsfall globalt. Flera faktorer inklusive parasit kvarstad i vävnader, vaskulär dysfunktion och inflammatoriskt svar påverka utvecklingen av sjukdomen i malaria-infekterade personer. P. falciparum-infekterade röda blodkroppar (iRBCs) släppa små extracellulära blåsor (EVs) som innehåller olika typer av Last molekyler som medla patogenes och cellulär kommunikation mellan värd och parasit. EVs är effektivt tas upp av celler där de modulera deras funktion. Här diskuterar vi strategier för att hantera rollen som EVs i parasit-värd-interaktioner. Först, vi beskriver en enkel metod för märkning och spårning EV internalisering av endotelceller, använda en grön cell linker färgämne. Det andra rapportera vi ett enkelt sätt att mäta permeabilitet över en endotelceller enskiktslager med hjälp av en fluorescently märkt dextran. Slutligen visar vi hur du undersöker rollen av små icke-kodande RNA-molekyler i endotelceller funktion.

Introduction

Enligt Världshälsoorganisationen, fanns det 212 miljoner nya fall av malaria i världen under 2015 och dog ca 429,000 människor, främst barn under fem års ålder1. De mekanismer som leder till svår sjukdom, som ofta är associerad med vaskulär dysfunktion, förblir oklara2. Plasmodium- iRBCs utsöndrar små bi-lipid membranet sfärer kallas extracellulära blåsor (EVs). Det är känt att dessa EVs är potentiellt relevanta infektionsprocessen och värd immunsvaret för infektion. men är lite känt om den exakta funktionen av dessa små blåsor under malaria-infektion3. Det är möjligt att de spelar två viktiga roller: å ena sidan kan de bidra till patogenesen genom att aktivera makrofager4,5. och å andra de kan medla cellulär kommunikation mellan parasiter och mellan parasiter och värd6,7. I själva verket kan parasiter överföra proteiner och nukleinsyror mellan varandra via EVs. Till exempel Trypanosoma brucei rhodesiense EVs kan överföra virulens faktor Serum Resistance-Associated (SRA), och kan rikta både andra T. brucei och värd erytrocyter8. Dessutom kommunicera P. falciparum- iRBCs mellan varandra genom att överföra nukleinsyror inom EVs. Detta tillåter parasiter att optimera och synkronisera sin tillväxt. I själva verket kan EVs vara den stora regulatorn av gametocyte omvandling, och därför bidra till regleringen av den överföring etapp7.

Inte bara reglerar EVs parasiter, de förmedlar också parasit-värd-interaktioner. Vi upptäckte nyligen att EVs från iRBCs innehåller värd-derived mikroRNA (Mirna, små RNA-arter i spänna av 21-25 nukleotider9) som togs upp av mänskliga endothelial celler. MicroRNA i EVs bildar stabila komplex med Ago2 (en medlem av den RNA-inducerad ljuddämpning komplexa), en gång levereras till mottagarens celler, kan som är specifikt tystar genuttryck och påverkar egenskaperna barriär av celler10. Standardprotokoll har utvecklats för att undersöka funktionen av EVs. Här beskriver vi först ett protokoll som tillåter fluorescerande märkning av EVs att undersöka deras upptag av mottagarens celler. Dessutom, genom att använda en confocal Mikroskop, är det möjligt att spåra EVS öde inuti cellen. Flera fluorescerande färger kan användas för att spåra EVs. De amine-reaktivt färgämne, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE) och Calcein-AM blir fluorescerande en gång inuti blåsor. Vi föredrar att använda amfifila etiketten, PKH, eftersom det ger en ljusare och mer enhetlig signal. Detta tillvägagångssätt ger viktig information för att förstå samspelet mellan EVs och mottagarens celler. Medan i vissa fall EVs binder till ytan av cellerna, tas några blåsor snabbt upp. Vid upptag leverera EVs sin last till cellerna, där de utöva sina tillsynsfunktioner.

Här beskriver vi ett protokoll för att mäta barriärfunktionen av endothelial celler in vitro- genom kvantifiering av överföring av en fluorescerande dextran genom en cellulär enskiktslager. Känsligare spårämnen kan användas såsom radiomärkt markörer. De kräver dock särskilda säkerhetsföreskrifter för användning. Andra analyser finns för att mäta barriärfunktionen i vitro såsom transendothelial resistans (TEER), som mäter åtsittande föreningspunkt integritet. Slutligen visualisera ZO-1, ett protein som åtsittande föreningspunkt, genom immunofluorescens tillåter bedömning av åtsittande föreningspunkt integritet som väl10. Eftersom EVs är komplexa och heterogena enheter som innehåller flera laster med potentiella reglerande kännetecken, är det användbart att överuttrycka en specifik RNA för att studera dess effekt på den mottagande cellen. Därför har vi också definiera ett protokoll som syftar till att generera stabila cellinjer som uttrycker miRNA intresse10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Människans röda blodkroppar erhölls från blodet hos friska donatorer, i enlighet med riktlinjerna i Swissethics (swissethics.ch).

Obs: P. falciparum parasiten kulturer (3D 7) och EV produktion beskrevs tidigare i Mbagwu, et al. 11 eftersom P. falciparum är mänskliga patogener, konsultera lokala föreskrifter för hantering. Kulturer bör hållas sterila hela tiden.

1. fluorescens märkning av EVs

Obs: Följande procedur utnyttjar den märkning tekniken att stabilt införliva ett grönt fluorescerande färgämne (PKH67) med stora alifatiska svansar i regionen lipid membranet som EV. Reaktionen utförs i en 200 µL slutliga färgning volym innehållande 20 µM koncentration på PKH67. Utföra alla steg vid rumstemperatur (20-25 ° C)

  1. Plats 100 µg av EVs i 1 mL PBS i en mikrocentrifug rör.
  2. Centrifugera EVs i en mikrocentrifug rör med maximal hastighet (20 000 x g) för 7 min till pellet.
    Obs: Eftersom hemozoin är närvarande i EVs, observeras en röd-mörk brunaktig pellet. Om supernatanten är rödaktig, har sedan EVs lyserat.
  3. Efter centrifugering, Aspirera supernatanten noggrant, för att undvika att ta bort eventuella EVs.
    Obs: Minimera mängden av kvarvarande buffert innan omblandning EVs i spädningsvätska C för att öka reproducerbarhet och effektivitet av färgningen.
  4. Återsuspendera pelleten EV i 100 µL av spädmedel C (2 X EV Suspension) och försiktigt Pipettera att försäkra fullständig spridning.
  5. Förbereda ett nytt mikrocentrifug rör och tillsätt 4 µL PKH67 enprocentig dye lösningen i 100 µL spädningsvätska C. Vortex väl att blanda. Förbered detta 2 x dye lösning (40 µM) omedelbart före färgning.
    Obs: För att undvika heterogena färgning, Lägg inte till PKH67 enprocentig dye lösningen direkt till EV pelleten.
  6. Snabbt, kombinera den 100 µL av 2 X EV Suspension (steg 1.4) med den 100 µL av 2 X dye stopplösningen (steg 1,5). Sedan blanda provet genom pipettering upp och ner 10 gånger.
  7. Inkubera EV/Dye fjädringen från steg 1,6 för 5 min skyddas från ljus och mix av vortexa 3 - 4 gånger under 5 min ruvning.
    Obs: Ruvning EV/Dye suspensionen för längre tider ger ingen fördel, eftersom färgningen är så snabb.
  8. Stoppa färgning reaktionen genom att lägga till en lika stor volym (200 µL) serum och inkubera i 1 min att tillåta bindning av överflödig färg.
    Obs: Innan du stoppar färgningen, bryter serumet från EVs genom centrifugering vid 20 000 x g i 20 min.
  9. Tvätta 3 gånger med PBS och varva ner vid 20 000 x g för 5 min. Återsuspendera EVs i 100 µL av PBS att nå en slutlig koncentration på 1 µg/µL.

2. visualisera upptag av EVs av konfokalmikroskopi

Obs: Följande protokoll beskriver spårning av EV internalisering av endothelial celler odlas på glas coverslips. Endotelceller är semi förevigade mänsklig benmärg endotelceller som beskrivs i12.

  1. Arbetar i en steril miljö, coat coverslips med ett överskott av 0,01% poly-L-lysin i 10 min i rumstemperatur (RT).
  2. Aspirera poly-L-lysin lösningen och låt coverslips torka helt.
  3. Utföra en livskraftig endotelceller räkna med Trypan blå utslagning och en hemocytometer.
  4. Överföra 1 x 105 endotelceller i 1 mL av komplett Endothelial cellen odlingsmedium som innehåller tillägg mixen till den poly-L-lysin-coated coverslips och låta cellerna växa till en enskiktslager.
    Obs: Medium innehåller tillväxtfaktorer som gör att cellerna att bilda en enskiktslager och att bilda åtsittande föreningspunkter.
  5. När cellerna bildar en enskiktslager, noggrant aspirera på medellång och tillsätt 1 mL av färskt medium att tvätta cellerna. Upprepa tvätten en gång till. Lägg 50 µg PKH67-märkt EVs och inkubera i 4 h.
    Obs: För att hitta den optimala tid-punkten för upptag, en tid-kurs kan utföras.
  6. Efter 4 h, aspirera på medellång och tvätta cellerna 3 gånger med PBS ta bort överflödig och obundna EVs. Fixa cellerna med 3% PARAFORMALDEHYD lösning i PBS för 15 min.
    Obs: Metanol kan störa aktin under processen fixering; Därför är det bäst att undvika eventuella metanol som innehåller fixativ eller andra lösningsmedel-baserade fixativ. Det rekommenderas att använda metanol-fri formaldehyd som ett fixativ.
  7. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS. Tillsätt försiktigt 250 µL 0,1% Triton x-100 i PBS till permeabilize cellerna. Inkubera vid RT i 5 min.
  8. Tvätta 3 gånger med PBS. Lägga till 400 µL blockerande buffert (5% BSA i PBS) under 30 minuter vid RT att blockera icke-specifik bindning.
  9. Tvätta cellerna en gång med PBS. Förbereda färglösningen genom att späda 5 µL phalloidin stamlösning i 200 µL PBS/1% BSA per varje täckglas. Pipettera 200 µL av färglösningen på täckglaset och inkubera i 20 min på RT.
  10. Tvätta 3 gånger med PBS. Counterstain DNA för 30 s med Hoechst 33342 med en slutlig koncentration på 2 µg/mL i PBS 200 µL.
  11. Tvätta 2 x täckglaset genom att lägga till 400 µL av PBS. Försiktigt ta täckglaset med pincett och Invertera det på toppen av en droppe antifade montering media på en glasskiva. Ta försiktigt bort överflödigt media med en vävnad och försegla varje sida med nagellack.
  12. Lagra bilder skyddas från ljus vid 4 ° C.
  13. Visualisera cellerna med confocal Mikroskop på laser excitationer 405 och 488 543 nm och en 63 X, 1,3 NA olja mål med fluorescerande utsläpp på 450-470 nm (blå), 505-530 nm (grön) och 620 nm.
    Obs: Typisk F-aktin färgning resultaten visas i figur 1.

3. endotelceller permeabilitet

Obs: Endotelceller permeabilitet bedöms genom att mäta överföringen av rodamin B fluoresceinisothiocyanat-dextran (genomsnittliga MW 70.000) över den endotelceller enskiktslager. Dextran ger ett utmärkt verktyg för att studera vaskulär permeabilitet.

  1. Räkna livskraftig endotelceller med 0,4% Trypan blå utslagning och en hemocytometer.
  2. Platta endotelceller med en täthet av 0,6 x 105 celler till sammanflödet i 24-väl vävnadsodling skär (0,4 µm porstorlek) och lämna ostörd i minst 5 dagar för att bilda differentierade enskiktslager. Uppdatera medium varannan dag.
  3. När cellerna når en enskiktslager, Ladda EVs (50 µg i 1 mL) på den övre kammaren. Lägga till den rodamin-dextran övre brunnen med en slutlig koncentration på 20 mg/mL. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
  4. Övervaka överföring av den fluorescerande dextran till botten väl genom att mäta fluorescens utsläpp från 40 µL medium alikvoter. Ställa in flerdels mikroplattan läsaren på 544 nm excitation och 590 nm utsläpp för mätningar.
    Obs: Mängden diffust dextran kan kvantifieras med kalibreringskurvor etablerat med stamlösning. Dessutom kan kinetiska experiment utföras genom att ta bort små prover av yttre kammaren mediet under en tid (figur 2). Även utan någon behandling, kommer dextran diffunderar genom den cell enskiktslager.

4. Bestäm Puromycin känslighet

Obs: Innan transducing cell fodrar med lentivirus, är det viktigt att fastställa döda kurvan för ett valt läkemedel för viss cell raden. Att bestämma den minsta mängden narkotika koncentration krävs för att döda alla celler, utföra en dos svar experiment använder inkrementell doser av valda drogen. Eftersom varje cellinje har en annan känslighet, innan experiment, bör den optimala koncentrationen av antibiotika fastställas genom att utveckla döda kurva titrering enligt nedan.

  1. Räkna cellerna med hjälp av hemocytometer. Återsuspendera endotelceller vid en koncentration på 1 x 105 celler/mL i komplett Endothelial cellen odlingsmedium som innehåller tillägg mixen.
  2. Tallrik 1 x 104 celler i en plattan med 96 brunnar i en slutlig volym av 100 µL av Endothelial cellen odlingsmedium.
  3. Tillsätt 100 µL av medium som innehåller antibiotika för att få en koncentration på 0,1-10 µg/mL (se figur 3).
  4. Undersöka cellviabiliteten varannan dag under ett ljusmikroskop med ett 20 X-objektiv. Odla cellerna för 10-14 dagar och ersätta media som innehåller puromycin var 2-3 dagar beroende på celltillväxt.
  5. Tillsätt 10 µL per brunn MTS reagens i varje brunn, mix, och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C i standard odlingsbetingelser.
  6. Skaka plåten kort på en shaker och Mät absorbansen av behandlat och obehandlat celler som använder en Plattläsare på 490 nm (figur 3).

5. transduktion av endotelceller med Lentiviral Vector

  1. Tallrik 1 x 105 endotelceller i 1 mL av komplett medium dagen innan transduktion. Utföra transduktion när cellerna har nått 50-80% konfluens.
  2. Tina lentivirus på is, och göra alikvoter av viral bestånden till undvika frysning-tining cykler. Snurra ner materialet på 200 x g för 30 s, i rör innan du öppnar för att undvika spill över.
  3. Lägg till hexadimethrine metylbromid till celler på en slutlig koncentration på 8 µg/mL.
    Obs: Hexadimethrine metylbromid hjälper transduktion effektivitet, men i vissa fall kan det vara giftiga för cellerna. Den optimala koncentrationen bör därför bestämmas genom att utföra en dödande kurva innan transduktion.
  4. Snurra plattan försiktigt för att blanda. Tillsätt en lämplig mängd av viruspartiklar (mellan 0,5-2 x 106 partiklar) på en lämplig multiplicity av infektion (MOI) och snurra plattan försiktigt i 30 s att blanda.
  5. Centrifugera cell-virus-partikeln mixen i centrifugen vid RT för 45 min vid 300 x g att effektivisera transduktion. Inkubera cell-virus-partikeln blandningen vid 37 ° C över natten.
  6. Avlägsna försiktigt det virala partikel-innehållande mediet och kasseras enligt föreskrifter. Ersätta det med frisk, pre värmde komplett odlingsmedium.
  7. Börja markeringen med puromycin på den andra dagen: ta bort mediet och ersätta det med frisk medium som innehåller den rätta koncentrationen av puromycin som bestämts tidigare i avsnitt 4 (figur 3).
  8. Skörda celler efter puromycin urval och isolera RNA med hjälp av en RNA isolering kit följa tillverkarens instruktioner.
  9. Utföra cDNA syntes med den valda MicroRNA använder en omvänd Transkription kit (se Tabell för material).
  10. Ställa in qPCR reaktionen enligt den citerade protokoll13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här beskriver vi protokoll för att undersöka samspelet mellan EVs med värdceller. Upptaget av fluorescently märkt EVs övervakas av konfokalmikroskopi (figur 1). Endotelceller tar effektivt upp EVs, men inkubationstiden med EVs kan optimeras för att spåra upptaget. För en bättre lokalisering av EVs inuti cellerna, fläcken aktin med phalloidin. Nästa, vi använder en filtermembranet ovanpå som en enskiktslager av endothelial celler växer. Rodamin B fluoresceinisothiocyanat-dextran appliceras på den övre kammaren av filtermembranet och sedan genomträngligheten av den endothelial enskiktslager mäts genom att övervaka överföringen av den fluorescerande dextran till den undre kammaren (figur 2A). Vanligtvis är permeabiliteten av endotelceller påverkas vid inkubation med en ökande mängd EVs (figur 2B). Det är viktigt att odla cellerna i flera dagar för att se till att de kommer att utgöra en enskiktslager, annars färgämnet kommer snabbt diffundera genom brunnarna. Det är viktigt att notera att dextran även utan behandling, långsamt kommer diffunderar genom den cell enskiktslager.

MikroRNA är viktiga komponenter av EVs och efter överföringen till de mottagande cellerna, de reglerar genuttryck. För att undersöka specifikt MicroRNA roll, är det mycket användbart att överuttrycka dem i raden mottagande cell. Här beskriver vi hur man transduce MicroRNA till endotelceller. Det första steget består av att fastställa koncentrationen av puromycin som dödar endothelial celler för att markera stabilt sensorik celler (figur 4A). Slutligen kan nivån på uttryck för MicroRNA kontrolleras och valideras av qPCR (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: EVs tas upp av endotelceller. Renat EVs var märkt i grönt med PKH67 och ruvade i 4 h med en enskiktslager av endotelceller. Obehandlade endothelial celler används som en negativ kontroll. Efter omfattande tvättning för att avlägsna obunden EVs, var cellerna fläckade phalloidin att färga aktin (röd) och Hoechst 33342 att färga kärnan (blå). Cellerna observerades av konfokalmikroskopi. Bilder är tagna med hjälp av laser confocal Mikroskop och ett 63 x 1.3 NA olja mål. Hoechst 33342 exciteras vid 405 nm och med utsläpp samlas in vid 450-470 nm (blå); PKH67 är upphetsad på 488 nm, utsläpp samlas in vid 505-530 nm (grön); och Phalloidin-594 exciteras på 543 nm, utsläpp samlas in på 620 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: effekt av EV upptag på endotel barriär. (A) Schematisk av diffusionen av rodamin-märkt dextran: endothelial celler odlas till sammanflödet på toppen av en filtermembranet, den fluorescerande dextran används för den övre kammaren och diffunderar över tid genom membranet. Effekten av EVs på permeabilitet bedöms efter tillägg av EVs till den övre kammaren genom mätning av diffusionshastighet av dextran till botten kammare. (B) en ökande mängd EVs inkuberas med endotelceller. Överföring av rodamin-märkt dextran över ett trans-väl membran över tiden möjliggör permeabilitet mätningar. Permeabilitet över endothelial lagret är betydligt ökade efter 2 h inkubation med 50 och 100 µg/mL EVs. Uppgifterna utgör medelvärdet (± s.e.m.) från 3 experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: titrering av puromycin. Stamlösning av puromycin (10 mg/mL) späds RPMI 1640 kompletteras med 10% Värmeinaktiverade (56 ° C, 30 min) fetalt kalvserum, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL penicillin/streptomycin. Sammanlagt 15 µL tillsätts 10 mL medium i rör A. Sedan är 7,5 mL av lösningen från röret A blandad till 2,5 mL RPMI till röret B. Slutligen tillsätts 100 µL av utspädning 100 µL av celler för att ge en slutlig koncentration på 7,5 µL/mL, 5,62 µL/mL och så vidare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: generationen av endotelceller överuttryck av miR451a. (A) fastställande av dödande kurvan för puromycin på endotelceller. Endotelceller inkuberades med puromycin vid ökande doser. Livskraft mättes av MTS assay efter 72 h. Uppgifterna representerar medelvärdet (± s.e.m.) av en representativ experiment. (B), RNAs härrör från endotelceller överuttryck av miR451a eller en negativ kontroll skördades och miR451a avskriften kvantifierades med Real-Time PCR. qPCR resultaten normaliseras av metoden 2-Ct med U6 som en hushållerska gen och uttryckta menar (± s.e.m.) (n = 3 experiment). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera parasiter, inklusive Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania och Trichomonas frisättning av EVs av infekterade värdcellen. Beroende på patogenerna, kan släppt EVT modulera immunsvaret värd eller medla cellulär kommunikation mellan de parasiter6. Ändå finns det lite belägg för hur dessa små blåsor bidra till malaria sjukdom. Här har vi beskrivit flera sätt att undersöka funktionen av EVs under Plasmodium infektion. Exempelvis kan upptaget av EVs av mottagarens celler i vivo övervakas effektivt genom att märka dem med den PKH67 fluorescerande färgämnen. Flera kontroller måste utföras för att garantera specificitet märkning. Det är viktigt att notera att väl blandad med spädningsvätska C, PKH67 färgämnet tenderar att bilda aggregat, och det är därför nödvändigt att inkludera en kontroll med färgämnet ensam utan EVs att fastställa den icke-specifik färgning. Konfokalmikroskopi är metoden för val att skilja mellan blåsor bundna till ytan och verkligen internaliseras av mottagarens celler. Dessutom ger det ett utmärkt verktyg för att spåra och övervaka antalet blåsor som tas upp av cellerna. Det är dock fortfarande oklart hur EVs bearbetas i mottagarens celler14; Därför utför en tid-kurs med tid-punkter i 2, 4 och 8 h, kan vara mycket användbara för att fastställa optimala förutsättningar för upptag. Tillägg av subcellulär fack markörer kan användas att spåra EVs inuti cellerna av konfokalmikroskopi. EV upptag har visat sig ske via membranet fusion eller endocytos15. Fusion kan övervakas genom märkning EVs med oktadecyl rodamin B (R18). Fusion av EVs med cellmembran resulterar i utspädning av R18, vilket leder till en ökning av fluorescens16. Upptag av EVs genom endocytos kan studeras med hjälp av specifika hämmare av aktin, mikrotubuli och dynamin10.

För att studera physiologyen av EVs, är det möjligt att märka iRBCs direkt med de PKH färgämnena och samarbete kultur iRBCs med endotelceller. Problemet här är att cellerna kräver olika media och gas kompositioner och beloppet för EV överföring kan vara låg. Dessutom kan vesikulär proteiner smält med en fluorescerande tagg uttryckas i givare celler in vitro- och in vivo. Dock har så länge det inte testats med iRBCs

Infekterade röda blodkroppar är cytoadherent till mikrocirkulation av hjärnan, i en process som tros vara ansvarig för att orsaka cerebral malaria17. Överföring av parasiten material via EVs därför kan påverka endothelial celler och därmed vaskulär funktion18. In vitro- analysen beskrivs här, ger ett enkelt sätt att undersöka några av de grundläggande egenskaperna för endotelceller, som for example dess permeabilitet19. Ytterligare test såsom TEER eller immunfärgning med ZO-1 kan ge mer information om de åtsittande föreningspunkt integrity10.

Dessutom visar in vitro- modellen sig vara ett kraftfullt verktyg att studera molekylära mekanismer bakom cellulär kommunikation mellan parasiter och värdceller. Förutom upptag tillåter denna inställning utredningen av molekylära mekanismer involverade i denna process. Exempelvis har vi övervakat överföring av miR451a till acceptorn cellerna av Real-Time PCR och fluorescerande i situ hybridisering. Dessutom beskrivs hur man generera cellinjer överuttryck av en viss miRNA, för att direkt ta itu med dessa små RNA i vaskulär funktion10roll. Men bör flera kontroller utföras inklusive testning av icke-sensorik celler, eftersom transduktion själv kan påverka den cellulär funktionen. MiRNA-hämmare kan dessutom användas för att neutralisera effekten av microRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie var ekonomiskt stöds delvis av Novartis Stiftelsen för medicinsk - biologisk forskning (att PYM), Gottfried och Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (till MW och PYM) och forskning poolen av universitetet i Fribourg (till PYM). Ytterligare bidrag inkluderar den schweiziska regeringen Excellence stipendier för utländska akademiker (till KAB och SM). Vi tackar Isabelle Fellay och Solange Kharoubi Hess för teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher - Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. WHO Malaria Report 2015. (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16, (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6, (1), e1000744 (2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5, (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13, (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153, (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164, (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76, (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4, (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6, (7), e1001021 (2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25, (4), 501-515 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics