光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

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Summary

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr) を研究への応用を説明します。

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

遺伝的非正規アミノ酸 (ncAAs) 黄色停止コドン抑制を介して定款は、生細胞に直接人工プローブと反応性タンパク質をインストールするのには強力な手法です。各 ncAA はホストの有機体にインポートされる専用直交サプレッサー tRNA/アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS) ペアが組み込まれます。異なる ncAAs の取り込み効率大幅異なるできいくつかのケースで満足できます。直交ペアは AARS または tRNA のいずれかを操作することによって改善できます。ただし、tRNA や AARS の大規模なライブラリと死者/生きている選択方法を使用しての進化には哺乳類細胞で、可能ではありません。ここでは、哺乳類細胞における直交ペアの効率を評価するための簡易で堅牢な蛍光ベースの分析が表示されます。アッセイは、AAR/tRNA バリエーションそれなりの努力と合理的な時間内の数百数十をスクリーニングできます。ピロリシン直交系の効率を大幅に向上させる新しい Trna を生成するこのアッセイの使用説明は、ncAAs の G タンパク質の研究への応用とともに結合受容体 (Gpcr)、ncAA のオブジェクト挑戦しています。突然変異誘発。最初に、体系的に組み込むことで受容体の細胞外表面部分を通して光橋 ncAA、そのまま受容体の異なる配位子の結合部位は生細胞に直接マップされます。第二に、GPCR に最後の世代の ncAAs を組み込むこと、超高速触媒無料受容体の蛍光色素をラベル付けを発揮、bioorthogonal ひずみ昇格逆ディールス ・ アルダー付加環化反応 (SPIEDAC) 生きている細胞を悪用します。NcAAs できます一般に適用するには、そのサイズに個別に蛋白質をメソッドが関心を持つアプリケーションの数です。また、ncAA 定款は特別な装置を必要としないし、標準生化学研究所で簡単に実行されます。

Introduction

タンパク質化学プローブの遺伝的定款は、構造および動的な生細胞のネイティブ コンテキストに直接蛋白質機能の調査を促進する強力な手法です。今日では、非正規のアミノ酸 (ncAAs) 装備されて最も異なる化学グループの何百もの生合成1,2,3,4site-specifically タンパク質に組み込むことが。それらの間の 1 つを見つける写真されております5、写真ケージ6,7,8,9写真切替可能なアミノ酸10,などの感光性 ncAAs11, アミノ酸ベアリング緊張したアルケンとアルキン触媒無料 bioorthogonal 化学2,12,13,14,15,16 ,17, ダンシル18クマリン9,19, とプロダン20,21 fluorophores が付いて、運ぶアミノ酸およびアミノ酸として他の生物物理学的プローブを装備ポスト翻訳の修正1,2,3,4,22,23,24,25とも。

NcAA の遺伝のエンコーディングは、専用アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS)、同種サプレッサー tRNA、通常リボソーム合成の際に黄色停止コドンに対応 ncAA を取り入れたペアで有効です。ncAARS/tRNA のペアは、ホストの有機体すなわち内因性のペアしないクロストークで直交になるように設計されています。技術は、原核生物と真核生物のホストと哺乳類に簡単に該当するセルの両方確立しました。哺乳類細胞における定款の ncAA のペアは 3 つの主要な直交システムに基づいています: B. 中等度好熱27 (Ec からチロシン琥珀サプレッサーによるエシェリヒア属大腸菌26から TyrRS を組み合わせたチロシル システムTyrRS/Bst山芋ペア)、エシェリヒア属大腸菌ロイシル システム (EcLeuRS/tRNAルーCUAペア)6,18,28および古細菌由来ピロリジル システム (PylRS/tRNAPylペア)3、tRNApyl ブランドがあるという自然な琥珀色の抑制。一般に、各 ncAA は特殊な ncAARS によって認識されます。NcAA の構造に応じて、ncAARS は、いくつかの合成は、複数の ncAA を受け入れることができますがの TyrRS LeuRS や PylRS、進化を介して取得されます。

直交のペアは、単にプラスミッドのベクトルを使用して、セルにインポートされます。最も一般的かつ効率的なプラスミドは bicistronic であり、合成酵素と直交ペア29を形成する tRNA の両方をエンコードします。変更用に指定されたサイトで琥珀のコドンを軸受興味の蛋白質のための第 2 プラスミド エンコーディングは cotransfected です。NcAA は細胞成長培地に単に追加されます。ただし、異なる専門のグループはしばしば同じ ncAA の体用もプラスミドの構造のさまざまなバリエーションを使用します。ベクトル合成酵素の種類、コドン使用合成酵素遺伝子、プロモーターの使い方、tRNA と tRNA 式カセット数のバリアントの遺伝子配列で構造が異なります。さらに、異なる ncAAs の取り込み効率は、異なるシンテターゼ、品質、tRNA および他の要因の30の異なる触媒効率のため大幅に変更できます。したがって、それは手で直交ペア、全体的な蛋白質の表現を向上させるいくつかの最適化のステップを実行して、目的のアプリケーションに最も適したシステムを選択する両方の効率を評価する高速で信頼性の高いメソッドを持つことが重要得られます。

直交ペア29 (図 1) の効率を評価するためのシンプルで堅牢な蛍光ベースのアッセイを設けています。アッセイ、細胞が一緒にレポーターの bicistronic プラスミド寛容な位置 (EGFPタグ) 黄色停止コドンを軸受緑色蛍光タンパク質の両方をエンコードの直交ペアのプラスミッドのエンコーディングで cotransfected とmCherry 遺伝子。全体セル lysates の赤と緑の蛍光プレート リーダー、96 ウェル プレートでの独立したチャンネルで読み取られます。赤い蛍光性の強度は、測定サンプルとトランスフェクション効率のサイズの直接推定値を与えるに対し、緑の蛍光性の強度は直接琥珀色の抑制の効率と相関します。蛍光に基づいて同様の試金に関してアシスト セル (FACS) を並べ替え読み上げる31,32アッセイは、詳細セル全体の人口でタンパク質発現の包括的な評価を与える通常の実験条件の代表的な容易なデータ取得と標準ソフトウェアによる処理を提供しています。全体的に、アッセイの主な利点は、サンプル数が多いために、媒体は並行して分析できます。この試金を使用して、Pyl 直交系30の効率を向上させるサプレッサー Trna の合理的に設計されたライブラリを上映しました。この作品は、この分析を実行し、光橋 ncAA p アジドフェニル-L-フェニルアラニン (ウェット) 定款の直交ペアの最適化との比較など、応用事例を示す実験的プロトコルをについて説明します種類のアミノ酸 (図 2) の取り込み効率。

最後の年に ncAA のツールは非常に強力な構造を調査する実証されているし、G タンパク質の機能的な側面結合受容体 (Gpcr)33,34,35,36,37,38. ヒトでは、Gpcr 膜受容体 (800 人) の大家族を形成し、治療薬の主なターゲットを表しています。Gpcr の直接構造解析まだやりがいや補完的な生化学的手法が非常に彼らの調査のため必要があります。我々 が GPCR にサーフェスをマップし、リガンド結合ポケット34を発見光橋 ncAAs の使用の先駆者します。シュワンツの混入のための最適なシステムを使用して、我々 は体系的に生きている哺乳類セルに直接 GPCR の全体細胞ドメイン全体シュワンツを設立しました。UV 照射、シュワンツは近隣の分子が共有結合キャプチャ ナイトレンと反応性の高い種を形成します。リガンドをシステムに追加すると、シュワンツは受容体の位置に近づくバインドされたリガンドを明らかにするための近接プローブとして機能します。このように、神経ペプチド ホルモン私 (Ucn1) クラス B GPCR 副腎皮質刺激ホルモン-放出-因子受容体のタイプ 1 (CRF1R)33 Urocortin のバインディング モード初披露。最近、アゴニスト及びアンタゴニストの同じ受容体38の異なるバインドのパターンを開示しました。同様のアプローチは、orthosteric と他のペプチドや他の Gpcr の39,40,41,42の小分子リガンドのアロステリック結合部位を明らかにする他のユーザーによって適用されています。本稿では、光橋 GPCR 表面のマッピングの研究室において実験的プロトコルについて説明します。メソッドは、比較的高速な簡単なと標準生化学演習で適用されるように特別な装置を必要としません。重要なは、立体構造データが不足しており、リガンド結合部位を特定するだけでなく、またファーストクリーニング完全に変更された受容器からの情報を既存の in vitroデータを補完する貴重なツールを提供するアプローチ、生細胞の生理学的な環境。

新規の ncAAs 側鎖化学グループ超高速触媒無料 bioorthogonal 化学に適した軸受の最近の開発は蛋白質に超解像イメージングの最後の世代の蛍光物質をインストールする可能性を開いたライブで直接細胞の2,43を実行します。このようなケミカル アンカーは、緊張した cyclooctyne SCOK14BCNK12,17ビシクロ [6.1.0] nonyne と TCO のトランス cyclooctenes * K13,15,17他の ncAAs の間でノルボルネン16,17,44またはシクロプロペン45,46基をかくまっています。かさばる ncAAs bioorthogonal 化学 PylRSAFとして通常示される PylRS の変形によって組み込まれている (突然変異を示す Y271A、 M. barkeriの PylRS の Y349F)、その他アドホック進化 ncAARSs17よると同様,44. bioorthogonal アンカーがいくつ分43,48ラベリング高利回りを与える逆電子需要ディールス ・ アルダー付加環化反応による tetrazine 試薬47と反応します。ただし、直交の ncAA 設立システムの全体的な効率が低いため Gpcr のラベルにこの強力なアプローチの応用にチャレンジしております。私たちの強化された Pyl のシステムを使用して、我々 は最近 Gpcr と超高速 GPCR は、生きている哺乳類セル30の表面上のラベルにこのようなアミノ酸の高収率定款を実証しました。ラベル付けされた受容体の通り彼らは生理学的アゴニストの受容体を活性化時に内面のまだ機能している。Bioorthogonal 定款の実験的プロトコルが Gpcr に固定し、ラベリング手順をここで説明します。小さな明るい fluorophores が付いている Gpcr で装備は、高度な顕微鏡技術を介して生きているセルの GPCR の構造ダイナミクスの研究に向けた最初の基本的なステップです。

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Protocol

1. 結合効率 (図 1) の蛍光ベースのスクリーニング

  1. ダルベッコ変更イーグル培地で HEK293 細胞を維持 (DMEM; 高グルコース、4 mM グルタミン、ピルビン酸) 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われます。
  2. 種細胞のトランスフェクション前日。
    1. 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリプシン/PBS で 37 ° C で 5 分間細胞をデタッチします。10 cm 皿に 1 mL のトリプシン/EDTA を使用します。完全培地の 10 巻で癒す、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。検定49を使用して懸濁液中の細胞数をカウントします。
    2. 2 mL の完全培地に 6 ウェル プレートのウェルあたり 6.0 × 10 の種5 HEK293 細胞。サンプル、および 2 つの追加の井戸の数としての多くの井戸を野生型 EGFP とモック トランスフェクションのサンプルそれぞれ準備します。
  3. 顕微鏡下で合流 (セルによって占有される領域) を制御します。ポリエチレンイミン (PEI) 試薬を用いた ~ 70% 合流でセルを transfect します。
    1. 0.25 0.5 の最終 ncAA 濃度のすべての井戸に作りたて ncAA 原液の適切な量を追加、トランスフェクション前 1 h mM。野生タイプ肯定的な制御と細胞増殖に及ぼす ncAA によって引き起こされるかもしれない蛍光信号の違いを防ぐために、モック トランスフェクション細胞などを含むすべての井戸に ncAA を追加します。
      注:原液を準備する溶解 0.1 0.5 ncAA M 0.2 0.5 を使用してメートル naoh 水溶液。ただし、いくつかの ncAAs は使用する前に 1 M HEPES (pH 7.4) の 4 つのボリュームで DMSO における初期の可溶化および/または中和を必要があります。一般的には、メーカーはストック溶液を調製するためのプロトコルをお勧めします。
    2. 微量遠心チューブに 1 μ g のプラスミド DNA 記者プラスミド (pcDNA3.0 EGFP183TAG- mCherry) の 1 μ g でテストする ncAARS/tRNA ペアのエンコーディングをミックスします。別のチューブで EGFP 野生型参照を使用して同じトランスフェクションとモック トランスフェクションを準備します。
      注:NcAARS/tRNA ペアのプラスミッドのエンコーディングに埋め込まれている tRNA カセットのコピーの数は、アプリケーションによって異なります。クローン作成を容易にする 1 tRNA コピーが推奨されるときに異なる Trna をスクリーニング (とはいえ厳密には必要ありません) を 4 枚お勧めします一方、テストの別の ncAARS または同じ直交ペアによって異なる ncAAs 定款。
    3. 各チューブを含む DNA は 100 μ L 乳酸 pH 4.0 および 150 mM NaCl で乳酸ナトリウム 20 mM を含むバッファーの食塩水 (ポンド) を追加します。軽く混ぜます。
    4. 各管にポンドで DNA を含むポンドで 1 μ g/μ l プリンスエド ワード島 6 μ L を追加 (ペイ/DNA の比率 = 3/1 w/w) と渦をすぐに。RT で 10-15 分間インキュベートします。
    5. 各ウェルから 400 μ L 細胞用培地を取るし、pH を中和するために DNA PEI の混合物にそれを追加します。セルに DNA の混合物をドリブルします。
      注:DMEM には通常、酸塩基指示薬としてのフェノールレッドが含まれています。中和ステップ チューブで追加の混合物の色は黄色 (酸性) から赤 (ニュートラル) に変更します。酸性 pH でポンドで DNA 複合体の形成を与える最高のトランスフェクション利回り50が、(例えばで無血清 DMEM) pH 7.4 で直接または DNA PEI 錯体を形成できます。フォーム DNA 錯体を DMEM を使用する場合は、中和手順 1.3.5 をスキップします。いずれの場合も、それが欠かせません、血清が存在しない混合物の複合体を形成します。
  4. セル 48 時間後トランスフェクションを収穫します。
    1. 培地を吸引し、2 mL に予め温めておいた PBS (37 ° C) で一度セルをすすいでください。0.5 mM EDTA を添加した PBS の 800 μ L を追加し、37 ° C で 20 分間インキュベート外し、上下にピペッティングにより細胞を中断します。
    2. 5 mM MgCl2で 200 μ L の PBS を含む 1.5 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。
    3. 800 x g で 2 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
      注:プロトコルはここで一時停止することができます。この場合、フラッシュ-凍結液体 N2のペレット、1 か月最大-80 ° C で保存します。常に目の保護ゴーグルを着用します。
  5. 100 μ L トリスバッファーの換散を追加 (50 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl、1% トリトン X-100, 1 mM EDTA とたて追加 PMSF) 細胞ペレットにし、氷上で 30 分間加温します。渦 5 分ごと溶解しやすい。
  6. 4 ° C および 14,000 x g で 10 分間細胞の残骸をスピンダウン黒 96 ウェル プレート上澄みの 90 μ L を転送。蛍光モジュール搭載プレート リーダーを用いた EGFP と mCherry の蛍光を測定します。
    注:適切な刺激および放出フィルターを使用して、EGFP の (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) と mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm)。EGFP の測定値が通常野生型 EGFP から得られる最大値とモック トランスフェクション細胞から得られた最小値範囲に及びます。測定器で正確な測定ウィンドウの設定の世話をします。
  7. NcAA 定款の効率は、サンプルの蛍光と野生型 EGFP の発現から得られる蛍光の比率として計算されます。すべての値は、mCherry 蛍光に正規化されます。
    Equation 1

2. 遺伝的混入 ncAAs の Gpcr 光橋マッピングの GPCR リガンド相互作用のため (図 3)

  1. 10% (v/v) FBS、100 U/mL ペニシリンおよび 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストマイ DMEM HEK293T 細胞を維持します。
  2. 種細胞トランスフェクション前日。
    1. 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリプシン/PBS で 37 ° C で 5 分間細胞をデタッチします。10 cm 皿に 1 mL のトリプシン/EDTA を使用します。完全培地の 10 巻とクエンチし、上下にピペッティングにより細胞を再懸濁します。検定49を使用して懸濁液中の細胞数をカウントします。
    2. 6 ウェル プレートで 2 mL の完全培地にウェルあたり種子 5.0 x 105 293 t 細胞。各位置に上映されると、バインド コントロール33,38の配位子プラス 1 つの井戸のあたりにも 1 を準備します。野生型 (wt) 受容体と transfected に余分なもは突然変異体の発現量を確認する含まれて可能性があります。
  3. 翌日は、顕微鏡下で合流 (セルによって占有される領域) を制御します。プリンスエド ワード島を使用して 〜 70% 合流でセルを transfect します。
    1. 1 時間前、トランスフェクションからは、最終濃度 0.5 ミリメートルのすべての井戸にシュワンツを追加します。
      1. シュワンツの 0.5 M のストック溶液を準備します。6 ウェル プレートあたり 1.2 mg シュワンツにチューブの重量を量るし、15 μ L 0.5 M に溶かして水酸化ナトリウム。1.2 mL の完全培地で原液を希釈し、混合物の 200 μ L を各ウェルに追加します。
        注:すべての実験のシュワンツの新鮮な在庫ソリューションを準備します。アジ化部位は、特に基本的な pH の水溶液の半減期が短いと、AziRS には、そのまま、また劣化した形が組み込まれています。
    2. 総額ウェルあたり 2 μ g DNA を transfect: 1 μ g のプラスミドは目的の位置と 1 μ g のプラスミド シュワンツ (E2AziRS51と、同系の 4 コピー専用直交ペアのエンコーディングでタグ コドンを軸受フラグ タグ GPCR のエンコーディングサプレッサー tRNA Bst山芋)33,38
      注:Wt 比較表現のレベルをチェックするを含むときは transfect wt 受容体のプラスミド DNA の低い金額です。に応じて GPCR、0.2 0.5 μ g のプラスミドの変異体プラスミドの 1.0 μ g として wt 受容体収量と同様レベルをエンコードします。モック (例えば空のベクター) と行方不明の DNA がいっぱい、すべての井戸で DNA の同量を transfect します。
    3. 1.3.3-1.3.5 の説明に従います。
    4. 48 時間後のトランスフェクションは、リガンドの光橋の 2.4 の段階のいずれかを進むか、2.5 を直接収穫して受容体の発現を確認するための手順に進みます。
  4. 写真-架橋配位子の。
    1. 1,000 x リガンド原液を準備します。DMSO で 100 μ M の濃度でペプチド リガンドを溶解します。
      注:リガンド濃度は、解離定数 KD GPCR リガンド相互作用に依存します。最終濃度 100 倍 KDはおすすめです。ペプチド リガンドはトリフルオロ酢酸 (TFA) の塩、分子量を計算するときに TFA の重量を考慮 (1 塩基性アミノ酸、ペプチドのあたり x TFA)。また、ペプチドは、一般的な吸放湿することを検討してください。ペプチド粉末の繰り返しの凍結を避けるため、部屋の温度に達していないそれまで決してペプチド コンテナーを開きます。
    2. 0.1 %bsa、0.01% から成る結合バッファーでリガンド原液縮尺を希釈トリトン X 100、5 mM MgCl2解離 HEPES 緩衝液 (HDB) 12.5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) を含む-塩酸 pH 7.4 では、140 mM の NaCl5 mM KCl。 シュワンツ GPCR 変異あたり 1 mL を準備します。細胞の培地をリガンド溶液 1 mL に置き換えます。室温 10 分間インキュベートします。
      注:特定の GPCR は配位子動力学と受容体の内在化のため会計にインキュベーション時間を調整します。インキュベーション時間を延長しても、架橋歩留まりは向上しません。
    3. 365 で UV 架橋剤で 20 分間サンプルを照射管の 5 x 8 W の nm と ~ セルに 5 センチの距離。ピペッティングにより細胞をデタッチし、1.5 mL の反応管にそれらを転送します。800 x g で 3 分のセルをペレットし、上澄みを廃棄します。
    4. プロテアーゼ阻害薬 (PI) 50 x の原液を 1 mL 25 mM EDTA/H2O のカクテルの錠剤を溶解します。分注 PI ソリューションを在庫し、-20 ° C で保存1:25 HDB で 50 x の在庫を希釈し、2 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します × HDB のパイ。フラッシュ-凍結液体 N2のセル。
      注:目の保護ゴーグルを着用します。この時点で、最大 1 ヶ月間、-80 ° c サンプルを格納できます。2.6 手順に進みます。
  5. 直接セルの収穫。
    1. 培地を吸引します。HDB で 0.5 ミリメートルの EDTA の 800 μ L を追加します。常温または氷の上に 10 分間インキュベートします。
    2. 上下にピペッティングにより細胞をデタッチし、1.5 mL の反応管にそれらを転送します。HDB の 5 mM MgCl2 200 μ L を追加します。800 x g で 3 分のセルをペレットし、上澄みを廃棄します。
    3. 2 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します × HDB とフラッシュの凍結液 N2のパイ。目の保護ゴーグルを着用します。
      注:この時点で、サンプルは 1 ヶ月-80 ° C で保存できます。
  6. セルの換散。
    1. 30 45 s と渦の 37 ° C の水浴中で細胞を簡単に解凍します。寒いこれからのサンプルをしてください。2,500 x g と 10 分のための 4 ° C でペレット膜は細胞質蛋白質の大部分を含む上清を破棄します。
    2. 50 mM HEPES 塩酸 pH 7.5、150 mM の NaCl、10% グリセロール, 1% トリトン X-100, 1.5 mM MgCl2、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM DTT、新たに追加された 2 倍の PI カクテルを含む 50 μ L HEPES 換散バッファーでペレットを再懸濁します。ミックス徹底的。氷と渦 5 分ごとに 30 分の細胞を溶解させます。
    3. 14,000 x g で 10 分間、4 ° C の細胞の残骸をスピンします。すぐに新鮮な反応チューブに上清を転送します。
      注:すぐに解析を続行します。Lysates は-20 ° C で保存することができます、しかし、すべて凍結融解サイクルは結果の質を損ないます。
  7. 西部のしみの分析。
    1. サンプルを準備し、3-5 μ L のライセートを取るまでにそれを埋める 7 μ L H2O を追加 2 μ L 1 M DTT と 63 mM トリス塩酸 pH 6.8, 2 %sds、10% グリセロールと 0.04 %bromphenol を含む 3 μ L 4 x サンプルバッファーの青します。37 ° C で 30 分間インキュベートします。
    2. 問題、信号強度を増加し、バンドをシャープ PNGase f deglycosylate サンプルでは、GPCR がグリコ、またはかすれたりにじんだりバンド。次のサプライヤーのプロトコル 10 μ L の総ボリュームで 3-5 μ L ライセートと deglycosylate を使用します。3 μ L 4 x サンプルバッファーを追加します。
      注:膜タンパク質が多い複数のサイトと国家の SDS-PAGE 解析の解像度の品質を損なうグリコ。しかし、deglycosylate ではない成熟した細胞表面受容体の完全にグリコの部分を評価に関係あるため反フラグ抗体を用いたシュワンツ GPCR 変異体の発現レベルの分析用試料を行います。
    3. 標準の SDS ページ経由でサンプルを解決し、PVDF 膜に伝達タンパク質のしみ。
      注意:アクリルアミドは神経毒性です。手袋、眼の保護を着用します。
    4. RT で 1 時間または一晩 4 ° c 5% TBS T 含む 20 mM トリス塩酸 ph 7.4、スキムミルクで膜をブロック 0.15 M 塩化ナトリウムおよび 0.1% Tween 20。
    5. HRP 標識二次抗体が続く反リガンド抗体を用いた膜をプローブします。TBS"T"での間を洗うシュワンツ GPCR の発現レベルを検出するプローブ商業 HRP 抗体を用いた膜 (材料の表を参照してください)。
    6. 自家製の ECL 試薬を用いた化学発光 (ECL) 反応を実行し、暗闇の中で 5 分信号を検出します。

3. 超高速 Bioorthogonal の生きている哺乳類セルの Gpcr のラベル付け

注:4 よくチェンバード coverslips にプロトコルを最適化 (ウェル エリア = 2.2 cm2)。よくサイズが異なるため、プロトコルのそれに応じてスケールが必要があります。

  1. 顕微鏡のスライドの表面塗装。無菌フードの下で全体の手順を実行します。
    1. ポリ-D-リジン臭化水素を準備 (MW = 500-550 kDa) (PDL) 50 mM ホウ酸バッファー (Ph8.5) 1 mg/mL の濃度で原液。6 ヶ月まで 4 ° C で保存します。凍結しないでください。
    2. 25 μ g/mL (作業ソリューション) の最終的な集中に滅菌超純水で原液 1:40 歯根膜を希薄化し、0.22 μ m の滅菌フィルターを通してソリューションをフィルター処理します。
      注:実用的なソリューションは、最大 3 カ月の 4 ° C で保存できます。
    3. PDL 作業ソリューションを 500 μ l 添加の顕微鏡スライドの各ウェルの底を完全にカバーします。室温で 20 分間インキュベートし、PDL 作業ソリューションを吸引します。
      注:PDL の作業ソリューションは、3 回まで使用できます。ソリューションは、再利用する必要があります、スライドに塗ったから新鮮な生殖不能の管に使用されるソリューションを転送、チューブをそれに応じてラベルします。新鮮なソリューションを使用リサイクル ソリューションを混在させないでください。
    4. リンスとも 3 x 〜 700 μ l 滅菌超純水と少なくとも 1 時間乾燥させます。
      注:正確には、PDL ソリューションの残基は、細胞に有毒、井戸を洗浄する非常に重要です。コーティング スライドを顕微鏡用直線距離または 4 ° C で最大一週間保存することができます。
  2. 10% (v/v) FBS、100 U/mL ペニシリンおよび 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストマイ DMEM HEK293T 細胞を維持します。
  3. 種細胞トランスフェクション前日。
    1. 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリプシン/PBS で 37 ° C で 5 分間細胞をデタッチします。10 cm 皿に 1 mL のトリプシン/EDTA を使用します。完全培地の 10 巻で癒す、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。検定49を使用して懸濁液中の細胞数をカウントします。
    2. 種子 1.0 x 105 HEK293T 細胞/ウェル (面積 2.2 cm ²) 600 μ L で色素が完全な DMEM を無料します。
      注:目的をイメージングのため任意の染料を含まない培地で初めから動作するように非常に便利です。染料無料 DMEM 製剤が市販されています。
  4. 脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた ~ 70% 合流でセルを transfect し、顕微鏡下で合流 (セルによって占有される領域) を制御します。
    1. 1 時間、トランスフェクション前準備 TCO の新鮮な 100 mM 原液 * 0.2 M NaOH で 15% (v/v) DMSO K。
    2. 好評につき、TCO の 3 μ l をミックス * 1 M HEPES pH 7.4 の 12 μ L と K 原液。優しく最終的な TCO の井戸にソリューションを追加 * 0.5 ミリメートルの K 濃度。
    3. 総額ウェルあたり 500 ng の DNA を準備します。微量遠心チューブに希釈 200 pcDNA3.1_CRF1R の ng-95TAG-EGFP、200 MbPylRSAF/tRNA エンコードPyl直交ペア プラスミドの ng (tRNA の 4 カセットM15) と 100 pcDNA3.1_Arrestin3 の ngプラスミド 50 μ L 中 (色素フリー、無血清、抗生物質無料)。
      注:一般に、Arrestin との共トランスフェクションは、GPCR の内面を観察する必要はありません。ただし、Arrestin3 の共同株は多くの突然変異体の内面を分析する際、非常に便利である、CRF1R の内面化をスピードアップします。
    4. 50 μ L 媒体 (色素フリー、無血清、抗生物質無料) 脂質ベースのトランスフェクション試薬 (DNA の 1 μ g あたり 2.5 μ L) の 1.25 の μ L を希釈し、DNA の混合物にソリューションを追加します。渦をすぐにし、セルに追加した DNA-リン脂質複合体で 5-10 分間加温します。
      注:我々 の経験で細胞の形態は、PEI による脂質ベースのトランスフェクション ルックスより生理に比べて細胞のトランスフェクションを transfected しました。プリンスエド ワード島は、トランスフェクション効率を与える、脂質ベースのトランスフェクションがイメージング実験のための細胞を使ってより良い選択に対しプリンスエド ワード島は西部のしみのような下流のアプリケーションに適してはずです。
  5. 24 h 後トランスフェクション ラベル蛍光色素を持つ受容体です。
    1. DMSO と DNA 染色染料原液超純粋な H2o. の 10 mg/mL に 0.5 mM 染料 tetrazine 原液を準備します。
    2. 各ウェルから 1.5 mL の反応管に 100 μ L の培地を転送します。染料 tetrazine 原液の 1.8 μ L と 0.3 μ L の DNA 染色染料原液を追加します。井戸に戻す染料を含む培地を転送し、37 ° C で 5 分間インキュベート
      注:Tetrazine オレンジ蛍光染料には、1.5 μ M の最終濃度があります。
    3. 培地を吸引し、色素の過剰な削除する PBS で 2 回細胞を優しくすすいでください。無料成長媒体を予熱した完全な色素の 600 μ L を 37 ° C に追加します。
  6. 蛍光顕微鏡と受容体の内在化。
    1. 下 63 x (または類似の) ラベルの受容体を可視化する GFP の適切なフィルターを使用して倍率 (λabs: 488 nm; λem: 509 nm)、オレンジ蛍光染料 (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) および DNA 染色染料 (λabs: 350 nm;Λem: 461 nm)。受容体を活性化する前に、各フィルターで写真を撮る。
    2. 200 を使用して受容体の内在化を促進する Ucn1 の nM。
      1. DMSO で 200 μ M の 1,000 x Ucn1 原液を準備します。
        注:ペプチドの溶解性によって純粋な水やバッファーの在庫を準備することができます。
      2. 1.5 mL の反応管の井戸から 100 μ L 中に転送し、ペプチド アゴニスト原液の 0.6 μ L を追加します。井戸に中型のバックを転送します。
      3. 顕微鏡下で内面を観察します。内面化 (受容体および Arrestins の過剰発現によって、時間に 10-15 分) が明確に検出可能な発生した後写真を撮る前に説明したフィルターを使用して。

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Representative Results

蛍光アッセイの概要は、図 1に描かれています。アッセイは、3 つのアプリケーションで採用されています。まず初めに、Pyl 直交ペアで Lys(Boc) の定款の tRNA の亜種の数は除かれます。Lys(Boc) は、アミノ酸立体 Pyl のようです。Pyl は市販、Lys(Boc)、PylRS の標準的な基板として使用されます。選別された Trna を tRNA に基づくpyl ブランド。それぞれの tRNA のバリエーションは、単一拠点またはループや tRNA 安定性と真核生物の翻訳機械との互換性を改善するために設計された茎で塩基の変異を負いません。TRNA の設計のすべての詳細については、私たちの最近の仕事の30のとおりです。典型的な結果は、図 2 aで説明: 異なる Trna を与える別の抑制効率測定蛍光量明確に反映されています。値再現性の高い生物学的トリプリケートの小さな誤差を示します。2 位、写真架橋剤 p-アジドフェニル-Phe (ウェット) が組み込まれている、E2AziRS26,51の 2 つの遺伝子バリアントが評価されます。E2AziRS は、大腸菌TyrRS から派生されます。1 つの遺伝子の変形を採用ネイティブエシェリヒア属大腸菌のコドン使用 2 番目のコドン最適化H. サピエンスの使用のためだったに対し。蛍光アッセイでは、コドンに最適化されたバリアントが高いタンパク質利回り (図 2 b) を与えることを示しています。最後に、bioorthogonal クリック化学アミノ酸の混入率は、(図 2) を比較します。ここに示すすべての ncAAs (BCNK、TCO * K と SCOK) 同じ直交 MbPylRSAF/tRNAPyl ペアが組み込まれています。Lys(Z) もこのペアによって組み込まれているし、肯定的な制御として使用されました。蛍光アッセイの信頼性を示すためには、GPCR、CRF1R の並列 ncAA 導入実験を行った。西部のしみの分析は GPCR 式 (図 2 b, C) の推定を行った。蛍光アッセイでの EGFP と同じ傾向は、CRF1R で観察されました。に比べても蛍光アッセイによると可溶性タンパク質 (EGFP) の 1.5-2 倍の緩やかな改善がないことを示すネイティブの遺伝子コドンに最適化された E2AziRS 遺伝子を使用するとき特に、シュワンツ CRF1R 混入された強化高、挑戦的な膜蛋白質 (図 2 b) の発現レベルに大きな影響を与える。各アプリケーションに使用される tRNA カセットの数についての一般的な注意としてクローニング プロシージャを促進するために別の Trna をスクリーニングする場合にのみ 1 つの tRNA のカセットは推奨します。別の ncAARS または同じ直交ペアによって異なる ncAAs の取り込み効率のスクリーニング、カセット ncAA 定款最高利回りを達成することが推奨される tRNA の 4 つのタンデムが繰り返されます。

シュワンツ定款のヒト E2AziRS 遺伝子を含む最適化されたシステムを展開、CRF1R の結合のポケットをマップし、5 異なる配位子の結合パスを定義する: 2 つのペプチド アゴニスト Ucn1 と CRF、および 3 つのペプチド性拮抗体 Ucn1(8-40)、CRF (9-41) とdFXCRF(12-41) (図 3)。シュワンツ定款効率は減少 GPCR C 末端33,34に近づくときに、先ほどシュワンツの混入のための最適化された体制可能タグ サイト シュワンツ-突然変異体の対等な発現レベルGPCR 遺伝子 (図 4 a) のさまざまな部分。図 4 bで結果表示 2 (ECL2) の細胞外のループのスクリーニングとヘリックス CRF1R V リガンド結合ポケットの代表的な部分として。架橋製品の適切なサイズでバンドでは、リガンド-受容体複合体の内でリガンドの近さの位置、すなわち結合ポケットの一部であることを明らかにします。複数の架橋のヒットは、すべての配位子、テストで、ペプチドのアゴニストとアンタゴニストの異なるバインドのパターンを明らかに発見されました。特に、架橋のヒット パターンは、受容体の構造要素に関する情報を提供します。ECL2 (拮抗薬との組み合わせで F260 R263 の位置) で観測された、連続ヒット数では、柔軟なループ領域を示唆しています。螺旋構造に向かってらせん V (D269/Y270、Y272/Q273, I277) ヒントで見つかったとしてすべての 3 〜 4 残基のパターン。画面は、GPCR のすべての関連するドメインに拡張できます。3 D 構造や受容体の分子モデルが存在する場合は、それぞれの ligand (図 5) 架橋ヒットを強調することによって配位子の足跡を視覚化できます。

蛍光および西部のしみのデータ (図 2) ことが示唆された TCO * K はMbPylRSAFで最高の効率で組み込まれる bioorthogonal 化学 ncAA。別の PylRS の突然変異体は他クリック ncAAs17の高い法人利回りを与えるかもしれないが、彼らはこの研究ではテストされていません。TCO * K は CRF1R EGFP 融合タンパク質に組み込まれ、受容体 (図 6 b) に小さな明るい蛍光 SPIEDAC 化学 (図 6 a) 経由でインストールするを有効にします。特殊にラベリングの証拠としてラベルの蛍光表示される (図 6 bで緑のセル) 受容体を発現する細胞でのみ暗い細胞でには、各実験で否定的な統制を提供したがってして。受容体の超高速 SPIEDAC 化学を使用してラベル付けはまだ機能であります。ペプチド作動薬を追加すると、蛍光コンパートメント GPCR 内面化 (図 6) の生理学的なプロセスを明らかに細胞質全体に観察されました。すべての回、GPCR の選択的直交ラベルを確認する蛍光色素と共局在融合 EGFP の信号。

Figure 1
図 1: 蛍光を用いた測定停止コドン抑制の効率を評価します。HEK293 細胞は ncAA の存在下で 2 種のプラスミドを持つ cotransfected です。プラスミドの 1 つを目的の ncAARS とサプレッサー tRNA のエンコードします。2 番目のプラスミドを mCherry コントロールとともに寛容なサイトでタグ停止コドンを軸受 EGFP 遺伝子をエンコードします。トランスフェクション後、2 日間の全体セル lysates の緑と赤の蛍光プレート リーダーで測定されます。EGFP N-セグメントとして上流停止コドン (グレー) ではない蛍光、フルレングス EGFP (緑) の収量直接関連する ncAA 定款効率 mCherry (赤) の正規化のため独立した参照を提供します。直交系の効率は、EGFP 停止コドン抑制を介して取得量と通常の翻訳 (ない琥珀抑制) によって得られる野生型 EGFP の量間の比率によって与えられます。Serfling からの図が変更された r. & コイン、;2016 年、哺乳類細胞、酵素学の方法でタンパク質への非天然型アミノ酸の取り込み 580、89-107。29再生は、エルゼビアの著作権クリアランス センターで許可でした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 蛍光アッセイの代表的なアプリケーションです。(A) tRNA のスクリーニングPyl亜種30。HEK293 細胞であった記者プラスミドとMbPylRS/tRNA ペアのプラスミド cotransfected (1 つは tRNA をコピー)。バーでは、野生型 EGFP と比較して Lys(Boc) の設立から得られる EGFP の相対的な蛍光を表します。(B)は、ncAARS 遺伝子のコドン使用の環境影響を評価します。(左側のパネル)E2AziRS の 2 つの異なる遺伝子変異細胞の蛍光アッセイをトランスフェクトしました。(1) からエシェリヒア属大腸菌および (2) ヒト遺伝子コドン。(右側のパネル)CRF1R95Aziの西部のしみの分析-フラグ。フルレングスの受容体は、反フラグ抗体によって検出されます。アクチン β がコントロールを読み込むとして使用されました。(C)は、bioorthogonal 化学用に設計された 3 つの ncAAs の取り込み効率を評価します。(左側のパネル)この実験で使用される ncAAs の構造。(肯定的な制御、(2) BCNK、TCO (3) として使用された 1) LysZ、* K と SCOK (4)。(中央のパネル)HEK293 細胞の蛍光アッセイ transfected プラスミッドを組み込むMbPylRSAFと tRNA15 (A) からのコピーが 4 つのエンコーディング (1)、(2) と (3) と (4)。(右側のパネル)西部のしみの位置 95 ベアリング 4 つの ncAAs の CRF1R フラグの変異体の解析。アクチン β がコントロールを読み込むとして使用されました。パネル A 1-10 (2018 年) に Serfling、哺乳類細胞核酸研究46 (1) ピロリシン システムによる非正規のアミノ酸の定款の効率的な r. らデザイナー Trna から適応され、クリエイティブ ・ コモンズによると再現帰属ライセンス。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: シュワンツを介した光橋マッピングの概略図。写真アクティブ化可能なアジドフェニル関数 (黄色の星) は、受容体 (グレー) 内で定義された位置に配置されます。アジドフェニル グループはバインドされている配位子 (赤) に近位に位置し、UV 照射によって共有結合で架橋製品が形成 (黄色のマル印架橋サイト)。アジドフェニル グループの受容体の別の位置への取り込みでは、結合のポケットを表すリガンドの結合表面 (紫) を明らかにします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 写真架橋結合ポケットのマッピングのための CRF1R を通じて、シュワンツの設立。(A)野生タイプ受容体に向かってシュワンツ CRF1R フラグを突然変異体の発現レベルの比較。一番上の行に示されているように、シュワンツ設立サイトは全体の受容体を通して配布されます。全体セル lysates の西部のしみを反フラグが表示されます。アクチン β がコントロールを読み込むとして使用されました。(B)いずれかのアンチ CRF を用いて探る西部のしみまたは抗 Ucn1 抗体が表示されます。シュワンツに置き換え残基は、上の行に示されます。右に記載されている配位子を添加して細胞紫外線 365 nm および換散で続きます。サンプルは 10% の解決された SDS-PAGE、deglycosylated PNGase F を使用して、西部にしみが付くことによって分析します。Deglycosylated リガンド CRF1R の複合体は、33〜 40 kDa の明白な MW で実行されます。非架橋配位子が検出された (MW 3 〜 4 kDa) ではありません。この図の両方のパネルは、ザイデル、L. ら構造洞察ライブのひと細胞のペプチド ホルモンによるクラス B G タンパク質共役型受容体の活性化から変更されています。Elife6 10.7554/eLife.27711 とは、クリエイティブ ・ コモンズのライセンスによると再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5:ペプチド アゴニスト及びアンタゴニスト B GPCR の CRF1R クラスのフット プリント。CRF1R 膜貫通ドメインの表面表現。CRF1R の位置その架橋配位子シュワンツで置換する際が強調表示されます。CRF と Ucn1 のペプチド アゴニストの足跡は、青色で拮抗薬 CRF (9-41) と Ucn1(8-40) の足跡マゼンタでハイライトされます。CRF(12-41) 拮抗薬dFXのフット プリントは、オレンジ色で強調表示されます。7 つの膜貫通ヘリックス I 〜 vii 群は、ローマ数字で示されます。(A B)膜面から結合ポケットの側の景色。(C)は細胞外の側から結合ポケットに平面図です。サイデル、L. ら構造洞察ライブのひと細胞のペプチド ホルモンによるクラス B G タンパク質共役型受容体の活性化からの転載。Elife6 10.7554/eLife.27711 とは、クリエイティブ ・ コモンズのライセンスによると再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 生きているセルの CRF1R の SPIEDAC のラベルします。(A)ひずみ昇格逆電子需要 Diels-alder 付加環化 (SPIEDAC) の反応機構: ncAA TCO のトランス-シクロ-2-octene グループ * tetrazine グループと K 反応 Cy3 蛍光体にリンクされています。(B, C)HEK293T 細胞 CRF1R95TCO * K- EGFP。緑、赤と青のチャンネルの代表的なイメージ。スケール バーの大きさは 10 μ m。 (B)細胞が tetrazine Cy3 (1.5 μ m) を 5 分間で処理しました。(緑) の受容体を発現する細胞のみ表示ラベルの発生する (赤)。(C)細胞を施した 200 nM Ucn1 15 分細胞内小胞が内面化された受容体に対応した後のイメージを作成し、。B と C のパネルが Serfling、哺乳類細胞核酸研究ピロリシン システムによる非正規のアミノ酸の定款の効率的な r. らデザイナー Trna から変更します。46 (1) 1-10 (2018) (オックスフォード大学出版局) とは、クリエイティブ ・ コモンズのライセンスによると再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

プロトコルでは、直交ペアの ncAAs の哺乳類細胞で発現したタンパク質混入の効率を評価するためにシンプルで信頼性の高いアッセイについて説明します。FACS に基づいて広く使用されているアッセイを尊重しこの方法の主な利点は同時準備と多数のサンプルの測定を可能にしては簡単に普通のソフトウェアを使用して分析データを提供します。哺乳類細胞における直交ペアを分析する媒体スループット方法の可用性は、新しい直交ペアの開発及び既存の向上にとって非常に重要です。確かに、哺乳類システムの大規模なランダムなライブラリと死者/生きている選択の生成を介して直交ペアの進化を実行不可能します。アッセイは、比較的短い時間内で実験的努力を投資することによって小さなサイズのスクリーニング ライブラリ (メンバー数百) をことができます。この試金によって合理的に設計された tRNA セットを上映、ピロリシン システム30の効率を大幅に高める新しい Trna を生成でした。古典的な組み合わせ EGFP/mCherry は、EGFP が混入効率性と内部統制として mCherry の記者として機能するという蛍光の読み出しに使用されます。EGFP レポーターおよび mCherry コントロールは、同じプラスミッドに抱いているが 2 つの独立したプロモーターのベアリング 2 つの別々 の式カセットに埋め込まれています。この方法 mCherry 式トランスフェクション効率と細胞数に関連しているが、測定された緑の蛍光性は赤い蛍光を正規化できるように、EGFP 発現の独立です。これは EGFP タグ mCherry7と iRFP GFP (赤外蛍光タンパク質を示す iRFP) とY39TAG 52など 2 つのタンパク質のタンデムとして建てられた他のレポーターのケースではありません。このようなコンストラクト両蛋白質同じ mRNA 転写されています。真核生物、Mrna は時期尚早停止コドンを軸受は、ナンセンス変異を介した崩壊 (NMD) 機構53による監視と劣化を受けます。したがって、両方記者とコントロールのシーケンスが同時に低下し、2 つの遺伝子の発現は厳密に独立していません。ルシフェラーゼ レポーター蛍光レポーターではなくに基づいて同様の試金がされている54,55他記述されています。酵素発光が蛍光測定よりも感度が高くなる、後者は別の細胞のバッチ間再現性を示した。

膜蛋白質と低の豊富な蛋白質のような蛋白質ターゲットを求めてを操作するとき、ncAA 体用哺乳類セルに堅牢なシステムが絶対に必要です。我々 がここで写真アクティブ化可能な ncAA の定款のロバスト最適化直交ペアを示した Gpcr にシュワンツ。システムは、GPCR 表面全体の体系的な光橋マッピングとリガンド結合部位の同定は、全体の受容体を通して均一のシュワンツ設立料金を提供します。メソッドの強度の 2 つの主要なポイントは、異なる配位子は、並列に同じ受容体に分析できます、データが体外のアプローチから得られた情報を補完する生細胞における受容体から派生したことです。メソッドは、原則として任意の蛋白質ターゲットに適用および蛋白質蛋白質の相互作用のトポロジをマップにも適しています。また、架橋位置の特定のサブセットは、近位のアミノ酸の分子間のペアに関連付けられている複雑な33,38ピンポイントに 2次元架橋をさらに分析できます。このようなアミノ酸のペアは、インシリコ実験相互作用33,38の正確な分子モデルを構築するに適用される空間的制約を提供します。組織的な観点からリマーク架橋実験からの唯一の肯定的結果を考慮すべき価値があります。リガンドから重要な半径内はない架橋位置ができます。偽陰性は、架橋剤によって導入された変異ネイティブ相互作用を阻害架橋部位、リガンドは、離れたポイントまたは、溶媒によって急冷分子内架橋を受けるときにも発生することができる場合に発生することができます。法の重要な部分は、架橋の発生を検出する方法です。最初の場所では、全体セル lysates は共有結合受容体にバインドされていない任意の配位子を分離する SDS ページに解決されます。第二に、反リガンド抗体を用いたウエスタンブロットを介して共有結合リガンド-受容体複合体が検出されました。ペプチド性リガンド、リガンドに対する高親和性抗体が最適です。代わりに、タグに適当なスペーサーを介して反フラグ抗体アクセス提供寛大な位置にフラグ タグ付きペプチド性リガンドを装備できます。内因性ビオチン化タンパク質によるバック グラウンドによる解釈が困難になる可能性がありますが、ビオチンのタグも使用できます。小分子リガンドは標識通常タグ標識可能な56,57もあります。プロトコルのシュワンツ Gpcr 混入されている57,58,59他人によっても公開されました。しかし、これらのプロトコル シュワンツの混入のための 3 つのプラスミドの使用を伴う簡単 2 プラスミド システム「E2AziRS、非-コドン-最適化に関してより良い結果を与えるのヒトの遺伝子を含むのに対し 1 つ (図 2 b).

現代顕微鏡技術クラシック EGFP、ハイエンド用途に適していないように遺伝的に符号化された蛋白質の蛍光物質として、興味の蛋白質に非常に明るく、効率的な fluorophores が付いてをインストールする必要。したがって、人気のスナップ60とヘイロー61タグを他の人の間の発展につながっているタンパク質に有機 fluorophores が付いてのインストールを有効にする方法の連続的な検索があります。しかし、このようなタグまだターゲット蛋白質の機能を混乱させるし、蛍光体の正確な位置についての非常に大きな不確実性を残す可能性のあるいくつかの kDa のサイズがあります。いくつかのアミノ酸の最小限の大きさ、tetracysteine モチーフはフルオレセインやらのヒ素化合物 (フラッシュ、ReAsH)62,63を使用してより正確なラベリングのための小さい代替を表します。ただし、このアプローチは、GPCR 研究64,65,66にもに適用されて非常に成功したが、チオールと広範な洗浄のステップが必要です、それに苦しんで高いバック グラウンド、多くの場合、いずれの場合も、それはできません。単一残渣分解能でラベルを配置します。代わりに、bioorthogonal アンカー装備 ncAAs はネイティブ構造とターゲット蛋白質の機能に干渉することの危険性を最小限に抑える単一のアミノ酸の位置に蛍光ラベルをインストールする可能性を提供しています。Bioorthogonal 化学の最後の世代の ncAAs 好き TCO * タンパク質ラベリング直接生きているセル17,43K13ここでは、採用を有効にします。メソッドは、適切な細胞膜透過性の色素が使用可能な17,,6768標的タンパク質細胞表面に、細胞内ターゲットに適用されます。SPIEDAC 化学は桁違い高速ひずみ昇格アジドフェニル アルキンの環化付加反応 (SPAAC) を尊重し、アジにシュタウディンガー Bertozzi およびアンカー2,13。実際には、GPCR 遺伝子のラベリングはシュワンツ、組み込まれてが、彼らは孤立した Gpcrの in vitro37,59,69にのみ適用されますいくつかのプロトコルが公開されています。代わりに、私たちを示しているここで滑らかに生細胞の機能的な Gpcr の bioorthogonal ラベルします。我々 のプロトコルは、同じ化学43,48,70, を使用して既存のプロトコルに似ていますが、最適化された ncAA 設立体制展開メソッドのスコープ GPCR 研究。実験手順の重要なステップは、TCO と交換される位置の選択 * K、受容体の内ではすべてのポジションとして、交換のため寛容なまたは蛍光色素にアクセスできます。したがって、いくつかのポジションは、最も適当な 1 つを見つけるに予備的な画面でテストする必要があります。

結論としては、この作業は ncAAs、Gpcr など挑戦的な標的のタンパク質への応用などの一般的なアプリケーションのためのツールを示します。光橋マッピングとラベリング、この頃 GPCR 研究の ncAAs の主な用途 bioorthogonal 多く将来のアプリケーション両方 GPCR リガンドまたは他の蛋白質の相互作用のトポロジを発表し、GPCR の研究を見つけることを期待して生細胞の構造動力学。

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Disclosures

著者を宣言する競合があります。

Acknowledgments

この作品は CO822/2-1 (Emmy Noether プログラム) と CO822/3-1 陽性の補助金の下で、ドイツ研究振興協会 (DFG) によって設立されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114, (9), 4764-4806 (2014).
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