फोटो के लिए GPCRs में रासायनिक जांच के आनुवंशिक निगमन-crosslinking मानचित्रण और लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में Bioorthogonal रसायन विज्ञान का अनुकूलन

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Chemistry

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Summary

एक सतही प्रतिदीप्ति परख अमीनो की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है-acyl-tRNA-synthetase/tRNA जोड़े शामिल गैर विहित अमीनो-एसिड (ncaas) प्रोटीन में स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की । जी का अध्ययन करने के लिए ncaas के आवेदन प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) फोटो crosslinking बाइंडिंग साइटों की मानचित्रण और bioorthogonal GPCR रहते कोशिकाओं पर लेबलिंग सहित वर्णित है ।

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

गैर के आनुवंशिक शामिल-विहित अमीनो एसिड (ncaas) एंबर रोक codon दमन के माध्यम से एक शक्तिशाली तकनीक को सीधे जीवित कोशिका में प्रोटीन पर कृत्रिम जांच और प्रतिक्रियाशील moieties स्थापित है । प्रत्येक ncAA एक समर्पित ओर्थोगोनल दमन-tRNA/एमिनो-acyl-tRNA-synthetase (AARS) जोड़ी है कि मेजबान जीव में आयात किया जाता है द्वारा शामिल है । विभिंन ncaas के निगमन दक्षता बहुत अलग कर सकते हैं, और कुछ मामलों में असंतोषजनक है । ओर्थोगोनल जोड़े या तो AARS या tRNA जोड़ तोड़ से सुधार किया जा सकता है । हालांकि, tRNA या बड़े पुस्तकालयों और मृत/जिंदा चयन विधियों का उपयोग AARS के विकास का निर्देश स्तनधारी कोशिकाओं में व्यवहार्य नहीं हैं । इधर, स्तनधारी कोशिकाओं में ओर्थोगोनल जोड़े की कुशलता का मूल्यांकन करने के लिए एक सतही और दमदार प्रतिदीप्ति आधारित परख प्रस्तुत की गई है. परख एक उदारवादी प्रयास के साथ AARS/tRNA वेरिएंट के सैकड़ों को दसियों स्क्रीनिंग की अनुमति देता है और एक उचित समय के भीतर । इस परख का उपयोग करने के लिए नए tRNAs कि काफी pyrrolysine ओर्थोगोनल प्रणाली की क्षमता में सुधार उत्पंन करने के साथ वर्णित है, जी के अध्ययन के लिए ncaas के आवेदन के साथ प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), जो ncaa के लिए वस्तुओं को चुनौती दे रहे हैं mutagenesis । पहले, व्यवस्थित एक रिसेप्टर के extracellular सतह भर में एक तस्वीर crosslinking ncAA शामिल करके, बरकरार रिसेप्टर पर अलग लाइगैंडों के बंधन साइटों सीधे लाइव सेल में मैप कर रहे हैं. दूसरा, एक GPCR, ultrafast उत्प्रेरक-मुक्त रिसेप्टर एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग में अंतिम पीढ़ी के ncaa को शामिल करके प्रदर्शन किया है, जो bioorthogonal तनाव-पदोंनत व्युत्क्रम Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) जी सेल पर बढ़ावा दिया । के रूप में ncaas आम तौर पर किसी भी प्रोटीन के लिए स्वतंत्र रूप से अपने आकार पर लागू किया जा सकता है, विधि आवेदनों की एक संख्या के लिए सामांय ब्याज की है । इसके अलावा, ncAA निगमन किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और आसानी से मानक जैव रसायन प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया ।

Introduction

प्रोटीन में रासायनिक जांच के आनुवंशिक निगमन एक शक्तिशाली विधि सीधे जीवित कोशिका के मूल संदर्भ में प्रोटीन समारोह के संरचनात्मक और गतिशील पहलुओं की जांच की सुविधा है । आजकल, गैर-विहित अमीनो एसिड के सैकड़ों (ncaas) सबसे अलग रासायनिक समूहों के साथ सुसज्जित साइट-विशेष रूप से जैव संश्लेषण1,2,3,4द्वारा प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है । उन दोनों के बीच, एक फोटो के रूप में संवेदनशील ncaas ढूंढता है-crosslinkers5, फोटो-पिंजरा6,7,8,9 और फोटो स्विच अमीनो एसिड10, 11, अमीनो एसिड उत्प्रेरक मुक्त bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए तनावपूर्ण alkenes और alkynes असर2,12,13,14,15,16 ,17, एमिनो एसिड dansyl ले जाने18, अनंतमूलि9,19, और prodan20,21 fluorophores, और एमिनो एसिड अन्य के रूप में भौतिक जांच से सुसज्जित अच्छी तरह के रूप में पोस्ट शोधों संशोधनों के साथ1,2,3,4,22,23,24,25.

एक ncaa के आनुवंशिक एंकोडिंग एक समर्पित अमीनो द्वारा सक्षम है-acyl-tRNA-synthetase (AARS) एक cognate शमन करने के लिए युग्मित-tRNA, जो नियमित codon संश्लेषण के दौरान एक एंबर रोक राइबोसोमल के जवाब में ncAA शामिल हैं । ncAARS/tRNA जोड़े इंजीनियर होते हैं ताकि मेजबान जीव में ओर्थोगोनल हो, यानी अंतर्जात जोड़े के साथ क्रॉस-टॉक न हो. तकनीक अच्छी तरह से दोनों prokaryotic और eukaryotic मेजबान में स्थापित है और आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं को लागू । स्तनधारी कोशिकाओं में ncAA शामिल करने के लिए जोड़े तीन मुख्य ओर्थोगोनल प्रणालियों पर आधारित हैं: tyrosyl प्रणाली है, कि ई. कोलाई26 से TyrRS एक tyrosyl एंबर दमन के साथ बी stearothermophilus27 से जोड़ती है (चुनाव आयोग TyrRS/Bstयम् जोड़ी), ई. कोलाई leucyl प्रणाली (ईसीLeuRS/tRNAलियूकूए pair)6,18,28 और archaeal pyrrolysyl सिस्टम (PylRS/tRNA Pyl जोड़ी)3, जिससे tRNAPyl एक प्राकृतिक एंबर दमन है । सामांय में, प्रत्येक ncAA एक विशेष ncAARS द्वारा मांयता प्राप्त है । ncaa की संरचना पर निर्भर करता है, ncAARS या तो TyrRS, LeuRS या PylRS का निर्देशन विकास के द्वारा प्राप्त की है, हालांकि कुछ synthetases एक से अधिक ncAA स्वीकार कर सकते हैं ।

ओर्थोगोनल जोड़ी केवल एक प्लाज्मिड वेक्टर का उपयोग करके कोशिकाओं में आयात किया जाता है । सबसे आम और कुशल plasmids bicistronic और synthetase और ओर्थोगोनल जोड़ी के गठन tRNA के लिए दोनों सांकेतिक शब्दों में बदलना कर रहे है29। एक दूसरा प्लाज्मिड संशोधन के लिए नामित साइट पर एक एंबर codon असर ब्याज के प्रोटीन के लिए एंकोडिंग सह है transfected । ncAA बस सेल विकास माध्यम में जोड़ा गया है । हालांकि, विभिंन विशिष्ट समूहों अक्सर प्लाज्मिड के विभिंन वेरिएंट का उपयोग भी एक ही ncAA के शामिल करने के लिए निर्माण । निर्माण वेक्टर में जीन की व्यवस्था में अलग, synthetase के प्रकार, synthetase जीन में codon उपयोग, प्रवर्तक उपयोग, tRNA के संस्करण और tRNA अभिव्यक्ति कैसेट की संख्या । । इसके अलावा, विभिंन ncaas के निगमन दक्षता काफी अलग synthetases के विभिंन उत्प्रेरक दक्षता, tRNA की गुणवत्ता, और अंय कारकों के कारण भिंन हो सकते है30। इसलिए, यह एक ओर्थोगोनल जोड़ी की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए हाथ में एक तेज और विश्वसनीय विधि है, दोनों एक वांछित आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त प्रणाली का चयन करने के लिए और कुछ अनुकूलन कदम है कि समग्र प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है पैदावार.

हम एक सरल और मजबूत प्रतिदीप्ति आधारित परख की स्थापना की है ओर्थोगोनल जोड़े29 (चित्रा 1) की दक्षता का मूल्यांकन । परख में, कोशिकाओं को सह रहे है ओर्थोगोनल जोड़ी के लिए प्लाज्मिड एंकोडिंग के साथ transfected, एक bicistronic रिपोर्टर प्लाज्मिड हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दोनों एंकोडिंग एक codon स्थिति में एक एंबर बंद स्वतंत्र असर (EGFPटैगके साथ) और mCherry जीन. साबुत-सेल lysates के लाल और हरे प्रतिदीप्ति एक प्लेट रीडर पर 96-वेल प्लेट में अलग चैनल में पढ़ते हैं । हरे प्रतिदीप्ति की तीव्रता एंबर दमन की दक्षता के साथ सीधे संबद्ध है, जबकि लाल प्रतिदीप्ति की तीव्रता मापा नमूना और अभिकर्मक दक्षता के आकार का एक सीधा अनुमान देता है । इसी तरह प्रतिदीप्ति असिस्टेड सेल छँटाई (FACS) के आधार पर समान परख के संबंध में बाहर पढ़ें31,32, परख पूरे सेल जनसंख्या में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक तत्काल और व्यापक आकलन देता है, जो अधिक है सामांय प्रयोगात्मक शर्तों के प्रतिनिधि, और मानक सॉफ्टवेयर के साथ एक आसान डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रदान करता है । कुल मिलाकर, परख का मुख्य लाभ यह है कि नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए एक माध्यम समानांतर में विश्लेषण किया जा सकता है । इस परख का प्रयोग, हम दमन-tRNAs के एक तर्कसंगत डिजाइन पुस्तकालय की जांच की है Pyl ओर्थोगोनल प्रणाली की क्षमता में सुधार30। इस काम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इस परख प्रदर्शन और अपने आवेदन के उदाहरण दिखाने के लिए, फोटो के शामिल करने के लिए ओर्थोगोनल जोड़ी के अनुकूलन सहित-crosslinking ncAA p-azido-L-फेनिलएलनिन (Azi) और की तुलना विभिंन अमीनो एसिड (चित्रा 2) की क्षमता को शामिल करना ।

पिछले वर्षों में, ncAA उपकरण बहुत जी के संरचनात्मक और कार्यात्मक पहलुओं की जांच करने के लिए शक्तिशाली साबित किया गया है प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. मनुष्यों में, GPCRs झिल्ली रिसेप्टर्स (800 सदस्यों) के एक बड़े परिवार के रूप में और चिकित्सीय दवाओं के लिए मुख्य लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । GPCRs के प्रत्यक्ष संरचनात्मक लक्षण वर्णन अभी भी चुनौतीपूर्ण है और जैव रासायनिक तरीकों पूरक अत्यधिक उनकी जांच के लिए आवश्यक हैं । हम GPCR सतहों नक्शा और ligand बंधन जेब34की खोज करने के लिए फोटो crosslinking ncaas के उपयोग का बीड़ा उठाया है । Azi निगमन के लिए हमारे अनुकूलित प्रणाली का उपयोग करना, हम व्यवस्थित सीधे एक GPCR के पूरे juxtamembrane डोमेन में Azi शामिल रहते स्तनधारी कोशिकाओं में । यूवी विकिरण पर, Azi एक उच्च प्रतिक्रियाशील nitrene प्रजातियों कि covalently पड़ोसी अणुओं कब्जा रूपों । जब ligand प्रणाली में जोड़ा जाता है, Azi एक निकटता जांच के रूप में कार्य करता है पता चलता है जो रिसेप्टर की स्थिति बंधे ligand के करीब आते हैं । इस तरह, वर्ग बी GPCR corticotropin पर neuropeptide हार्मोन Urocortin मैं (Ucn1) के बंधन मोड-रिलीज कारक रिसेप्टर प्रकार 1 (CRF1R)33 पहले का अनावरण किया गया था । हाल ही में, हम एक ही रिसेप्टर38पर एगोनिस्ट और विरोधी के अलग बाध्यकारी पैटर्न का खुलासा किया है । एक समान दृष्टिकोण अंय पेप्टाइड्स और छोटे अणु लाइगैंडों के अंय GPCRs39,40,41,42पर orthosteric और allosteric बाध्यकारी साइटों को प्रकट करने के लिए दूसरों के द्वारा लागू किया गया है । इस पांडुलिपि का वर्णन प्रयोगात्मक GPCR सतहों के फोटो crosslinking मानचित्रण के लिए हमारी प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल । विधि अपेक्षाकृत तेज है, सीधा है और किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, इसलिए है कि यह मानक जैव रसायन प्रयोगशालाओं में लागू है । महत्वपूर्ण बात, दृष्टिकोण न केवल ligand बाध्यकारी साइटों जहां 3 डी संरचनात्मक डेटा दुर्लभ है की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है, लेकिन यह भी पूरी तरह से पोस्ट-अनुवाद में संशोधित रिसेप्टर्स से जानकारी के साथ इन विट्रो डेटा में मौजूदा पूरक करने के लिए लाइव सेल के शारीरिक वातावरण ।

उपंयास ncaas साइड चेन रासायनिक समूहों ultrafast उत्प्रेरक मुक्त bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए उपयुक्त पर असर के हाल के विकास के लिए खोला गया है संभावना प्रोटीन में सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए पिछले पीढ़ी fluorophores स्थापित करने के लिए सीधे जीवित कोशिकाओं2,43पर । इस तरह के रासायनिक एंकरों में SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne में BCNK12,17, और ट्रांस-cyclooctenes में TCO * K13,15,17 अन्य ncaas के बीच तनावपूर्ण cyclooctyne शामिल हैं हार्बर एक norbornene१६,१७,४४ या cyclopropene४५,४६ moiety. bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए महाकाय ncaas PylRS के एक संस्करण द्वारा आम तौर पर PylRSवायुसेना के रूप में चिह्नित (उत्परिवर्तन Y271A और Y349F में एम. barkeri PylRS), के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंय तदर्थ विकसित ncAARSs17 द्वारा शामिल कर रहे है , 44. bioorthogonal लंगर tetrazine रिएजेंट47 के साथ उलटा इलेक्ट्रॉन के माध्यम से प्रतिक्रिया-मांग Diels-Alder cycloaddition कुछ मिनट43,48के भीतर उच्च लेबलिंग पैदावार दे । हालांकि, इस शक्तिशाली दृष्टिकोण के आवेदन GPCRs लेबल करने के लिए ओर्थोगोनल ncAA शामिल प्रणाली की एक कम समग्र दक्षता के कारण चुनौतीपूर्ण है । हमारे बढ़ाया Pyl प्रणाली का उपयोग करना, हम हाल ही में प्रदर्शन किया है उच्च GPCRs और ultrafast में ऐसे अमीनो एसिड की उपज शामिल GPCR लाइव स्तनधारी कोशिकाओं की सतह पर लेबलिंग30। लेबल रिसेप्टर्स अभी भी कार्यात्मक थे, के रूप में वे शारीरिक रूप से एक एगोनिस्ट के साथ रिसेप्टर को सक्रिय करने पर आंतरिक. GPCRs में bioorthogonal लंगरों के शामिल होने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल और निंनलिखित लेबलिंग कदम यहां वर्णित हैं । लैस GPCRs छोटे उज्ज्वल fluorophores के साथ उन्नत माइक्रोस्कोपी तकनीक के माध्यम से लाइव सेल में GPCR संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन की ओर पहला मौलिक कदम है.

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Protocol

1. प्रतिदीप्ति-निगमन क्षमता के आधार पर स्क्रीनिंग (चित्रा 1)

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में HEK293 कोशिकाओं को बनाए रखने (DMEM; उच्च ग्लूकोज, 4 मिमी glutamine, पाइरूवेट) 10% के साथ पूरक (वी/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 U/एमएल पेनिसिलिन और 100 µ g/एमएल streptomycin 37 ° c, 95% आर्द्रता और 5% CO2
  2. अभिकर्मक से पहले दिन कोशिकाओं बीज ।
    1. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग से 37 ° c में 0.05% Trypsin/पंजाबियों 0.5 mM EDTA के साथ पूरक । 10-cm डिश के लिए 1 मिलीलीटर Trypsin/EDTA का प्रयोग करें । पूरा माध्यम के 10 संस्करणों के साथ बुझाने और pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड । एक hemocytometer49का उपयोग कर निलंबन में कक्षों की संख्या की गणना ।
    2. बीज 6.0 x 105 HEK293 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर पूर्ण विकास मध्यम में 6-well प्लेट्स । नमूनों की संख्या के रूप में कई कुओं, और जंगली प्रकार EGFP के लिए दो अतिरिक्त कुओं और एक नकली-transfected नमूना, क्रमशः तैयार करें ।
  3. नियंत्रण संगम (कोशिकाओं के कब्जे वाले क्षेत्र) एक खुर्दबीन के नीचे. Transfect कोशिकाओं पर ~ 70% polyethyleneimine (पी) रिएजेंट का उपयोग कर संगम ।
    1. अभिकर्मक करने से पहले, नए सिरे से तैयार ncaa स्टॉक समाधान के लिए सभी कुओं को 0.25-0.5 मिमी के अंतिम ncaa एकाग्रता के लिए उपयुक्त राशि जोड़ें । सभी कुओं के लिए ncaa जोड़ें, जंगली प्रकार के सकारात्मक नियंत्रण और नकली-transfected कोशिकाओं सहित, प्रतिदीप्ति संकेतों है कि सेलुलर विकास पर ncAA के प्रभाव की वजह से हो सकता है में मतभेदों को रोकने के लिए ।
      नोट: स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, ncAA को भंग करने के लिए 0.1-0.5 m का उपयोग कर 0.2-0.5 m NaOH. हालांकि, कुछ ncaas उपयोग करने से पहले DMSO और/या 1 मीटर HEPES (पीएच 7.4) के चार संस्करणों द्वारा बेअसर में प्रारंभिक solubilization की आवश्यकता हो सकती है । सामान्यतः, निर्माता एक स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल की अनुशंसा करता है ।
    2. एक microcentrifuge ट्यूब में, ncAARS/tRNA जोड़ी के लिए प्लाज्मिड डीएनए एंकोडिंग के 1 µ जी मिश्रण रिपोर्टर µ डीएनए के 1 प्लाज्मिड जी के साथ परीक्षण किया जा करने के लिए (pcdna 3.0-EGFP183TAG-mCherry) । अलग ट्यूबों में, एक समान अभिकर्मक EGFP जंगली प्रकार के संदर्भ और एक नकली अभिकर्मक का उपयोग कर तैयार करते हैं ।
      नोट: ncAARS/tRNA जोड़ी के लिए प्लाज्मिड एंकोडिंग में एंबेडेड tRNA कैसेट की प्रतियां की संख्या आवेदन पर निर्भर करता है । क्लोनिंग की सुविधा के लिए, 1 tRNA कॉपी जब अलग tRNAs स्क्रीनिंग की सिफारिश की है, जबकि 4 प्रतियां सिफारिश की है (हालांकि सख्ती से आवश्यक नहीं) जब भी अलग ncAARS या एक ही ओर्थोगोनल जोड़ी द्वारा अलग ncaas के शामिल परीक्षण ।
    3. प्रत्येक डीएनए युक्त ट्यूब करने के लिए जोड़ें 100 µ एल स्तनपान बफर (एलबीएस) से युक्त 20 मिमी सोडियम स्तनपान कराने के पीएच 4.0 और 150 मिमी NaCl. संक्षेप में मिलाएं ।
    4. प्रत्येक एलबीएस में डीएनए युक्त ट्यूब के लिए 1 µ जी के 6 µ एल जोड़ें/µ एल बेई में एलबीएस (अनुपात पी/डीएनए = 3/1 डब्ल्यू/ 10-15 मिनट के लिए आर टी पर मशीन ।
    5. एक अच्छी तरह से 400 µ एल सेल माध्यम ले लो और यह डीएनए पी मिश्रण करने के लिए पीएच बेअसर करने के लिए जोड़ें । कोशिकाओं पर डीएनए मिश्रण चूना ।
      नोट: DMEM आमतौर पर पीएच संकेतक के रूप में phenol लाल होता है । बेअसर कदम के दौरान ट्यूब में जोड़ा मिश्रण का रंग पीला (अम्लीय) से लाल (तटस्थ) से बदल जाएगा. हालांकि अंलीय पीएच में एलबीएस में डीएनए परिसरों के गठन उच्चतम अभिकर्मक पैदावार50देता है, डीएनए-पी परिसरों वैकल्पिक रूप से पीएच 7.4 पर सीधे गठन किया जा सकता है (उदाहरण के लिए सीरम मुक्त DMEM में) । यदि डीएनए परिसरों के फार्म का उपयोग DMEM, बेअसर कदम 1.3.5 छोड़ । किसी भी मामले में, यह आवश्यक है कि कोई सीरम मिश्रण में मौजूद है जब परिसरों का गठन ।
  4. फसल कोशिकाओं 48 एच पोस्ट-अभिकर्मक ।
    1. एक बार 2 मिलीलीटर पूर्व गरम पंजाब (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ मध्यम और कुल्ला कोशिकाओं महाप्राण । जोड़ें 800 µ के साथ अनुपूरक पंजाब 0.5 mM EDTA और 20 मिनट के लिए गर्मी में 37 डिग्री सेल्सियस । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग और निलंबित ।
    2. 5 मिमी MgCl2के साथ पूरक की 200 µ l पंजाबियों युक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    3. 800 x जी में 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । इस मामले में, फ्लैश-एक महीने तक के लिए तरल एन2 और स्टोर में-80 डिग्री सेल्सियस में छर्रों फ्रीज । हमेशा आंख संरक्षण काले चश्मे पहनते हैं ।
  5. जोड़ें 100 µ l Tris lysis बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 1% ट्राइटन एक्स-100, 1 मिमी EDTA और हौसले से जोड़ा PMSF) सेल छर्रों के लिए और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन. lysis, भंवर हर 5 मिनट की सुविधा के लिए ।
  6. 4 ° c और 14,000 x g पर 10 मिनट के लिए सेल मलबे नीचे स्पिन और काले 96-अच्छी तरह से प्लेटों में supernatant के 90 µ एल हस्तांतरण । माप EGFP और mCherry प्रतिदीप्ति एक प्लेट पाठक एक प्रतिदीप्ति मॉड्यूल के साथ सुसज्जित का उपयोग कर ।
    नोट: EGFP के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का प्रयोग करें (λabs: 488 एनएम; λem: 509 एनएम) और mCherry (λabs: 588 एनएम; λem: 611 एनएम) । मापा EGFP मूल्यों नकली-transfected कोशिकाओं और एक अधिकतम मूल्य है, जो आम तौर पर जंगली प्रकार EGFP से प्राप्त की है से प्राप्त ंयूनतम मूल्य के बीच एक सीमा तक विस्तृत होगा । साधन में सही माप खिड़की की स्थापना का ख्याल रखना ।
  7. ncAA निगमन की दक्षता नमूने के प्रतिदीप्ति और वंय-प्रकार EGFP की अभिव्यक्ति से प्राप्त प्रतिदीप्ति के बीच अनुपात के रूप में गणना की है । सभी मान mCherry प्रतिदीप्ति को सामान्यीकृत कर रहे हैं ।
    Equation 1

2. Ligand-GPCR बातचीत के फोटो-crosslinking मानचित्रण के लिए GPCRs में ncaas के आनुवंशिक निगमन (चित्रा 3)

  1. DMEM में HEK293T कोशिकाओं को बनाए रखने के 10% के साथ पूरक (वी/वी) FBS, 100 U/एमएल पेनिसिलिन और 100 µ g/एमएल streptomycin 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% CO2
  2. बीज कोशिकाओं अभिकर्मक पहले दिन ।
    1. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग से 37 ° c में 0.05% Trypsin/पंजाबियों 0.5 mM EDTA के साथ पूरक । 10-cm डिश के लिए 1 मिलीलीटर Trypsin/EDTA का प्रयोग करें । पूर्ण माध्यम के 10 संस्करणों के साथ बुझाने और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड । एक hemocytometer49का उपयोग कर निलंबन में कक्षों की संख्या की गणना ।
    2. बीज 5.0 x 105 293T कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर पूर्ण विकास मध्यम में 6-अच्छी तरह से प्लेटों में । प्रत्येक स्थिति के लिए जांच की जा करने के लिए, ligand प्लस एक अच्छी तरह से बाध्यकारी नियंत्रण के लिए33,38के अनुसार 1 तैयार । एक अतिरिक्त अच्छी तरह से जंगली के साथ transfected प्रकार (wt) रिसेप्टर उत्परिवर्ती के अभिव्यक्ति स्तर की जांच करने के लिए शामिल किया जा सकता है ।
  3. दिन के बाद, नियंत्रण संगम (कोशिकाओं के कब्जे वाले क्षेत्र) एक खुर्दबीन के नीचे । Transfect कोशिकाओं पर ~ 70% पी का उपयोग संगम ।
    1. अभिकर्मक करने से पहले, 0.5 mM के अंतिम एकाग्रता के लिए सभी कुओं के लिए Azi जोड़ें ।
      1. Azi का 0.5 मीटर स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । प्रति 6-खैर प्लेट, वजन 1.2 मिलीग्राम एक ट्यूब में Azi और 15 µ l 0.5 M NaOH में भंग । 1.2 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम में स्टॉक समाधान को पतला करें और प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण के 200 µ l को जोड़ें ।
        नोट: हर प्रयोग के लिए Azi का एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार करें । azide moiety एक छोटी आधा जलीय समाधान में जीवन है, विशेष रूप से बुनियादी पीएच में, और AziRS बरकरार है लेकिन यह भी नीचा फार्म शामिल हैं ।
    2. Transfect के अनुसार 2 µ g डीएनए की कुल राशि: 1 ध्वज के लिए प्लाज्मिड एंकोडिंग के µ g-टैग GPCR के लिए वांछित स्थान पर एक टैग codon असर और µ के लिए समर्पित प्लाज्मिड जोड़ी के लिए एंकोडिंग के 1 ओर्थोगोनल जी Azi (E2AziRS51 और cognate के 4 प्रतियां दमन-tRNA Bstयम्)33,38.
      नोट: जब अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए एक wt तुलना सहित, wt रिसेप्टर के लिए प्लाज्मिड डीएनए की एक कम राशि transfect. GPCR पर निर्भर करता है, 0.2-0.5 प्लाज्मिड के µ जी एंकोडिंग wt रिसेप्टर के रूप में समान स्तर की उपज 1.0 µ जी के उत्परिवर्ती प्लाज्मिड । सभी कुओं में डीएनए की एक ही राशि Transfect, एक नकली (उदाहरण के लिए एक खाली सदिश) के साथ लापता डीएनए को भरने ।
    3. 1.3.3-1.3.5 में बताए गए अनुसार आगे बढ़ें ।
    4. 48 एच के बाद अभिकर्मक, या तो कदम 2.4 के साथ फोटो-लाइगैंडों के crosslinking के लिए या सीधे फसल और रिसेप्टर एक्सप्रेशन सत्यापित करने के लिए विश्लेषण के लिए 2.5 कदम के लिए जाना ।
  4. फोटो-crosslinking का ligand ।
    1. एक 1, 000x ligand स्टॉक समाधान तैयार करें । DMSO में 100 µ मीटर की एकाग्रता पर पेप्टाइड ligand भंग ।
      नोट: ligand एकाग्रता ligand-GPCR बातचीत के पृथक्करण लगातार कश्मीरडी पर निर्भर करता है । 100 x KD के अंतिम एकाग्रता की अनुशंसा की जाती है । यदि पेप्टाइड ligand trifluoroacetic एसिड (TFA) का एक नमक है, TFA के वजन पर विचार जब आणविक वजन की गणना (1 एक्स TFA में बुनियादी एमिनो एसिड प्रति) पेप्टाइड । साथ ही, विचार करें कि पेप्टाइड्स सामान्य हीड्रोस्कोपिक में हैं । पेप्टाइड पाउडर की दोहराया ठंड से बचें और एक पेप्टाइड कंटेनर कभी नहीं खुला जब तक यह कमरे के तापमान तक नहीं पहुंच गया है ।
    2. ligand शेयर समाधान 1 पतला: 1000 बाइंडिंग बफर में 0.1% BSA, 0.01% ट्राइटन-X 100, 5 mm MgCl2 में HEPES पृथक्करण बफर (HDB) से युक्त 12.5 mm 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES)-एचसीएल पीएच 7.4, 140 mm NaCl और 5 मिमी KCl. Azi-GPCR उत्परिवर्ती प्रति 1 मिलीलीटर तैयार करें । कक्ष मध्यम को ligand समाधान के 1 मिलीलीटर से बदलें । आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: विशिष्ट GPCR, ligand कैनेटीक्स और रिसेप्टर internalization के लिए लेखांकन के लिए मशीन समय समायोजित करें । समय समय पर मशीन crosslinking पैदावार में सुधार नहीं करता है ।
    3. विकीर्ण 5 x 8 डब्ल्यू ट्यूबों और ~ 5 सेमी दूरी के साथ कोशिकाओं के लिए एक यूवी crosslinker में 20 मिनट के लिए नमूने के साथ 365 एनएम । pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग और एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में उन्हें हस्तांतरण । 800 x जी में 3 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली और supernatant त्यागें ।
    4. एक 50x स्टॉक समाधान बनाने के लिए 1 मिलीलीटर 25 मिमी EDTA/एच2में छेड़ने वाला अवरोधक (PI) कॉकटेल के एक गोली भंग । PI स्टॉक समाधान Aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान । hdb में 50x स्टॉक 1:25 पतला और 50 µ एल में सेल छर्रों स्थगित 2 hdb में एक्स PI । फ्लैश-तरल एन में कोशिकाओं फ्रीज2
      नोट: आंख संरक्षण काले चश्मे पहनते हैं । इस बिंदु पर, नमूने के लिए एक महीने के लिए-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । 2.6 कदम के साथ आगे बढ़ें ।
  5. डायरेक्ट सेल हार्वेस्ट ।
    1. यम महाप्राण । HDB में 0.5 mM EDTA के 800 µ एल जोड़ें । आर टी पर या बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    2. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग और एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में उन्हें हस्तांतरण । HDB में 5 मिमी MgCl2 के 200 µ एल जोड़ें । 800 x जी में 3 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली और supernatant त्यागें ।
    3. के 50 µ एल में सेल छर्रों reसस्पेंड 2 HDB में एक्स PI और तरल एन2में फ्लैश फ्रीज । आंख संरक्षण काले चश्मे पहनते हैं ।
      नोट: इस बिंदु पर, नमूनों को 1 महीने तक के लिए-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. सेल lysis ।
    1. 30-45 एस और भंवर संक्षेप में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में कोशिकाओं गल । अभी से सैंपलों को ठंडा रखें । 10 मिनट के लिए 2,500 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली झिल्ली supernatant, जो cytosolic प्रोटीन के थोक में शामिल है त्यागें ।
    2. 50 मिमी HEPES-एचसीएल पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 1% ट्राइटन एक्स-100, 1.5 मिमी MgCl2, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी डीटीटी और हौसले से जोड़ा 2 एक्स PI कॉकटेल युक्त µ एल HEPES lysis बफर में छर्रों reसस्पेंड । अच्छी तरह से मिलाएं । लाइसे बर्फ और भंवर पर कोशिकाओं को 30 मिनट हर 5 मिनट ।
    3. 14,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन सेल मलबे । तुरंत एक ताजा प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
      नोट: तुरंत विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें । lysates-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, हालांकि, हर फ्रीज-गल चक्र परिणामों की गुणवत्ता ख़राब कर देता है ।
  7. पश्चिमी दाग विश्लेषण ।
    1. नमूना तैयार करने के लिए, ले 3-5 µ l lysate और इसे भरने के लिए 7 µ एल के साथ एच2ओ जोड़ें 2 µ एल 1 एम डीटीटी और 3 µ एल 4 एक्स नमूना बफर युक्त 63 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल और 0.04% bromphenol नीला । 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    2. जब GPCR ग्लाइकोसिलेटेड और बेहोश या धब्बा बैंड एक समस्या है, संकेत तीव्रता बढ़ाने के लिए PNGase एफ के साथ deglycosylate नमूने और बैंड पैनापन । आपूर्तिकर्ता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 10 µ l की कुल मात्रा में 3-5 µ l lysate और deglycosylate का प्रयोग करें । 3 µ l 4 x नमूना बफ़र जोड़ें ।
      नोट: झिल्ली प्रोटीन अक्सर कई साइटों और राज्यों में ग्लाइकोसिलेटेड हैं, जो एसडीएस में संकल्प की गुणवत्ता को बाधित-पृष्ठ विश्लेषण । तथापि, विरोधी ध्वज एंटीबॉडी का उपयोग कर Azi-GPCR म्यूटेंट के अभिव्यक्ति स्तर के विश्लेषण के लिए नमूनों deglycosylate नहीं है क्योंकि यह पूरी तरह से ग्लाइकोसिलेटेड के हिस्से का मूल्यांकन करने के लिए प्रासंगिक है, सेल सतह पर परिपक्व रिसेप्टर.
    3. एक PVDF झिल्ली के लिए मानक एसडीएस-पृष्ठ और दाग स्थानांतरण प्रोटीन के माध्यम से नमूनों को हल ।
      सावधानी: Acrylamide neurotoxic है । दस्ताने और आंख संरक्षण पहनते हैं ।
    4. आरटी में 1 ज के लिए झिल्ली ब्लॉक या 5% में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर टीबीएस में दूध स्किम 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.4, 0.15 M NaCl और 0.1% के बीच 20 ।
    5. जांच एक विरोधी ligand एंटीबॉडी एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा के साथ झिल्ली । टीबीएस-टी के साथ बीच में धो लें । Azi-GPCR की अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाने के लिए, एक वाणिज्यिक एचआरपी एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की जांच ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    6. प्रदर्शन बढ़ाया chemiluminescence (ECL) घर का बना ECL रिएजेंट का उपयोग प्रतिक्रिया और अंधेरे में 5 मिनट के लिए संकेतों का पता लगाने ।

3. जीवित स्तनधारी कोशिकाओं पर GPCRs की Ultrafast Bioorthogonal लेबलिंग

नोट: प्रोटोकॉल 4-अच्छी तरह से चैम्बर्ड coverslips के लिए अनुकूलित है (अच्छी तरह से क्षेत्र = 2.2 cm2) । विभिंन अच्छी तरह से आकार के लिए, प्रोटोकॉल तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए ।

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड की सतह कोटिंग । एक बाँझ डाकू के तहत पूरी प्रक्रिया बाहर ले ।
    1. एक पाली-डी-lysine hydrobromide (मेगावाट = 500-550 केडीए) (PDL) स्टॉक समाधान 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में 50 मिमी बोराटे बफर (पीएच 8.5) में तैयार करें । 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । फ्रीज न करें ।
    2. 25 µ जी के अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ अल्ट्रा शुद्ध पानी में PDL स्टॉक समाधान 1:40 पतला (काम समाधान), तो एक 0.22 µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर.
      नोट: काम समाधान 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    3. पूरी तरह से PDL काम समाधान के 500 µ एल के साथ माइक्रोस्कोपी स्लाइड के प्रत्येक कुआं के नीचे कवर । आर टी पर 20 मिनट के लिए मशीन और PDL काम समाधान महाप्राण ।
      नोट: PDL कार्य समाधान के लिए तीन बार उपयोग किया जा सकता है । अगर समाधान के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेपित स्लाइड से एक ताजा बाँझ ट्यूब के लिए इस्तेमाल किया समाधान हस्तांतरण और ट्यूब तदनुसार लेबल । ताजा समाधान के साथ पुनर्नवीनीकरण समाधान मिश्रण कभी नहीं ।
    4. कुल्ला प्रत्येक अच्छी तरह से 3 एक्स के साथ ~ 700 µ l बाँझ अल्ट्रा शुद्ध पानी और जाने के लिए सूखे से कम 1 ज.
      नोट: यह बहुत ही कुओं सही कुल्ला महत्वपूर्ण है, PDL समाधान के अवशेषों के रूप में कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं । लेपित स्लाइड सीधे माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए संग्रहीत ।
  2. DMEM में HEK293T कोशिकाओं को बनाए रखने के 10% के साथ पूरक (वी/वी) FBS, 100 U/एमएल पेनिसिलिन और 100 µ g/एमएल streptomycin 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% CO2
  3. बीज कोशिकाओं अभिकर्मक पहले दिन ।
    1. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग से 37 ° c में 0.05% Trypsin/पंजाबियों 0.5 mM EDTA के साथ पूरक । 10-cm डिश के लिए 1 मिलीलीटर Trypsin/EDTA का प्रयोग करें । पूरा माध्यम के 10 संस्करणों के साथ बुझाने और pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड । एक hemocytometer49का उपयोग कर निलंबन में कक्षों की संख्या की गणना ।
    2. बीज 1.0 x 105 HEK293T कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (क्षेत्र 2.2 सेमी ²) 600 µ एल डाई में नि: शुल्क पूरा DMEM ।
      नोट: इमेजिंग प्रयोजनों के लिए, यह एक माध्यम है कि किसी भी डाई शामिल नहीं है में शुरुआत से काम करने के लिए बहुत सुविधाजनक है । डाई मुक्त DMEM योगों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
  4. नियंत्रण संगम (कोशिकाओं के कब्जे वाले क्षेत्र) एक खुर्दबीन के नीचे और transfect पर कोशिकाओं ~ 70% एक लिपिड आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग संगम.
    1. 1 ज अभिकर्मक करने से पहले, TCO * K के 0.2 M NaOH और 15% (v/v) DMSO में एक ताजा 100 mM स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    2. प्रति well, मिश्रण 3 µ एल के TCO * K स्टॉक समाधान के साथ 12 µ l के 1 M HEPES पीएच 7.4. धीरे 0.5 mM के एक अंतिम TCO * K एकाग्रता के लिए कुओं के लिए समाधान जोड़ें ।
    3. 500 की कुल राशि के प्रति अच्छी तरह से डीएनए एनजी तैयार करते हैं । एक microcentrifuge ट्यूब में, pcdna 3.1 _crf1r के 200 एनजी-95TAG-EGFP, 200 एमबीप्लाज्मिडवायुसेनाPylRS/tRNA Pyl जोड़ी (ओर्थोगोनलtRNAके चार कैसेट) और 100 M15 3.1 pcdna के एनजी के लिए कूटबंधन के एनजी प्लाज्मिड में 50 µ एल मीडियम (डाई फ्री, सीरम मुक्त, एंटीबायोटिक फ्री) ।
      नोट: सामांय में, सह Arrestin के अभिकर्मक GPCR internalization का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक नहीं है । हालांकि, सह-transfecting Arrestin3 CRF1R के internalization को गति मिलती है, जो कई internalization के म्यूटेंट का विश्लेषण करते समय बहुत सुविधाजनक होता है ।
    4. पतला 1.25 µ एल के लिपिड आधारित अभिकर्मक एजेंट (2.5 µ एल डीएनए के प्रति 1 µ जी) 50 µ एल मीडियम में (डाई फ्री, सीरम मुक्त, एंटीबायोटिक फ्री) और डीएनए मिश्रण करने के लिए समाधान जोड़ें । भंवर तुरंत और आर टी पर 5-10 मिनट की मशीन जोड़ें डीएनए-कोशिकाओं को लिपिड परिसरों ।
      नोट: हमारे अनुभव में, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान लिपिड आधारित अभिकर्मक का उपयोग transfected बेई के साथ transfected कोशिकाओं की तुलना में अधिक शारीरिक लग रहा है. बेई के रूप में उच्च अभिकर्मक दक्षता देता है, पी पश्चिमी दाग की तरह बहाव अनुप्रयोगों के लिए पसंद किया जाना चाहिए, जबकि लिपिड आधारित अभिकर्मक इमेजिंग प्रयोगों के लिए transfect कोशिकाओं के लिए एक बेहतर विकल्प है ।
  5. 24 एच पोस्ट-अभिकर्मक, फ्लोरोसेंट रंगों के साथ रिसेप्टर लेबल ।
    1. DMSO में एक 0.5 mM डाई-tetrazine स्टॉक समाधान तैयार करें और एक 10 मिलीग्राम/एमएल में डीएनए धुंधला डाई स्टॉक समाधान अल्ट्रा शुद्ध एच2ओ ।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में एक अच्छी तरह से 100 µ एल माध्यम हस्तांतरण । रंग के 1.8 µ एल जोड़ें-tetrazine शेयर समाधान और डीएनए धुंधला डाई स्टॉक समाधान के 0.3 µ एल । अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्मी के लिए वापस रंजक युक्त माध्यम स्थानांतरण ।
      नोट: Tetrazine-ऑरेंज-फ्लोरोसेंट डाई 1.5 µ एम की एक अंतिम एकाग्रता है ।
    3. महाप्राण मध्यम और धीरे से दो बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं कुल्ला डाई से अधिक हटाने के लिए । पूर्ण डाई मुक्त विकास मध्यम के 600 µ एल जोड़ें 37 ° c करने के लिए गरम ।
  6. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और रिसेप्टर internalization.
    1. 63x के तहत लेबल रिसेप्टर्स कल्पना (या समान) GFP के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग आवर्धन (λabs: 488 एनएम; λem: 509 एनएम), नारंगी-फ्लोरोसेंट डाई (λabs: 550 एनएम; λem: 570 एनएम) और डीएनए धुंधला डाई (λ abs: 350 एनएम; emλ: 461 एनएम) । रिसेप्टर को सक्रिय करने से पहले प्रत्येक फिल्टर के साथ एक तस्वीर ले लो ।
    2. Ucn1 के 200 एनएम का उपयोग कर रिसेप्टर internalization को बढ़ावा देना ।
      1. DMSO में 200 µ m के 1,000 x Ucn1 शेयर सॉल्यूशन तैयार करें ।
        नोट: पेप्टाइड के घुलनशीलता के आधार पर, आप शुद्ध पानी या बफर में शेयर तैयार करने में सक्षम हो सकता है ।
      2. एक अच्छी तरह से एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 100 µ एल माध्यम हस्तांतरण और 0.6 µ एल के पेप्टाइड एगोनिस्ट स्टॉक समाधान जोड़ें । मध्यम वापस अच्छी तरह से स्थानांतरण ।
      3. माइक्रोस्कोप के तहत internalization का निरीक्षण । internalization की स्पष्ट रूप से पता लगाने की घटना के बाद तस्वीरें ले लो (घंटे के लिए 10-15 मिनट, Arrestins के रिसेप्टर और एक्सप्रेस पर निर्भर करता है) पहले उल्लेख किया फिल्टर का उपयोग.

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Representative Results

प्रतिदीप्ति परख की रूपरेखा चित्रा 1में दिखाया गया है । परख तीन आवेदनों में कार्यरत है । फर्स्ट प्लेस में Pyl ओर्थोगोनल पेयर द्वारा Lys (बीओसी) के लिए tRNA वेरिएंट की संख्या दिखलाई जाती है । Lys (बीओसी) एक एमिनो एसिड sterically Pyl के समान है । के रूप में Pyl व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, Lys (बीओसी) सामांयतः PylRS के लिए एक मानक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है । tRNAPylके आधार पर दिखलाई tRNAs हैं । प्रत्येक tRNA संस्करण छोरों में एकल कुर्सियां या आधार जोड़े के उत्परिवर्तनों भालू और तर्क से eukaryotic शोधों मशीनरी के साथ tRNA स्थिरता और अनुकूलता में सुधार करने के लिए डिज़ाइन उपजा है । tRNA डिजाइन के बारे में सभी विवरण हमारे हाल के काम30में वर्णित हैं । विशिष्ट परिणाम चित्र 2aमें बताए गए हैं: भिंन tRNAs भिंन दमन दक्षता देते हैं, जो कि मापी गई प्रतिदीप्ति की मात्रा में स्पष्ट रूप से प्रतिबिंबित होती है । जैविक triplicates की छोटी सी त्रुटि पट्टियां दर्शाती हैं कि मान अत्यधिक reproducible हैं । दूसरे स्थान पर, E2AziRS के दो जीन वेरिएंट26,51, जो फोटो-crosslinker पी-azido-Phe (Azi) को शामिल किया गया है, का मूल्यांकन कर रहे हैं । E2AziRS ई. कोलाई TyrRS से व्युत्पंन है । एक जीन संस्करण देशी ई. कोलाई codon उपयोग कार्यरत है, जबकि दूसरी codon था एच sapiensमें उपयोग के लिए अनुकूलित । प्रतिदीप्ति परख से पता चलता है कि codon-अनुकूलित संस्करण उच्च प्रोटीन पैदावार देता है (चित्र b) । अंत में, bioorthogonal क्लिक रसायन विज्ञान के लिए अलग अमीनो एसिड की निगमन दर तुलना कर रहे है (चित्रा 2c) । सभी ncaas यहां प्रस्तुत (BCNK, TCO * कश्मीर और SCOK) एक ही ओर्थोगोनल MbPylRSAF/tRNAPyl जोड़ी द्वारा शामिल किए गए हैं । Lys (Z) भी इस जोड़ी द्वारा शामिल है और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । प्रतिदीप्ति परख, समानांतर ncAA निगमन प्रयोगों की विश्वसनीयता वर्णन करने के लिए एक GPCR, CRF1R पर प्रदर्शन किया गया । पश्चिमी दाग विश्लेषण GPCR अभिव्यक्ति का अनुमान (चित्रा बी सी, सी) के लिए किया गया था । इसी प्रवृत्तियों प्रतिदीप्ति परख में EGFP के साथ मनाया CRF1R के साथ मनाया गया । विशेष रूप से, Azi CRF1R में शामिल अत्यधिक बढ़ाया जब codon-अनुकूलित E2AziRS जीन का उपयोग कर देशी जीन की तुलना में, दिखा रहा है कि 1.5 के एक उदारवादी सुधार-2 एक घुलनशील प्रोटीन के लिए गुना (EGFP) प्रतिदीप्ति परख के अनुसार एक हो सकता है अधिक चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तर पर अधिक से अधिक प्रभाव (चित्रा बीसी). के रूप में सामांय ध्यान दें, tRNA कैसेट की संख्या के संबंध में प्रत्येक आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, केवल एक tRNA कैसेट की सिफारिश की है जब विभिंन tRNAs स्क्रीनिंग के क्रम में क्लोनिंग प्रक्रियाओं की सुविधा के लिए । जब या तो अलग ncAARS या एक ही ओर्थोगोनल जोड़ी द्वारा अलग ncaas के शामिल करने दक्षता स्क्रीनिंग, tRNA कैसेट के चार मिलकर दोहराता ncAA निगमन के उच्चतम पैदावार को प्राप्त करने के लिए पसंद कर रहे हैं ।

मानव E2AziRS जीन सहित Azi निगमन के लिए अनुकूलित प्रणाली CRF1R की बाध्यकारी जेब नक्शा और 5 अलग लाइगैंडों के बाध्यकारी रास्तों को परिभाषित करने के लिए तैनात किया गया था: दो पेप्टाइड एगोनिस्ट Ucn1 और CRF, और तीन पेप्टाइड विरोधी Ucn1 (8-40), CRF (9-41) और dFXCRF (12-41) (चित्रा 3) । जबकि Azi निगमन की क्षमता पहले से कम जब GPCR सी आ-टर्मिनस33,34के लिए, हमारे अनुकूलित प्रणाली Azi निगमन के लिए सक्षम दिखाया गया था Azi के तुलनीय अभिव्यक्ति स्तर-म्यूटेंट टैग के साथ-साइटों GPCR जीन (चित्रा 4a) के विभिंन भागों में । चित्रा 4B में परिणाम extracellular पाश 2 (ECL2) और ligand-बाध्यकारी जेब के एक प्रतिनिधि भाग के रूप में CRF1R के कुण्डल वी की स्क्रीनिंग दिखाने के लिए । crosslinking उत्पाद के सही आकार में एक बैंड से पता चलता है कि स्थिति ligand-रिसेप्टर परिसर के भीतर ligand की निकटता में निहित है, यानी यह बाध्यकारी जेब का हिस्सा है । एकाधिक crosslinking हिट सभी लाइगैंडों परीक्षण के साथ पाया गया, पेप्टाइड एगोनिस्ट और विरोधी के लिए अलग बाध्यकारी पैटर्न खुलासा । विशेष रूप से, crosslinking हिट्स के पैटर्न रिसेप्टर के संरचनात्मक तत्वों के बारे में जानकारी प्रदान करता है । लगातार हिट के एक नंबर, के रूप में ECL2 में मनाया (पदों F260-विरोधी के साथ संयोजन में R263) एक लचीला पाश क्षेत्र पता चलता है । एक I277 संरचना की ओर संकेत कुंडल वी (D269/Y270, Y272/Q273, पेचदार) में पाया के रूप में हर तीन से चार अवशेषों का एक पैटर्न । स्क्रीन GPCR के सभी प्रासंगिक डोमेन के लिए बढ़ाया जा सकता है । यदि एक 3 डी संरचना या रिसेप्टर की एक आणविक मॉडल मौजूद है, ligand पैरों के निशान प्रत्येक ligand के लिए crosslinking हिट पर प्रकाश डाला द्वारा visualized किया जा सकता है (चित्र 5) ।

दोनों प्रतिदीप्ति और वेस्टर्न ब्लाट डेटा (चित्रा 2c) सुझाव है कि TCO * K bioorthogonal रसायन विज्ञान है कि एमबीPylRSवायुसेनाद्वारा उच्चतम दक्षता के साथ शामिल हो जाता है के लिए ncAA है । अलग PylRS म्यूटेंट अंय क्लिक ncaas के उच्च निगम पैदावार दे सकता है17, लेकिन वे इस अध्ययन में परीक्षण नहीं किया गया । TCO * K एक CRF1R-EGFP फ्यूजन प्रोटीन में शामिल किया गया था और SPIEDAC रसायन (चित्रा 6A) रिसेप्टर (चित्रा घमण्ड) पर एक छोटे से चमकीले fluorophore के माध्यम से स्थापित करने में सक्षम. विशिष्ट लेबलिंग का एक प्रमाण के रूप में, लेबल की प्रतिदीप्ति रिसेप्टर ( चित्रा घमण्डमें हरी कोशिकाओं) और अंधेरे कोशिकाओं में नहीं, जो इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग में एक आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण प्रदान व्यक्त कोशिकाओं में ही दिखाई जानी चाहिए. ultrafast SPIEDAC रसायन विज्ञान का उपयोग कर लेबल रिसेप्टर्स अभी भी कार्यात्मक हैं । एक पेप्टाइड एगोनिस्ट जोड़ने के बाद, फ्लोरोसेंट डिब्बों cytosol भर में मनाया गया, GPCR internalization (चित्रा 6C) की शारीरिक प्रक्रिया का खुलासा । आपस में जुड़े EGFP के संकेतों को हर समय फ्लोरोसेंट डाई के साथ स्थानीयकृत, GPCR के चयनात्मक biorthogonal लेबलिंग की पुष्टि ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिदीप्ति-आधारित परख रोकने codon दमन की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए । HEK293 कक्ष ncAA की उपस्थिति में दो plasmids के साथ सह-transfected हैं । वांछित ncAARS और दमन-tRNA के लिए एक प्लाज्मिड encodings । EGFP जीन असर एक टैग एक स्वतंत्र साइट पर एक mCherry नियंत्रण के साथ एक साथ codon बंद करने के लिए दूसरी प्लाज्मिड encodings । दो दिन अभिकर्मक के बाद साबुत-सैल lysates के हरे और लाल प्रतिदीप्ति को प्लेट रीडर में नापा जाता है । के रूप में EGFP N-खंड ऊपर बंद codon (ग्रे) फ्लोरोसेंट नहीं है, पूर्ण लंबाई EGFP की उपज (हरा) सीधे ncAA शामिल करने की क्षमता को संबंधित है, जबकि mCherry (लाल) सामांय के लिए एक स्वतंत्र संदर्भ प्रदान करता है । ओर्थोगोनल प्रणाली की दक्षता रोक codon दमन के माध्यम से प्राप्त EGFP की राशि और नियमित रूप से अनुवाद द्वारा प्राप्त जंगली प्रकार EGFP की राशि (कोई एंबर दमन) के बीच अनुपात द्वारा दिया जाता है । आंकड़ा Serfling, आर और सिक्का, मैं से संशोधित किया गया है; स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त प्रोटीन में अप्राकृतिक अमीनो एसिड का शामिल करना, Enzymology में तरीकों, 2016, 580, 89-107. 29 पुनरुत्पादन को Elsevier के कॉपीराइट क्लीयरेंस केंद्र द्वारा अनुमति दी गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिदीप्ति परख के प्रतिनिधि आवेदन । (क) tRNAPyl वेरिएंट की स्क्रीनिंग30। HEK293 कक्षों को रिपोर्टर प्लाज्मिड और plasmids एंकोडिंग के साथ MbPylRS/tRNA जोड़ी (एक प्रतिलिपि tRNA) के लिए सह-transfected किया गया था । सलाखों के Lys (बीओसी) के निगमन से प्राप्त EGFP के सापेक्ष प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व जंगली प्रकार EGFP की तुलना में । (ख) ncAARS जीन के लिए codon-उपयोग के प्रभाव का मूल्यांकन करना. (बायां फलक) कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति परख E2AziRS के दो अलग जीन वेरिएंट के साथ transfected । (१) ई. कोलाई और (२) मानवतावादी जीन से codon उपयोग. (दायां फलक) CRF1R95Aziके पश्चिमी दाग विश्लेषण-झंडा । पूर्ण लंबाई रिसेप्टर एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी द्वारा पता चला है. Actin β लोड नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था । (ग) bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए डिजाइन तीन ncaas के निगमन दक्षता का मूल्यांकन । (बायां फलक) इस प्रयोग में प्रयुक्त ncaas की संरचनाओं । (१) LysZ, जिसका प्रयोग धनात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, (२) BCNK, (३) TCO * बादशाह और (४) SCOK. (केंद्रीय कक्ष) HEK293 कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति परख के लिए एक प्लाज्मिड एंकोडिंग के साथ transfected एमबीPylRSवायुसेना और (ए) से tRNA15 की चार प्रतियां शामिल करने के लिए (1), (2), (3) और (4) । (दायां फलक) एक CRF1R के पश्चिमी दाग विश्लेषण-झंडा उत्परिवर्ती स्थिति 95 में चार ncaas के एक असर । Actin β लोड नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था । पैनल ए Serfling, आर एट अल डिजाइनर tRNAs स्तनधारी कोशिकाओं न्यूक्लिक एसिड Res में pyrrolysine प्रणाली द्वारा गैर विहित अमीनो एसिड के कुशल शामिल करने के लिए के लिए अनुकूलित किया गया था । 46 (1), 1-10 (2018) और क्रिएटिव कॉमंस के अनुसार reproduced है एट्रिब्यूशन लाइसेंस. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : Azi के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-मध्यस्थता फोटो-crosslinking मानचित्रण । एक तस्वीर activatable azido समारोह (पीला सितारा) रिसेप्टर (ग्रे) के भीतर एक परिभाषित स्थिति में रखा गया है । जब azido समूह बंधे ligand (लाल), एक आबंध crosslinking उत्पाद यूवी विकिरण (पीला चक्र इंगित करता है crosslinking साइट) पर गठित है के लिए समीपस्थ स्थित है । रिसेप्टर के विभिंन पदों में azido समूह के शामिल करने के बाध्यकारी सतह (ligand, जो बाध्यकारी जेब का प्रतिनिधित्व करता है की बैंगनी) से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Azi के लिए CRF1R भर में शामिल फोटो-बाध्यकारी जेब की crosslinking मानचित्रण के लिए । (क) Azi-CRF1R-झंडा म्यूटेंट की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना जंगली प्रकार रिसेप्टर की ओर. Azi निगमन साइटों पूरे रिसेप्टर भर में वितरित कर रहे हैं के रूप में शीर्ष पंक्ति में संकेत दिया. पूरे-सेल lysates के एंटी-फ्लैग वेस्टर्न दाग दिखाए गए हैं । Actin β लोड नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था । (ख) पश्चिमी दाग या तो विरोधी CRF या विरोधी Ucn1 एंटीबॉडी के साथ जांच कर दिखाया जाता है । Azi द्वारा प्रतिस्थापित अवशेषों ऊपरी पंक्ति में संकेत कर रहे हैं । कोशिकाओं को सही पर सूचीबद्ध लाइगैंडों के साथ मशीन थे, यूवी विकिरण द्वारा 365 एनएम और lysis के बाद । नमूने पर हल किया गया 10% एसडीएस-पृष्ठ, deglycosylated का उपयोग कर PNGase F और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण. deglycosylated ligand-CRF1R परिसर के एक स्पष्ट मेगावाट में चलाता है ~ 40 केडीए33। गैर-crosslinked ligand का पता नहीं है (मव ~ 3-4 केडीए) । इस आंकड़े के दोनों पैनलों Seidel, एल एट अल से संशोधित किया गया है एक वर्ग बी जी के सक्रियकरण में संरचनात्मक अंतर्दृष्टि-प्रोटीन युग्मित मानव कोशिकाओं में पेप्टाइड हार्मोन द्वारा रिसेप्टर । Elife. 6 10.7554/eLife. 27711 और क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के अनुसार reproduced हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : वर्ग बी GPCR CRF1R पर पेप्टाइड एगोनिस्ट और विरोधी के पदचिह्नों । CRF1R transmembrane डोमेन की सतह प्रतिनिधित्व । CRF1R की स्थिति है कि crosslinked ligand जब Azi द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे है पर प्रकाश डाला । पेप्टाइड एगोनिस्ट CRF और Ucn1 के पदचिह्नों रानी में प्रकाश डाला जाता है, विरोधी के पदचिह्नों CRF (9-41) और Ucn1 (8-40) नीले रंग में । विरोधी dFXCRF (12-41) के पदचिह्न नारंगी में प्रकाश डाला है । सात transmembrane helices I-VII रोमन संख्याओं द्वारा दर्शाया गया है । (A, B) झिल्ली विमान से बाध्यकारी जेब के पक्ष में विचार । (ग) extracellular पक्ष से बाध्यकारी जेब में शीर्ष देखें । Seidel, एल एट अल. स्ट्रक्चरल इनसाइट से एक वर्ग बी जी के सक्रियकरण में पुनर्मुद्रित-प्रोटीन-जी मानव कोशिकाओं में पेप्टाइड हार्मोन द्वारा रिसेप्टर युग्मित । Elife. 6 10.7554/eLife. 27711 और क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के अनुसार reproduced हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : लाइव कोशिकाओं पर CRF1R के SPIEDAC लेबलिंग । (क) प्रतिक्रिया योजना के तनाव को बढ़ावा उलटा इलेक्ट्रॉन-मांग Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC): ट्रांस cyclo-2-octene ncAA TCO के समूह * कश्मीर tetrazine fluorophore से जुड़े समूह के साथ प्रतिक्रिया करता है । (ख, ग) HEK293T कोशिकाओं को व्यक्त CRF1R95TCO * K-EGFP. हरे, लाल और नीले चैनल के प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार का आकार 10 µm है । (ख) कोशिकाओं 5 मिनट के लिए tetrazine-Cy3 (1.5 µ m) के साथ इलाज किया गया । केवल कोशिकाओं को व्यक्त रिसेप्टर (ग्रीन) लेबलिंग की घटना शो (लाल). (ग) कोशिकाओं को 200 एनएम Ucn1 के साथ इलाज किया गया और 15 min. Intracellular बुलबुले के बाद imaged आंतरिक रिसेप्टर के अनुरूप । पैनलों बी और सी Serfling से संशोधित कर रहे हैं, आर एट अल डिजाइनर tRNAs स्तनधारी कोशिकाओं में pyrrolysine प्रणाली द्वारा गैर-विहित अमीनो एसिड के कुशल शामिल करने के लिए न्यूक्लिक एसिड Res. 46 (1) 1-10 (2018) (ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय प्रेस) और क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के अनुसार reproduced हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल का वर्णन एक सरल और विश्वसनीय परख के लिए ncaas के शामिल करने के लिए ओर्थोगोनल जोड़े की दक्षता का आकलन प्रोटीन में स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की । FACS के आधार पर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख के संबंध में इस पद्धति का मुख्य लाभ यह है कि यह एक साथ तैयारी और नमूनों की बड़ी संख्या के माप की अनुमति देता है, और डेटा है कि आसानी से एक साधारण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे है विश्लेषण प्रदान करता है । स्तनधारी कोशिकाओं में ओर्थोगोनल जोड़े का विश्लेषण करने के लिए एक मध्यम प्रवाह विधि की उपलब्धता नए ओर्थोगोनल जोड़े के विकास और मौजूदा लोगों के सुधार के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । दरअसल, यह स्तनधारी प्रणालियों में बड़े यादृच्छिक पुस्तकालयों और मृत/जिंदा चयन की पीढ़ी के माध्यम से ओर्थोगोनल जोड़े के विकास का निर्देशन प्रदर्शन करने के लिए संभव नहीं है । परख छोटे आकार पुस्तकालयों (सदस्यों के सैकड़ों) एक अपेक्षाकृत कम समय के भीतर एक उचित प्रायोगिक प्रयास निवेश द्वारा स्क्रीनिंग की अनुमति देता है । इस परख के माध्यम से तर्कसंगत रूप से डिजाइन tRNA सेट स्क्रीनिंग, हम उपंयास tRNAs कि काफी pyrrolysine प्रणाली की क्षमता को बढ़ावा देने के30उत्पंन कर सकता है । क्लासिक संयोजन EGFP/mCherry फ्लोरोसेंट पढ़ने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिससे EGFP आंतरिक नियंत्रण के रूप में निगमन दक्षता और mCherry के रिपोर्टर के रूप में कार्य करता है । EGFP रिपोर्टर और mCherry नियंत्रण एक ही प्लाज्मिड में बंदरगाह रहे हैं, लेकिन दो स्वतंत्र प्रवर्तकों असर दो अलग अभिव्यक्ति कैसेट में एंबेडेड हैं । इस तरह, mCherry अभिव्यक्ति अभिकर्मक दक्षता और कोशिका गिनती से संबंधित है, लेकिन EGFP अभिव्यक्ति से स्वतंत्र है, ताकि मापा हरी प्रतिदीप्ति लाल प्रतिदीप्ति को सामान्यीकृत किया जा सकता है । यह वास्तव में अंय जैसे EGFP-टैग-mCherry7 और iRFP-GFPY39TAG के रूप में दो प्रोटीन के एक मिलकर के रूप में निर्मित संवाददाताओं का मामला नहीं है (iRFP अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन टिप्पण के साथ)52। इस तरह के निर्माण में, दोनों प्रोटीन एक ही mRNA प्रतिलिपि पर हैं । eukaryotes में, mRNAs असर समयपूर्व रोक codons बकवास मध्यस्थता क्षय (एनएमडी) तंत्र53द्वारा निगरानी और क्षरण से गुजरना । इसलिए, रिपोर्टर और नियंत्रण के दोनों अनुक्रम एक साथ नीचा और अभिव्यक्ति दो जीन की स्वतंत्र नहीं है कड़ाई से । इसी तरह एक प्रतिदीप्ति रिपोर्टर के बजाय एक luciferase संवाददाता पर आधारित परख दूसरों के द्वारा वर्णित किया गया है54,55। जबकि एंजाइमी luminescence प्रतिदीप्ति माप की तुलना में उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, बाद में विभिन्न सेल बैचों के बीच उच्च reproducibility दिखाया ।

स्तनधारी कोशिकाओं में ncAA शामिल करने के लिए मजबूत प्रणालियों बिल्कुल जरूरत है जब झिल्ली प्रोटीन और कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की तरह प्रोटीन लक्ष्य की मांग के साथ काम कर रहे हैं । हम यहां GPCRs में फोटो-activatable ncAA Azi के मजबूत शामिल करने के लिए एक अनुकूलित ओर्थोगोनल जोड़ी दिखाई है । पूरे GPCR सतहों और ligand बाध्यकारी साइटों की पहचान के व्यवस्थित फोटो-crosslinking मानचित्रण के लिए अनुमति देता है कि पूरी रिसेप्टर में सजातीय Azi निगमन दरों प्रणाली देता है । विधि की ताकत के दो प्रमुख अंक है कि अलग लाइगैंडों समानांतर में एक ही रिसेप्टर पर विश्लेषण किया जा सकता है और डेटा लाइव सेल में रिसेप्टर से प्राप्त कर रहे हैं, जो इन विट्रो दृष्टिकोण से प्राप्त जानकारी का पूरक है. विधि सिद्धांत रूप में किसी भी प्रोटीन लक्ष्य के लिए लागू है, और उपयुक्त भी प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के topologies नक्शा है । इसके अलावा, crosslinked पदों की पहचान की सबसेट आगे 2 डी crosslinking के साथ पिन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, संबद्ध परिसर में समीपस्थ अमीनो एसिड की आणविक जोड़े33,38। इस तरह के एमिनो एसिड जोड़े स्थानिक बाधाओं कि silico प्रयोगों में करने के लिए33,38संपर्क के सटीक आणविक मॉडल बनाने के लिए लागू कर रहे है प्रदान करते हैं । देखने के व्यवस्थित बिंदु से, यह है कि केवल crosslinking प्रयोगों से सकारात्मक परिणाम पर विचार किया जाना चाहिए टिप्पणी लायक है । एक स्थिति है कि crosslink नहीं था अभी भी ligand से महत्वपूर्ण त्रिज्या के भीतर हो सकता है । झूठी नकारात्मक हो सकता है जब crosslinker द्वारा शुरू उत्परिवर्तन देशी संपर्क में बाधा, लेकिन यह भी हो सकता है जब crosslinking moiety या तो ligand से दूर अंक, या विलायक द्वारा बुझती है, या intramolecular crosslinking है । विधि का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है कैसे crosslinking की घटना का पता लगाने के लिए । पहली जगह में, पूरे सेल lysates एसडीएस पृष्ठ पर हल कर रहे है किसी भी ligand कि रिसेप्टर के लिए बाध्य covalently नहीं है अलग करने के लिए । दूसरा, आबंध ligand-रिसेप्टर परिसर पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से पता चला है एक विरोधी ligand एंटीबॉडी का उपयोग कर । पेप्टाइड लाइगैंडों के लिए, उच्च अपनत्व polyclonal एंटीबॉडी ligand के खिलाफ उठाया इष्टतम पसंद कर रहे हैं । एक विकल्प के रूप में, पेप्टाइड लाइगैंडों एक स्वतंत्र स्थिति में एक झंडा टैग के साथ सुसज्जित किया जा सकता है, बशर्ते टैग एक उपयुक्त स्पेसर के माध्यम से विरोधी झंडा एंटीबॉडी के लिए सुलभ बना दिया है. बायोटिन टैग भी इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि परिणाम अंतर्जात biotinylated प्रोटीन द्वारा पृष्ठभूमि की वजह से व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है । छोटे अणु लाइगैंडों आमतौर पर radiolabeled हैं, हालांकि टैग लेबलिंग भी56,57संभव हो सकता है । GPCRs में Azi निगमन के लिए प्रोटोकॉल भी दूसरों के द्वारा प्रकाशित किया गया है57,58,59। हालांकि, इन प्रोटोकॉल Azi निगमन के लिए तीन plasmids का उपयोग शामिल है, जबकि हम एक सरल दो प्लाज्मिड प्रणाली का उपयोग करें, E2AziRS के लिए एक मानवतावादी जीन सहित, जो गैर के संबंध में बेहतर परिणाम देता है codon-एक अनुकूलित (चित्रा बीसी) ।

आधुनिक सूक्ष्म तकनीक ब्याज के प्रोटीन में बहुत उज्ज्वल और कुशल fluorophores स्थापित करने की आवश्यकता है, जैसे कि क्लासिक EGFP के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन fluorophores उच्च अंत अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं । इसलिए, वहां तरीकों की एक सतत खोज है कि प्रोटीन, जो लोकप्रिय तस्वीर60 और हेलो61 टैग, दूसरों के बीच के विकास के लिए नेतृत्व किया है पर कार्बनिक fluorophores स्थापित करने में सक्षम है । हालांकि, इस तरह के टैग अभी भी कई केडीए का एक आकार है, जो लक्ष्य प्रोटीन के समारोह perturb और fluorophore की सटीक स्थिति के बारे में काफी बड़ी अनिश्चितता छोड़ सकते हैं । कुछ अमीनो एसिड की एक ंयूनतम आकार के साथ, tetracysteine आकृति अधिक सटीक fluorescein या resorufin आर्सेनिक यौगिकों (फ्लैश, ReAsH)62,63का उपयोग लेबलिंग के लिए एक छोटे विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है । हालांकि इस दृष्टिकोण बहुत सफलतापूर्वक भी GPCR अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है64,65,66, यह thiols के साथ व्यापक धुलाई कदम की आवश्यकता है, यह अक्सर उच्च पृष्ठभूमि से ग्रस्त है, और किसी भी मामले में, यह अनुमति नहीं है एकल अवशेषों के समाधान के साथ लेबल पोजिशनिंग । इसके बजाय, bioorthogonal लंगर के साथ सुसज्जित ncaas एक एमिनो एसिड की स्थिति में फ्लोरोसेंट लेबल स्थापित करने की संभावना प्रदान करते हैं, इस प्रकार देशी अनुरूपता और लक्ष्य प्रोटीन की कार्यक्षमता के साथ हस्तक्षेप के जोखिम को कम करने । bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए अंतिम पीढ़ी के ncaas, TCO * K13 यहां कार्यरत है, की तरह सक्षम है प्रोटीन लेबलिंग सीधे लाइव सेल17,43पर । विधि सेल सतह पर प्रोटीन लक्ष्यों के लिए लागू है, लेकिन यह भी intracellular लक्ष्य पर, बशर्ते कि उपयुक्त कोशिका-पारगंय रंजक उपलब्ध हैं17,67,68. SPIEDAC रसायन विपरिमाण के कई आदेश है तेजी के संबंध में तनाव को बढ़ावा azido-alkyne cycloaddition (SPAAC) और Staudinger Bertozzi ligations पर azide लंगर2,13। वास्तव में, कई प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से शामिल Azi पर GPCR लेबलिंग के लिए प्रकाशित किया गया है, लेकिन वे केवल अलग GPCRs इन विट्रो37,59,69पर लागू होते हैं । इसके बजाय, हम यहां का प्रदर्शन किया है चिकनी bioorthogonal लाइव सेल पर कार्यात्मक GPCRs के लेबल । हमारे प्रोटोकॉल मौजूदा एक ही रसायन विज्ञान43,48,70का उपयोग कर प्रोटोकॉल के समान है, लेकिन हमारे अनुकूलित ncAA शामिल प्रणाली अध्ययन GPCR करने के लिए विधि के दायरे का विस्तार । प्रयोगात्मक प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम की स्थिति का चुनाव है TCO * कश्मीर के साथ विमर्श किया, रिसेप्टर के भीतर नहीं सभी पदों के रूप में या तो एक प्रतिस्थापन या फ्लोरोसेंट डाई के लिए सुलभ के लिए स्वतंत्र हैं । इसलिए, कई पदों के लिए एक प्रारंभिक स्क्रीन में परीक्षण किया जाना चाहिए सबसे उपयुक्त एक खोजने के लिए ।

अंत में, यह काम ऐसे GPCRs के रूप में चुनौतीपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों को आवेदन सहित ncaas के सामांय आवेदन के लिए उपकरण प्रस्तुत करता है । हमें आशा है कि फोटो crosslinking मानचित्रण और bioorthogonal लेबलिंग, आजकल ncaas के GPCR अध्ययन करने के लिए मुख्य आवेदन, दोनों GPCR या अंय प्रोटीन के साथ लाइगैंडों बातचीत के topologies अनावरण करने के लिए कई भविष्य अनुप्रयोगों मिल जाएगा और अध्ययन करने के लिए GPCR लाइव सेल में संरचनात्मक गतिशीलता ।

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Disclosures

लेखकों के एलान का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा अनुदान CO822 के तहत स्थापित किया गया है/2-1 (एमी-Noether कार्यक्रम) और CO822/3-1 से आईसी

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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