Optimalisere genetisk inkorporering av kjemiske sonder i GPCRs for foto-crosslinking kartlegging og Bioorthogonal kjemi i Live pattedyrceller

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En lettvinte fluorescens analysen er presentert for å evaluere effektiviteten av amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA omfatter ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i proteiner i pattedyrceller. Bruk av ncAAs å studere G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) er beskrevet, inkludert Foto-crosslinking tilordning av bindende områder og bioorthogonal GPCR merking på levende celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Genetisk inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via rav stopp codon undertrykkelse er en kraftfull teknikk installere kunstige sonder og reaktive moieties på proteiner direkte i live cellen. Hver ncAA er innarbeidet med en dedikert ortogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) par som importeres inn i verten organisme. Inkorporering effektiviteten av forskjellige ncAAs varierer sterkt, og være tilfredsstillende i noen tilfeller. Ortogonale par kan forbedres ved å manipulere AARS eller i tRNA. Men regissert utviklingen av tRNA eller AARS store biblioteker og døde/levende utvalg metoder er ikke gjennomførbart i pattedyrceller. Her vises en lettvinte og robust fluorescens-baserte analysen å evaluere effektiviteten av ortogonale par i pattedyrceller. Analysen kan screening titalls til hundrevis av AARS/tRNA varianter med en moderat innsats og innen rimelig tid. Bruk av denne analysen til å generere nye tRNAs som forbedrer effektiviteten av pyrrolysine ortogonale betydelig er beskrevet, sammen med bruk av ncAAs til studiet av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs), som er utfordrende objekter for ncAA mutagenese. Først, ved å systematisk innlemme en foto-crosslinking ncAA gjennom ekstracellulære overflaten av en reseptor, bindende områder av forskjellige ligander på intakt reseptoren tilordnes direkte i live cellen. Andre, ved å innlemme siste generasjons ncAAs i en GPCR, lynraske katalysator-fri reseptor merking med et fluorescerende farge er bevist, som utnytter bioorthogonal belastning forfremmet omvendt Diels or cycloaddition (SPIEDAC) på den levende cellen. Som ncAAs kan generelt brukes til alle protein i størrelse, er metoden av generell interesse for en rekke applikasjoner. I tillegg ncAA innlemmelse krever ikke spesialutstyr og utføres enkelt i standard biokjemi laboratorier.

Introduction

Genetisk inkorporering av kjemiske sonder i proteiner er en kraftig metode å lette etterforskningen av strukturelle og dynamisk aspekter av protein funksjonen direkte i opprinnelige kontekst av levende celle. I dag, kan hundrevis av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) utstyrt med de mest ulike kjemiske gruppene site-specifically innlemmet i proteiner av biosyntesen1,2,3,4. Mellom dem, finner man Foto-sensitive ncAAs som Foto-crosslinkers5, foto-bur6,7,8,9 og foto-valgbar aminosyrer10, 11, aminosyrer anstrengt alkener og alkynes for katalysator-fri bioorthogonal kjemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyrer bærer dansyl18, kumarin9,19og prodan20,21 fluorophores og aminosyrer utstyrt med andre Biofysiske sonder som godt som med innlegg translasjonsforskning modifikasjoner1,2,3,4,22,23,24,25.

Genetiske kodingen av en ncAA aktiveres som en dedikert amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) koblet til en beslektet suppressor-tRNA, som inkorporerer ncAA svar på en gul stopp codon under vanlige ribosomal syntese. ncAARS/tRNA par er konstruert for å være ortogonale i verten organisme, altså ikke cross-talk med endogene parene. Teknikken er godt etablert både i prokaryotic og eukaryotic verter og lett gjelder pattedyr celler. Par for ncAA innlemmelse i pattedyrceller er basert på tre viktigste ortogonale systemer: tyrosyl systemet, som kombinerer TyrRS E. coli26 med en tyrosyl rav suppressor fra B. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstYam par), E. coli leucyl system (EcLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 og archaeal pyrrolysyl system (PylRS-tRNA- Pyl par)3, der tRNAPyl er en naturlig rav suppressor. Generelt, gjenkjennes hver ncAA av en spesialisert ncAARS. Avhengig av ncAA struktur, er ncAARS innhentet via regissert utviklingen av TyrRS, LeuRS eller PylRS, selv om noen synthetases kan godta flere ncAA.

Ortogonale paret importeres inn i cellene ved å bruke en plasmider vektor. Mest vanlige og effektive plasmider er bicistronic og kode både i synthetase og tRNA danner ortogonale par29. En andre plasmider koding for protein av rentebærende et gult codon på stedet angitt for endring er co transfekterte. NcAA legges bare til celle vekst medium. Imidlertid bruker forskjellige spesialiserte grupper ofte ulike varianter av plasmider konstruksjoner for inkorporering av samme ncAA. Konstruksjoner varierer i ordningen av gener i vektor, type av synthetase, codon bruk i synthetase genet, formidler bruk, variant av tRNA og antall tRNA uttrykk kassetter. Videre kan innlemmelse effektiviteten av forskjellige ncAAs variere drastisk på grunn av ulike katalytisk effektiviteten av de forskjellige synthetases, kvaliteten på tRNA og andre faktorer30. Derfor er det viktig å ha på hånden en rask og pålitelig metode for å vurdere effektiviteten av et ortogonale par, både å velge det mest passende systemet for et ønsket program og utføre noen optimering skritt som forbedrer generell protein uttrykk gir.

Vi har etablert en enkel og robust fluorescens-baserte analysen for å evaluere effektiviteten av ortogonale par29 (figur 1). I analysen, cellene er co transfekterte med plasmider koding for ortogonale paret, sammen med en bicistronic reporter plasmider koding både for grønne fluorescerende protein bærer en gul stopp codon på en ettergivende posisjon (EGFPTAG) og mCherry gene. Rød og grønn fluorescens av hele celler lysates leses i separate kanaler på en plate leser i en 96-brønns plate. Intensiteten av den grønne fluorescensen direkte korrelerer med effektiviteten av rav undertrykkelse, mens intensiteten av rød fluorescens gir en direkte anslag over størrelsen på målt prøven og transfection effektiviteten. Med hensyn til lignende analyser basert på fluorescens lese assistert celle sortering (FACS) ut31,32, analysen gir en umiddelbar og omfattende vurdering av protein uttrykk i befolkningen hele cellen, som er mer representant for vanlige eksperimentelle forhold, og tilbyr en enklere datainnsamling og prosessering programvare. Samlet er den største fordelen med analysen som et medium til et stort antall prøver kan bli analysert i parallell. Bruker denne analysen, har vi vist et rasjonelt utformet bibliotek med suppressor-tRNAs for å effektivisere Pyl ortogonale systemet30. Dette verket beskriver eksperimentelle protokollen for å utføre denne analysen og viser eksempler på programmet, inkludert optimalisering av ortogonale paret inkorporering av den Foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanin (Azi) og sammenligning av inkorporering effektiviteten av ulike aminosyrer (figur 2).

De siste årene, ncAA verktøy har vist seg svært kraftig undersøke strukturelle og funksjonelle aspekter av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs),33,,34,,35,,36,,37 , 38. hos mennesker, GPCRs danner en stor familie membran reseptorer (800 medlemmer) og representerer viktigste mål for terapeutisk narkotika. Direkte strukturelle karakterisering av GPCRs er fortsatt utfordrende og komplementære biokjemiske metoder er svært nødvendig for etterforskningen. Vi har banebrytende bruk av foto-crosslinking ncAAs kartet GPCR overflater og oppdage ligand binding lommer34. Bruker systemet vårt er optimalisert for Azi innlemmelse, innlemmet vi systematisk Azi gjennom hele juxtamembrane domenet for en GPCR direkte i live pattedyrceller. På UV bestråling danner Azi en svært reaktive nitrene arter som covalently fanger nærliggende molekyler. Når ligand legges til systemet, fungerer Azi som en nærhet sonde å avsløre posisjoner av reseptoren komme nær bundet ligand. På denne måten ble bindingsmodus av neuropeptide hormone Urocortin jeg (Ucn1) på klasse B GPCR corticotropin-slippe-faktor reseptoren type 1 (CRF1R)33 først lansert. I det siste har vi avslørte distinkte bindende bruksmønstre agonister og motstanderne på det samme reseptor38. En lignende tilnærming har blitt brukt av andre å avsløre orthosteric og allosteric bindende områder av andre peptider og små molekyl ligander på andre GPCRs39,40,41,42. Dette manuskriptet beskriver eksperimentelle protokollen anvendt i vår lab for foto-crosslinking tilordning av GPCR overflater. Metoden er relativt rask, enkel og krever ikke spesielt utstyr, slik at det er aktuelt i standard biokjemi laboratorier. Viktigere, tilnærmingen gir et verdifullt verktøy ikke bare å identifisere ligand binding områder der 3D strukturelle data er mangelvare, men også å komplettere eksisterende i vitro data med informasjon fra fullt post-translationally endret reseptorer i den fysiologiske miljø i live cellen.

Den siste utviklingen av romanen ncAAs betydning siden kjeden kjemiske gruppene egner for superrask katalysator-fri bioorthogonal kjemi har åpnet opp muligheten til å installere siste generasjons fluorophores for super-oppløsning bildebehandling i proteiner direkte på live celler2,43. Slike kjemiske ankere inneholde anstrengt cyclooctyne i SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, og trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 blant andre ncAAs skjuler en norbornene16,17,44 eller cyclopropene45,46 moiety. Store ncAAs i bioorthogonal kjemi er innlemmet ved en variant av PylRS vanligvis merket som PylRSAF (som angir mutasjon Y271A og Y349F i M. barkeri PylRS), så vel som av andre ad hoc utviklet ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankere reagere med tetrazine reagenser47 via omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition å gi høy merking avkastning innen et par minutter43,48. Men har anvendelsen av denne kraftige tilnærmingen til etiketten GPCRs vært utfordrende på grunn av en lav virkningsgraden i ortogonale ncAA innlemmelse systemet. Bruke vår forbedrede Pyl system, har vi nylig vist høy dekkevne innlemmelse av slike aminosyrer i GPCRs og lynraske GPCR merking på overflaten av live pattedyrceller30. Merket reseptorer var fremdeles funksjonell, som de fysiologisk internalisert på aktivere reseptoren med en Agonistiske. Eksperimentell protokollen for inkorporering av bioorthogonal plugger i GPCRs og merking følgende beskrives her. Utstyre GPCRs med små lyse fluorophores er det første grunnleggende skrittet mot studiet av GPCR strukturelle dynamikken i live cellen via avanserte mikroskopi teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fluorescens-basert Screening av inkorporering effektivitet (figur 1)

  1. Opprettholde HEK293 celler i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM; høy glukose, 4 mM glutamin, pyruvate) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO2.
  2. Frø cellene dagen før transfection.
    1. Koble celler for 5 min på 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS supplert med 0,5 mM EDTA. Bruk 1 mL Trypsin/EDTA for en 10 cm rett. Slukke med 10 mengder komplett medium og resuspend celler av pipettering. Tell antall celler i suspensjon bruker en hemocytometer49.
    2. Frø 6.0 x 105 HEK293 celler per brønn av 6-og plater i 2 mL komplett vekst medium. Forberede så mange brønner som antall eksempler og to flere brønner for vill-type EGFP og et uekte-transfekterte eksempel, henholdsvis.
  3. Kontrollere samløpet (område okkupert av cellene) under et mikroskop. Transfect cellene på ~ 70% samløpet med polyethyleneimine (PEI) reagens.
    1. 1 time før transfection, legge til riktig mengde nylagde ncAA lagerløsning alle brønner for en siste ncAA konsentrasjon av 0,25-0,5 mM. Legge til ncAA alle brønner, inkludert vill-type positiv kontroll og uekte-transfekterte celler, å forhindre forskjeller i fluorescens signaler som skyldes effekten av ncAA på mobilnettet vekst.
      Merk: For å forberede lager løsninger, oppløse ncAA til 0,1-0,5 M benytter 0,2 0,5 M NaOH. Noen ncAAs kan imidlertid kreve første solubilization i DMSO og/eller nøytralisering av fire volumer på 1 M HEPES (pH 7.4) før bruk. Vanligvis anbefaler produsenten en protokoll for å forberede en lagerløsning.
    2. I et microcentrifuge rør, bland 1 µg plasmider DNA koder for ncAARS/tRNA par skal testes med 1 µg av reporteren plasmider DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). I separate rør, Forbered en identisk transfection bruke EGFP vill-type referanse og en narr transfection.
      Merk: Antall eksemplarer av tRNA kassetten i plasmider koding for ncAARS/tRNA paret avhenger av programmet. For å lette kloning, 1 tRNA Kopier anbefales når screening forskjellige tRNAs, mens 4 Kopier anbefales (men ikke strengt nødvendig) når tester ulike ncAARS eller innlemmelse av ulike ncAAs av samme ortogonale par.
    3. Hver rør som inneholder DNA legge 100 µL laktat bufrede saltvann (LBS) som inneholder 20 mM natrium laktat på pH 4.0 og 150 mM NaCl. Bland kort.
    4. Hver rør som inneholder DNA i LBS legge 6 µL av 1 µg/µL PEI i LBS (forholdet PEI/DNA = 3/1 w/w) og vortex umiddelbart. Ruge på RT i 10-15 min.
    5. Tar 400 µL celle medium fra hver brønn og legger den til DNA-PEI blanding å nøytralisere pH. Dribble DNA blandingen på cellene.
      Merk: DMEM inneholder vanligvis fenol rød som pH indikator. Under det nøytralisering steget endres fargen på blandingen lagt i røret fra gul (syrlig) til rød (nøytral). Selv om danner DNA komplekser i LBS på surt pH gir den høyeste transfection gir50, kan DNA-PEI komplekser også dannes direkte ved pH 7.4 (for eksempel i serum-free DMEM). Hvis bruker DMEM til skjemaet DNA komplekser, hoppe over nøytralisering trinn 1.3.5. Uansett, er det viktig at ingen serum finnes i blandingen når forming komplekser.
  4. Høste celler 48 timer etter hva.
    1. Sug opp mediet og skyll cellene gang med 2 mL forvarmes PBS (37 ° C). Legge til 800 µL av PBS med 0,5 mM EDTA og ruge etter 20 min på 37 ° C. Løsne og suspendere cellene av pipettering opp og ned.
    2. Overføre celle suspensjon til 1,5 mL rør som inneholder 200 µL PBS med 5 mM MgCl2.
    3. Virvel i 2 minutter på 800 x g og kast nedbryting.
      Merk: Protokollen kan pauses her. I dette tilfellet flash-fryse pellets i flytende N2 og lagre-80 ° c i opptil en måned. Bruk alltid vernebriller beskyttelse.
  5. Legge til 100 µL Tris lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA og nylig lagt PMSF) til celle pellets og Inkuber på is 30 min. Å forenkle lysis, vortex hver 5 min.
  6. Nedspinning celle rusk i 10 min 4 ° C og 14.000 x g og overføre 90 µL nedbryting av i svart 96-brønns plater. Måle EGFP og mCherry fluorescens bruker en plate leser utstyrt med en fluorescens modul.
    Merk: Bruke riktig eksitasjon og utslipp filtre for EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) og mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). EGFP måleverdiene vil spenner mellom den laveste verdien fra uekte-transfekterte celler og en maksimumsverdi som hentes vanligvis fra vill-type EGFP. Ta vare på sette opp vinduet korrekt måling i instrumentet.
  7. Effektiviteten av ncAA innlemmelse beregnes som forholdet mellom fluorescens for utvalget og fluorescens fra uttrykket av vill-type EGFP. Alle verdier er normalisert til mCherry fluorescens.
    Equation 1

2. genetisk innlemmelse av ncAAs i GPCRs for foto-crosslinking kartlegging av Ligand-GPCR vekselsvirkningene (Figur 3)

  1. Opprettholde HEK293T celler i DMEM med 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO2.
  2. Frø celler dagen før transfection.
    1. Koble celler for 5 min på 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS supplert med 0,5 mM EDTA. Bruk 1 mL Trypsin/EDTA for en 10 cm rett. Slukke med 10 mengder komplett medium og resuspend celler av pipettering opp og ned. Tell antall celler i suspensjon bruker en hemocytometer49.
    2. Frø 5.0 x 105 293T celler per brønn i 2 mL komplett vekstmediet i 6-og plater. For hver posisjon til å bli vist, forberede 1 per ligand pluss en brønn er bindende kontroll33,38. En ekstra godt å være transfekterte med vill-type (wt) reseptoren inkluderes kanskje kontrollere hvilket uttrykk mutant.
  3. Dagen etter, kontrollere samløpet (område okkupert av cellene) under et mikroskop. Transfect cellene på ~ 70% samløpet med PEI.
    1. 1 time før transfection, Legg Azi til alle brønner til en siste konsentrasjon på 0,5 mM.
      1. Forberede en 0,5 M lager løsning av Azi. Per 6-vel plate, veie 1,2 mg Azi inn i et rør og oppløse den i 15 µL 0,5 M NaOH. Fortynne lagerløsning 1,2 mL komplett medium og legge 200 µL av blandingen i hver brønn.
        Merk: Utarbeide en fersk lager løsning av Azi for hver eksperimentet. Azide moiety har kort halveringstid i vandige løsninger, spesielt på grunnleggende pH, og AziRS opptar det intakt, men også dårligere form.
    2. Transfect et samlet beløp på 2 µg DNA per brønn: 1 µg plasmider koding for flagg-merket GPCR bærer en TAG codon ønsket posisjon og 1 µg plasmider koding for ortogonale paret dedikert til Azi (E2AziRS51 og 4 kopier av beslektet Suppressor-tRNA BstYam)33,38.
      Merk: Når en wt sammenligning å kontrollere uttrykket nivåer, transfect en lavere mengde plasmider DNA for wt reseptoren. Avhengig av GPCR, 0,2 til 0.5 µg av plasmider koding wt reseptor avkastning lignende nivåer som 1.0 µg av den muterte plasmider. Transfect samme mengde DNA i alle brønnene, fylle opp mangler DNA med en uekte (for eksempel en tom vektor).
    3. Fortsett som beskrevet i 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 timer etter transfection, Fortsett med trinn 2.4 for foto-crosslinking av ligander eller gå til trinn 2.5 for direkte høsting og analyse for å verifisere reseptor uttrykk.
  4. Foto-crosslinking av ligand.
    1. Forberede en 1000 x ligand lagerløsning. Oppløse peptid ligand i en konsentrasjon av 100 µM i DMSO.
      Merk: Ligand konsentrasjonen avhenger av dissosiasjon konstant KD av ligand-GPCR interaksjon. En siste konsentrasjon av 100 x KD anbefales. Hvis peptid ligand er en salt av trifluoroacetic syre (TFA), vurdere vekten av TFA ved beregning av molekylvekt (1 x TFA per grunnleggende aminosyre i peptid). Også vurdere at peptider er generelt hygroskopisk. Unngå gjentatt frysing av peptid pulver og aldri åpne en peptid beholder før den ikke har nådd romtemperatur.
    2. Fortynne ligand lagerløsning 1:1,000 i bindingen buffer bestående av 0,1% BSA, 0,01% Triton-X 100, 5 mM MgCl2 HEPES dissosiasjon buffer (HDB) inneholder 12.5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl og 5 mM KCl. Forbered 1 mL per Azi-GPCR mutant. Erstatt celle mediet med 1 mL av ligand løsningen. Inkuber i 10 min på RT.
      Merk: Justere inkubasjon tid til den bestemte GPCR, regnskap for ligand kinetics og reseptor internalisering. Forlenge inkubasjon tiden forbedrer ikke crosslinking avkastning.
    3. Irradiate eksemplar for 20 min i en UV crosslinker ved 365 nm med 5 x 8 W rør og ~ 5 cm avstand til cellene. Koble cellene av pipettering og overføre dem til en 1,5 mL reaksjon rør. Pellets celler for 3 min 800 x g og kast nedbryting.
    4. Oppløse en tablett av protease hemmer (PI) cocktail i 1 mL 25 mM EDTA/T2O lage en 50 x lagerløsning. Aliquot PI lagerløsning og lagre den på 20 ° C. Fortynne 50 x lager 1:25 i HDB og resuspend celle pellets i 50 µL av 2 x PI HDB. Flash-fryse cellene i flytende N2.
      Merk: Bruk vernebriller beskyttelse. På dette punktet, kan prøvene lagres ved-80 ° C i opptil en måned. Fortsett med trinn 2.6.
  5. Direkte celle innhøstingen.
    1. Sug opp mediet. Legge til 800 µL av 0,5 mM EDTA i HDB. Inkuber i 10 min RT eller is.
    2. Koble cellene av pipettering opp og ned og overføre dem til en 1,5 mL reaksjon rør. Legge til 200 µL av 5 mM MgCl2 i HDB. Pellets celler for 3 min 800 x g og kast nedbryting.
    3. Resuspend celle pellets i 50 µL av 2 x PI HDB og flash fryse i flytende N2. Bruk vernebriller beskyttelse.
      Merk: På dette punktet, kan prøvene lagres ved-80 ° C i opptil 1 måned.
  6. Celle lysis.
    1. Tine cellene i et vannbad ved 37 ° C i 30-45 s og vortex kort. Holde prøver kaldt fra nå av. Pellet membraner på 2500 x g og 4 ° C for 10 min. forkaste nedbryting, som inneholder mesteparten av cytosolic proteiner.
    2. Resuspend pellets i 50 µL HEPES lyseringsbuffer inneholder 50 mM HEPES-HCl pH 7.5 150 mM NaCl, 10% glyserol, 1% Triton X-100, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT og nylig lagt 2 x PI cocktail. Bland godt. Lyse cellene 30 min på is og vortex hver 5 min.
    3. Nedspinning celle rusk for 10 min 14.000 x g og 4 ° C. Øyeblikkelig overføre nedbryting slik frisk reaksjon.
      Merk: Fortsett med analyse umiddelbart. Lysates kan lagres på 20 ° C, men hver fryse-Tin syklus svekker kvaliteten på resultatene.
  7. Western blot analyse.
    1. Å forberede prøven, ta 3-5 µL lysate og fylle den opp til 7 µL med H2O. legge 2 µL 1 M DTT og 3 µL 4 x prøve buffer inneholder 63 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glyserol og 0,04% bromphenol blå. Inkuber i 30 min på 37 ° C.
    2. Når GPCR er glycosylated og svak eller smurt band er et problem, deglycosylate prøver med PNGase F å øke signalet intensitet og skjerpe bandene. Bruke 3-5 µL lysate og deglycosylate i et totalt volum på 10 µL etter leverandørens protokoll. Legge 3 µL 4 x prøve buffer.
      Merk: Membran proteiner er ofte glycosylated i flere områder og stater, som hemmer kvaliteten på oppløsning i SDS-side analyse. Men gjør ikke deglycosylate prøvene for analyse av uttrykk nivået av Azi-GPCR mutanter bruker anti-flagg antistoffer fordi det er relevant å evaluere delen av fullt glycosylated, modne reseptor på celleoverflaten.
    3. Løse prøver via standard SDS-siden og blot overføring proteiner til en PVDF membran.
      Forsiktig: Akrylamid er nevrotoksiske. Bruk vernehansker og vernebriller.
    4. Blokkere membranen 1t på RT eller overnatting på 4 ° C i 5% skummet melk i TBS-T som inneholder 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 0,15 M NaCl og 0,1% mellom 20.
    5. Sonde membranen med et anti-ligand antistoff etterfulgt av HRP-konjugerte sekundære antistoffer. Vask i mellom med TBS-T. For å oppdage hvilket uttrykk Azi-GPCR, undersøke membranen med en kommersiell HRP antistoff (se Tabell for materiale).
    6. Utføre forbedret chemiluminescence (ECL) reaksjon med hjemmelaget ECL reagens og oppdage signaler for 5 min i mørket.

3. lynraske Bioorthogonal merking av GPCRs på Live pattedyrceller

Merk: Protokollen er optimalisert for 4-og kamret coverslips (godt området = 2.2 cm2). For forskjellige godt størrelser, må protokollen skaleres tilsvarende.

  1. Overflatebelegg objektglass. Utføre hele prosedyren under sterilt hette.
    1. Forberede en poly-D-lysine hydrobromide (MW = 500-550 kDa) (PDL) lagerløsning i en konsentrasjon av 1 mg/mL i 50 mM borate buffer (pH 8.5). Lagre på 4 ° C for inntil 6 måneder. Må ikke fryses.
    2. Fortynne PDL lager løsning 1:40 i sterilt ultra rent vann til et siste konsentrasjonen av 25 µg/mL (fungerende løsning), deretter filtrere løsningen gjennom filtere 0.22 µm sterilt.
      Merk: Fungerende løsning kan lagres på 4 ° C for inntil 3 måneder.
    3. Fullt dekke bunnen av hver brønn mikroskopi lysbildet med 500 µL av PDL fungerende løsning. Inkuber etter 20 min på RT og Sug opp PDL fungerende løsning.
      Merk: PDL arbeider løsningen kan brukes opptil tre ganger. Hvis løsningen må brukes på nytt, overføre brukte løsningen fra belagt lysbilder til en frisk sterilt rør og etiketten røret tilsvarende. Aldri blande resirkulert løsningen med frisk løsning.
    4. Skyll hver vel 3 x med ~ 700 µl sterilt ultra rent vann og la tørr minst 1t.
      Merk: Det er svært viktig å skylle brønnene nøyaktig, rester av PDL løsningen er giftig for cellene. Bestrøket lysbildene kan brukes umiddelbart for mikroskopi eller lagret i opptil en uke på 4 ° C.
  2. Opprettholde HEK293T celler i DMEM med 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO2.
  3. Frø celler dagen før transfection.
    1. Koble celler for 5 min på 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS supplert med 0,5 mM EDTA. Bruk 1 mL Trypsin/EDTA for en 10 cm rett. Slukke med 10 mengder komplett medium og resuspend celler av pipettering. Tell antall celler i suspensjon bruker en hemocytometer49.
    2. Frø 1.0 x 105 HEK293T celler per brønn (området 2.2 cm ²) i 600 µL dye ledig fullstendig DMEM.
      Merk: For bildebehandling formål, er det veldig praktisk å arbeide fra begynnelsen i et medium som ikke inneholder noen fargestoff. Fargestoff gratis DMEM formuleringer er kommersielt tilgjengelig.
  4. Kontrollere samløpet (område okkupert av cellene) under et mikroskop og transfect cellene på ~ 70% samløpet med en lipid-baserte transfection reagens.
    1. 1 time før transfection, utarbeide en fersk 100 mM lager løsning av TCO * K i 0,2 M NaOH og 15% (v/v) DMSO.
    2. Per Vel, blande 3 µl av TCO * K lagerløsning med 12 µL av 1 M HEPES pH 7.4. Forsiktig legge til løsningen i brønnene for en siste TCO * K konsentrasjon på 0,5 mM.
    3. Forberede et samlet beløp på 500 ng DNA per brønn. I et microcentrifuge rør, fortynne 200 ng av pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng av plasmider koding for MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonale par (fire kassetter av tRNAM15) og 100 ng av pcDNA3.1_Arrestin3 plasmider i 50 µL medium (fargestoff gratis, serum-free, antibiotika gratis).
      Merk: Generelt, er co transfection av Arrestin ikke nødvendig å observere GPCR internalisering. Imidlertid raskere co transfecting Arrestin3 internalization av CRF1R, som er veldig praktisk når du analyserer internalisering av mange mutanter.
    4. Fortynne 1,25 µL av lipid-baserte transfection reagensen (2,5 µL per 1 µg DNA) i 50 µL medium (fargestoff gratis, serum-free, antibiotika gratis) og legge løsningen til DNA blanding. Vortex umiddelbart og Inkuber 5-10 minutter til RT. Legg DNA-lipid komplekser til cellene.
      Merk: I vår erfaring, morfologi av celler transfekterte med lipid-baserte hva ser mer fysiologiske forhold til som celler transfekterte med PEI. PEI gir høyere transfection effektivitet, bør PEI være foretrukket for nedstrøms programmer som Western blot, mens lipid-baserte transfection er et bedre valg til transfect celler for imaging eksperimenter.
  5. 24 timer etter transfection, etikett reseptoren med fluorescerende fargestoffer.
    1. Forberede en 0,5 mM fargestoff-tetrazine lager løsning i DMSO og en 10 mg/mL av DNA farging fargestoff lagerløsning i ultra ren H2O.
    2. Overføre 100 µL medium fra hver brønn i en 1,5 mL reaksjon rør. Legge til 1,8 µL av fargestoff-tetrazine lager løsningen og 0,3 µL av DNA flekker fargestoff lagerløsning. Overføre mediet som inneholder fargestoffer tilbake til brønnen og ruge i 5 min på 37 ° C.
      Merk: Tetrazine-orange-fluorescerende farge har en siste konsentrasjon på 1,5 µM.
    3. Sug opp mediet og forsiktig skyll cellene to ganger med PBS fjerne overflødig fargestoff. Legge til 600 µL komplett fargestoff gratis oppblomstringen medium forvarmet 37 ° C.
  6. Fluorescens mikroskopi og reseptor internalisering.
    1. Visualisere merket receptors under 63 x (eller lignende) forstørrelse bruke filtre passer for GFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), orange-fluorescerende farge (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) og DNA flekker fargestoff (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Ta et bilde med hvert filter før aktivering reseptoren.
    2. Fremme reseptor internalisering bruker 200 nM i Ucn1.
      1. Forberede en 1000 x Ucn1 lager løsning av 200 μm i DMSO.
        Merk: Avhengig av Løseligheten av peptid, kan du forberede bestanden i rent vann eller bufferen.
      2. Overføre 100 µL medium fra brønn til en 1,5 mL reaksjon rør og legge 0,6 µL av peptid Agonistiske lager løsningen. Overføre middels baksiden i brønnen.
      3. Observere internalisering under mikroskopet. Ta bilder etter klart synlig forekomst av internalisering (10-15 min timer, avhengig av reseptoren og overuttrykte Arrestins) bruke filtre nevnt tidligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omrisset av fluorescens analysen er avbildet i figur 1. Analysen er ansatt i tre programmer. I første omgang, er et antall tRNA varianter for innlemmelse av Lys(Boc) av Pyl ortogonale paret vist. Lys(Boc) er en aminosyre som er sterically lik Pyl. Som Pyl ikke er kommersielt tilgjengelig, brukes Lys(Boc) vanligvis som en standard substrat for PylRS. Vist tRNAs er basert på tRNAPyl. Hver tRNA variant bærer mutasjoner enkelt baser eller base-parene i løkker og stammer rasjonelt for å forbedre tRNA stabilitet og kompatibilitet med eukaryote translasjonsforskning maskiner. Alle detaljer om tRNA design er beskrevet i vår siste arbeidet30. Typiske resultater er beskrevet i figur 2A: forskjellige tRNAs gi forskjellige undertrykkelse effektivitet, som er klart reflektert i målt fluorescens. Liten feilfeltene av biologiske triplicates viser at verdiene er svært reproduserbare. På andre plass evalueres to genet varianter av den E2AziRS26,51, som inkorporerer den Foto-crosslinker p-azido-Phe (Azi). E2AziRS er avledet fra E. coli TyrRS. En genet variant ansatt innfødt E. coli codon bruk, mens andre var codon-optimalisert for bruk i H. sapiens. Fluorescens analysen viser at codon-optimalisert varianten gir høyere protein avkastning (figur 2B). Endelig innlemmelse frekvensen av ulike aminosyrer for bioorthogonal Klikk kjemi er forhold (figur 2C). Alle ncAAs presenteres her (BCNK, TCO * K og SCOK) er en del av den samme ortogonale MbPylRSAF/tRNAPyl. Lys(Z) er også innarbeidet med dette paret og ble brukt som en positiv. For å illustrere påliteligheten til fluorescens analysen, ble parallelle ncAA innlemmelse eksperimenter utført på en GPCR, CRF1R. Western blot analyse ble gjennomført for å anslå GPCR uttrykk (figur 2B, C). Samme trender observert med EGFP i fluorescens analysen ble observert med CRF1R. Spesielt Azi inkorporering CRF1R ble svært forbedret ved codon-optimalisert E2AziRS genet sammenlignet med innfødt genet, viser at selv en moderat forbedring av 1,5-2-fold for et løselig protein (EGFP) i henhold til fluorescens analysen kan ha en større innvirkning på hvilket uttrykk mer utfordrende membran proteiner (figur 2B). Som generell note, med hensyn til antall tRNA kassetter som skal brukes for hvert program, anbefales bare én tRNA kassett når screening forskjellige tRNAs for å lette kloning prosedyrer. Når screening ulike ncAARS eller innlemmelse effektiviteten av ulike ncAAs av samme ortogonale par, gjentar fire tandem av tRNA kassett er foretrukket å oppnå høyeste avkastningen ncAA selskap.

Optimalisert systemet for Azi innlemmelse inkludert humanized E2AziRS genet ble deployert for å tilordne bindende lommen på CRF1R og definere bindende baner av 5 forskjellige ligander: to peptid agonister Ucn1 og CRF og tre peptid antagonister Ucn1(8-40), CRF (9-41) og dFXCRF(12-41) (Figur 3). Mens effektiviteten av Azi innlemmelse ble tidligere vist å redusere når du nærmer deg GPCR C-terminus33,34, gir våre optimalisert system for Azi innlemmelse sammenlignbare uttrykk nivåer av Azi-mutanter med TAG-nettsteder i ulike deler av GPCR genet (figur 4A). Resultatene i figur 4B Vis screening av ekstracellulære loopen 2 (ECL2) og helix V av CRF1R som et representativt delen av ligand-bindende lommen. Et band på riktig størrelse crosslinking produktet avslører at stillingen ligger i nærheten av ligand innenfor ligand-reseptor komplekset, dvs det er del av binding lomme. Flere crosslinking treff ble funnet med alle ligander testet, avslører distinkte bindende mønstre for peptid agonister og antagonister. Spesielt gir mønster av crosslinking treff informasjon om strukturelle elementer av reseptoren. Et antall påfølgende treff, som observerte i ECL2 (plasserer F260-R263 i kombinasjon med antagonister) antyder en fleksibel loop-regionen. Et mønster av treff hver tre-fire rester som finnes i helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) hint mot en spiralformede struktur. Skjermen kan utvides til alle relevante domener av GPCR. Hvis det finnes en 3D-struktur eller en molekylær modell av reseptoren, kan ligand overføringene visualiseres ved å markere de crosslinking treffene for hver ligand (figur 5).

Både fluorescens og Western blot data (figur 2C) foreslår at TCO * K er ncAA for bioorthogonal kjemi som blir tatt med høyeste effektiviteten av MbPylRSAF. Forskjellige PylRS mutanter kan gi høyere innlemmelse gir andre Klikk ncAAs17, men de ble ikke testet i denne studien. TCO * K ble innlemmet i et CRF1R-EGFP fusion protein og aktivert installere via SPIEDAC kjemi (figur 6A) en liten lys fluorophore på reseptoren (figur 6B). Som et bevis på bestemte merking, fluorescens av etiketten skal være synlig bare i celler som uttrykker reseptoren (grønne celler i figur 6B) og ikke i mørke celler, som dermed gir en negativ internkontroll i hvert eksperiment. Reseptorer merket med lynraske SPIEDAC kjemi er fremdeles funksjonell. Etter tilføyer et peptid Agonistiske, ble fluorescerende rom observert gjennom stoffer avslørende i fysiologiske prosessen med GPCR internalisering (figur 6C). Signalene fra de smeltet EGFP Co lokalisert med fluorescerende fargestoff til enhver tid, bekrefter den selektive biorthogonal merking av GPCR.

Figure 1
Figur 1: fluorescens-baserte analysen å evaluere effektiviteten av stopp codon undertrykkelse. HEK293 celler er co transfekterte med to plasmider i nærvær av ncAA. En plasmider koder for ønsket ncAARS og suppressor-tRNA. Den andre plasmider koder for EGFP genet bærer en TAG stopp codon hos en ettergivende sammen med en mCherry-kontroll. To dager etter hva, de grønne og røde fluorescensen av hele celler lysates måles i en plate-leser. Som EGFP N-segmentet oppstrøms stopp codon (grå) ikke er fluorescerende, avkastningen av full lengde EGFP (grønn) direkte korrelerer til effektiviteten til ncAA innlemmelse, mens mCherry (rød) gir en uavhengig referanse for normalisering. Effektiviteten av ortogonale systemet er gitt av forholdet mellom mengden av EGFP innhentet via stopp codon undertrykkelse og mengden av vill-type EGFP ved vanlig oversettelse (ingen rav undertrykkelse). Figuren endres fra Serfling, R. & mynt, jeg; Innlemmelse av unaturlig aminosyrer i proteiner uttrykt i pattedyrceller, metoder i Enzymology, 2016, 580, 89-107. 29 reproduksjon var tillatt av Copyright klaring senter av Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant programmer til fluorescens analysen. (A) Screening av tRNAPyl varianter30. HEK293 celler var co transfekterte reporter plasmider og plasmider koding for MbPylRS/tRNA par (en kopi tRNA). Stolper representerer den relative fluorescensen av EGFP fra inkorporering av Lys(Boc) sammenlignet med vill-type EGFP. (B) vurderer påvirkning av codon bruk for ncAARS tilblivelse. (venstre panel) Fluorescens analysen av celler transfekterte med to forskjellige genet varianter av E2AziRS. (1) codon bruk fra E. coli og (2) humanized genet. (høyre panel) Western blot analyse av CRF1R95Azi-flagg. Full lengde reseptoren oppdages av en anti-flagg antistoff. Utgangen β ble brukt som laster inn kontroll. (C) vurdere innlemmelse effektiviteten av tre ncAAs designet for bioorthogonal kjemi. (venstre panel) Strukturer av ncAAs i dette eksperimentet. (1) LysZ, som ble brukt som positive kontroll, (2) BCNK, (3) TCO * K og (4) SCOK. (sentrale panel) Fluorescens analysen av HEK293 celler transfekterte med en plasmider koding for MbPylRSAF og fire kopier av tRNA15 fra (A) for å innlemme (1), (2) (3) og (4). (høyre panel) Western blot analyse av en CRF1R-flagg mutant bærer en av de fire ncAAs i posisjon 95. Utgangen β ble brukt som laster inn kontroll. Panelet A var tilpasset fra Serfling, R. et al. Designer tRNAs for effektiv innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer av pyrrolysine systemet i pattedyrceller nukleinsyrer disponible 46 (1), 1-10 (2018) og gjengis etter Creative Commons Attribution-lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Skjematisk fremstilling av Azi-mediert Foto-crosslinking tilordningen. En foto-activatable azido funksjon (gul stjerne) plasseres i en definert posisjon innenfor reseptoren (grå). Når gruppen azido ligger proksimale til bundne ligand (rød), et kovalente crosslinking produkt er dannet på UV bestråling (gul sirkel angir crosslinking området). Innlemmelse av gruppen azido i forskjellige posisjoner på reseptoren avslører bindende overflaten (lilla) av ligand, som representerer binding lomme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Innlemmelse av Azi gjennom CRF1R for foto-crosslinking tilordning av binding lomme. (A) sammenligning av uttrykket Azi-CRF1R-flagg mutanter mot vill-type reseptor. Azi innlemmelse områder distribueres gjennom hele reseptoren som vist i den øverste raden. Anti-flagg vestlige blots av hele celler lysates vises. Utgangen β ble brukt som laster inn kontroll. (B) vestlige blots analysert med enten anti-CRF eller anti-Ucn1 antistoffer vises. Rester erstattet av Azi vises i den øverste raden. Cellene ble inkubert med ligander oppført til høyre etterfulgt av UV irradiation 365 nm og lyse. Prøvene ble løst på 10% SDS-side, deglycosylated bruker PNGase F og analyseres av vestlige blotting. Deglycosylated ligand-CRF1R komplekset kjører en tilsynelatende MW ~ 40 kDa33. Ikke-krysskoblet ligand er ikke oppdaget (MW ~ 3-4 kDa). Begge paneler av dette tallet har blitt endret fra Seidel, L. et al. Structural innsikt aktivering av en klasse B G-protein-kombinert reseptor av peptidhormonene i levende menneskelige celler. Liv. 6 10.7554/eLife.27711 og er gjengitt i henhold til Creative Commons Attribution-lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Avtrykk peptid agonister og antagonister i klassen B GPCR CRF1R. Overflaten representasjon av CRF1R transmembrane domenet. Plasseringen av CRF1R at krysskoblet ligand når erstattet av Azi er uthevet. Fotavtrykk av peptid agonister CRF og Ucn1 er uthevet i magenta fotavtrykk av antagonister CRF (9-41) og Ucn1(8-40) i blått. Fotavtrykk av antagonist dFXCRF(12-41) er markert med oransje. De syv transmembrane helikser jeg VII angis av romerske tall. (A, B) Visninger av bindende lommen fra membranen flyet. (C) sett ovenfra i bindingen lommen fra ekstracellulære side. Gjengitt fra Seidel, L. et al. Structural innsikt aktivering av en klasse B G-protein-kombinert reseptor av peptidhormonene i levende menneskelige celler. Liv. 6 10.7554/eLife.27711 og er gjengitt i henhold til Creative Commons Attribution-lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : SPIEDAC merking av CRF1R på levende celler. (A) reaksjon ordningen belastning forfremmet omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition (SPIEDAC): gruppen trans-cyclo-2-octene i ncAA TCO * K reagerer med gruppen tetrazine koblet til fluorophore Cy3. (B, C) HEK293T celler uttrykke CRF1R95TCO * K- EGFP. Representant bilder av grønn, rød og blå kanalen. Baren skala er 10 µm. (B) celler ble behandlet med tetrazine-Cy3 (1,5 µM) i 5 min. Bare celler uttrykke reseptoren (grønn) viser forekomsten av merking (rød). (C) celler ble behandlet med 200 nM Ucn1 og fotografert etter 15 min. intracellulær blemmer tilsvarer internalisert reseptoren. Paneler B og C er endret fra Serfling, R. et al. Designer tRNAs for effektiv innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer av pyrrolysine systemet i pattedyrceller Nukleinsyre disponible 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) og er gjengitt i henhold til Creative Commons Attribution-lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskriver en enkel og pålitelig analysen for å vurdere effektiviteten av ortogonale for inkorporering av ncAAs proteiner i pattedyrceller. Den største fordelen med denne metoden gjelder brukte analyser basert på FACS er at det tillater samtidig forberedelse og måling av større antall prøver, og gir data som analyseres enkelt ved hjelp av en vanlig programvare. Tilgjengeligheten av en medium gjennomstrømming metode for å analysere ortogonale par i pattedyrceller er svært viktig for utviklingen av nye ortogonale parene og forbedring av eksisterende. Faktisk, det er ikke mulig å utføre regissert evolusjon via generasjonen av ortogonale store tilfeldig biblioteker og døde/levende utvalg i pattedyr systemer. Analysen kan screening liten størrelse biblioteker (hundrevis av medlemmer) ved å investere en rimelig eksperimentelle innsats innen relativt kort tid. Ved screening rasjonelt designet tRNA apparater via denne analysen, kan vi generere romanen tRNAs som betydelig øke effektiviteten av pyrrolysine systemet30. Klassisk kombinasjonen EGFP/mCherry brukes for fluorescerende lese-ut, der EGFP fungerer som reporter innlemmelse effektivitet og mCherry som internkontroll. EGFP reporter og kontrollen mCherry er skjult i de samme plasmider, men er innebygd i to separat uttrykk kassetter med to uavhengige arrangører. På denne måten mCherry uttrykk gjelder transfection effektivitet og celletall, men er uavhengig av EGFP uttrykk, slik at den målte grønne fluorescensen kan normaliseres til den røde fluorescensen. Dette er ikke akkurat ved andre journalister bygget som en tandem av to proteiner som EGFP-TAG-mCherry7 og iRFP-GFPY39TAG (med iRFP viser infrarøde fluorescerende protein)52. I slike konstruksjoner er begge proteiner på samme mRNA transkripsjon. I eukaryoter gjennomgå mRNAs bærer tidlig stopp kodon overvåking og nedbrytning av nonsense formidlet decay (NMD) mekanisme53. Derfor både sekvensen av reporteren og kontroll samtidig forringet, og uttrykk for de to genene er ikke strengt uavhengig. Lignende analyser basert på en luciferase reporter i stedet for fluorescens reporter har blitt beskrevet av andre54,55. Mens enzymatisk luminescence tilbyr høyere følsomhet fluorescens målene, viste sistnevnte høyere reproduserbarhet mellom ulike celle bunker.

Robuste systemer for ncAA innlemmelse i pattedyrceller er helt nødvendig når du arbeider med krevende protein mål som membran proteiner og lav rikelig proteiner. Vi har vist her en optimalisert ortogonale par for robust innlemmelse av foto-activatable ncAA Azi i GPCRs. Systemet gir homogen Azi innlemmelse priser gjennom hele reseptoren som gir systematisk Foto-crosslinking tilordningen av hele GPCR overflater og identifisering av ligand binding nettsteder. De to viktigste punktene styrke av metoden er at ulike ligander kan analyseres på samme reseptoren parallelt og at dataene er avledet fra reseptoren i live cellen som utfyller informasjon innhentet fra i vitro tilnærminger. Metoden er i prinsippet gjelder for alle protein mål, og er også for kart topologier av protein-protein interaksjoner. Videre kan identifiserte delsettet med krysskoblet posisjoner videre bli analysert med 2D crosslinking å pin-punkt intermolekylære par proksimale aminosyrer i tilknyttede komplekse33,38. Slike aminosyre par gir romlige begrensninger som brukes i sili eksperimenter å bygge nøyaktige molekylær modeller av samhandling33,38. Fra metodisk synspunkt er det verdt å bemerke at bare positive resultater fra crosslinking eksperimenter bør vurderes. En posisjon som gjorde ikke krysskobling kan fortsatt være i kritiske radius fra ligand. Feilaktige negativer kan oppstå når mutasjon introdusert av crosslinker hemmer innfødt interaksjon, men kan også forekomme når crosslinking moiety enten poeng fra ligand, er slukket av løsemiddelet eller gjennomgår intramolekylære crosslinking. En viktig del av metoden er å oppdage forekomsten av crosslinking. I første omgang, løses hele celler lysates på SDS-siden for å skille en ligand som covalently ikke er bundet til reseptoren. Andre registreres kovalente ligand-reseptor komplekset via Western blotting bruker et anti-ligand antistoff. For peptid ligander er høy affinitet polyklonale antistoffer reist mot ligand det optimale valget. Alternativt kan peptid ligander være utstyrt med et flagg-merke på en ettergivende posisjon, forutsatt at koden er gjort tilgjengelig for anti-flagg antistoffer gjennom en passende avstand. Biotin koder kan også brukes, selv om resultatene kan være vanskelige å tolke på grunn av bakgrunnen av endogene biotinylated proteiner. Små molekyl ligander er vanligvis radiolabeled, selv om ID-merking kan også være mulig56,57. Protokoller for Azi inkorporering GPCRs publisert også av andre57,58,59. Men disse protokollene involverer bruk av tre plasmider for Azi innlemmelse, mens vi bruker en enklere to-plasmider system, inkludert et humanized gen for E2AziRS, som gir bedre resultat med hensyn til den ikke-codon-optimalisert en (figur 2B).

Moderne mikroskopi teknikker krever installere svært lyse og effektiv fluorophores i protein av interesse, som genetisk kodet protein fluorophores som den klassiske EGFP ikke er egnet for avanserte programmer. Derfor er det en kontinuerlig etterspørsel av metoder som gjør installere organisk fluorophores på proteiner, noe som har ført til utviklingen av den populære SNAPIN60 og Halo61 koder, mellom andre. Men har slike koder fortsatt en størrelse på flere kDa, som kan forurolige funksjonen av protein mål og la ganske stor usikkerhet om den nøyaktige plasseringen til fluorophore. Med størrelsen av noen aminosyrer representerer tetracysteine motivet en mindre alternativ for mer nøyaktig merking med fluorescein eller resorufin arsenical forbindelser (FlAsH, ReAsH)62,63. Selv om denne tilnærmingen er brukt svært vellykket også til GPCR studier64,65,66, det krever omfattende vask trinn med thiols, den lider ofte høye, og i alle fall tillater ikke posisjonering etiketten med enkelt rester løsning. I stedet tilby ncAAs utstyrt med bioorthogonal ankere mulighet å installere fluorescerende etiketter på en enkelt aminosyre posisjon, således minimere risikoen for konflikt med det opprinnelige konformasjon og funksjonaliteten av målet protein. Siste generasjons ncAAs for bioorthogonal kjemi, liker TCO * K13 ansatt her, har aktivert protein merking på lever celler17,43. Metoden gjelder protein mål på cellens overflate, men også på intracellulær mål, forutsatt at egnet cellen-permeable fargestoffer er tilgjengelig17,67,68. Staudinger Bertozzi ligations på azide forankrer2,13SPIEDAC kjemi er flere størrelsesordener raskere i forhold til belastningen forfremmet azido-alkyne cycloaddition (SPAAC). Faktisk, er flere protokoller publisert for GPCR merking på genetisk innlemmet Azi, men de gjelder bare for isolerte GPCRs i vitro37,59,69. I stedet vi har vist her glatt bioorthogonal merking av funksjonelle GPCRs live-cellen. Våre protokollen ligner på eksisterende protokoller bruker samme kjemi43,48,70, men optimalisert ncAA innlemmelse systemet utvider rekkevidden til metoden GPCR studier. Et viktig skritt i den eksperimentelle prosedyren er valget av plasseringen skal utveksles med TCO * K, som ikke alle stillinger i reseptoren er ettergivende en erstatning eller tilgjengelig til fluorescerende farge. Derfor bør flere stillinger testes en foreløpig skjermen for å finne den mest passende.

I konklusjonen, presenterer dette arbeidet verktøy for generell søknad av ncAAs, inkludert program utfordrende protein mål som GPCRs. Vi forventer at Foto-crosslinking kartlegging og bioorthogonal merking, i dag den viktigste anvendelser av ncAAs til GPCR studier, vil finne mange fremtidige programmer både å avsløre topologier av GPCR vekselsvirkningene med ligander eller andre proteiner og studere GPCR strukturelle dynamikk i live-cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet er grunnlagt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under tilskudd CO822/2-1 (Emmy-Noether program) og CO822/3-1 til IC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114, (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844, (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38, (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7, (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126, (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132, (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134, (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136, (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128, (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13, (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4, (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134, (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128, (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135, (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131, (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4, (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131, (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13, (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136, (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30, (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3, (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10, (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155, (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117, (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7, (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292, (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289, (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10, (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32, (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49, (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5, (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136, (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283, (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19, (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3, (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2, (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531, (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531, (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137, (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22, (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics