Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

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Chemistry

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Summary

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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Abstract

A incorporação genética de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) através da supressão de códon de parada âmbar é uma técnica poderosa para instalar sondas artificiais e partes reativas para proteínas diretamente na célula viva. Cada ncAA é constituída por um dedicado ortogonais supressor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) par que é importado para o organismo hospedeiro. A eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode extremamente diferentes e insatisfatória, em alguns casos. Ortogonais pares podem ser melhoradas através da manipulação ou da raa ou o tRNA. No entanto, evolução dirigida de tRNA ou AARS usando grandes bibliotecas e métodos de seleção mortos/vivos não são viáveis em células de mamíferos. Aqui, apresenta-se um ensaio facile e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência de pares ortogonais em células de mamíferos. O ensaio permite a seleção de dezenas a centenas de variantes de RAA/tRNA com um esforço moderado e dentro de um prazo razoável. Uso deste teste para gerar novos tRNAs que melhoram significativamente a eficiência do sistema ortogonal Pirrolisina é descrito, juntamente com a aplicação de ncAAs ao estudo da proteína G acoplados receptores (GPCRs), que são difíceis de objetos para o ncAA mutagênese. Em primeiro lugar, incorporando sistematicamente uma foto-reticulação ncAA em toda a superfície extracelular de um receptor, locais obrigatórios de ligantes diferentes no receptor intacto são mapeados diretamente na célula viva. Segundo, incorporando ncAAs de última geração para um GPCR, ultra rápida do receptor livre de catalisador etiquetando com uma tintura fluorescente é demonstrado, que explora o opaco promovido a tensão inversa Diels-Alder cicloadição (SPIEDAC) sobre a célula viva. Como ncAAs pode geralmente ser aplicado para qualquer proteína, independentemente de seu tamanho, o método é de interesse geral para um número de aplicações. Além disso, a incorporação de ncAA não exige qualquer equipamento especial e é facilmente realizada em laboratórios de bioquímica padrão.

Introduction

A incorporação genética de sondas químicas em proteínas é um método poderoso para facilitar a investigação dos aspectos estruturais e dinâmicos da função da proteína diretamente no contexto nativo da célula ao vivo. Hoje em dia, centenas de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) equipados com os mais diferentes grupos químicos podem ser site-specifically incorporadas em proteínas de biossíntese1,2,3,4. Entre eles, reencontra-se foto-sensível ncAAs como crosslinkers-foto5, foto-enjaulado6,7,8,9 e foto-comutável aminoácidos10, 11, ácidos aminados, tendo tensas alcenos e alcinos por catalizador-livre opaco química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos carregando dansyl18, cumarina9,19e prodan20,21 fluorophores e aminoácidos equipados com outras sondas biofísicas como bem como com post modificações translacionais1,2,3,4,22,23,24,25.

A codificação genética de um ncAA é ativada por um dedicado amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) emparelhado com um supressor-tRNA cognato, que incorpora a ncAA em resposta a um codão stop âmbar durante a síntese ribossomal regular. pares de ncAARS/tRNA são projetados para serem ortogonais no organismo hospedeiro, ou seja, não a Cruz-conversa com os pares endógenos. A técnica é bem estabelecida, tanto em procariontes e eucariontes hospedeiros e células facilmente aplicáveis aos mamíferos. Pares para a incorporação da ncAA em células de mamíferos são baseados em três principais sistemas ortogonais: sistema de correntes, que combina o TyrRS de e. coli26 com um supressor de correntes âmbar de b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / par deBstYam), o sistema (parCELeuRS/tRNALeuCUA ) Escherichia coli de leucyl6,18,28 e o sistema de pyrrolysyl de Archaea (PylRS/tRNA Pyl par)3, pelo qual o tRNAPyl é um supressor natural de âmbar. Em geral, cada ncAA é reconhecido por um ncAARS especializado. Dependendo da estrutura do ncAA, a ncAARS é obtido através de uma evolução dirigida de LeuRS, TyrRS ou PylRS, embora algumas sintetases podem aceitar mais de um ncAA.

O par ortogonal é importado para as células simplesmente usando um vetor do plasmídeo. Mais comuns e eficientes plasmídeos são bicistronic e codificam para a sintetase e o tRNA formando o par ortogonais29. Um plasmídeo segundo a codificação da proteína de interesse, tendo um códon âmbar no local designado para a modificação é co transfectada. O ncAA é simplesmente adicionado ao meio de crescimento de célula. No entanto, diferentes grupos especializados muitas vezes usam diferentes variantes do plasmídeo construções mesmo para a incorporação do ncAA mesmo. Construções diferem no arranjo dos genes no vetor, tipo da sintetase, uso de códon no gene da sintetase, uso do promotor, variante do tRNA e número de fitas de expressão do tRNA. Além disso, a eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode variar drasticamente devido a eficiência catalítica diferente dos sintetases diferentes, a qualidade do tRNA e outros fatores30. Portanto, é importante ter à mão um método rápido e confiável para avaliar a eficiência de um par de ortogonal, para escolher o sistema mais adequado para uma aplicação desejada e para executar algumas etapas de otimização que melhoram a expressão de proteínas totais rendimentos.

Nós estabelecemos um ensaio simples e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência dos pares ortogonais29 (Figura 1). No ensaio, as células são co transfectadas com o plasmídeo de codificação para o par ortogonal, juntamente com um plasmídeo do repórter bicistronic codificação tanto para a proteína verde fluorescente, tendo um códon âmbar parada em uma posição permissiva (EGFPTAG) e o gene mCherry. Vermelha e verde fluorescência da célula inteira lysates são lidos em canais separados em um leitor de placa em uma placa de 96 poços. A intensidade da fluorescência verde correlaciona diretamente com a eficiência da supressão de âmbar, Considerando que a intensidade da fluorescência vermelha dá uma estimativa direta do tamanho da amostra medida e a eficiência do transfection. No que diz respeito a ensaios semelhantes baseados em fluorescência assistida célula classificação (FACS) ler31,,32, o ensaio dá uma avaliação imediata e abrangente da expressão da proteína da população celular, que é mais representativo das condições experimentais habituais e oferece uma fácil aquisição de dados e processamento com software padrão. Em geral, a principal vantagem do ensaio é que um meio para um grande número de amostras pode ser analisado em paralelo. Usando este ensaio, tem exibido uma biblioteca racionalmente concebida de supressor-tRNAs para melhorar a eficiência do sistema ortogonal Pyl30. Este trabalho descreve o protocolo experimental para executar este ensaio e mostram exemplos de sua aplicação, incluindo a otimização do par ortogonal para a incorporação da foto-reticulação ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e a comparação de eficiências de incorporação de aminoácidos diferentes (Figura 2).

Nos últimos anos, foram comprovadas ferramentas ncAA muito poderosas para investigar estrutural e aspectos funcionais da proteína G acoplados a receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. em humanos, GPCRs formam uma grande família de receptores de membrana (800 membros) em representam os principais alvos para drogas terapêuticas. Caracterização estrutural direta de GPCRs é ainda um desafio e métodos bioquímicos complementares são altamente necessários para sua investigação. Nós temos pioneira no uso de foto-reticulação ncAAs para mapear as superfícies GPCR e descubra ligante vinculação bolsos34. Usando nosso sistema otimizado para incorporação de Azi, incorporamos sistematicamente Azi em todo o domínio de toda juxtamembrane de um GPCR diretamente em células de mamíferos vivas. Após irradiação UV, Azi forma uma espécie de nitrene altamente reativos que capta covalentemente a moléculas vizinhas. Quando o ligante é adicionado ao sistema, Azi serve como uma sonda de proximidade para revelar quais as posições do receptor vem perto do ligante ligado. Desta forma, o modo de ligação do hormônio neuropeptídeo Urocortin (Ucn1) no receptor da classe B GPCR corticotropin-liberando-fator digito 1 (CRF1R)33 foi primeiramente revelado. Ultimamente, nós temos divulgados padrões distintos de ligação dos agonistas e antagonistas sobre o mesmo receptor38. Uma abordagem semelhante foi aplicada por outros para revelar orthosteric e sítios de ligação alostéricos de outros peptídeos e ligantes pequena molécula em outros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito descreve o protocolo experimental aplicado em nosso laboratório para foto-reticulação mapeamento de superfícies GPCR. O método é relativamente rápido, simples e não requer nenhum equipamento especial, para que seja aplicável em laboratórios de bioquímica padrão. Importante, a abordagem fornece uma ferramenta valiosa não apenas para identificar sites de ligação do ligante onde dados estruturais 3D são escassos, mas também para complementar o existente em vitro dados com informações de receptores post-translationally totalmente modificadas na ambiente fisiológico da célula ao vivo.

O desenvolvimento recente do romance ncAAs rolamento sobre os lado da cadeia grupos químicos apropriados para ultra livre de catalisador opaco química abriu a possibilidade de instalar fluorophores de última geração para a imagem latente de super-resolução nas proteínas diretamente sobre o live células2,43. Tais âncoras químicas incluem cyclooctyne tensa em SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne na BCNK12,17e trans-cyclooctenes no TCO * K13,15,17 , entre outros ncAAs abrigando um norbornene16,17,44 ou,ciclopropeno4546 moiety. NcAAs volumosos para opaco química são incorporados por uma variante do PylRS geralmente denotado como PylRSAF (indicando a mutação Y271A e Y349F em M. barkeri PylRS), bem como por outras ad hoc evoluído ncAARSs17 , 44. as âncoras opaco reagem com reagentes de tetrazine47 via cicloadição de Diels-Alder elétron-demanda inversa para dar altos rendimentos rotulagem dentro de alguns minutos,43,48. No entanto, aplicação desta abordagem poderosa para rótulo GPCRs tem sido desafiador devido a uma baixa eficiência global do sistema ortogonal de incorporação da ncAA. Usando o nosso avançado sistema de Pyl, demonstrámos alto rendimento incorporação de tais aminoácidos GPCRs e ultra rápida GPCR rotulagem na superfície de células de mamífero vivo30recentemente. Rotulado de receptores foram ainda funciona, como eles fisiologicamente internalizado em cima ativando o receptor com um agonista. O protocolo experimental para a incorporação de opaco Ancora em GPCRs e etiquetando as etapas a seguir são descritas aqui. Equipar GPCRs com pequenas fluorophores brilhante é o primeiro passo fundamental para o estudo da dinâmica estrutural GPCR na célula ao vivo através de técnicas avançadas de microscopia.

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Protocol

1. baseado em fluorescência triagem das eficiências de incorporação (Figura 1)

  1. Manter as células HEK293 no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM; alta glicose, glutamina 4mm, piruvato) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 100 de U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2.
  2. As células da semente no dia anterior do transfection.
    1. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL tripsina/EDTA para um prato de 10 cm. Saciar com 10 volumes de meio completo e ressuspender as células pipetando. Conte o número de células em suspensão usando um hemocytometer49.
    2. Semente 6.0 x 105 HEK293 células por poço de placas 6-poços em 2 mL de meio de crescimento completo. Prepare como muitos poços como o número de amostras e dois poços adicionais para o selvagem-tipo EGFP e uma amostra de simulação-transfectadas, respectivamente.
  3. Controlar a confluência (área ocupada pelas células) sob um microscópio. Transfect células na confluência de ~ 70% usando o reagente de polyethyleneimine (PEI).
    1. 1h antes de transfeccao, adicionar a quantidade apropriada da solução recentemente preparada ncAA todos os poços para uma concentração final de ncAA de 0,25-0,5 mM. Adicione o ncAA a todos os poços, incluindo o controlo positivo do selvagem-tipo e células transfectadas de simulação, para evitar que as diferenças em sinais de fluorescência que podem ser causadas pelos efeitos do ncAA no crescimento celular.
      Nota: Para preparar as soluções, dissolver o ncAA para 0.1-0.5 M usando 0.2-0.5 M de NaOH. No entanto, alguns ncAAs podem exigir inicial solubilização em DMSO e/ou neutralização por quatro volumes de 1m HEPES (pH 7,4) antes do uso. Comumente, o fabricante recomenda um protocolo para preparar uma solução de reserva.
    2. Em um tubo de microcentrifugadora, misture 1 µ g de Plasmideo DNA codificação para o par de ncAARS/tRNA para ser testado com 1 µ g de repórter do DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). Em tubos separados, prepare um idêntico transfeccao usando a referência de tipo selvagem EGFP e um simulado transfeccao.
      Nota: Número de cópias da fita tRNA incorporado na codificação do plasmídeo para o par de ncAARS/tRNA depende da aplicação. Para facilitar a clonagem, 1 cópia de tRNA é recomendada quando o rastreio tRNAs diferentes, Considerando que 4 cópias são recomendadas (embora não estritamente necessário) quando ncAARS diferentes testes ou a incorporação de diferentes ncAAs pelo mesmo par ortogonal.
    3. Para cada tubo contendo DNA adicionar 100 µ l de solução salina tamponada (LBS) contendo lactato de sódio 20 mM no pH 4.0 e 150 mM NaCl de lactato. Misture rapidamente.
    4. A cada tubo contendo o DNA em LBS adicionar 6 µ l de 1 µ g / µ l PEI em LBS (relação PEI/DNA = 3/1 w/w) e vortex imediatamente. Incube a RT por 10-15 min.
    5. Pegue meio de celular 400 µ l de cada poço e adicioná-lo à mistura de DNA-PEI para neutralizar o pH. Drible a mistura de ADN em células.
      Nota: DMEM geralmente contém vermelho de fenol como indicador de pH. Durante a etapa de neutralização, a cor da mistura adicionada no tubo mudará de amarelo (ácido) para vermelho (neutro). Embora formar os complexos de DNA em libras em pH ácido dá o mais alto de rendimentos do transfection50, complexos DNA-PEI alternativamente podem ser formados diretamente no pH 7,4 (por exemplo em DMEM isento de soro). Se usando DMEM para formar complexos de DNA, ignore a etapa de neutralização 1.3.5. Em qualquer caso, é essencial que não soro está presente na mistura quando formando os complexos.
  4. Colheita do pós-transfection 48 h de células.
    1. Aspire o meio e lave-as células uma vez com 2 mL de PBS pré-aquecido (37 ° C). Acrescente 800 µ l de PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA e incube por 20 min a 37 ° C. Desanexar e suspender as células pipetando para cima e para baixo.
    2. Transferi a suspensão de eritrócitos para tubos de 1,5 mL contendo 200 µ l PBS suplementado com 5 mM de MgCl2.
    3. Centrifugar por 2min a 800 x g e descartar o sobrenadante.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Neste caso, congelam as pelotas no líquido N2 e armazenar a-80 ° C por até um mês. Use sempre óculos de proteção de olho.
  5. Juntar 100 µ l tampão de Lise Tris (pH 50 mM Tris-HCl 8.0, 150 mM de NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA e recém adicionado PMSF) para as pelotas de célula e incubar no gelo por 30 min. Para facilitar a Lise, vórtice cada 5 min.
  6. Spin para baixo os detritos celulares durante 10 minutos a 4 ° C e 14.000 x g e transferir 90 µ l do sobrenadante para pretas placas de 96 poços. Medir a fluorescência EGFP e mCherry usando um leitor de placa equipado com um módulo de fluorescência.
    Nota: Use filtros de excitação e emissão apropriados para EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) e mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Valores medidos EGFP irão abranger um intervalo entre o valor mínimo obtidos de células transfectadas de simulação e um valor máximo, que normalmente é obtido do selvagem-tipo EGFP. Cuida-se de configurar a janela de medição correta no instrumento.
  7. A eficiência da incorporação de ncAA é calculada como o rácio entre a fluorescência da amostra e a fluorescência obtidos de expressão do selvagem-tipo EGFP. Todos os valores são normalizados para fluorescência de mCherry.
    Equation 1

2. genética incorporação de ncAAs GPCRs para foto-reticulação mapeamento de ligante-GPCR interações (Figura 3)

  1. Manter HEK293T células em DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2.
  2. Células da semente no dia anterior do transfection.
    1. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL tripsina/EDTA para um prato de 10 cm. Saciar com 10 volumes de meio completo e ressuspender as células pipetando para cima e para baixo. Conte o número de células em suspensão usando um hemocytometer49.
    2. Semente 5.0 x 105 293T células por poço em 2 mL de meio de crescimento completo em placas 6-boas. Para cada posição será projectado, prepare 1 bem por ligante mais um bem para o controle de vinculação33,38. Um extra bem a transfected com o receptor do selvagem-tipo (wt) pode ser incluído para verificar o nível de expressão do mutante.
  3. No dia seguinte, controlar confluência (área ocupada pelas células) sob um microscópio. Transfect células na confluência de ~ 70% usando o PEI.
    1. 1h antes de transfeccao, adicionar Azi todos os poços a uma concentração final de 0.5 mM.
      1. Prepare uma solução stock de 0,5 M de Azi. Por placa de 6, pesa 1,2 mg Azi num tubo e dissolvê-lo em 15 µ l 0,5 M NaOH. Diluir a solução-mãe no meio completo de 1,2 mL e adicionar 200 µ l da mistura para cada poço.
        Nota: Prepare uma solução fresca de Azi para cada experimento. A fracção de azida tem uma meia-vida curta em soluções aquosas, especialmente em pH básico, e o AziRS incorpora a intacta, mas também a forma degradada.
    2. Transfect um montante total de 2 µ g DNA por alvéolo: 1 µ g de plasmídeo codificação para GPCR bandeira-marcados tendo um codão TAG na posição desejada e 1 µ g da codificação para o ortogonal par dedicado a Azi (E2AziRS51 e 4 cópias do cognato plasmídeo supressor-tRNA BstYam)33,38.
      Nota: Quando acompanhadas de uma comparação de wt para verificar os níveis de expressão, transfect uma menor quantidade de ADN do plasmídeo para o receptor do wt. Dependendo do GPCR, 0,2-0,5 µ g de plasmídeo codificação os níveis semelhantes de wt receptor rendimento como 1,0 µ g do plasmídeo mutante. Transfect a mesma quantidade de DNA em todos os poços, enchendo o DNA faltando com um mock (por exemplo, um vetor vazio).
    3. Proceda como descrito em 1.3.3-1.3.5.
    4. pós-transfeccao 48 h, prossiga com passo 2.4 para foto-reticulação de ligantes ou vá para a etapa 2.5 para colheita directa e análise para verificar a expressão do receptor.
  4. Foto-reticulação do ligante.
    1. Prepare uma solução stock de ligante de 1.000 x. Dissolva o ligante de peptídeo em uma concentração de 100 µM em DMSO.
      Nota: A concentração de ligante depende da constante de dissociação KD da interação ligante-GPCR. Uma concentração final de 100 x KD é recomendável. Se o ligante de peptídeo é um sal de ácido trifluoroacético (TFA), considere o peso do TFA quando o cálculo do peso molecular (1 x TFA por aminoácidos básicos em peptide). Além disso, considere que os peptídeos são em geral higroscópico. Evitar repetido congelamento de pó do peptide e nunca abrir um contêiner de peptídeo até que não chegou a temperatura ambiente.
    2. Diluir o 1:1,000 de solução estoque de ligante em tampão de ligação consiste em 0,1% BSA, 0,01% Triton X 100, 5 mM MgCl2 no tampão HEPES de dissociação (HDB) contendo ácido de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 12,5 mM 4 (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM de NaCl e 5 mM KCl. preparar 1 mL por mutante Azi-GPCR. Substitua o meio celular com 1 mL da solução de ligante. Incubar durante 10 minutos a RT.
      Nota: Ajuste o tempo de incubação para GPCR específico, contabilidade para internalização de cinética e receptor ligante. Prolongar o tempo de incubação não melhora rendimentos de reticulação.
    3. A irradiação das amostras por 20 min em uma crosslinker UV a 365 nm, com 5 x 8 W tubos e ~ 5 cm de distância para as células. Separar as células pipetando e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL. As células para 3 min a 800 x g de pelotas e descartar o sobrenadante.
    4. Dissolva um comprimido de inibidor da protease (PI) cocktail em 1 mL 25 mM EDTA/H2O, tornar-se uma solução stock de 50x. Alíquota do PI solução e armazená-lo a-20 ° C. Diluir o estoque 50 x 01:25 em HDB e ressuspender as pelotas de célula em 50 µ l de 2 x PI em HDB. Congelar as células no líquido N2.
      Nota: Use óculos de proteção de olho. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C por até um mês. Prossiga com a etapa 2.6.
  5. Colheita da pilha direto.
    1. Aspire o meio. Adicione 800 µ l de 0,5 mM EDTA em HDB. Incube durante 10 min no RT ou no gelo.
    2. Separar as células pipetando para cima e para baixo e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de 5 mM MgCl2 em HDB. As células para 3 min a 800 x g de pelotas e descartar o sobrenadante.
    3. Resuspenda as pelotas de célula em 50 µ l de 2 x PI em HDB e congelamento flash em líquido N2. Use óculos de proteção de olho.
      Nota: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C por até 1 mês.
  6. Lise celular.
    1. Descongele as células em um banho-maria a 37 ° C por 30-45 s e vórtice brevemente. Não deixar amostras de agora em diante. Membranas de pelota em 2.500 x g e 4 ° C por 10 min. desprezar o sobrenadante, que contém a maior parte das proteínas citosólica.
    2. Resuspenda as pelotas em tampão de Lise HEPES 50 µ l contendo pH 50mm HEPES-HCl 7.5, 150 mM NaCl, glicerol 10%, 1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 1mm EGTA, 1 milímetro DTT e recém adicionado 2 x PI cocktail. Misture bem. Lise as células 30 min no gelo e vórtice cada 5 min.
    3. Spin para baixo os detritos celulares por 10 min a 14.000 x g e 4 ° C. Imediatamente transferi o sobrenadante para um tubo de reação fresca.
      Nota: Prosseguir com a análise agora mesmo. Os lysates podem ser armazenados a-20 ° C, no entanto, a cada ciclo de congelamento-descongelamento prejudica a qualidade dos resultados.
  7. Análise ocidental do borrão.
    1. Para preparar a amostra, tomar 3 a 5 µ l lisado e preenchê-lo até 7 µ l com H2O. adicionar 2 µ l 1 M DTT e amortecedor da amostra 4 x 3 µ l contendo pH 63 mM Tris-HCl 6,8, SDS 2%, 10% de glicerol e 0,04% bromofenol azul. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
    2. Quando GPCR é glicosilados e bandas de desmaio ou borradas são um problema, amostras de deglycosylate com PNGase F para aumentar a intensidade do sinal e aguçar as bandas. Use 3-5 µ l lisado e deglycosylate em um volume total de 10 µ l, seguindo o protocolo do fornecedor. Adicione 3 µ l 4 x amortecedor da amostra.
      Nota: Proteínas da membrana são frequentemente glicosilados em vários sites e Estados-Membros, o que prejudica a qualidade da resolução em análise de SDS-PAGE. No entanto, que não deglycosylate as amostras para análise do nível de expressão dos mutantes Azi-GPCR usando anticorpos antibandeira, porque é relevante para avaliar a parte o totalmente glicosilados, maduro do receptor na superfície da célula.
    3. Resolver as amostras através de SDS-PAGE padrão e borre a transferência de proteínas para uma membrana PVDF.
      Atenção: Acrilamida é neurotóxica. Use luvas e óculos de proteção.
    4. Bloquear a membrana para 1h no RT ou durante a noite a 4 ° C em 5% leite em pH de 20 mM Tris-HCl contendo TBS-T 7.4, 0.15 M NaCl e 0.1% Tween 20.
    5. Sonda a membrana com um anticorpo antiligante seguido o anticorpo secundário conjugado HRP. Entre lavar com TBS-T. Para detectar o nível de expressão do Azi-GPCR, sonda a membrana com um anticorpo HRP comercial (ver Tabela de materiais).
    6. Realizar a reação de quimioluminescência reforçada (ECL) usando o reagente de ECL caseiro e detectar sinais por 5 min no escuro.

3. ultra rápido opaco rotulagem dos GPCRs em células de mamíferos vivas

Nota: O protocolo é otimizado para as lamelas septadas 4-bem (área bem = 2,2 cm2). Para tamanhos bem diferentes, o protocolo deve ser dimensionado em conformidade.

  1. Revestimento de superfície de lâminas de microscópio. Realizar todo o processo sob uma capa de estéril.
    1. Preparar um hydrobromide poli-D-lisina (MW = 500-550 kDa) solução-mãe (PDL) a uma concentração de 1 mg/mL de tampão de borato de 50 mM (pH 8,5). Armazenar a 4 ° C por até 6 meses. Não congele.
    2. Diluir o PDL solução estoque 01:40 em água ultra-pura estéril para uma concentração final de 25 µ g/mL (solução de trabalho) e, em seguida, filtrar a solução através de um filtro de 0,22 µm estéril.
      Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C por até 3 meses.
    3. Cobrir totalmente o fundo de cada poço do slide microscopia com 500 µ l de solução de trabalho de PDL. Incubar durante 20 min em RT e aspirar a solução de trabalho de PDL.
      Nota: A solução de trabalho de PDL pode ser usada até três vezes. Se a solução precisa ser reutilizado, transferência da solução das lâminas revestidas de para um tubo estéril de fresco e rotular o tubo adequadamente. Nunca misture a solução reciclada com solução fresca.
    4. Lave cada bem 3x com ~ 700 µ l água ultra-pura estéril e deixar secar pelo menos 1 h.
      Nota: É muito importante lavar os poços com precisão, como resíduos da solução PDL são tóxicos para as células. As lâminas revestidas podem ser usadas imediatamente para microscopia ou armazenadas por até uma semana, a 4 ° C.
  2. Manter HEK293T células em DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO2.
  3. Células da semente no dia anterior do transfection.
    1. Separe as células por 5 min a 37 ° C em 0.05% tripsina/PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL tripsina/EDTA para um prato de 10 cm. Saciar com 10 volumes de meio completo e ressuspender as células pipetando. Conte o número de células em suspensão usando um hemocytometer49.
    2. Semente de 1,0 x 105 HEK293T células por poço (área 2,2 cm ²) em 600 µ l corante livre DMEM completa.
      Nota: Para fins de geração de imagens, é muito conveniente trabalhar desde o início em um meio que não contenha qualquer corante. Corante livre DMEM formulações estão disponíveis comercialmente.
  4. Controlar a confluência (área ocupada pelas células) sob um microscópio e transfect as células na confluência de ~ 70% usando um reagente de transfeccao baseada em lipídios.
    1. 1 h antes de transfeccao, prepare uma solução stock de 100mm fresco de TCO * K em 0,2 M de NaOH e DMSO 15% (v/v).
    2. Por bem, misturar 3 µ l do TCO * K solução estoque com 12 µ l de 1m pH HEPES 7,4. Adicionar a solução suavemente nos poços para um TCO final * K concentração de 0,5 mM.
    3. Prepare um montante total de 500 ng DNA por bem. Em um tubo de microcentrifugadora, diluir 200 ng de pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng de codificação para a MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonais par o plasmídeo (quatro fitas de tRNAM15) e 100 ng de pcDNA3.1_Arrestin3 plasmídeo no meio de 50 µ l (corante livre, livre de soro, antibiótico livre).
      Nota: Em geral, co transfeccao de Arrestin não é necessário observar a internalização GPCR. No entanto, co transfecting Arrestin3 acelera internalização da CRF1R, que é muito conveniente quando analisando a internalização de muitos mutantes.
    4. Diluir a 1,25 µ l do reagente de transfeccao baseada em lipídios (2,5 µ l por 1 µ g de DNA) no meio de 50 µ l (corante livre, livre de soro, antibiótico gratuito) e adicionar a solução para a mistura de DNA. Vórtice imediatamente e incubar 5-10 min a complexos de RT. Add DNA-lipídica para as células.
      Nota: Em nossa experiência, a morfologia das células transfectadas usando transfeccao baseada em lipídios parece mais fisiológica em comparação com o de células transfectadas com PEI. Como PEI dá maior eficiência de transfeccao, PEI deve ser preferido para aplicações a jusante como borrão ocidental, considerando transfeccao baseada em lipídios é uma escolha melhor para transfect células para experimentos de imagem.
  5. rótulo de transfeccao pós, 24 h o receptor com corantes fluorescentes.
    1. Prepare uma solução stock de corante-tetrazine de 0,5 mM em DMSO e um 10 mg/mL de DNA solução corante de coloração em ultra-pura H2O.
    2. Transferi o meio de 100 µ l de cada poço em um tubo de reação de 1,5 mL. Adicione 1,8 µ l da solução corante-tetrazine e 0,3 µ l do DNA solução corante de coloração. Transferir o meio contendo os corantes para o bem e incubar durante 5 min a 37 ° C.
      Nota: Tetrazine-laranja-fluorescente tintura tem uma concentração final de 1,5 µM.
    3. Aspire o meio e lave delicadamente as células duas vezes com PBS para remover o excesso de corante. Adicionar 600 µ l de tintura completa médio de crescimento livre pré-aquecido a 37 ° C.
  6. Internalização de microscopia e receptor de fluorescência.
    1. Visualizar os receptores etiquetados abaixo dos 63 x (ou similar) ampliação usando filtros adequados para as boas práticas agrícolas (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), tintura de laranja-fluorescente (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) e DNA coloração tintura (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Tire uma foto com cada filtro antes de ativar o receptor.
    2. Promover a internalização do receptor usando 200 nM de Ucn1.
      1. Prepare uma solução de estoque 1.000 x Ucn1 de 200 µM em DMSO.
        Nota: Dependendo da solubilidade do peptide, você pode ser capaz de preparar o estoque em água pura ou buffer.
      2. Meio de 100 µ l de transferência de um bem em um tubo de reação de 1,5 mL e adicionar 0,6 µ l de solução-mãe agonista do peptide. Transferi a médio de volta dentro do poço.
      3. Observe a internalização sob o microscópio. Tirar fotos após a ocorrência claramente detectável de interiorização (10-15 min a horas, dependendo do receptor e a superexpressão de Arrestins) usando os filtros mencionados anteriormente.

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Representative Results

O esboço do ensaio da fluorescência é retratado na Figura 1. O ensaio é empregado em três aplicações. Em primeiro lugar, um número de variantes de tRNA para incorporação de Lys(Boc) pelo par Pyl ortogonais é selecionado. Lys(BOC) é um aminoácido estericamente semelhante ao Pyl. Como Pyl não está comercialmente disponível, Lys(Boc) é comumente usado como um substrato padrão para o PylRS. Os tRNAs selecionados baseiam o tRNAPyl. Cada variante de tRNA tem mutações de bases simples ou de pares de bases a loops e hastes racionalmente concebidos para melhorar o tRNA estabilidade e compatibilidade com a maquinaria de translação eucariótica. Todos os detalhes sobre o projeto de tRNA são descritos em nosso recente trabalho30. Resultados típicos são descritos na Figura 2A: tRNAs diferentes dar eficiência supressão diferentes, que se reflecte claramente na quantidade de fluorescência medida. As barras de erro pequeno de triplica biológico mostram que os valores são altamente reprodutíveis. Em segundo lugar, duas variantes do gene do E2AziRS26,51, que incorpora o foto-crosslinker p-azido-Phe (Azi), são avaliadas. E2AziRS é derivado do TyrRS de e. coli . Uma variante do gene empregado nativo Escherichia coli uso códon, enquanto que o segundo era códon otimizado para uso em H. sapiens. O ensaio de fluorescência mostra que a variante de códon otimizado dá rendimentos mais elevados de proteína (Figura 2B). Finalmente, a taxa de incorporação de aminoácidos diferentes para opaco clique química são comparados (Figura 2). Todos os ncAAs aqui apresentados (BCNK, TCO * K e SCOK) são incorporados com o mesmo par de MbPylRSAF/tRNAPyl ortogonal. Lys(Z) também é incorporada por este par e foi usado como controle positivo. Para ilustrar a confiabilidade do ensaio da fluorescência, paralelo ncAA incorporação experimentos foram realizados em um GPCR, o CRF1R. Realizou-se análise ocidental do borrão para estimar a expressão GPCR (Figura 2B, C). As mesmas tendências observadas com EGFP no ensaio de fluorescência foram observadas com o CRF1R. Notavelmente, Azi incorporação CRF1R foi altamente aprimorada quando usando o gene códon otimizado de E2AziRS em comparação com o gene nativo, mostrando que mesmo uma melhoria moderada de 1,5-2-fold para uma proteína solúvel (EGFP) de acordo com o ensaio de fluorescência pode ter um maior impacto sobre o nível de expressão de proteínas de membrana mais desafiadoras (Figura 2B). Como nota geral, no que diz respeito ao número de fitas de tRNA deve ser usado para cada aplicativo, apenas uma gaveta de tRNA é recomendada quando os tRNAs diferentes de rastreio, a fim de facilitar os procedimentos de clonagem. Quando rastreio ncAARS diferentes ou a eficiência da incorporação de ncAAs diferentes pelo mesmo par ortogonal, em tandem quatro repetições do tRNA gaveta são preferidas para atingir os mais altos rendimentos de incorporação da ncAA.

O sistema otimizado para incorporação de Azi, incluindo o gene E2AziRS humanizado foi implantado para mapear o bolso de ligação do CRF1R e definir caminhos de ligação de 5 ligantes diferentes: as dois agonistas de peptídeo Ucn1 e CRF e os antagonistas de peptídeo de três Ucn1(8-40), CRF (9-41) e dFXCRF(12-41) (Figura 3). Enquanto a eficiência de Azi incorporação anteriormente foi mostrada para diminuir quando se aproxima o GPCR C-terminal33,34, nosso sistema otimizado para incorporação de Azi permite níveis de expressão comparável de Azi-mutantes com TAG-sites em diferentes partes do gene GPCR (Figura 4A). Os resultados na Figura 4B mostram o rastreio do extracelular loop 2 (ECL2) e helix V de CRF1R como uma parte representativa da ligação de ligante bolso. Uma banda no tamanho correto do produto reticulação revela que a posição encontra-se na proximidade do ligante dentro do complexo ligante-receptor, ou seja, é parte do bolso de vinculação. Vários hits de reticulação foram encontrados com todos os ligantes testados, revelando padrões de ligação distintos para as agonistas do peptide e antagonistas. Notavelmente, o padrão de reticulação hits fornece informações sobre os elementos estruturais do receptor. Um número de visitas sucessivas, como observado na ECL2 (posições F260-R263 em combinação com antagonistas) sugere uma região do circuito flexível. Um padrão de hits a cada três ou quatro resíduos como encontrados em dicas de V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) hélice em direção uma estrutura helicoidal. A tela pode ser estendida a todos os domínios relevantes do GPCR. Se existir uma estrutura 3D ou um modelo molecular do receptor, pegadas de ligante podem ser visualizadas, realçando os hits de reticulação para cada ligante (Figura 5).

Tanto a fluorescência e dados de Western blot (Figura 2) sugerem que TCO * K é a ncAA para química opaco que fica incorporada com a máxima eficiência pelo MbPylRSAF. Diferentes PylRS mutantes podem dar rendimentos mais elevados de incorporação de outras clique ncAAs17, mas eles não foram testados neste estudo. TCO * K foi incorporada a uma proteína de fusão de CRF1R-EGFP e ativado Instalando através de química SPIEDAC (figura 6A) um pequeno brilhante fluoróforo no receptor (Figura 6B). Como prova de rotulagem específica, a fluorescência do rótulo deve ser visível apenas nas células que expressam o receptor (células verdes na Figura 6B) e não em células escuras, que, assim, fornecer um controle negativo interno em cada experimento. Os receptores rotulados usando química ultra rápida de SPIEDAC são ainda funcionais. Após a adição de um agonista do peptide, fluorescentes compartimentos foram observados ao longo do citosol, revelando o processo fisiológico de interiorização GPCR (Figura 6). Os sinais do EGFP fundido co localizados com o corante fluorescente em todos os momentos, confirmando a rotulagem biorthogonal seletiva do GPCR.

Figure 1
Figura 1: ensaio baseado em fluorescência para avaliar a eficiência da supressão de códon de parada. As células HEK293 são co transfectadas com dois plasmídeos na presença da ncAA. Um plasmídeo codifica para a ncAARS desejada e supressor-tRNA. O plasmídeo segundo codifica para o gene EGFP tendo um códon de parada do TAG em um local permissivo juntamente com um controle de mCherry. Dois dias depois de transfeccao, fluorescência verde e vermelha do lisado de células inteiras são medidos em um leitor de placa. Como o EGFP N-segmento montante que o códon de parada (cinza) não é fluorescente, o rendimento do longa-metragem EGFP (verde) diretamente se correlaciona com a eficiência da incorporação da ncAA, enquanto mCherry (vermelho) fornece uma referência independente para normalização. A eficiência do sistema ortogonal é dada pelo quociente entre a quantidade de EGFP obtida por meio de supressão de códon de parada e a quantidade do selvagem-tipo EGFP obtido pela tradução regular (sem supressão de âmbar). A figura é modificada de Serfling, R. & moeda, eu; Incorporação de aminoácidos não naturais de proteínas expressado em células de mamíferos, métodos em enzimologia, 2016, 580, 89-107. 29 reprodução foi autorizada pelo centro de autorização Copyright de Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Aplicações representativas do ensaio da fluorescência. (A) de rastreio do tRNAPyl variantes30. Células HEK293 foram co transfectadas com o plasmídeo do repórter e plasmídeos codificação para o par de PylRS/tRNA Mb(um copiar tRNA). Barras representam a fluorescência relativa de EGFP obtido a partir da incorporação de Lys(Boc) em relação ao tipo selvagem EGFP. (B) avaliar a influência de códon-uso de genes ncAARS. (painel esquerdo) Ensaio de fluorescência das células transfectadas com duas variantes do gene diferente de E2AziRS. (1) uso de codão de e. coli e gene (2) humanizado. (painel direito) Análise ocidental do borrão de CRF1R95Azi-bandeira. O receptor de longa-metragem é detectado por um anticorpo anti-FLAG. Actina β foi usado como controle de carga. (C) avaliar a eficiência da incorporação de três ncAAs projetado para opaco química. (painel esquerdo) Estruturas de ncAAs usado neste experimento. (1) LysZ, que foi usado como controle positivo, (2) BCNK, (3) TCO * K e (4) SCOK. (painel central) Ensaio de fluorescência das células HEK293 transfected com um plasmídeo codificação para MbPylRSAF e quatro cópias de tRNA15 do (A) para incorporar (1), (2), (3) e (4). (painel direito) Western blot-análise de um mutante de CRF1R-bandeira dentre os quatro ncAAs rolamento na posição 95. Actina β foi usado como controle de carga. Painel A foi adaptado de Serfling, R. et al. Designer tRNAs eficiente incorporação de aminoácidos não-canônicos pelo sistema Pirrolisina em células de mamíferos ácidos nucleicos res 46 (1), 1-10 (2018) e são reproduzidas de acordo com o Creative Commons Atribuição de licença. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representação esquemática do mapeamento de foto-reticulação mediada por Azi. Uma função de foto-ativável azido (estrela amarela) é colocada em uma posição definida dentro do receptor (cinza). Quando o grupo azido está localizado proximal para o ligante acoplado (vermelho), um produto de reticulação covalente é formado a partir de irradiação UV (círculo amarelo indica local de reticulação). A incorporação do grupo azido em diferentes posições do receptor revela a superfície de ligação (roxa) do ligante, que representa o bolso de vinculação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Incorporação de Azi em toda a CRF1R para o mapeamento de foto-reticulação de bolso da ligação. (A) comparação dos níveis de expressão de mutantes Azi-CRF1R-bandeira em direção do receptor do tipo selvagem. Os sites de incorporação de Azi são distribuídos por todo o receptor todo conforme indicado na linha superior. Anti-FLAG borrões ocidentais de células inteiras lysates são mostrados. Actina β foi usado como controle de carga. (B) borrões ocidentais sondaram com qualquer anti-CRF ou anticorpos anti-Ucn1 são mostrados. Os resíduos de redacção Azi são indicados na linha superior. As células foram incubadas com ligantes listadas à direita, seguido por irradiação UV a 365 nm e Lise. As amostras foram resolvidas em 10% SDS-PAGE, deglycosylated usando PNGase F e analisados pela mancha ocidental. O complexo ligante-CRF1R de deglycosylated é executado em um aparente MW de ~ 40 kDa33. O ligante não-ligação cruzada não é detectado (kDa MW ~ 3-4). Ambos os painéis desta figura foram modificados de Seidel, insight L. et al. Structural sobre a ativação de um receptor acoplado à G-proteína de classe B por Hormônios peptídicos em células humanas ao vivo. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 e são reproduzidas de acordo com a licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Pegadas de peptídeo agonistas e antagonistas na classe B GPCR CRF1R. Representação de superfície do domínio transmembrana CRF1R. Posições de CRF1R que quitosana destacam-se o ligante Quando substituído por Azi. Pegadas dos agonistas do peptídeo, CRF e Ucn1 são destacadas em magenta, pegadas dos antagonistas CRF (9-41) e Ucn1(8-40) em azul. A pegada do antagonista dFXCRF(12-41) é destacada em laranja. Os sete hélices transmembrana eu-VII são indicadas por números romanos. (A, B) Vistas de lado no bolso de vinculação do plano da membrana. (C) vista no bolso do lado extracelular ligação superior. Reproduzido de Seidel, insight L. et al. Structural sobre a ativação de um receptor acoplado à G-proteína de classe B por Hormônios peptídicos em células humanas ao vivo. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 e são reproduzidas de acordo com a licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : SPIEDAC marcação de CRF1R em células vivas. (A) esquema de reação de cicloadição de Diels-Alder a estirpe-promovido elétron-demanda inversa (SPIEDAC): o grupo de trans-cyclo-2-octeno do ncAA TCO * K reage com o grupo de tetrazine ligado ao fluoróforo Cy3. (B, C) HEK293T células expressando CRF1R95TCO * K- EGFP. Imagens representativas do canal verde, vermelho e azul. O tamanho da barra de escala é de 10 µm. (B) as células foram tratadas com tetrazine-Cy3 (1,5 µM) por 5 min. Apenas células expressando o receptor (verde) mostram a ocorrência de rotulagem (vermelho). (C) as células foram tratadas com 200 nM Ucn1 e fotografada depois de 15 min. de vesículas intracelulares correspondem ao receptor interiorizado. Os painéis B e C são modificados de Serfling, R. et al. Designer tRNAs eficiente incorporação de aminoácidos não-canônicos pelo sistema Pirrolisina em células de mamíferos Res de ácido nucleico 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) e são reproduzidas de acordo com a licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo descreve um ensaio simples e confiável para avaliar a eficiência de pares ortogonais para a incorporação de ncAAs proteínas expressado em células de mamíferos. A principal vantagem deste método em relação aos ensaios amplamente utilizados, com base na FACS é que permite a preparação simultânea e medição de um maior número de amostras e fornece dados que facilmente são analisados usando um software comum. A disponibilidade de um rendimento médio método para analisar pares ortogonais em células de mamíferos é muito importante para o desenvolvimento de novos pares de ortogonais e a melhoria dos existentes. Na verdade, não é possível realizar a evolução dirigida de pares ortogonais através da geração de grandes bibliotecas aleatórias e seleção mortos/vivos nos sistemas dos mamíferos. O ensaio permite que bibliotecas de rastreio de pequeno porte (centenas de membros), investindo um razoável esforço experimental dentro de um prazo relativamente curto. Selecionando conjuntos de tRNA racionalmente concebidos através deste ensaio, geramos os tRNAs romance que aumentam significativamente a eficiência do sistema Pirrolisina30. A clássica combinação EGFP/mCherry é usada para a leitura fluorescente, através do qual EGFP serve como repórter de eficiência de incorporação e mCherry como o controle interno. O repórter EGFP e o controle de mCherry são abrigou no mesmo plasmídeo mas são incorporados em duas fitas de expressão separado tendo dois promotores independentes. Desta forma, mCherry expressão refere-se à eficiência de transfecção e contagem de células, mas é independente da expressão EGFP, para que a fluorescência verde medida pode ser normalizada para a fluorescência vermelha. Isto é exatamente o caso de outros repórteres, construído como um conjunto de duas proteínas tais como EGFP-TAG-mCherry-7 e iRFP-GFPY39TAG (com iRFP denotando a proteína fluorescente infravermelha)52. Em tais construções, ambas as proteínas estão a mesma transcrição de mRNA. Em eucariontes, mRNAs códons de parada prematura do rolamento se submeter a vigilância e a degradação pelo mecanismo de deterioração mediada por absurdo (NMD)53. Portanto, tanto a sequência do repórter e o controle são simultaneamente degradadas e expressão de dois genes não é estritamente independente. Ensaios semelhantes com base em um repórter do luciferase em vez de um repórter de fluorescência têm sido descritas por outros54,,55. Enquanto luminescência enzimática oferece maior sensibilidade do que medidas de fluorescência, este último mostrou maior reprodutibilidade entre lotes de célula diferente.

Sistemas robustos para incorporação de ncAA em células de mamíferos são absolutamente necessários quando se trabalha com exigentes metas de proteínas como as proteínas de membrana e proteínas abundantes baixas. Mostramos aqui um par ortogonal otimizado para incorporação robusto do ncAA foto-ativável Azi em GPCRs. O sistema oferece taxas de incorporação de Azi homogêneas em todo o receptor todo que permite o mapeamento de foto-reticulação sistemático das superfícies GPCR inteiras e identificação dos sítios de ligação do ligante. Os dois principais pontos de força do método são que ligantes diferentes podem ser analisados no mesmo receptor em paralelo e que os dados são derivados do receptor na célula viva, que complementa as informações obtidas em vitro abordagens. O método é, em princípio aplicável para qualquer destino da proteína e é adequado também para mapear topologias de interações da proteína-proteína. Além disso, o subconjunto identificado de quitosana posições ainda mais pode ser analisado com reticulação 2D para pin-point de pares intermoleculares de aminoácidos proximais no complexo associado33,38. Tais pares de aminoácido fornecem restrições espaciais que são aplicadas para experimentos em silício para construir modelos moleculares precisos da interação33,38. Do ponto de vista metódico, vale comentar que devem ser considerados apenas positivos resultados de experimentos de reticulação. Uma posição que fez crosslink não pode ainda estar dentro do raio crítico desde o ligante. Falso-negativos podem ocorrer quando a mutação introduzida pelo crosslinker dificulta a interação nativa, mas também pode ocorrer quando a fracção de reticulação pontos longe do ligante, ou é extinguida pelo solvente ou sofre de reticulação intramolecular. Uma parte crucial do método é como detectar a ocorrência de reticulação. Em primeiro lugar, lysates de células inteiras são resolvidos em SDS-PAGE para separar qualquer ligante que não está ligado ao receptor. Em segundo lugar, o complexo ligante-receptor covalente é detectado através da mancha ocidental, usando um anticorpo antiligante. Por ligantes de peptídeo, Anticorpos policlonais de alta afinidade levantados contra o ligante são a escolha ideal. Como alternativa, ligantes de peptídeo podem ser equipados com um bandeira-tag em uma posição permissiva, desde que a tag é disponibilizada para o anticorpo anti-FLAG através de um espaçador adequado. Etiquetas de biotina também podem ser usadas, embora os resultados podem ser difíceis de interpretar devido ao fundo por proteínas endógenas biotinilado. Ligantes de pequenas moléculas são geralmente radiolabeled, embora marca-rotulagem pode também ser possível56,57. Protocolos para Azi incorporação GPCRs tem sido publicado também por outros57,58,59. No entanto, estes protocolos envolvem o uso de três plasmídeos para incorporação de Azi, Considerando que nós usamos um sistema mais simples do dois-plasmídeo, incluindo um gene humanizado para E2AziRS, que dá o melhor resultado em relação a não-códon-otimizados um (Figura 2B).

Técnicas de microscopia modernas exigem instalando fluorophores muito brilhante e eficiente para a proteína de interesse, como proteína codificada geneticamente fluorophores, tais como o clássico EGFP não são adequados para aplicações high-end. Portanto, há uma busca contínua de métodos que permitem instalar fluorophores orgânico em proteínas, que levou ao desenvolvimento do popular SNAP60 e rótulos de61 Halo, entre outros. No entanto, tal tags ainda têm um tamanho de vários kDa, que pode perturbar a função da proteína alvo e deixar uma grande incerteza sobre a posição exata do fluoróforo. Com um tamanho mínimo de alguns aminoácidos, o motivo do tetracysteine representa uma alternativa menor para a rotulagem mais precisas usando fluoresceína ou resorufin compostos de arsénio (FlAsH, Sousa)62,63. Embora essa abordagem tem sido aplicada com muito sucesso também a GPCR estudos64,,65,66, requer etapas de lavagem extensa com tióis, sofre muitas vezes de fundo elevado, e em qualquer caso, não permite posicionamento do rótulo com resolução único resíduo. Em vez disso, ncAAs equipados com âncoras opaco oferecem a possibilidade de instalação de etiquetas fluorescentes em uma posição de único aminoácido, minimizando assim o risco de interferir com a conformação nativa e funcionalidade da proteína alvo. NcAAs de última geração para opaco química, como o TCO * K13 empregado aqui, permitiram a rotulagem da proteína diretamente em células vivas17,43. O método é aplicável aos alvos de proteína na superfície das células, mas também em alvos intracelulares, desde que apropriado célula-permeável corantes são disponíveis17,67,68. SPIEDAC química é várias ordens de grandeza mais rápido em relação à tensão-promovido azido-alquino cicloadição (SPAAC) e Staudinger Bertozzi ligadura na azida Ancora2,13. Na verdade, vários protocolos foram publicados por GPCR marcação na geneticamente incorporados Azi, mas são aplicáveis apenas aos isolados GPCRs em vitro37,59,69. Em vez disso, Nós demonstramos aqui liso opaco rotulagem de GPCRs funcionais na célula viva. Nosso protocolo é semelhante aos protocolos existentes usando a mesma química43,,48,70, mas nosso sistema otimizado de incorporação de ncAA expande o escopo do método de estudos GPCR. Um passo crítico no procedimento experimental é a escolha da posição a ser trocada com TCO * K, como nem todos os cargos dentro do receptor são permissivos para uma substituição ou acessível para o corante fluorescente. Portanto, várias posições devem ser testadas em uma tela preliminar até encontrar a mais adequada.

Em conclusão, este trabalho apresenta ferramentas para aplicação geral de ncAAs, incluindo aplicação de desafiadoras metas de proteínas tais como GPCRs. Prevemos que a foto-reticulação mapeamento e opaco, etiquetando, hoje em dia as principais aplicações de ncAAs para estudos GPCR, encontrará muitas aplicações futuras tanto desvendar topologias de interações GPCR com ligantes ou outras proteínas e estudar GPCR dinâmica estrutural na célula viva.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum conflito para declarar.

Acknowledgments

Este trabalho foi fundado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob bolsas CO822/2-1 (programa de Emmy Noether) e CO822/3-1 ao I.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114, (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844, (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38, (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7, (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126, (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132, (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134, (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136, (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128, (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13, (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4, (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134, (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128, (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135, (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131, (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4, (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131, (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13, (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136, (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30, (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3, (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10, (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155, (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117, (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7, (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292, (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289, (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10, (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32, (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51, (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49, (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5, (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136, (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283, (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19, (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3, (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124, (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2, (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531, (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531, (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137, (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22, (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

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