미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

Immunology and Infection

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Summary

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

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Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

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Abstract

초파리 melanogaster 의 병원 성 감염 시 hemocytes 감염을 통해 면역 반응에 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서,이 프로토콜의 목표, 즉 hemocytes의 특정 면역에 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 개발 하는 것입니다. 여기, 3 × 10에 제시 된 방법을 사용 하 여6 라이브 hemocytes ex vivo 감염에 대 일 분에서 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 얻을 수 있습니다. 또는, hemocytes는 감염 된 vivo에서 구명 hemocyte 추출에 의해 감염 된 후 24 시간에 3rd 탈피 애벌레의 주사를 통해 하실 수 있습니다. 이러한 감염된 1 차 셀 고정, 스테인드, 고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 그럼, 3D 표현 병원 체 침입을 결정적으로 보여 이미지에서 생성 되었습니다. 또한, qRT-PCR에 대 한 높은-품질 RNA 병원 체 mRNA 다음의 탐지를 위해 얻어질 수 있다 감염, 그리고 충분 한 단백질 서쪽 오 점 분석에 대 한 이러한 셀에서 추출할 수 있습니다. 함께 찍은, 우리 병원 체 침입의 확실 한 조정 및 세균성과 바이러스 성 병원 체 종류와 hemocyte 추출 위한 효율적인 방법 초파리 에서 충분 한 라이브 hemocytes를 사용 하 여 감염의 확인 하는 방법 제시 vivo ex vivo에서 감염 실험의 애벌레

Introduction

초파리 melanogaster 타고 난 면제1의 연구에 대 한 기초가 튼튼한 모델 생물 이다. 타고 난 면역 반응 동안 hemocytes 병원 체 도전 하 응답에서 중요 한 역할을 재생합니다. Hemocytes는 캡슐화 기생충, 곰 팡이, 바이러스, 그리고 세균성 감염2,3중 phagocytic 행동을 통해 병원 체 퇴치에 중요 한 기능을가지고 위한 중요 합니다.

최고의 호스트의 병원 성 미생물 감염에 타고 난 면역 반응 이해, 그것은 병원 체 감염 시 호스트 셀을 침공 하는 방법을 시각화 하는 것이 중요. 이 시각화의 메커니즘의 이해에 기여 한다. 병원 체 세포내 지역화의 세부 사항 및 세포질 응답, 이러한 데이터는 감염 하는 미생물이 작용 하는 세포 세포 호스트 응답에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 영상 현미경 검사 법에 의해 후 3D 모델 재구성 호스트 세포에 병원 균의 정확한 위치를 확인 하려면 유용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Coxiella burnetii (C. burnetii), Q 열, 기본 초파리 hemocytes에 둘 다 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 동물 매개 질병의 원인이 되는 대리인의 침공 시각. 최근에, 그것은 초파리 는 Biosafety 수준 2 9 마일 단계 II (NMII) 복제 4 C. burnetii 의 긴장과이 긴장은 초파리4를 복제할 수는 를 나타내는에 취약 입증 되었다 초파리 C. burnetii 병 인을 공부 하는 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.

이전 연구는 호스트의 타고 난 면역 반응 검사를 hemocytes를 사용 했습니다. Hemocytes 형태학 관찰5,,67, 형태학 분석2,8, 먹어서 분석2,3, qRT-PCR2 사용 되었습니다. , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent 분석10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 및 immunohistochemistry9,14. 초파리 S2 세포, 다양 한 생체 외에서 실험에 사용할 수도 있지만 immortalization 및 잠재적인 기존의 바이러스 감염 그들의 행동15,16변경. S2 세포 같은 불멸 하 게 셀 라인, 반대로 1 차 셀의 사용 수 있습니다 타고 난 면역 기능 연구에 대 한 시스템에서 전체 유기 체의 더 대표. 또한, hemocytes에서 vivo에서, 추출, 이전 감염 다른 호스트 단백질 및 조직, 비보 전 감염 전에 hemocytes의 추출에 비해 우위를 셀 수 있습니다. 다른 방법의 수는 hemocytes 살아8,17,,1819계속 시간의 짧은 기간에 hemocytes의 충분 한 수를 이용 되어 있다.

이 연구에서는 hemocytes C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria), 또는 무척추동물 무지개 빛깔의 병원 성 미생물 감염에 대 한 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 하는 방법 소개 6 (IIV6) 바이러스입니다. Vivo에서 비보 전 hemocyte 감염에 대 한 방법을 설명합니다. Vivo에서-와 ex vivo-감염된 hemocytes confocal 현미경 검사 법으로 구상 되었고 C. burnetii 의 3D 모델을 구축 하는 데 사용. 또한, 프로토콜을 사용 하는 추출, ex vivo-감염된 hemocytes 유전자와 단백질 식에 사용 된 분석 실험. 특히, IIV6 및 Listeria감염의 정도 검사, 총 RNA 또는 단백질 했다 격리 qRT-PCR 또는 서쪽 오 점 분석에 대 한 셀에서. 함께 찍은, 프로토콜 빠르게 3rd 탈피 애벌레와 기본 hemocytes, vivo에서 또는 전 비보감염 증거에서 hemocytes의 높은 숫자를 수집 하는 메서드를 제공 합니다에 대 한 적합 한 플랫폼 미생물 병원 체 감염 연구 그리고 현미경 검사 법, transcriptomics, proteomics 등 해당 다운스트림 분석.

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Protocol

1. 감염 비보 전

  1. 매체 및 장비
    1. 무 균 조건 하에서 준비 신선한 초파리 Hemocyte 분리 매체 (작성자) 75% 슈나이더의 초파리 를 포함 보통 25%로 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 필터 살 균 그것.
    2. 레이어는 stereomicroscope에서 10 cm x 10 cm 파라핀 영화의 2-3 조각.
    3. 유리 모 세관을 준비 합니다. 최대의 55%를 모 세관 끌어당기는 히터를 설정 합니다. 약 10 µ m의 날카로운 포인트를 모 세관 튜브를 당겨.
    4. 백필 미네랄 오일 모 세관입니다.
    5. Nanoinjector (그림 1A)에 채워진된 모 세관 튜브를 조립 하 고 집게 (그림 1B) 끝을 끊어서 융합된 세관 팁을 엽니다. 팁의 외부 직경은 hemocytes의 쉬운 이해를 위한 100 µ m 이어야 한다.
    6. 모 세관 튜브 끝에서 가능한 많은 기름 추출 다음 작성자와 작성. 최대 촬영 hemolymph와 오일의 테두리 쉽게 시각화, 포함 석유와 작성자 사이 공기 거품 (그림 1B').
  2. Hemolymph 추출
    1. 선택 3rd 탈피 초파리 애벌레 안쪽에서 음식의 벽 집게를 사용 하 여 부드럽게 리 바이 알 및 100 µ m 여과기 (그림 1C)에 그들을 배치. 3rd 탈피 애벌레는 성인 여성에 의해 누워 비옥한 계란을 다음 3-6 일 찾을 수 있습니다.
      참고: 이러한 실험 사용 유전자 형, w1118; P {w+ mCHml GAL4.Δ =} 2, P {w+ mCUAS-2xEGFP =} AH2, 이후이 동물에서 hemocytes 표현 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 현미경으로 세포의 식별에 도움.
    2. 애벌레에 붓는 살 균 물의 5 mL와 5 미 장소 작업 지우기에 여과기 과잉의 물을 제거 하는 여과기를 흔들어 (그림 1C').
    3. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 애벌레를 전송 합니다. 5 CO2 가스와 함께 그들을 anesthetize (그림 1D).
    4. 등-면 (그림 2A) 최대 stereomicroscope, 아래 파라핀 필름에 애벌레를 놓습니다.
    5. 제자리에 후부 표 피 중단을 장소 애벌레 후부 시체에 가볍게 모 세관 유리 정밀한 날카로운된 집게 (그림 2B)를 사용 하 여 엽니다.
    6. Hemolymph 파라핀 필름 (그림 2C)에 흐르는 것을 허용 한다.
    7. 파라핀 영화에 한 번에 20-50 애벌레에서 hemocytes를 포함 하는 hemolymph의 풀을 확인 합니다.
    8. 소요는 유리를 사용 하 여 풀링된 hemolymph nanoinjector (그림 2D)에 모 세관.
      참고: hemolymph의 약 10-20 µ L을 하 고 있어야 합니다.
    9. 작성자 (그림 2E)의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 hemolymph를 꺼냅니다.
    10. 반복 단계 1.2.4)-1.2.9) 애벌레의 모든 일괄 처리에 대 한.
  3. Hemocytes의 수를 계산 합니다.
    1. 죽은 세포 얼룩 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 5 µ L 플라스틱 부드럽게 작성자와는 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 hemocytes 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 hemocytes를 포함 하 여 작성자의 5 µ L를 전송 하 고 부드럽게 혼합.
    2. 1:1 Trypan 파랑: hemocyte 혼합물에서 셀의 10 µ L는 hemocytometer에 플라스틱.
    3. 라이브 hemocytes는 하지로 얼룩진 Trypan 블루는 hemocytomter의 4 모서리 필드의 각을 계산 하는 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 hemocytes의 농도의 수를 계산:
      Equation 1
      여기서 X는 밀리; 당 라이브 hemocytes의 농도 a, b, c, 그리고 d는 필드의 각 4 (Trypan 블루 제외 결정)로 라이브 셀 수는 hemocytometer에 계산. 셀 계산의 총 수의 2에 의해 Trypan 블루 셀의 1:1 희석 때문입니다. Trypan 푸른 물 셀 죽으로 간주 됩니다.
  4. 비보 전 감염
    1. Timepoints 및 생물에 따라 세포와 시드를 우물의 수 복제 각 실험에 필요한 결정 합니다. 5.0 × 104 hemocytes는 RNA와 단백질 정화 감염 다음 필요한.
    2. 작성자는 다음 수식을 사용 하 여 감염에 대 한 희석에 병원 체의 볼륨을 계산:
      Equation 2
      어디 감염 (MOI)의 다양성은 바이러스의 수 또는 박테리아 세포 당 원하는.
      참고: 사용 하는 나는 개별 실험 및 분석 실험 수행에 따라 다릅니다. 여기, 10 게놈 등가물 (GE) / C. burnetii, Listeria의 10 CFU/셀 또는 IIV6의 1 TCID50/cell의 셀이 사용 되었다.
    3. 튜브에 바이러스 성 또는 세균성 볼륨에 작성자의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 24-잘 접시의 각 음에 대 한 병원 체 매체의 500 µ L를 준비 합니다.
    4. 장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드.
    5. 24-잘 접시의 우물에는 hemocytes를 포함 하 여 작성자를 분할.
    6. 잘에서 hemocytes에 병원 체 매체의 500 µ L를 추가 합니다.
    7. 1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심
    8. 1 h 28 ° c.에 대 한 접시를 품 어 모든 15 분 부드럽게 앞, 다음 5 오른쪽 왼쪽 뒤에서 접시 기울기 손으로 s.
    9. 침공/첨부 파일 단계 1.4.8의 1 h), 후 부드럽게 병원 체 매체에서 플라스틱 세척 신선한 작성자와 hemocytes 그리고 신선한 작성자의 500 µ L 리필.
    10. 원하는 시간에 대 한 감염된 hemocytes를 품 어. 이러한 실험, C. burnetii에서-또는 IIV6에 감염 된 hemocytes는 24 시간, 및 Listeriaincubated-감염된 hemocytes 1, 2, 또는 4 h 알을 품는.

2. vivo에서 감염

  1. 감염
    1. 따뜻한 실 온 15 분 접시에서 초파리 과일 주스 천 배지 이전 만들어집니다20을설명 합니다.
      1. 물과 압력솥의 700 mL를 agar의 30 g 추가 40 분 동안 그것.
      2. 메 틸 paraben 절대 에탄올 10 mL에 0.5 g을 녹.
      3. 과일 주스 농축의 300 mL에 메 틸 paraben 솔루션을 추가 합니다.
      4. 신속 하 게 압력가 한 솔루션으로 농축 혼합 하 고 10 × 35 mm 페 트리 접시에 5 mL을 분배.
      5. 후 15 분 동안 냉각 판, 4 ° c.에서 그들을 저장합니다
    2. 3rd 탈피 애벌레 1.2.1 단계 준비)-1.2.3).
    3. 한 천 배지에서 효 모 반죽을 놓습니다. 애벌레 (그림 3A) 건조를 피하기 위해 마이그레이션할 수 한 천 배지에서 잘 컷을 확인 합니다. 파라핀 영화 (그림 3B, C)를 사용 하 여 집게를 들고와 0.001 m m 지적된 텅스텐 바늘을 조립.
    4. 높은 titer mCherry의 50 µ L 플라스틱 표현-C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL)를 파라핀에 스테레오 현미경 영화 하 고 애벌레 박테리아의 수영장.
    5. 박테리아의 수영장으로 애벌레를 놓습니다. 텅스텐 바늘 (그림 3D) 애벌레를 찌 르 기. 한 천 배지 (그림 3E)에 애벌레를 전송 합니다.
    6. 한 접시에 나머지 병원 체 매체 전송 및 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.
    7. 원하는 시간 후 감염 (그림 3F)까지 습 한 공기에는 접시에 애벌레 계속. 이 실험에서 C. burnetii-24 h에 대 한 접시에는 감염 된 애벌레.
  2. Hemolymph 추출 및 hemocytes의 도금
    1. 준비 단계 1.1 다음과 같은 장비와 매체).
    2. 장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드. 우물에 작성자의 500 µ L 플라스틱
    3. 에서 추출 하는 hemolymph 단계 1.2.4 감염 된 애벌레)-1.2.8).
    4. 그럼 다음에 hemolymph를 추출 단계 2.2.2).
    5. 2.2.3 반복) 및 2.2.4) 애벌레의 여러 일괄 처리에 대 한.
    6. 1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심

3입니다. 시각화

  1. 담합 및 얼룩
    1. 우물에서 라운드 커버 유리에 hemocytes 수 있도록, 후 부드럽게 각 우물에서 매체를 제거 합니다.
    2. 부드럽게 정착된 hemocytes의 각 음에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 20 분 동안 hemocytes를 품 어.
    3. 4% 제거 PFA 부드럽게 0.1%를 포함 하는 PBS의 200 µ L을 추가 하 고 트라이 톤 X-100 그리고 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 각 잘 하. 실 온에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.
    4. PBS를 제거 하 고 부드럽게 200 µ L의 ' 1 × 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 각 영역을 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.
    5. DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 각 우물에 PBS를 추가. 실 온에서 5 분 동안 hemocytes를 품 어.
    6. 유리 현미경 슬라이드에서 antifade 설치 매체의 10 µ L를 드롭.
    7. 각 우물에서 PBS를 제거한 후 덮개 유리 잘 지적 집게를 사용 하 여 24-잘 접시에서 제거 합니다. 부드럽게 유리 슬라이드에 아래로 hemocytes antifade 장착 매체에 커버 유리 넣습니다.
    8. 어두운 하룻밤에 그것을 배치 하 여 건조를 허용 합니다.
  2. Confocal 영상
    1. DAPI, EGFP, 및 mCherry의 세 가지 컬러 이미징 공초점 현미경을 구성 합니다. 다음 설정 사용: (예) 405 DAPI 여기 nm, 방출 (em) 415-480 nm; 488 전 EGFP nm, em 493-564 nm; 587 ex mCherry nm, em 597-700 nm.
    2. 현미경과 63 X를 사용 하 여 샘플에 초점에 샘플 배치 / 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 목표. 이미징에 대 한 보기 필드에에서 원하는 hemocytes를 찾습니다.
    3. 샘플의 적절 한 노출을 달성 레이저 파워 및 검출기 이익 조정 합니다. 여러 z-비행기 노출 수준 전체 샘플 두께 적합 한지를 확인 하십시오.
    4. 전체 hemocyte의 z 축에서 위쪽 및 아래쪽 위치를 찾아. Z 단면에 대 한 시작 및 끝 위치도이 위치를 설정 합니다.
    5. 검색 줌 이미지는 hemocyte에 포함 된 영역을 사용 합니다. 3 X의 확대/축소 요소는 자주 사용 하 고 있다.
    6. X-y 평면에서 1024 x 1024 픽셀 등 적절 한 해상도 이미지 시리즈와 z 차원에서 0.3 µ m 간격을 수집 합니다.
  3. 3D 모델 재구성
    참고: 오픈 소스 소프트웨어는 3D 모델 재구성에 대 한 대부분의 아래에 설명 된 함수를 수행 하는 존재 합니다.
    1. 3D 모델 재구성 confocal 현미경과 관련 된 소프트웨어에 z sectioned 이미지 시리즈 파일을 가져옵니다.
    2. DAPI와 mCherry C. burnetii 는 EGFP hemocyte 표현에 표현 스테인드 핵의 공동 지역화를 표시 하는 셀을 선택 합니다. 자르기만 단일 셀을 포함 하도록 이미지 시리즈.
    3. 3D 뷰어 옵션 소프트웨어의 사전 패키지 된 알고리즘을 사용 하 여 3D 모델을 재구성을 선택 합니다. 3D 표현 혼합, 표면, 및 혼합된 옵션 중 원하는 유형을 선택 합니다. 이 방법에서는, hemocytes, 핵, 및 C. burnetii 표시 됩니다 표면 모델을 사용 하 여.
    4. 마우스 버튼을 누른 화면 커서를 드래그 하 여 보기의 다양 한 위치에서 3D 복원된 셀을 관찰 합니다. 셀 방향 및 이미지를 최적화 하기 위해 모델된 광원의 위치를 조정 합니다. 불투명도, 최소 및 최대 임계값, 스 페 큘 러, 주위, Shineness, 및 감마에 대 한 다른 옵션 이미지를 최적화 하기 위해 존재 합니다.
    5. 횡단면은 hemocyte의 내부 내용을 시각화를 클리핑 및 단면 명령을 사용 하 여 모델을 가져가 라.

4입니다. 유전자 및 단백질 분석에 대 한 응용 프로그램

  1. 후속 qRT-PCR를 위한 세포를 lyse 다음 IIV6 및 Listeria, 감염 또는 서쪽 오 점 분석 앞에서 설명한 다음 제조업체의 지침과21 .
    참고: qRT-PCR를 위한 뇌관 및 서쪽 오 점을 위해 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
  2. 증폭된 제품의 적절 한 길이 있도록 agarose 젤 전기 이동 법, 앞에서 설명한22로 PCR 제품 분석.

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Representative Results

수집 3 × 10에 ex vivo 감염에 대 한 hemocytes 살고6 hemocytes 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 되었다. 우리의 방법 개발, 다양 한 다른 기술 시도 했다. 개별 애벌레 해 부까지 1.5 h 걸릴 것 이라고 하 고 ~ 8000 셀의 평균이 방법18, 대부분의 컬렉션의 끝에 의해 살아 있던을 사용 하 여 얻은 했다. 다음, 우리는 hemocytes를 포함 하는 hemolymph를 추출 하려고, 한 번 사용 하 여 표 피와 유리 모 세관 튜브19, 하지만 모 세관 막힌 되었다 20 애벌레에서 소재와 hemolymph 하지 못했습니다 유리에 의해 효율적으로 채택 될 모 세관입니다. 마지막으로, 우리는 기계적으로 미세 집게12, 일괄 처리 당 20-50 유 충의 표 피를 중단 하 고 쉽게 이해에 대 한 hemolymph 풀을 만든. 이 애벌레 (표 1)의 많은 수에서 많은 양의 hemocytes의 쉬운 수집을 허용.

추출 된 hemocytes 했다 살아 하 고 감염에 대 한 적합을 Trypan 블루 제외 분석 결과 (그림 6A) 여기에 제시 된 방법을 사용 하 여 추출 하는 라이브 hemocytes의 비율을 계산 위해 수행 되었습니다. 또한, 우리는 목표 분리 하 고 구별 순환 주민 기계적 장애 방법을 개발 하는 이전에 게시 방법으로 hemocyte 추출에 대 한 우리의 방법을 비교 개인 초파리에서 hemocytes 유 충23. 10 독립적인 실험 격리에서 두 가지 방법 간의 비교, 시 세포 생존 능력은 약간 더 큰그림 6(A); 여기에 제시 된 방법을 사용 하 여 관찰 그러나, Petraki 에서 방법. (그림 6B) 모든 10 해 부 애벌레에서 두 배나 많은 hemocytes 가까이 나왔고. Petraki 에서 hemocytes의 증가 한 수에 대 한 이유. 메서드는이 방법을 순환 hemocytes 뿐 아니라 거주 (고착) hemocytes, 수집. 확인 하려면 여기에 제시 된 방법으로 추출 셀 hemocytes 사실에 했다, 우리가 활용 transgenes는 업스트림 활성 시퀀스 (UAS)는 hemolectin (Hml) 발기인 hemocytes 순환에 GAL4 운전에 대 한 포함 된 플라이 라인 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 전사 및 식에는 hemocytes 활성화 합니다. Hemocytes에서 hml GAL4 > UAS EGFP 애벌레 고정 연 발된 coverglass 슬라이드에 추출 되었다, permeabilized 및으로 얼룩진 DAPI 앞21에서 설명한. 그림 7 대부분 DAPI 양성 세포는 또한 EGFP 긍정을 보여준다. 공동 식의 정량화에서 여러 개의 이미지에서 수행한 우리 고립 된 세포의 86±9%는 계산 했다 hemocytes.

3rd 탈피 애벌레 비보 전 또는 vivo에서 C. burnetii 감염 다음에서 추출 하는 초파리 hemocytes에 병원 체의 혁신적인 3D 모델에 프로토콜. 우리 때문에 박테리아 익스프레스 mCherry C. burnetii 감염의 이미지를 수 있었다. 감염 된 hemocytes 고정 했다 스테인드 후 그들은 DAPI, EGFP, 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 mCherry에 대 한 몇 군데 있었다. Hemocyte 감염 속도, mCherry 전시 EGFP 양성 세포의 비율에 의해 결정으로 신호, ex vivo와 비보 C. burnetii에 감염 했다 거의 100%. 10 GE/셀의 나 비보 전 감염, 셀24의 100%의 감염 발생 한다 사용 했다 것으로 예상 했다. 애벌레는 mCherry의 높은 titer 물방울에 배치 됩니다 이후 vivo에서 감염에 관한 표현-C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL), 박테리아의 수는 대략 10,000-fold 유 충 당 hemocytes의 수 보다 더 높은. 따라서, 100% 감염 속도 vivo에서 감염에 대 한 전망 이다.

다음, Z-섹션 hemocyte 3d, 전체 셀을 시각화 하 고 C. burnetii 세포의 내부에 있는지 확인을 통해 수집 되었다. 그림 4 셀의 내부에 볼 (빨간색)으로 C. burnetii 과 hemocyte (녹색)에서 투명 한 횡단면을 보여준다. 이미지 또한 hemocyte C. burnetii, cross-sectioned hemocytes의 내부에서 C. burnetii 를 다시 보여주는의 서피스를 나타내는 3D 모델 (그림 5)에 재건 되었다. Vivo에서흥미롭게도,-감염 된 hemocytes 큰 세포질 확장을 전시 하 고 비보 전하면서 자연에 아첨 했다-감염된 hemocytes 했다 더 둥근 (그림 5). 이는 vivo에서에서 lamellocytes의 큰 인구를 나타낼 수 있습니다-인구와 비보 전 인구7plasmatocytes 감염. Lamellocyte 차별화는 일반적으로 기생 말 벌 감염25동안 유도, 동안 초파리 애벌레의 부상 이기도 lamellocyte 차별화26유도 하기에 충분 합니다. 마지막으로, 여기에 제시 된 실험에 활용 되지, GFP 표현 형태의 Listeria27 IIV628 hemocyte 감염의 3D 모델을 생성 하는 데 사용할 수 있는 있습니다. 대신, Listeria-및 IIV6 감염 hemocytes 서 부 럽 고 qRT-PCR 실험을 위해 사용 되었다.

여기에 제시 된 방법을 사용 하면 감염 수행 됩니다 ex vivo 그리고 vivo에서 화상 진 찰에 대 한. 또한, 병원 체의 mRNA와 단백질 분석에는 비보 전 감염 따 랐 다. 특히, 추출 된 hemocytes IIV6에 감염 되었습니다 그리고 qRT-PCR 분석에 적용 된. 그것은 IIV6-193R, apoptosis29, 모의 및 IIV6 감염 세포 (그림 8A) 사이 putative 억제제에 대 한 인코딩 하는 바이러스 성 유전자의 상당히 높은 수준을 보여주었다. 증폭된 제품의 전기에 감염 된 샘플만 하지 모의 감염 샘플 (그림 8B) IIV6 193R 유전자 제품에 대 한 밴드의 존재를 확인 했다. 증폭된 밴드 RpII 내 인 성 제어에 대 한 모든 샘플에서 발견 된 고 S2 세포에서 IIV6 감염 긍정적인 컨트롤으로 수행 되었다. IIV6 감염 나의 1 TCID50/cell에서 수행 했다, 이후 셀의 약 50% 감염, 포아송 분포24에 기반으로 예상 했다.

총 단백질 모의-또는 Listeria-감염 hemocytes 1, 2, 및 4 h 후 감염에서 수집 된 고 단백질 농도 Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 의해 결정 되었다. 100%는 나 10 CFU/셀24이후 감염 된 비보 전 것으로 예상 했다. Listeria의 존재를 확인 서 부 럽-4 h 후 감염 (그림 9)에 의해 달성 하는 높은 수준의 감염된 hemocytes에 단백질 제품을 파생. Listeria의 감지에 긍정적인 컨트롤로 listeria inoculum을 사용-특정 밴드. 말라의 존재 로드 단백질의 수준을 확인 하는 hemocyte 샘플에 표시 됩니다. 함께 찍은, 이러한 결과 여기에 제시 된 방법을 사용 하 여 추출 하는 hemocytes 두 바이러스와 세균 감염 실험에 적합 했다 나타냅니다.

Figure 1
그림 1 : 장비 및 hemocyte 추출에 사용 되는 재료의 개요. 장비 해 부 하기 전에 먼저 준비 되었다. A)를 뽑아 유리 모 세관 미네랄 오일으로 다시 가득 되 고 후에 nanoinjector에 삽입 되었다. 유리 모 세관의 B)는 융합된 팁 100 µ m 외부 직경을 만들려고 집게로 부서 졌다. B') 작성자 셀 오염을 방지 하는 모 세관에 의해 채택 되었다 및 공기 방울 기름과 작성자 사이 명확한 구별을 소개 되었다. C) 애벌레는 음식 튜브에서 선택 하 고 셀 거르는에 배치. C') 애벌레는 메 마른 물에서 세척과 물 작업 지우기, d 조 제거 됩니다) 애벌레는 microcentrifuge 튜브로 전송 하 고 CO2 가스 마 취. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Hemocytes의 추출에 대 한 타임 라인 및 흐름 차트. A) 애벌레는 표 피를 열기 전에 그들의 등 쪽 측에 배치 됩니다. B)는 표 피는 잘 지적된 집게와 모 세관 바늘 중단 됩니다. C) hemolymph는 파라핀 필름에 없어져야 합니다. D) 풀 20-50 애벌레에서 hemolymph의 유리 모 세관 및 nanoinjector 가져옵니다. E) hemolymph와 hemocytes 500 µ L 작성자는 hemocytometer와 계산을 포함 하는 microcentrifuge 튜브로 전송 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: vivo에서 감염. A) 초파리 과일 주스 한 천 배지 및 붙여넣기 효 모 비보에 감염 된 애벌레의 부 화에 대 한 사용 됩니다. 상처 한 천 배지에서 애벌레 장 수 (회색 화살표)을 촉진 하기 위해 만들어집니다. B)는 0.001 m m 지적된 텅스텐 바늘 집게를 사용 하 여 파라핀 영화에 첨부 됩니다. 0.001 m m 지적된 텅스텐 바늘의 팁 C). D) 유 충은 병원 체 풀 스테레오 현미경 파라핀 영화에 텅스텐 바늘으로 찔 러 서. E) 찔된 애벌레는 한 접시에 배치 됩니다. F) 접시 파라핀 필름으로 밀봉 하 고 적절 한 시간까지 컨테이너에 축축한 종이 수건에 보관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 :는 hemocytes로 병원 체의 횡단면. 병원 체에 감염 된 hemocytes의 3D 공초점 레이저 스캐닝에서 추출 하는 섹션입니다. A, B) xy 섹션에서는 C. burnetii (빨간색 흰색 화살표 표시)는 hemocyte의 내부에. 회색 화살촉 표시 hemocytes의 핵. A'는, ", B') yz xz 단면 이미지를 포함 한 보기 표시 2 추가 보기 포인트에서 hemocytes로 C. burnetii 의 침공. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 3D 모델은 hemocytes로 병원 체의. C. burnetii 는 hemocytes에 침공의 재건된 3D 모델 전 비보 , vivo에서 감염 다음 생성 됩니다. 소프트웨어를 사용 하 여 모델을 자유롭게 회전할 수 있습니다. 여기 6 포인트 보기는 녹색, C. burnetii (흰색 화살표), 빨간색에서 및 파란색 (회색 화살촉) 핵 hemocyte 함께 표시 됩니다. 병원 체 침입 세포의 내부를 보여주는 단면 이미지도 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 백분율 및 라이브 hemocytes의 인구. Hemocytes Petraki 외의 방법을 사용 하 여 10 3rd 탈피 애벌레의 그룹에서 추출한 고 여기에 제시 된 방법. A) 라이브 hemocytes의 비율 Trypan 블루 제외 분석 결과 의해 각 기술에 대 한 계산 됩니다. B) hemocytes의 전체 인구는 두 기술 간의 비교 되었다. 막대 그래프는 n에서 평균 ± 표준 편차를 나타내는 추출 및 분석 결과 형 당 10 생물 복제를 =. 양측 스튜던트 T-검정 가정 불평등 차이에서 P-값이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : Hemolectin 드라이버를 사용 하 여 추출 된 hemocytes의 이미지. Hemocytes w1118;의 80 애벌레에서 추출한 P {w [+ 엠씨] Hml GAL4.Δ =} 2, P {w [+ 엠씨] = UAS-2xEGFP} AH2. Hml 위한 발기인 UAS EGFP 전사 및 식 활성화를 바인딩하는 hemocytes, 순환에 GAL4 드라이브. hemocytes 고정 하 고 앞에서 설명한20DAPI 물 했다. Hemocytes 연 발된 coverslips에 장착 되며, 미분 간섭 (DIC) 계약과 형광 현미경 검사 법에 의해 몇 군데. 파랑 채널 DAPI와 녹색 채널 스테인드 핵 EGFP 표현 hemocytes 보여줍니다 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8 : qRT-PCR 및 젤 전기 이동 법. IIV6 193R 유전자의 표현 qRT-PCR IIV6 감염 hemocytes에 의해 관찰 되었다. A) 193R 유전자 발현 내부 제어, RpII, 표준화 되었고 비율로 제시. 모의 감염 hemocytes에 대 한 주기 수 있기 때문에이 샘플에서 193R 검색 되지 않습니다 분석을 위한 40의 최대 사이클 수 임의로 설정 했다. 데이터가 n에서 평균 ± 표준 편차를 나타내는 그룹 당 3 생물 복제를 =. P-값에 양측 스튜던트 T-검정 불평등 분산 가정. B)는 qRT-PCR 제품 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9 : 서쪽 오 점 분석. Listeria 항 및 모의 및 Listeria말라 식-3rd 에서 감염된 hemocytes 탈피 초파리 애벌레 1, 2, 및 4 h (탐정) 감염 된 후에 서 부 럽에 의해 결정 됩니다. 총 단백질 농도 Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 의해 단백질 젤의 각 레인에 로드 된의 총 금액을 정상화 하기로 결정 했다. hemocytes 감염 하는 데 사용 하는 inoculum 긍정적인 컨트롤 샘플으로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

메서드 애벌레의 평균 수
hemocyte 추출에 대 한
총 hemocytes의 평균 수
hemolymph
모 세관 추출
(이 방법)
192.44 (SD: 86.05) 105 셀 x 4.56 (SD: 5.83 x 105)
(범위: 70-390, N = 25 재판) (범위: 1.20 x 105 -106 셀 x 2.95)
개별
애벌레의 해 부
26.67 (SD: 11.55) 103 셀 x 8.33 (SD: 6.66 x 103)
(범위: 20-40, N = 10 타석) (범위: 4.00 x 103 -104 셀 x 1.60)
애벌레
모 세관 추출 *
해당 없음 * 해당 없음 *
* hemocytes 모 세관 바늘의 막힘 때문에이 메서드를 사용 하 여 추출 될 수 있었다

표 1: 수의 애벌레를 해 부하 고 hemocytes 다른 기술을 사용 하 여 추출. 해 부 애벌레와 추출 된 hemocytes의 평균 숫자는 여기에 제시 된 방법과 다른 방법 사이 비교 되었다. 우리의 방법은 애벌레와 hemocytes의 높은 숫자의 컬렉션에 결과. 애벌레 모 세관 추출 방법 또한 시도 했다, 그러나 hemocytes 모 세관 팁의 막힘으로 인해 추출 하지 못했습니다.

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Discussion

잘 이해 하려면 어떻게 호스트 세포 감염 될, 이전 안 된 병원 체와 세포 유형 조합4에 실험 하는 경우에 특히 셀, 병원 체의 지역화를 명확 하 게 중요 하다. 동안 감염에 따라 세포질 응답 캐스케이드 공부 생산 병원 체 침입을 나타낼 수 있습니다, 이미징 및 세포 응답 데이터의 조합 병원 체 침입 및 감염을 필수적 이다. 호스트 세포에 병원 체의 2 차원 이미지를 보여 주는 보고서 생산적인 감염을 표시 하는 경향이 있다, 몇 가지 질문 수 호스트 세포에서 초기 병원 체 침입의 타이밍에 대하여 남아 있다. 따라서, 3D 모델을 2D 이미지의 z-섹션 검색에서 재건 이러한 질문을 해결 하 고 호스트 세포 (그림 45)에 병원 체 위치를 나타내는 수 있습니다. 그러나, 기본 hemocytes를 사용 하 여 제한 셀 문화에 그들의 장 수 이다. 이전 보고서 상태 셀 문화 미디어에서 hemocyte 생존은만 8 h18우리의 감염 프로토콜에 24 시간, 하지만 이상 하지 최대 분석 실험을 수행할 수 있었습니다. 따라서, C. burnetii 복제의 높은 수준이 나 어떤 형태에 감염 된 후 2 일 때까지 시작 하지 않는 4-6 일 후 감염30 까지 현저 하 게 큰은 parasitophorous 공포 형성을 관찰할 수 없었습니다. .

어디 끝점 분석 활용 단백질 또는 RNA 분석에 대 한 많은 실험에 대 한 많은 수의 셀 일반적으로 심문에 대 한 충분 한 자료를 생산 하기 위해 필요 합니다. 예를 들어 여기, 우리 사용 하 여 끝점 분석 부 럽 고 3rd 에서 파생 하는 기본 hemocytes에 병원 체 감염의 정도 조사 하 여 qRT-PCR 탈피 초파리 애벌레와 같은. 따라서, 방법을 제시 여기 빠른 애벌레 해 부 및 전 비보 병원 체 감염에 대 한 충분 한 라이브 hemocytes를 포함 하는 hemolymph의 컬렉션에 초점을 맞추고. 이 메서드는 hemolymph 및 hemocytes를 신속 하 게 채택 하는 nanoinjector 사용 하 여를 소개 합니다. 작성자 25%를 포함 하는 hemocytes 배치 FBS hemocyte 생존을 위해 중요 하다. 또한, 감염에 대 한는 비보 전 여기에 제시, hemocytes의 많은 수는 필요 하다. Melanization31,,3233를 피하기 위해, 해 부 및 hemocyte 컬렉션 빠르게 발생 합니다. Hemocyte 추출에 대 한 다른 방법 존재18,,1923, 비보 전 감염에 대 한 hemocytes의 충분히 큰 수를 수집 하는 이러한 방법의 기간이 너무 길었다. 100 µ m 좋은 팁 모 세관 바늘의 막힘으로 이어질 수 있습니다 다른 장기를 차지 하지 않고 hemolymph의 통풍 관에 대 한 도움이 됩니다. nanoinjector의 사용 micromanipulator 단계에 연결 된 경우에 자동 수 있습니다 및 발 페달, 초파리 애벌레의 빠른 해 부에 집중 하는 hemocytes는 애벌레 주변 없이 시간 사용자 조직 또는 세포 문화 미디어. 그럼에도 불구 하 고,는 피 펫의 사용 작성자 전송 위한 hemolymph 최대 걸릴 수 이기도 합니다. 또한, 우리의 방법 해 부; 전에 애벌레 anesthetize CO2 가스 활용 파라핀 영화 커버와 함께 추운 블록의 사용은 또 다른 가능한 방법은23이다. 마지막으로, 작성자의 방울에서 애벌레의 해 부는 hemolymph의 릴리스 동안 파라핀 영화에 집착 손실 됩니다 hemocytes의 수를 줄일 수 있습니다 하지만 모 세관 바늘에 의해 이해에 필요한 시간을 증가 합니다.

상해와 애벌레 표 피 절 개 하는 동안 발생 하는 초파리 에서 일반적인 면역 반응 melanization31,,3233이다. Hemocytes의 추출 하는 동안 우리 추출 다음 10 분으로 일찍 작성자에 hemocytes의 melanization를 관찰 것 이라고 합니다. Melanization 급속 한 과정으로,이 세포 병원 체 감염 실험에서 제외 될 것 이라고. 또한, 항 응고 제 phenylthiourea9부상 하는 동안 phenoloxidase 활성화 시스템 및 melanization를 억제 하기 위해 작성자를 추가할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, melanization 및 apoptosis는 초파리의 타고 난 면역 반응, 그들의 수준을 정량화 다음 hemocyte 추출 및 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 자극 수 있습니다.

많은 양의 단백질 또는 RNA 자료 복구는 서쪽 오 점 등 qRT-PCR 기술에 대 한 요구, RNAseq 등 새로운 기법, 훨씬 적은 입력된 자료, 단일 셀34에서 높은-품질 총 RNA의 약간 10 세 필요 합니다. 이러한 실험적인 질문, 재미 있는 인상 하나가 시작할 수 있는 초파리 hemocytes 크리스탈 셀, plasmatocytes, 및 lamellocytes7을 포함 하는 유형이 다른 인구 때문에와 같은 실험에 각 셀의 transcriptional 응답35를 입력 합니다. 예를 들어 Kurucz 외., 초파리 hemocyte 하위 집합에 사용할 수 있는 격리 하는 데 사용할 수 있는 항 체를 개발 했습니다 transcriptional 또는 proteomic 다양 한 자극에 따라 프로 파일링. 또한, 단일 셀 RNAseq 기술의 최근 개발 각 유형의 세포 항 체의 사용 없이 처음 분리 각 셀 유형36,,3738, transcriptomes를 정의할 수 있습니다. 39. 또한, 하나 질문 어떻게 인간의 혈액 세포 계보를 이해 하는 데 도움이 될 수 있는 hemocyte 하위 집합에 있는 유전자 규칙에 관한 유래 및 노력 비교 유전체학을 통해 고 대 생물에서 진화 물어보세요. 다양 한 실험 기법의 조합이 필요로 이러한 문제 그리고 무척 추 동물 애벌레에서 hemocytes의 많은 수의 분리가 필요한 경우 여기에 설명 된 기술은 이러한 노력에 대 한 유용할 수 있습니다.

여기, 3D의 조합 숫자, 생 화 확 적인 감염의 확인에 대 한 데이터 모델 하는 것이 좋습니다. 미래에 연구, 우리 공동 호스트 현미경 분석에 대 한 단백질을 얼룩이 지기에 의해 면역 반응 및 호스트 세포로 병원 체 침입의 메커니즘을 관찰을 여기에 설명 된 방법을 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgements

우리는 표현 하는 mCherry Coxiella burnetii의 주식을 제공 하기 위한 박사 로버트 Heinzen에 감사입니다. 우리는 비행 주식 제공 무척 추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 및 블루밍턴 재고 센터 제공을 위한 닥터 루이스 테 세이 라 감사 합니다. 이 프로젝트는 NIH 부여 R00 AI106963 (A.G.G.)와 워싱턴 주립 대학에 의해 부분적으로 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

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