中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.

Introduction

細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト - または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)4との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。

いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年5ノーベル化学賞の原点であった。これらすべての方法の間であるパーム6 (Photo-Activated ローカリゼーション顕微鏡) スイッチング蛍光タンパク質を使用して嵐7 fluorophores が付いてまたは dSTORM4 のペアのような単一分子局在に基づく方法従来 fluorophores が付いています。ローカライズするためにこれらすべてのメソッドは、「オフ」状態に (i) 蛍光レポーターのほとんどのスイッチから成っている同じ原理に基づいています」(非蛍光灯)、(ii) それらのサブセットを蛍光の確率論的活性化状態のナノメートル精度、および (iii) できるだけ fluorophores の多くのサブセットをアクティブにするためにこのプロセスの繰り返しと空間的な位置。最終的なイメージは、20 ~ 40 までの横方向の分解能を提供する活性化分子のすべてのローカライズを使用して再構築されます nm。パーム/嵐をできるようにいくつか商品化された光学系のルーチンの実験のための生物学者に今あります。ここでは、1 つのようなシステムは微小管と IFs の結合構造を研究に使用されました。非常に薄い層状の領域を観察する最適ですのですべて単一分子局在ベースのメソッドの間でデュアル カラー dSTORM 手法が選ばれた (< 1 μ m) 付着性のセルの画像解像度の大幅な改善を提供することができます、最小限の時間とお金の投資。確かに、dSTORM は、細胞染色と蛍光抗体法により定期的に使用される標準的な有機色素と互換性がある非常に便利な汎用性の高いテクニックです。

限られている場合は特に、選択バッファーに正しく 2 つの染料が点滅する場合もあるので、実験の条件を最適化する必要がありますデュアル カラー dSTORM 1色 dSTORM 画像は Alexa6478蛍光体を使用して取得する比較的簡単なレーザー パワー。優秀な論文は dSTORM9,1011,12,13, マルチカラー イメージングをセットアップする方法に使用されておりこれらの書類は、詳細に説明の可能なソース成果物と劣化画像の解像度だけでなく、それらを克服する方法。この記事は、細胞の固定、染色、サンプル準備の面で最適な実験条件、画像取得と画像再構成が密な細胞質場合ネットワークと微小管の画像を得るために説明デュアル カラー dSTORM とグリア細胞。簡単に言えば、Chazeau ら12の抽出/固定方法がグリア細胞に適応されポスト固定ステップ、最適化された抗体濃度で使用、10 ミリメートルと嵐バッファー MEA の記載したデンプシー9ら実験のセットアップとサンプル タイプに最適なことが判明します。

グリア細胞は主に 3 種類の場合はタンパク質を表現: ビメンチン、ネスチンと GFAP (グリア細胞の酸性タンパク質の線維性)。これらの 3 つのタンパク質は、アストロ サイト14共重合に示されていた。我々 は以前超解像の構造化照明顕微鏡 (SR SIM) 同じ単一の場合フィラメントのこれらの 3 つの場合の蛋白質を見つけることができます、グリア細胞15と同様の分布と動態表示ことを示した。3 の場合蛋白質の間の類似点のため全体の場合ネットワークの腔は使用レポーターとして。DSTORM を使用すると、回折では不可能でしたが微小管に沿って場合フォーム バンドルが顕微鏡技術15に限られた解決することができた。これらの観察は、ビメンチン IFs にテンプレート微小管ことができる方法を理解し、彼らの成長の軌道の細胞移行16中極性軸の整備を推進を規制できます。超解像画像 2 つの細胞骨格サブシステムの相互作用に重要な情報を提供し、空間協会とセル型特定17となるローカル関数間のリンクへの洞察力をもたらした。一般に、密度と特異性の面で条件が良い染色に達した、デュアル カラー dSTORM を骨格要素やその他の細胞小器官間のクロストークを勉強する使用できます。この手法は膠芽腫と星の中に、細胞骨格の変化を特徴付けるより役に立つでしょう、最も一般的なと最も悪性の腫瘍の場合蛋白質の表現が、中枢神経系の変更18 19,20,21

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslips 準備 (日 1、30 分)

  1. プラスチック ラックに 18 mm nº1.5H (5 μ m ± 170 μ m) のガラス coverslips を配置します。
  2. アセトン、5 分間浸漬が入った 100 mL ビーカーにラックを置きます。
  3. 無水エタノール、5 分間浸漬が入った 100 mL ビーカー ラックに転送します。
  4. 無水エタノールが入った新しい 100 mL ビーカーにラックを転送し、超音波クリーナー装置にビーカーを置きます (材料の表参照) 室温で。"On"を押すし、10 分間待ちます。
  5. 層流フードの下でラックを入れ、乾燥または乾燥フィルターの空気の流れと coverslips coverslips を聞かせてください。
  6. プラズマ クリーナー装置で coverslips にラックを置きます。真空ポンプのスイッチ、ドアを閉め、真空洗浄直後後 1 分使用、coverslips プラズマにスイッチし 3 分待ちます。それらを保存しません。

2. セルめっき (日 1、20 分)

  1. 10 cm 直径プラスチック シャーレにグリア細胞ライン U373 最小必須培地 (MEM) で 10% 牛胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシンおよび 1% 非本質的なアミノ酸を成長します。
  2. 層流フードの下で 12 ウェル プレートできれいなガラス coverslips を置き、ウェルあたり予熱した細胞用培地 1 mL を追加します。
  3. セル インキュベーター (37 ° C、5% CO2) からの細胞を含んでいる皿を取る。
  4. メディアを削除し、10 mL の PBS を追加します。
  5. PBS を削除し、追加の 1 mL 0.05% トリプシン-EDTA。
  6. 2-3 分のためのインキュベーターに戻って料理を配置します。
  7. 皿の上の 37 ° C で予熱した温かい媒体の 10 mL を追加し、細胞を再懸濁します。
  8. Coverslips を含む 12 ウェル プレートのウェル (細胞の 〜 150 μ L) あたりの種子約 100 000 細胞。
  9. 少なくとも 6 時間 (または一晩) 細胞の拡散を許可するを待ちます。

3. セル固定 (日 2、2 h)

  1. 7 mM の MgCl2、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、150 mM の NaCl、80 mM パイプで骨格バッファーを準備し、6.9 に pH を調整します。
  2. PBS で 1 回洗浄を行う。
  3. PBS を削除し、ゆっくり抽出/固定の解決の井戸あたり 1 mL を追加 (0.3%、0.25% グルタルアルデヒド骨格バッファーでトリトン X-100) 37 ° C で予熱
  4. 60 間インキュベート ルーム温 s。
  5. ソリューションを削除し、優しく骨格バッファーで希釈した予熱と作りたての 4 %pfa (パラホルムアルデヒド) ソリューションの井戸あたり 1 mL を追加します。
    注意:手袋を使用し、化学のフードの下で動作します。
  6. 37 ° C で 10 分間のインキュベーターに戻って 12 ウェル プレートを配置します。
  7. PFA を削除し、ウェルあたり 3 mL の PBS を追加します。
    注:手袋と化学のフードの下で動作し、特定のビンのリサイクル PFA を置きます。
  8. PBS で 2 回洗浄します。
  9. PBS を削除し、グルタルアルデヒドから蛍光をクエンチするために、PBS で希釈した作りたて 10 ミリメートル NaBH4のソリューションを追加します。
  10. 部屋の温度で 7 分間インキュベートします。
  11. 特定のビンのリサイクル NaBH4を置きます。
  12. PBS で洗浄 3 回 5 分。
  13. PBS を削除し、ブロッキング液 (PBS で 5 %bsa 溶液) を追加します。
  14. 部屋の温度 (または一晩で 4 ° C) に 1 時間孵化させなさい。
    注:骨格バッファーは、数ヶ月の常温保存できます。グルタルアルデヒド NaBH4 PFA は、特別な注意 (フード、手袋、および特定のリサイクル ビン) と処理必要があります。ソリューションの追加や優しく細胞の整合性を維持するために削除する必要があります。細胞の乾燥をさせないことが重要です。

4. 免疫染色 (日 2, 5 h)

  1. 抗ビメンチンと抗チューブリンのブロッキング溶液 1: 500 希釈使用一次抗体の溶液を準備します。
  2. パラフィン膜層に希釈した一次抗体 100 μ L 滴を置いて、下向きセルとそれらの上に coverslips に配置。
  3. PBS で 12 ウェル プレートに戻って coverslips いっぱい入れて 2 における一次抗体と細胞を孵化させなさい。軌道シェーカーで室温で PBS のたびに 5 分間 3 回リンスします。
  4. 一方で、抗マウス Alexa647 と抗ラット Alexa555 を使用してブロッキング液で 1:1, 000 の希釈で二次抗体溶液を調製します。室温で 1 h の二次抗体と細胞を孵化させなさい。4.2 のように進んでください。光から細胞を保護します。
  5. PBS でいっぱい 12 ウェル プレートに、coverslip を置きます。軌道シェーカーで室温で PBS のたびに 5 分間 3 回リンスします。PBS を削除し、0.5 mL の PBS 0.1 μ m tetraspeck ビーズの 1 μ L で混合を追加します。
  6. 30 分 PBS で洗浄軌道シェーカーに井戸を置きます。PBS を外し、PBS の 4 %pfa ソリューションと 5 分のセルを孵化させなさい。PBS に 3 回すすぐ。
    注:PBS で 4 ° C で数週間のカップルのため固定セルを格納できます。最後の最後で、免疫染色を行う必要があります。

5. 試料 (日 3、5 分)

  1. アイス バスケットに MEA (システアミン、1 M、pH 8.3)、グルコースオキシダーゼ (100 x, 50 mg/mL)、カタラーゼ (500 x、20 mg/mL) の因数を置きます。
  2. 50 mL のトリス NaCl バッファーを準備 (50 mM トリス、10 mM の NaCl、pH = 8) ブドウ糖 (100 mg/mL) の 10% を添加しました。
  3. 10% ブドウ糖でトリス NaCl バッファーのちょうど 10 mM MEA、0.5 mg/mL (75 U/mL) グルコース酸化酵素は、40 μ g/mL カタラーゼ (80-200 U/mL) のイメージングの前にバッファーをイメージングの 1.2 mL を準備します。
  4. 磁気サンプル ホルダー (例えば chamlide 商工会議所) にラベル付きセルを含む coverslip をマウントし、チャンバーを完全に画像バッファーを追加します。ふたし、イメージングのバッファーと蓋の間に気泡がないことを確認してください。
  5. 無水エタノールとサンプルの下をきれいにし漏れがないことを確認します。グリースを使用して、必要に応じて正しくサンプル ホルダーをシールします。
    注:MEA ソリューション (pH 8.3 HCl を使用して調整)、ブドウ糖酸化酵素 50 mg/ml の在庫および 20 mg/mL の水の中にカタラーゼの在庫の 1 M 在庫を準備し、因数 MEA とグルコース酸化酵素やカタラーゼの年まで 1 ヶ月-20 ° C で保存します。因数は再冷凍しないでください。トリス NaCl バッファーを事前に準備、それを数ヶ月常温で保存します。実験 (ステップ 5.3) の日に血糖値を追加します。

6. 画像の取得 (日 3、セルごとの ~ 1 h)

  1. 顕微鏡を切り替えます。集録ソフトウェアに切り替えるし、システムを起動を押します。
  2. セットアップ マネージャー ツール グループで買収タブ展開イメージ投射セットアップツールを選択します。買収のレーザー WF (広視野) モードを選択します。100 X ナ 1.46目的を選択します。照らされている視野を減らすためのコリメーターを使用して全反射 u HPモードを選択し、小さな領域にレーザー エネルギーを集中します。Optovarレンズ 1.6 倍100 nm のピクセル サイズを使用します。
  3. 時系列ツールを選択し、50 000 のフレームとフレーム間 0.0 ms の時間経過を設定します。集録パラメーター ツール グループチャンネルツールを展開し、「すべて表示」を選択します。
  4. Alexa647 トラックを設定: チェック、642 と 405 レーザー励起用ラインとオンに受け入れます。イメージング セットアップで"655 LP"排出フィルターを選択します。「647」の名前を変更します。
  5. '+'チャンネルツールで別の光パスを追加し、モードを選択するにはクリックして"スイッチ トラックごと: フレーム」イメージ投射セットアップツールで。561, 488 と 405 レーザー ラインを確認し、オンに受け入れます。選択、"BP 570-650 + LP750"排出フィルターし、optovar レンズ 1.6 を使用して x。全反射 uHP モードが選択されていることを確認します。トラック「555」の名前を変更します。
  6. アクイジション ・ モードツールを選択し、フレーム サイズを 200 × 200 ピクセルに設定します。フォーカス デバイスと戦略ツールを選択し、(フォーカス ロック システムが存在する場合) 1 000 フレームに明確なフォーカスを設定します。
  7. 目的のオイルを入れてサンプルを置きます。[検索] タブを選択し、蛍光ランプのシャッターを開きます。フォーカスを検索し、画像の接眼レンズを使用するセルを探します。ジョイスティックを使用してビューのフィールドの中央にそれを置きます。
  8. アクイジション ・ モードに戻って取得] タブを選択します。「647」トラックを選択して、642 レーザパワーを 0.2% に設定、405 レーザー パワーを 0 に設定、露出時間を 50 ms と 50 の利得に設定。画面上のセルを観察する連続集録モードを選択します。フォーカスを調整します。ビューのフィールドの少なくとも 1 つの tetraspeck ビーズがあることを確認、必要に応じてそれらを参照するコントラストを増加します。ディスプレイの自動サイズ調整モードを使用します。スナップをクリックしてビメンチン ネットワークの広視野落射蛍光画像を取るし、それを保存します。全反射照明をチェックするには、全反射をつけ、照明の均一なフィールドとそれを保存する必要がある場合、照明やコリメータの角度を調整します。
    注: それは全反射と epifluorescent の画像が高品質の raw データ集録を開始する前にいることが重要です。不連続、非一様にラベル付きのフィラメントは質の悪い dSTORM 画像に上昇を与えます。
  9. 「647」トラックをオフに選択し、「555」トラックを確認します。微小管ネットワークの落射蛍光画像を撮影し、それを保存します。全反射画像を取るし、あまりにもそれを保存します。
  10. 「555」トラック オフに、[、"647"トラックをチェックし、、連続を押します。ゲインを 0 に置くし、10 さんに露出時間を濃い状態 (~ 2 kW/cm2) Alexa647 染料のほとんどをポンプするために 642 nm レーザー パワーを 100% に設定します。一度、fluorophores が付いて 15 ms への暴露を入れて点滅を開始し、300 を得る。照明の全反射モードを選択します。自動スケールなし範囲インジケーターモードを使用して、単一分子信号が (赤い色で示される) カメラを飽和させないことを確認します。その場合は、彩度が消えるまでゲインを減少します。Tetraspeck ビーズ獲得の初めに飽和状態のままです。セルの連続観測を停止する停止を押します。
  11. オンライン処理ツールを展開し、集録時に嵐の画像を視覚化するオンライン パームの処理をチェックします。次のパラメーターを使用する: ピーク マスク サイズ (9 ピクセルの直径)、および騒音ピーク強度の 6 の 9。論文パラメーターは (十分に明るくと重複する) 処理で考慮されて分子を定義します。PAL-統計情報ツールでのプロット タイプを選択:ヒストグラム、およびヒストグラム ソース:精度集録を開始を押してください。
  12. 集録中に再び (フォーカス ロック デバイスがない) 場合に必要に応じて焦点を当てます。(露出、レーザー) のパラメーターを調整し、最終的に (0.001% から開始) 1 μ m 単一分子間の最小距離と fluorophores の中密度を保つために 405 nm レーザー ラインのスイッチ (> 9 ピクセルの 100 nm、マスクのピーク サイズ) (図 1 aB)。分子密度は少し高すぎる、全反射ではなく照明のヒロ (高傾斜・積層光学シート) モードを使用します。これは 20% 増のレーザー出力。ローカリゼーション精度再構成画像の下のヒストグラムのピークが周りや 10 の下に中央揃えされていることを確認 nm。
    注:通常の分子の数は時間とともに減少、405 nm レーザーのパワーは必要に応じてゆっくりと増量します。目的は 10 以下のピークと可能な限り定位精度 (ヒストグラム超解像画像の下に表示) を減少させる、nm (図 1)。椰子の画像も多く明るいビーズがフィールドに存在する場合、必要に応じてコントラストを上げます。
  13. (通常後 40 000 フレーム) 局在化6以上 10 に達したときに、ムービーを停止する停止を押します。0.2% にレーザーを置く (642 nm) と 0 (405 nm)。.Czi 形式で嵐の買収の生データを保存します。チャンネル ツールでトラック「647」をオフに選択し、トラック「555」をチェックします。
  14. 露出時間を 25 ミリ秒に設定し、0 に得る。連続ボタンを押すし、暗い状態 (~ 2 kW/cm2 ) ポンプ Alexa555 染料 100% の 488 561 のレーザーを設定します。始めれば、fluorophores が付いて点滅、250 にゲインを置くヒロ照明モードを使用し、単一分子が範囲インジケーター モードでカメラを飽和させないことを確認します。場合場合は、利得が低下します。停止を押します。488 レーザー出力の 50% を減少させます。
  15. 集録を開始を押してください。集録中に徐々 に飽和度の限界に常にゲインを上げます。視野 (を参照してくださいステップ 6.18) で単一分子の中の密度を保つために 405 nm レーザー力を高める一歩一歩。405 レーザが 15% より高い 488 レーザー出力の 20-30% を減少します。徐々 に減少し、488 分子の点滅は、可能な限り高速を保つために 405 のレーザー ラインを増加させながら。最大強度で 561 励起レーザーと相まって 488 レーザー ラインは 405 レーザー ラインのみでの率の増加に対し両方オンとオフ、fluorophores の率を増加します。
  16. これ以上の分子は、点滅しているときは、(後で約 20000 フレーム) 以上 500 000 のローカライズに達しているときの買収以上を停止します。.Czi 形式で嵐の買収の生データを保存します。
    注:常に他の色の漂白 (または活性化) を避けるためにより高い波長で始まります。定期的に、例えば画像バッファーを変更することが可能です chamlide チャンバーがシールされていないので別のバッファー条件をテストします。561 レーザー パワーが (100 mW のレーザー) と限られている場合にのみ、Alexa 555 染料を使い果たす 488 レーザー ラインを使用してな。

7. 画像再構成 (5 分)

  1. PAL ドリフトツール 8 の最大サイズ自動セグメントモデルに基づく補正タイプを使用します。行で、ドリフトを修正するまで複数回を適用に押します。このモデルに基づく補正は、ドリフトを修正する相互相関解析に基づくアルゴリズムを適用します。
  2. PAL フィルターツールを使用して、ローカライズされた最高分子のみを選択することによって嵐画像の外観を改善します。たとえば、30 に定位精度に制限 nm と 120 180 nm に PSF。
  3. 1 PSF. のレンダリングを選択自動ダイナミック レンジ HR 値が 95% と 90% 値とレンダリング自動ダイナミック レンジ SWF の拡大要因とガウス表示モードと同様、 PAL レンダリングツールで 5 または 10 nm のピクセルの解像度を使用します。最高品質のレンダリングを選択します。
  4. (後処理モード) の [処理] タブのメニューのパームパームに変換を選択します。選択し、適用を押します。形式で作成された画像を保存します。LSM (およびない .czi、非常に重要です)。
    注:取得または取得ソフトウェアの画像処理モードを使用して後の直後に画像再構成を実行できます。オフライン モードが後処理、パラメーター (マスクのピーク サイズ、騒音ピーク強度) の異なる値を持つスタックを再分析することが可能です。常に「重複する分子を破棄」してない「ローカライズ前に平均する」を選択します。

8. 嵐画像 (10 分) のローカリゼーションの精度の推定

  1. あなたの嵐の生データを開き、処理タブパーム方法の選択と、パームを再度イメージを使用します。選択を押します。
  2. 9 と 6 (またはイメージ用に選択したパラメーター) の騒音ピーク強度のピークのマスクのサイズを使用して再建開始に適用を押します。
  3. 四角形グラフィック ツールを選択し、ガラス表面に単分子の周り raw 画像に四角形を描画します。いくつかの単一の分子が通常あります。
  4. プレス適用再度、および四角形の領域の内部に存在分子のみを分析します。
  5. PAL-統計情報ツールでのプロット タイプを選択: ヒストグラム、およびヒストグラム ソース: X 位置、Y 位置、位置ヒストグラムを視覚化します。
  6. 下の画像左上のローカライズの一覧でテーブルを保存します。
  7. X のヒストグラムを作成する、データ解析のソフトウェアを使用しておよび Y 位置 (図 1)。
  8. ガウス関数による分布に合い、σX σYの値を保存します。定位精度 σSMLMを用いて (σX *σY) ^0.5。
  9. 可能な限りとして多くの分子で 8.3 8.8 手順を繰り返し、平均 σSMLM

9. チャンネル登録 (5 分)

  1. フィジー (画像 J) ソフトウェアを使用して各色の嵐画像を開きます。
  2. Tetraspeck ビーズの位置を測定するための杖ツールを選択します。
  3. それぞれのビーズの X と Y のシフトを計算し、それらの平均します。
  4. 計算と 2 番目の画像に変換する「変換」コマンドを使用して X と Y のシフト。
  5. チャンネルを統合コマンドを使用して 2 つの画像をマージします。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

アルファ Plan Apo 100 X 512 x 512 カメラ 50 mW 405 nm と 100 mW 488、561、642 nm 固体レーザ、EMCCD 搭載顕微鏡/570 650 を渡す/655 放出フィルターがロングパス 1.46 の目標とバンド以下に示す代表的な結果を得るのために使用されました。

図 1 aは、対雑音比 raw 画像取得時に使用する分子密度と信号の例を与えます。良い品質の画像は、隣接分子間 〜 1 μ m の最小値が得られます。良い点滅状態で fluorophores が付いてはのみ 1 つのフレーム内に存在する必要があります。画像バッファー条件 (pH、還元剤、酸素システムを消去) を調整する必要があります良い点滅とレーザーに- とオフ-料金の蛍光物質したがって、義務に影響を及ぼすサイクル (、fluorophore に費やしている時間の割合オン状態)9,11図 1 b、それどころか、分子密度が高すぎる単一分子を解決できない raw 画像の例を与えます。

図 1は、すべての分子を検出し、20 000 フレームのスタックからメーカー ソフトウェアによって分析のため定位精度の典型的なヒストグラムを示しています。このヒストグラムは、図 3Bに示す微小管ネットワークの dSTORM イメージに対応します。製造元のソフトウェアによって提供されるローカリゼーション精度の値は、異なる時間ポイント22 (図 1) に局在する分子のポインティング精度を使って値推定次ステップ 8 とよく一致です。

図 2 aは、Alexa647 とビメンチン フィラメント カルビンディン抗体の dSTORM イメージの典型的な例を示しています。解像度の増加は、標準的な広視野顕微鏡 (図 2 b・ C) で取得した画像と比較に明確に観察できます。図 2 Dで表される蛍光強度分布を示す、超解像顕微鏡イメージングは、ビメンチン バンドルを解決することができます。DSTORM 解像度はフィラメント バンドルの現在の数をカウントするのに十分です。

図 3は、それぞれ Alexa647 と Alexa555 ビメンチンとチューブリン ネットワーク カルビンディン抗体のデュアル カラー dSTORM イメージの典型的な例を示します。ビメンチン バンドルがしばしば 2 つの骨格サブシステム間の結合に重要な構造情報を提供する微小管に沿ってローカライズされている 2 つのネットワークのオーバーレイが表示されます。

図 4は、非最適条件で得られた微小 dSTORM 画像のさまざまな例を示します。まず、Alexa488 とバッファーを使用して 143 mM β-メルカプトエタノール (MEA9,10,11の代わりに使用される別の還元的エージェント) と (0.5 mg/mL グルコースオキシダーゼと 40 μ G/ml から成る酸素清掃システムカタラーゼ)、フルオロ瞬いていたが、正確にローカライズされた (低すぎる光子の数) には十分に明るいでした (図 4 a)。第二に、143 mM β-メルカプトエタノール、50 mM MEA 清掃システム酸素と Alexa555 を使用して、fluorophores が付いて暗い状態に励起される可能性があります、したがってできませんよく空間的分離 (高すぎるのデューティ ・ サイクル、すなわち「オン」の状態での時間の割合長すぎます) (図 4 b)。最後に、143 mM β-メルカプトエタノール、50 mM MEA 清掃システム酸素と Alexa568 を使用して、fluorophores が付いてなかった明るいしがゆっくり点滅が非常に長い「オン」と「オフ」状態 (低光子数とあまりにも高いデューティ サイクル) (図 4)。これらのすべての非最適な条件で微小管ネットワークは不十分な超解像画像で表示されます。結論としては、最適な条件が高い光子数と fluorophores が付いてを必要とし、低デューティ サイクル9,10対応するイメージング バッファー。注意最適化密度をラベリングと良い点滅条件を取得するバッファーの状態をイメージング デュアル カラー dSTORM の標準的な手順は、場合に微小管のイメージングに固有ではありません。

ナイキスト ・ シャノンの定理によると少なくとも 10 fluorophores がある必要がある 20 の解像度を持つ nm nm。2次元構造を拡張、デンプシーら推定 μ m2あたり 10 〜4 fluorophores のラベル付けが必要であります。場合ネットワークは高密度のフィラメント、微小管ネットワークに細い (直径 10 nm 対 25 nm 第一次および二次抗体なし) 比較と、2 回以上のローカライズが場合ネットワークを記述するために必要なことを見ました。5 000 のローカライズ/μ m2の場合とそれぞれ 40 000 フレームと 20 000 フレームで得られた微小管の 2500 のローカライズ/µm² と良い画像を得た。最高解像度の画像が得られた σSMLMの局在化の精度 〜 8-12 nm の次のステップ 8 (別の時間に局在した単一分子のポインティング精度点22) プロトコルの推定します。ローカリゼーションの精度の推定 (例を図 1に示すように) の生のデータで検出されたすべての分子から抽出した定位精度のヒストグラムの製造元のソフトウェアによって提供される値とよく一致しました。このような定位精度が ~ 30 の解像度を持つ画像を提供できる nm (2.35 * 精度) 標識の密度が十分に高い場合。我々 は日常的に全角で半分最大 (FWMH) 〜 40 nm のビメンチン フィラメントと微小管幅 FWMH 〜 55 の観察 nm。定位精度とローカリゼーション密度の両方に依存する画像の解像度、両方の条件を考慮して最良の結果をできる実験条件を提供しています。

Figure 1
図 1: 買収とローカリゼーションの精度推定時に単一分子の最適密度。
(B)
左:抗ビメンチンと抗マウス(A)明るい状態の単一分子の最適密度と密度が高すぎて単一のフレームから代表的な raw 画像嵐取得 (ステップ 6.12。) 固定 U373 セルの中に(B)染色Alexa647。右:Raw 画像は、単一分子蛍光レベル (6 セット) ・ ノイズしきい値にピーク強度を超えるが円 (白または赤) に囲まれています。円の直径はピーク マスク サイズ (9 ピクセルに設定) によって設定され、色はない、または分子 (赤) と重なるかどうかを判断します (白)。重複は考慮されません嵐画像再構成のための分子を大量に ((B)) の単一分子鉛の高密度に注意してください。A埋め込み:赤で単一分子とそのガウスの一般的な蛍光強度分布を示すグラフがブラックに収まります。この例では、ローカリゼーションの精度は σx = 6.7 nm。スケール バー、1 μ m. すべての分子の局在精度の(C)の典型的なヒストグラム検出し、メーカー ソフトウェアによって分析します。それは視覚化することができます、オンライン処理のおかげで生データの取得中に定期的に更新されます。このヒストグラムは、図 3Bに示す微小管ネットワークの dSTORM イメージに対応します。(D)左:復興後ガラス表面上の単一分子の嵐画像を表します。右:ガウシアンフィッティング後に得られた X と Y の位置のヒストグラム。X と Y の分布のフィッティング ガウスの定位精度の見積もりを与えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ビメンチン ネットワークの代表 dSTORM イメージ。dSTORM イメージ(A)、対応する標準的な広視野画像(B)(C) U373 グリア細胞プロトコルで説明されているように固定し、Alexa647 とビメンチンのステンド グラスのリーディング エッジを表示のオーバーレイします。ハイライト表示領域の下: ズーム。(D)横強度プロファイル a 拡大画像の黄色の線に沿って B. スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: ビメンチンと微小管ネットワークの代表的なデュアル色 dSTORM イメージ。(A)ビメンチン ネットワークに染まった Alexa647 (図 2 aと同じ)。(B)微小管ネットワークは、Alexa555 ラベルの付いた。ビメンチン (赤) と右上のズーム領域を微小管 (シアン) ネットワークの(C)オーバーレイ。40 000 フレームからローカライズの ~1.5 百万を得たビメンチンの dSTORM 画像。〜 850 000 20 000 フレームからローカライズを得た微小 dSTORM 画像。スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 微小管の非最適撮影条件の例です。とき、fluorophores が付いて点滅が、十分に明るい、Alexa488 ラベルによるチューブリン U373 グリア細胞と 143 mM BetaMercaptoethanol とイメージングのバッファー (A)、脱酸素剤、fluorophores が付いて十分に明るいが、正しくできない場合は枯渇 (利用可能な最大のレーザー力) で暗い状態で点滅ゆっくりで 143 mM の BetaMercaptoethanol、50 mM MEA チューブリンと酸素スカベン ジャー バッファー (B)というラベルの付いた Alexa555 と fluorophores が付いてゆっくりと点滅と明るい Alexa568 を使用してない場合143 mM BetaMercaptoethanol、50 mM MEA と脱酸素剤を含む嵐バッファーのチューブリンをラベル付け(C).これらのすべてのケースで dSTORM 画像は解像度を低下しました。スケール バー、2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: U373 セルのビメンチンと微小管ネットワークの代表的なデュアル色 dSTORM イメージを 5 分のメタノール固定(A)ビメンチンと(B)の微小管ネットワークの付いた Alexa647 と Alexa555 それぞれ強調表示されているズーム。フィラメント ネットワークのグローバルの解像度を下げる細胞質に局在する細胞の前に単一の分子の存在を注意してください。スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6:DSTORM の比較再生像
(A) と雷雨 (フィジー プラグイン) (B) の製造元のソフトウェアによって再建された dSTORM イメージ。(C) オーバーレイのマゼンタの (A) と (B) のグリーン。スケール バー、2 μ m と 500 nm のズーム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

プロトコルの重要なステップ

微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件23。我々 は、最も重要な手順以下リストします。

表面に蛍光物質の非特異的結合を制限する重要なステップは、クリーニング、coverslips したがって dSTORM 画像の背景ノイズを制限します。

PFA (パラホルムアルデヒド) (ステップ n ° 3) とグルタールアルデヒドとトリトン、および固定のミックスを使用して抽出し、固定のソリューションの手順とサンプルを修正お勧めします。固定のプロトコルは、Chazeau et al12から適応された: 我々 は 60 に抽出/固定ステップ インキュベーション時間を減少した s (ステップ 3.4) 骨格バッファーからブドウ糖を削除し、透過の余分な手順を省略しました。このメソッドの利点は、自由に移動する細胞骨格サブユニットが離れて排水が少ない背景12と超解像イメージングを可能ことです。一般的には固定ステップが重要ですのでフィラメント ネットワークの部分的な破壊に (古い PFA、コールド」ソリューションもロング/ショート インキュベーション手順を使用) 悪い固定リード (壊れた微小管、微小セルの前面に到達していないおよび/またはに、低密度)。特にルダックら15に従ってビメンチン ネットワークをイメージだけメタノール固定を使用することが可能ですもに注意してください。ただし、バック グラウンド ノイズは、セル (図 5) の中観察できます。DSTORM 画像を用いてメタノール固定が貧しい品質のセルが場合に彼らはまだものの両方の情報を提供、微小管ネットワークのフィラメント密度の長期的に例えばよう必要があります。のみグルタルアルデヒドで固定は、微小管固定23最高のプロトコルだが、IFs の非常に悪い結果を与えた。

免疫染色では、ラットで産生された抗体の交差反応を最小限に抑える抗マウス抗体を使用することが重要です。我々 の彼らはマウス抗ビメンチンに加えてラット抗チューブリンと非特異的交差反応するため、この理由のための Fab 断片 (抗マウス) を使用できませんでした。

利用可能な限られたレーザー力のため暗い状態に Alexa555 染料をポンプする 488 と 561 nm のレーザー ラインを使用する必要です。ハイパワー 488 レーザー (50% 以下) は、バック グラウンド ノイズも増加しますが良い点滅し、低いデューティ ・ サイクル (fluorophore は時間の割合をオンの状態で使う) を観察する集録時にも必要です。全反射照明モード制限薄い層に蛍光物質の励起 (~ 200 nm ガラス基板上)。それは背景光を減少させることによって信号対雑音比を増加が、励振電力も減少します。ヒロ モードにより、軸断面と効率的な信号対雑音比を最適化することができます。したがって、エピと全反射間の良い中間です。ヒロ モードを使用しては、Alexa555 の蛍光物質は、正しく点滅する高いレーザー パワーを必要とを効率的に刺激する不可欠です。

もう一つの重要なステップは、生データ (手順 6) の習得です。(露出、ゲイン、全反射ともフォーカス フォーカス ブロック デバイスが利用できない場合) アクイジション ・ パラメーターを調整する必要がある映画を取得中。明るい蛍光物質の最適濃度を保つことは重要である (図 1 a): 40 000 フレーム後全体の構造を視覚化するのに十分高いが、各色素の立体的な分離に十分に低いことが必要があります。活性分子の数が小さすぎる場合長いスタックを取得する必要があります。良いイメージを得た 〜 IFs、µm² あたり 5000 ローカライズと微小管の cm ² あたり 2 500 のローカライズ。

変更およびメソッドのトラブルシューティング

新鮮なサンプルで動作することが重要であり、バッファーをイメージングに最適化されました。pH 正確に調整してください、特に、MEA のため。

ビメンチンと微小管は、(WF) 標準的な広視野顕微鏡を用いたイメージング際に均一にラベル付けされたはずです。フィラメントは、古典的な顕微鏡による中断/破線を見て、この超解像を使用する場合は、増幅されます。この場合は、新しいサンプルを準備することをお勧めします。探して断片化された微小管の最適化されていない固定条件 (古い PFA 等) があります。ガラス表面に高いバック グラウンドは、非効率的なブロックから生じる。その場合は、BSA (ウシ血清アルブミン) を FBS (ウシ胎児血清)、置き換えし、インキュベーションの各手順で使用できます。

ラベリングの密度が高すぎる場合 (図 1 b) と押されることは十分に暗いオフ - 状態、最高のレーザー パワーとも中等量 (一次抗体の量を減少させるより良い) 下がるべきである抗体。ただし、新しいサンプルの準備が必要です。一般に、経験的に使用する二次抗体の量を評価する必要があります。

Fluorophores が正常に点滅しない場合 (彼らべき明るい状態で 1 つのフレームの間に)、イメージングのバッファーの pH が正しい (pH 8.3) であることを確認します。(特に MEA) を解決しない場合は、新しいソリューションを準備します。常にチェック (TIRF u_HP) に全反射コリメータがあります。限られたレーザーの力で適切な点滅を得るかもしれない挑戦 (オンとオフの料金と同様色素明るさによって異なりますレーザー パワーの説明に従ってヴァン ・ デ ・ リンデら11)。他の染料のように励起レーザーのより多くの電力が利用可能な14の場合、Alexa488 または Atto488 を探索することができます。

Fluorophores の 40 000 のフレームの終わりの前に点滅が停止する場合は、酸化されているイメージングのバッファーを変更します。バッファー変更後バッファーと蓋の間に気泡がないことを確認します。シール サンプルは、raw で数時間のイメージでした。

嵐映画は、EMCCD を搭載した正規の全反射蛍光顕微鏡で取得した、イメージを再構築に雷雨24を使用することが可能です。ドリフトの補正、画像のフィルタ リングや画像のレンダリングには同様のオプションがあります。雷雨は、フィジー/imageJ ソフトウェアで使用するプラグインです。メーカー ソフトウェアと雷雨 (図 6) 同様の結果が得られました。

ベビーベッド (シクロオクタテトラエン) は、単一分子の局在化の精度向上にイメージングのバッファーに追加することができます。それは Alexa64725サイクルあたり放出される光子の数を増やします。定位精度の向上は確かに観察された (6 まで nm) 嵐バッファーに 2 mM のベッドを追加するで説明されている場合手順 5 または 100 ミリメートルと MEA に従って参照25。ただし、これらの条件で取得中に明るい分子の数が多く減少ベビーベッド、買収の終わりに分子の局在化の合計数を制限して、アンダー サンプリングの場合ネットワークにつながる可能性のあるなしよりも高速です。他のイメージングのバッファーは、Alexa 染料、清掃システム26酸素としてラクターゼと oxyrase を使用する場合などでも動作するように報告されました。このプロトコルではサンプルとイメージング、セットアップの我々 のタイプの解像度の長期的に最良の結果を与えたバッファー組成を報告、各サンプル タイプ ラベルに加えて、バッファーの最適化と固定条件の最適化が必要です。

メソッドの制限と改善の可能性

ここで紹介した方法は、固定セルや 2 D 画像に限られます。標準の全反射蛍光顕微鏡と、EMCCD をセットをイメージングを使用して、最も制限する要因だったレーザー力 (100 mW 561 nm レーザーが点滅 Alexa555 染料を作る足りなかった)。532 nm レーザー ラインはこれらの染料を刺激する方が効率的かもしれません。法の可能な改善は 3 D dSTORM 光乱視27を使用してを実行するでしょう。ラベリングの密度が低いと高められたフレーム数を除いて、プロトコルの最小限の修正が必要になります。3 D デュアル カラー嵐画像は、微小管、特にバンドルを包んだ IFs の方のビューを提供します。同じ固定法と蛍光ファロイジン8の量を最適化を用いたアクチン フィラメントを観察するも可能性がありますに注意してください。3 色の嵐は、3 つの細胞骨格サブシステムの組織を観察するされる可能性があります。

二次抗体が 20 までローカライズ目的のオブジェクトのサイズを増加させる第一次および二次抗体を使用してターゲットから nm。通常、直径 25 nm の微小管の幅を持って 〜 50 nm にラベリングした後。ターゲットと染料との間の距離を向上させる 1 つの可能性は、直接適切な染料で一次抗体をラベルすることです。理想的な有機色素の付いた nanobodies は使用される28をする必要があります。

ここで、次の Endesfelder ら22単一分子の平均ローカリゼーション精度を推定する簡易法だけいたします。画像の全体の解像度を両方のローカリゼーションの精度を考慮し、密度、ラベリングも測定できますフーリエ リング相関アプローチ29を使用します。

チャネルの登録に関するビューのフィールドに完全にすべてのビーズをオーバーレイすることは困難です。複雑な補正は、Chazeau et al 12で見つけることができます。

DNA 塗料 (ナノスケール地形の投射のための DNA ポイント蓄積)30を使用して fluorophores の点滅・ プローブの漂白から生じる制限を克服できます。このメソッドで単一分子のローカリゼーションに必要な点滅が、相補的なターゲットに短い色素標識オリゴヌクレオチドの非定常バインディングによって作成されます。

結論

この記事は、固定細胞における細胞骨格フィラメントの 2 次元でデュアル カラー dSTORM イメージングを実行する堅牢なプロトコルを示します。発見された我々 のサンプルのタイプの固定、反応やイメージングのバッファー面で最適な実験条件の詳細に記載されています。その後、raw データ集録および記録するが点滅のイメージの種類のプロセス (分子密度、信号対雑音比、fluorophore デューティ サイクルなど) dSTORM 画像を再構成、ドリフトとフィルターのデータを修正する方法などを提示します。これらの手順は、一般的なデュアル色 dSTORM イメージングとないタイプ固有のサンプルします。最後に、このテクニックが 2 つの結合の骨格ネットワークの密度の低い組織の解決を支援する方法を示します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

Acknowledgements

ミカエル ・ Lelek、オレシティス Faklaris と有意義な議論のニコラス ・城下町、アンドレイ Aristov と超解像技術のヘルプについてエレナ練とシャイラージャ ・ Seetharaman 原稿の注意深い読書のために感謝します感謝するフランス国立研究機関 (ANR 10 INSB 04; サポート フランス バイオ イメージング インフラストラクチャ ネットワークと同様、UtechS フォトニック バイオ イメージング (Imagopole) Citech のパスツール研究所 (パリ, フランス)未来への投資)、および地方イル (ドメーヌ d プログラム ' 水利 Majeur Malinf) Elyra 顕微鏡の使用のため。この仕事に支えられ、リーグ Contre le がんとフランス国立研究機関 (ANR-16-CE13-0019)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47, (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9, (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6, (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4, (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274, (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216, (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3, (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10, (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38, (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101, (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44, (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30, (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8, (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11, (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10, (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12, (6), 1198-1228 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics