इमेजिंग मध्यवर्ती रेशा और Microtubules 2-आयामी प्रत्यक्ष Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी के साथ

Biology

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Summary

इस पद्धति का समग्र लक्ष्य नमूना तैयारी से छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण के लिए इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों को देने के क्रम में 2d दोहरी रंग dSTORM छवियों microtubules और मध्यवर्ती तंतुओं की निश्चित कोशिकाओं में प्रदर्शन करने के लिए है

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Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

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Abstract

cytoskeleton, actin microfilaments, microtubules, और मध्यवर्ती रेशा से बना (यदि), कोशिका आकार, ध्रुवीकरण, और गतिशीलता के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । actin और microtubule नेटवर्क के संगठन बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है लेकिन आईएफएस की है कि अभी तक पूरी तरह से नहीं विशेषता है । आईएफएस 10 एनएम के एक औसत व्यास है और एक नेटवर्क के रूप में सेल कोशिका द्रव्य भर में विस्तार । वे शारीरिक रूप से आणविक मोटर्स और cytoskeletal लिंकर्स के माध्यम से actin और microtubules के साथ जुड़े रहे हैं । इस तंग एसोसिएशन विनियामक तंत्र है कि तीन cytoskeletal सबसे सेल कार्यों के लिए आवश्यक नेटवर्क के समंवित विनियमन सुनिश्चित करने के दिल में है । यह इसलिए अकेले आईएफएस कल्पना महत्वपूर्ण है और यह भी एक साथ अंय cytoskeletal नेटवर्क के प्रत्येक के साथ । हालांकि, अगर नेटवर्क सबसे सेल प्रकार में अत्यंत घने हैं, विशेष रूप से glial कोशिकाओं में है, जो अपने संकल्प बहुत मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (~ 250 एनएम के पार्श्व संकल्प) के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । प्रत्यक्ष STochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM) परिमाण के एक आदेश के पार्श्व संकल्प में एक लाभ की अनुमति तकनीक है । यहां, हम है कि पार्श्व dSTORM संकल्प दिखाने के लिए अगर नेटवर्क के घने संगठन को हल करने के लिए पर्याप्त है और, विशेष रूप से, अगर microtubules आसपास के बंडलों । इस तरह के तंग एसोसिएशन के लिए इन दो नेटवर्क के समंवित विनियमन में भाग लेने की संभावना है और मई, कैसे vimentin IFs टेंपलेट और स्थिर microtubule संगठन के रूप में अच्छी तरह के रूप में microtubule निर्भर vesicular ्े प्रभाव सकता है समझाओ । अधिक आम तौर पर, हम बताएंगे कि कैसे दोहरे रंग dSTORM तकनीक के साथ दो cytoskeletal घटकों के अवलोकन उनके आपसी संपर्क में नई अंतर्दृष्टि लाता है ।

Introduction

Cytoplasmic मध्यवर्ती रेशा (आईएफएस) 10 एनएम व्यास होमो-या एक कोशिका प्रकार विशिष्ट सबसेट के heteropolymers अगर प्रोटीन हैं । आईएफएस ऐसे सेल गतिशीलता, प्रसार और तनाव प्रतिक्रियाओं के रूप में सेलुलर कार्यों की एक बड़ी रेंज में भाग लेते हैं । उनकी प्रमुख भूमिका तथ्य यह है कि 90 से अधिक मानव रोगों सीधे में उत्परिवर्तनों की वजह से कर रहे है पर प्रकाश डाला है अगर प्रोटीन; उदाहरण के लिए, यदि संरचना में परिवर्तन ट्यूमर विकास के साथ है और1,2,3फैल । वहां सबूत है कि तीन cytoskeleton प्रणालियों के सहयोग से इस तरह के सेल ध्रुवीकरण, विभाजन और प्रवासन2,3के रूप में सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करने के लिए काम बढ़ रहा है । के बाद से वहां स्थानिक वास्तुकला और कार्यों के बीच एक तंग युग्मन है, यह अंय तंतुओं के साथ अगर और बेहतर cytoskeletal पार बात समझ के संरचनात्मक संगठन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आलेख सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक दोहरे रंग dSTORM (प्रत्यक्ष STochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी)4 को निष्पादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है और इसे यदि और microtubules के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो cultureed 2 आयामों में कोशिकाओं (2d) ।

कई सुपर संकल्प तकनीक पिछले एक दशक से अधिक विकसित किया गया है, और वहां खोजों रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार के मूल में 2014 में थे5। इन सभी तकनीकों के बीच एकल अणु स्थानीयकरण-पाम6 (फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी) जो photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन, fluorophores या dSTORM 4 के जोड़े के साथ7 तूफान का उपयोग करता है जैसे तरीकों आधारित है पारंपरिक fluorophores के साथ । इन सभी तरीकों को एक ही सिद्धांत है जो (i) एक "बंद" राज्य "(गैर फ्लोरोसेंट), (ii) में एक फ्लोरोसेंट राज्य में उनमें से एक सबसेट के stochastic सक्रियण के होते है के शामिल है पर आधारित है ताकि स्थानीयकरण के लिए उनके नैनोमीटर सटीकता के साथ स्थानिक स्थिति है, और (iii) इस प्रक्रिया के दोहराव के क्रम में संभव के रूप में fluorophores के कई सबसेट के रूप में सक्रिय करने के लिए । एक अंतिम छवि सक्रिय अणुओं के सभी स्थानीयकरण का उपयोग कर खंगाला है, एक पार्श्व संकल्प प्रदान करने के लिए नीचे ~ 20-40 एनएम । कई व्यावसायिक ऑप्टिकल पाम/तूफान की अनुमति प्रणाली नियमित प्रयोगों के लिए जीव के लिए अब उपलब्ध हैं । यहां, एक ऐसी प्रणाली microtubules और आईएफएस के संरचनात्मक संघ का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सभी एकल-अणु स्थानीयकरण-आधारित विधियों में, डुअल-कलर dSTORM तकनीक का चयन किया गया था, क्योंकि यह अनुयाई कोशिकाओं के बहुत पतले lamellar क्षेत्रों (< 1 µm) का निरीक्षण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और साथ में छवि रिज़ॉल्यूशन का महत्वपूर्ण सुधार प्रदान कर सकता है न्यूनतम समय और धन निवेश । दरअसल, dSTORM एक बहुत ही सुविधाजनक और बहुमुखी तकनीक है कि नियमित रूप से सेलुलर धुंधला और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इस्तेमाल किया मानक कार्बनिक रंजक के साथ संगत है ।

जबकि एक रंग dSTORM छवियों अपेक्षाकृत fluorophore Alexa647 का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं8, दोहरी रंग dSTORM प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन ताकि दो रंजक ठीक से चुना बफर में पलक कर सकते है की आवश्यकता है, खासकर जब वहां सीमित है लेजर शक्ति । उत्कृष्ट कागजात पहले से ही dSTORM9,10,11,12,13, और इन पत्रों के संभावित स्रोतों के विस्तार में समझाने के साथ बहु रंग इमेजिंग स्थापित करने के तरीकों पर उपलब्ध हैं कलाकृतियों और नीचा छवि संकल्प के साथ ही उन्हें दूर करने के लिए कैसे. इस अनुच्छेद में, कोशिकाओं निर्धारण, immunostaining, नमूना तैयारी, इमेजिंग अधिग्रहण और छवि पुनर्निर्माण के मामले में इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों में वर्णित है ताकि घने cytoplasmic की छवियां प्राप्त करने के लिए नेटवर्क और microtubules में दोहरी रंग dSTORM के साथ कोशिकाओं glial । संक्षेप में, निष्कर्षण/Chazeau एट अल12 में वर्णित विधि glial कोशिकाओं के लिए अनुकूलित और एक के बाद निर्धारण कदम, अनुकूलित एंटीबॉडी एकाग्रता, 10 मिमी मेे Dempsey9 एट अल में वर्णित के साथ एक तूफान बफर के साथ इस्तेमाल किया गया था । जो था प्रयोगात्मक सेट अप और नमूना प्रकार के लिए इष्टतम होना पाया ।

Glial कोशिकाओं को मुख्यतः यदि प्रोटीन के तीन प्रकार: vimentin, nestin और GFAP (Glial अंलीय fibrillary प्रोटीन) व्यक्त करते हैं । इन तीनों प्रोटीन्स को astrocytes14में सह-polymerize दिखाया गया । हम पहले सुपर संकल्प का उपयोग कर दिखाया दीप्ति माइक्रोस्कोपी (एसआर सिम) कि इन तीन अगर प्रोटीन एक ही एकल में पाया जा सकता है अगर रेशा और वे glial कोशिकाओं में इसी तरह के वितरण और गतिशीलता प्रदर्शन 15. तीन के बीच समानता के कारण अगर प्रोटीन, vimentin धुंधला पूरे अगर नेटवर्क के लिए एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । dSTORM का प्रयोग, हम कैसे अगर microtubules, जो विवर्तन सीमित माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ संभव नहीं था के साथ फार्म बंडलों को हल करने में कामयाब15। इन टिप्पणियों से यह समझने में मदद मिल सकती है कि vimentin IFs कैसे microtubules टेम्पलेट कर सकता है और उनके विकास पथ को विनियमित करता है, सेल माइग्रेशन के दौरान एक ध्रुवीय अक्ष के रखरखाव को बढ़ावा देता है16. सुपर संकल्प छवियों दो cytoskeletal उपतंत्रों के आपसी संपर्क के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की है, और स्थानिक एसोसिएशन और स्थानीय समारोह जो सेल प्रकार विशिष्ट हो सकता है के बीच कड़ी में अंतर्दृष्टि लाया17। सामान्य तौर पर दोहरे रंग के dSTORM का इस्तेमाल cytoskeletal तत्वों या अन्य प्रकार के organelles के बीच crosstalk का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है बशर्ते कि अच्छी immunostaining स्थितियाँ घनत्व और विशिष्टता की दृष्टि से पहुँची हों. इस तकनीक को बेहतर cytoskeleton परिवर्तन astrogliosis के दौरान और ग्लियोब्लास्टोमा, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सबसे आम और सबसे घातक ट्यूमर है, जहां की अभिव्यक्ति अगर प्रोटीन 18 बदल गया है की विशेषता के लिए उपयोगी हो जाएगा ,19,20,21.

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Protocol

1. Coverslips तैयारी (दिवस 1, 30 मिनट)

  1. प्लेस 18-mm n º 1.5 h (170 µm +/-5 µm) ग्लास coverslips एक प्लास्टिक रैक पर ।
  2. एक 100 मिलीलीटर एसीटोन से भरा चोंच में रैक रखो और 5 मिनट के लिए भिगो दें ।
  3. एक 100 मिलीलीटर निरपेक्ष इथेनॉल से भरा चोंच और 5 मिनट के लिए भिगोने के लिए रैक हस्तांतरण ।
  4. एक नया 100 मिलीलीटर पूर्ण इथेनॉल के साथ भरा चोंच के लिए रैक स्थानांतरण और एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर डिवाइस में चोंच जगह (सामग्री की तालिका देखें) कमरे के तापमान पर । प्रेस "पर" और 10 मिनट के लिए रुको ।
  5. एक लामिना फ्लो हूड के तहत रैक रखो और coverslips सूखी या फ़िल्टर्ड हवा के प्रवाह के साथ coverslips सूखी ।
  6. एक प्लाज्मा क्लीनर डिवाइस में coverslips के साथ रैक रखो । वैक्यूम पंप पर स्विच, दरवाजा बंद करो, 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए वैक्यूम और प्लाज्मा पर स्विच 1 मिनट के लिए । सफाई के बाद शीघ्र ही coverslips का प्रयोग करें । उन्हें स्टोर न करें ।

2. सेल चढ़ाना (दिन 1, 20 मिनट)

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन-Streptomycin, और 10 सेमी व्यास प्लास्टिक पेट्री डिश में 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड के साथ न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) में glial सेल लाइन U373 बढ़ाएँ ।
  2. लामिना फ्लो हूड के तहत 12-अच्छी तरह से प्लेटों में साफ ग्लास coverslips रखें और प्रति अच्छी तरह से पहले से गरम सेल मीडियम की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. सेल मशीन से कोशिकाओं से युक्त पकवान ले लो (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सह2) ।
  4. मीडियम निकालें और 10 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें ।
  5. पंजाबियों को हटाएं और 1 मिलीलीटर 0.05% Trypsin-EDTA जोड़ें ।
  6. पकवान वापस मशीन में 2-3 मिनट के लिए प्लेस ।
  7. डिश पर 37 डिग्री सेल्सियस में गर्म मध्यम गरम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  8. अच्छी तरह से प्रति १०० ००० कोशिकाओं के बारे में बीज (~ 150 कोशिकाओं के µ एल) में 12 अच्छी तरह से प्लेटों कि coverslips होते हैं ।
  9. सेल के प्रसार की अनुमति देने के लिए (या रात भर) कम 6 घंटे के लिए रुको ।

3. सेल निर्धारण (Day 2, 2h)

  1. 80 मिमी पाइप, 7 मिमी MgCl2, 1mM EGTA, 150 मिमी NaCl के साथ cytoskeleton बफर तैयार करें, और 6.9 करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
  2. पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
  3. पंजाबियों निकालें और धीरे से निष्कर्षण/निर्धारण समाधान (0.25% glutaraldehyde, 0.3% ट्राइटन एक्स-100 cytoskeleton बफर में) के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम ।
  4. कमरे के तापमान पर 60 एस के लिए मशीन ।
  5. समाधान निकालें और धीरे से कचौरी और हौसले से तैयार 4% पीएफए (paraformaldehyde) cytoskeleton बफर में पतला समाधान के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    सावधानी: उपयोग दस्ताने और रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं ।
  6. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन में 12-अच्छी तरह से वापस थाली प्लेस ।
  7. पीएफए निकालें और अच्छी तरह से प्रति पंजाब के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: दस्ताने के साथ रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं और एक विशिष्ट बिन में पुनर्नवीनीकरण पीएफए डाल दिया ।
  8. पंजाबियों के साथ दो बार धोएं ।
  9. पंजाबियों को हटा दें और glutaraldehyde से आ रही autofluorescence को बुझाने के लिए, पंजाब में हौसले से तैयार 10 मिमी नभ4 समाधान जोड़ें ।
  10. कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए मशीन ।
  11. एक विशिष्ट बिन में पुनर्नवीनीकरण नभ4 रखो ।
  12. पंजाबियों के साथ तीन बार 5 मिनट धो लें ।
  13. पंजाबियों को हटाने और ब्लॉकिंग समाधान (पंजाब में 5% BSA समाधान) जोड़ें ।
  14. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन (या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर) ।
    नोट: cytoskeleton बफर कुछ महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । पीएफए, नभ4 और glutaraldehyde विशेष देखभाल (हुड, दस्ताने, और विशिष्ट रिसाइकिलिंग डिब्बे) के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । समाधान जोड़ा जाना चाहिए और धीरे से हटाया क्रम में कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखने के लिए । इसके लिए जरूरी है कि कोशिकाओं को सूखने न दें ।

4. Immunostaining (Day 2, 5h)

  1. एंटी-vimentin और एंटी-tubulin का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी का समाधान अवरुद्ध समाधान में 1:500 कमजोर पड़ने के साथ तैयार करें ।
  2. एक तेल फिल्मी परत पर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 µ एल बूंदें रखो और नीचे का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ उन के शीर्ष पर coverslips जगह है ।
  3. 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ गर्मी कोशिकाओं coverslips एक 12-अच्छी तरह से पंजाबियों से भरी थाली में वापस रखो । 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला एक कक्ष के तापमान पर पंजाब में प्रत्येक समय एक कक्षीय शेखर पर ।
  4. इस बीच में, एंटी-माउस Alexa647 और एंटी-रैट Alexa555 का उपयोग करके द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को अवरुद्ध समाधान में 1:1, 000 के एक कमजोर पड़ने पर तैयार करते हैं । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ गर्मी कोशिकाओं । 4.2 की तरह आगे बढ़ें । प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा.
  5. पंजाबियों से भरी 12-वेल प्लेट में coverslip को वापस रख दें । 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला एक कक्ष के तापमान पर पंजाब में प्रत्येक समय एक कक्षीय शेखर पर । पंजाबियों को हटा दें और 0.1 µm tetraspeck मोतियों की 1 µ एल के साथ मिश्रित पंजाब के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर कुओं रखो पंजाबियों के साथ कुल्ला । पंजाबियों को हटाने और पंजाब में एक 4% पीएफए समाधान के साथ 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । पंजाब में तीन बार कुल्ला ।
    नोट: निश्चित कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में सप्ताह के एक जोड़े के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । Immunostaining अंतिम क्षण में किया जाना चाहिए ।

5. नमूना तैयारी (3 दिन, 5 मिनट)

  1. aliquots (cysteamine, 1 एम, पीएच 8.3), ग्लूकोज oxidase (100x, 50 मिलीग्राम/एमएल), catalase (500x, 20 मिलीग्राम/एमएल) एक बर्फ की टोकरी में डाल दिया ।
  2. Tris-NaCl बफर के 50 मिलीलीटर तैयार (50 मिमी Tris, 10 मिमी NaCl, पीएच = 8) ग्लूकोज के 10% के साथ पूरक (100 मिलीग्राम/
  3. केवल 10 मिमी मेे, 0.5 मिलीग्राम/एमएल (75 u/एमएल) ग्लूकोज oxidase, 40 µ जी/एमएल catalase (80-200 U/एमएल) के साथ इमेजिंग से पहले इमेजिंग बफर के 1.2 मिलीलीटर तैयार 10% ग्लूकोज के साथ Tris-NaCl बफर ।
  4. माउंट coverslip चुंबकीय नमूना धारक (जैसे chamlide चैंबर) पर लेबल कोशिकाओं से युक्त है और पूरी तरह से चैंबर को भरने के लिए इमेजिंग बफर जोड़ें । पर ढक्कन रखो और सुनिश्चित करें कि इमेजिंग बफर और ढक्कन के बीच कोई हवा बुलबुला है ।
  5. पूर्ण इथेनॉल के साथ नमूना के नीचे साफ और सत्यापित करें कि वहां रिसाव नहीं है । तेल का उपयोग करने के लिए नमूना धारक को सील ठीक से यदि आवश्यक हो ।
    नोट: 1 एम स्टॉक मेे समाधान तैयार करें (पीएच 8.3 एचसीएल का उपयोग कर समायोजित), ग्लूकोज oxidase का स्टॉक 50 मिलीग्राम/एमएल और catalase के स्टॉक में 20 मिलीग्राम/पानी में एमएल, aliquots बनाने और उंहें-20 के लिए एक महीने के लिए डिग्री विदेश मंत्रालय और ग्लूकोज oxidase और catalase के लिए एक साल के लिए । aliquots को फिर से फ्रीज न करें । Tris-NaCl बफर अग्रिम में तैयार है और कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर यह दुकान । प्रयोग के दिन ग्लूकोज जोड़ें (चरण 5.3).

6. छवि अधिग्रहण (3 दिन, ~ 1 प्रति सेल)

  1. माइक्रोस्कोप पर स्विच करें । अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पर स्विच करें और प्रारंभ सिस्टमदबाएं ।
  2. प्राप्ति टैब का चयन करें । सेटअप प्रबंधक उपकरण समूह में इमेजिंग सेटअप उपकरण का विस् तार करना । अधिग्रहण के लेज़र WF (वाइड फील्ड) मोड का चयन करें । 100X NA 1.46 उद्देश्य का चयन करें । चुनें TIRF यू-HP मोड जो एक संधानक का उपयोग करता है को देखने के क्षेत्र को कम किया जा रहा है और प्रबुद्ध एक छोटे क्षेत्र में लेजर ऊर्जा ध्यान केंद्रित । optovar लेंस 1.6 x का उपयोग करें जो 100nm की पिक्सेल आकार देता है ।
  3. समय श्रृंखला टूल का चयन करें और फ़्रेम के बीच ५० ००० फ़्रेम और 0.0 ms के साथ समय व्यतीत करें । प्राप्ति पैरामीटर उपकरण समूह में चैनल उपकरण का विस्तार करें और "सभी दिखाएं" चुनें ।
  4. Alexa647 ट्रैक सेट: उत्तेजना के लिए 642 और 405 लेजर लाइनों की जांच करें और उंहें चालू करने के लिए स्वीकार करते हैं । इमेजिंग सेटअपमें "655 LP" उत्सर्जन फ़िल्टर का चयन करें । का नाम बदलें "647" ।
  5. चैनल उपकरण में एक और लाइट पास जोड़ने और मोड "स्विच ट्रैक हर: फ़्रेम" में इमेजिंग सेटअप उपकरण का चयन करने के लिए ' + ' पर क्लिक करें । 561, 488 और 405 लेजर लाइनों की जांच करें और उंहें चालू करने के लिए स्वीकार करते हैं । "BP 570-650 + LP750" उत्सर्जन फ़िल्टर का चयन करें और optovar लेंस 1.6 x का उपयोग करें । जांच करें कि TIRF-uHP मोड चयनित है । ट्रैक का नाम बदलें "555" ।
  6. प्राप्ति मोड टूल का चयन करें और फ़्रेम आकार को 200 x 200 पिक्सेल में सेट कर दें । फोकस उपकरणों और रणनीति उपकरण का चयन करें और १ ००० फ्रेम करने के लिए निश्चित ध्यान केंद्रित सेट (अगर वहाँ एक फोकस लॉक सिस्टम है).
  7. उद्देश्य पर तेल डाला और नमूना पर डाल दिया । स्थिति जानें टैब का चयन करें, और प्रतिदीप्ति लैंप का शटर खोलें । फ़ोकस ढूँढें और ऐपिस का उपयोग करके चित्र के लिए कक्ष देखें. इसे देखने के क्षेत्र के केंद्र में जॉयस्टिक का उपयोग कर रखो ।
  8. प्राप्ति मोड पर वापस जाने के लिए प्राप्ति टैब का चयन करें । "647" ट्रैक का चयन करें, 642 0.2% करने के लिए लेजर शक्ति सेट, 405-लेजर शक्ति 0 सेट, 50 एमएस के लिए जोखिम समय निर्धारित और 50 के लाभ । स्क्रीन पर कक्ष का निरीक्षण करने के लिए निरंतर प्राप्ति मोड चुनें । फ़ोकस समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि वहां देखने के क्षेत्र में कम से एक tetraspeck मनका है, इसके विपरीत बढ़ाने के लिए उंहें देखने के लिए यदि आवश्यक हो । प्रदर्शन के लिए एक स्वत: स्केल मोड का उपयोग करें । स्नैप पर क्लिक करके और उसे बचाने के लिए vimentin नेटवर्क के वाइड-फील्ड epifluorescence इमेज लें । TIRF रोशनी की जांच करने के लिए, TIRF पर क्लिक करें, रोशनी और/या संधानक के कोण को समायोजित अगर रोशनी की एक सजातीय क्षेत्र है और इसे बचाने के लिए आवश्यक है ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कच्चे डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले TIRF और epifluorescent छवियों उच्च गुणवत्ता के हैं । सतत, गैर समान रूप से लेबल रेशा गरीब गुणवत्ता dSTORM छवियों को जंम दे देंगे ।
  9. अचयनित "647" ट्रैक और का चयन करें और "555" ट्रैक की जाँच करें. microtubule नेटवर्क की एक epifluorescence छवि ले लो और इसे बचाने के लिए । एक TIRF छवि ले लो और यह भी बचा ।
  10. अचयनित "555" ट्रैक, का चयन करें और "647" ट्रैक की जाँच करें, तो निरंतरदबाएँ. करने के लिए 0 और जोखिम समय 10 ms. के लिए 100% के लिए 642 एनएम लेजर पावर सेट करने के लिए अंधेरे राज्य (~ 2 किलोवाट/2) के लिए Alexa647 रंजक के सबसे पंप करने के लिए रखो । एक बार fluorophores शुरू निमिष, 15 एमएस के लिए जोखिम डाल और 300 को लाभ । रोशन के TIRF मोड का चयन करें । यह सत्यापित करने के लिए स्वत: स्केल के बिना श्रेणी संकेतक मोड का उपयोग करें (लाल रंग द्वारा दर्शाया गया) एकल अणु संकेतों को कैमरे से न संतृप्त करें । उस मामले में, जब तक संतृप्ति गायब हो जाता है लाभ घटाएं । Tetraspeck मोतियों के अधिग्रहण की शुरुआत में संतृप्त रहेगा । कक्ष का निरंतर अवलोकन रोकने के लिए रोकें दबाएं ।
  11. ऑनलाइन प्रसंस्करण उपकरण का विस्तार और अधिग्रहण के दौरान तूफान छवि कल्पना करने के लिए ऑनलाइन प्रसंस्करण हथेली की जांच करें । पीक मास्क आकार (9 पिक्सेल व्यास) के लिए 9, और शोर करने के लिए पीक तीव्रता के लिए 6: निम्न पैरामीटर का उपयोग करें । इन मापदंडों अणुओं है कि खाते में प्रसंस्करण में लिया जाता है (पर्याप्त उज्ज्वल है और अतिव्यापी नहीं) को परिभाषित करेगा । PAL-सांख्यिकी टूल में, प्लॉट प्रकार: हिस्टोग्राम, और हिस्टोग्राम स्रोत: परिशुद्धताचुनें । प्रारंभ प्राप्तिदबाएं ।
  12. अधिग्रहण के दौरान, यदि आवश्यक हो तो refocus (यदि कोई फोकस-लॉक डिवाइस है) । मापदंडों (एक्सपोजर, लेजर शक्तियों) को समायोजित करने और अंत में 405-एनएम लेजर लाइन पर स्विच (०.००१% से शुरू fluorophores का एक मध्यम घनत्व रखने के लिए 1 µm की ंयूनतम दूरी के साथ एक अणु (> 100 एनएम के 9 पिक्सल, पीक मास्क आकार) ( चित्र 1a-B). यदि अणु घनत्व थोड़ा बहुत अधिक है, हिलो का उपयोग करें (अत्यधिक झुका और टुकड़े में ऑप्टिकल शीट) रोशनी के बजाय TIRF के मोड । इससे लेजर पावर 20% तक बढ़ जाएगी । सुनिश्चित करें कि हिस्टोग्राम छवि के नीचे पर स्थानीयकरण शुद्धता का पीक 10 एनएम के आसपास या नीचे केंद्रित है ।
    नोट: आमतौर पर अणुओं की संख्या में समय के साथ कमी आती है, और 405 एनएम लेजर शक्ति धीरे तदनुसार वृद्धि हुई है । लक्ष्य स्थानीयकरण शुद्धता कम करने के लिए है (हिस्टोग्राम सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि के नीचे प्रदर्शित) 10 एनएम (चित्रा 1C) के नीचे एक चोटी के साथ जितना संभव हो । यदि आवश्यक हो तो हथेली की छवि के विपरीत बढ़ाएँ, यदि बहुत अधिक चमकीले मोती क्षेत्र में मौजूद हैं ।
  13. 10 से अधिक 6 स्थानीयकरण (सामांयतया ४० ००० फ़्रेंस के बाद) तक पहुंच जाने पर चलचित्र रोकने के लिए रोकें दबाएं । पराबैंगनीकिरण 0.2% (642 एनएम) और 0 (405 एनएम) के लिए वापस रखो । czi प्रारूप के साथ तूफान अधिग्रहण के कच्चे डेटा को बचाने के । चेक ट्रैक "647" चैनल उपकरण में, और का चयन करें और चेक ट्रैक "555".
  14. 25 एमएस और 0 करने के लिए लाभ के लिए जोखिम समय निर्धारित करें । सतत बटन दबाएँ और 100% पर दोनों 488 और 561 पराबैंगनीकिरण सेट करने के लिए अंधेरे राज्य के लिए Alexa555 रंजक पंप (~ 2 किलोवाट/ एक बार fluorophores निमिष शुरू, 250 को लाभ डाल, हिलो रोशनी मोड का उपयोग करें और जांच करें कि एक अणु रेंज संकेतक मोड के साथ कैमरे से संतृप्त नहीं है । अगर यही स्थिति रही तो नफा घटाएं । रोकेंदबाएं । 488 कम-लेजर शक्ति को 50% ।
  15. प्रारंभ प्राप्तिदबाएं । अधिग्रहण के दौरान, उत्तरोत्तर लाभ बढ़ाने के लिए हमेशा संतृप्ति की सीमा पर हो । कदम से कदम बढ़ाएं 405-एनएम लेजर शक्ति को देखने के क्षेत्र में एक अणु का एक मध्यम घनत्व रखने के लिए (६.१८ कदम देखें) । कम 488 लेजर बिजली 20-30% जब 405 लेजर 15% से अधिक है । तो फिर धीरे घटाएं 488 जबकि 405 लेजर लाइन में वृद्धि क्रम में तेजी से संभव के रूप में अणुओं के निमिष रखने के लिए । 488 लेजर अधिकतम तीव्रता पर 561 उत्तेजना लेजर के साथ मिलकर लाइन दोनों पर और fluorophores के बंद दर बढ़ जाती है, जबकि 405 लेजर लाइन केवल दर पर बढ़ जाती है ।
  16. जब ५०० ००० से अधिक स्थानीयकरण (लगभग २० ००० फ़्रेंस के बाद) या अधिक अणु ब्लिंकिंग नहीं कर रहे हैं, तब तक प्राप्ति रोकें । czi प्रारूप के साथ तूफान अधिग्रहण के कच्चे डेटा को बचाने के ।
    नोट: हमेशा अंय रंग के ब्लीचिंग (या सक्रियण) से बचने के लिए उच्च तरंग दैर्ध्य के साथ शुरू करते हैं । chamlide कक्ष सील नहीं है, के बाद से यह इमेजिंग बफ़र नियमित रूप से परिवर्तित करने के लिए संभव है, विभिन्न बफ़र स्थितियों का परीक्षण करने के लिए उदा. 488 लेजर लाइन का प्रयोग Alexa 555 रंजक को चूस ही जब 561 लेजर शक्ति (100 मेगावाट पराबैंगनीकिरण के साथ) सीमित है आवश्यक है ।

7. छवि पुनर्निर्माण (5 मिनट)

  1. पाल-बहाव उपकरण में, 8 का अधिकतम आकार के साथ स्वत: खंडों के साथ मॉडल-आधारित सुधार प्रकार का उपयोग करें । जब तक बहाव ठीक न हो तब तक एक पंक्ति में एक से अधिक बार लागू करें दबाएं । इस मॉडल आधारित सुधार एक एल्गोरिथ्म पार सहसंबंध विश्लेषण जो बहाव सही पर आधारित लागू होता है ।
  2. पाल-फ़िल्टर उपकरण का उपयोग करना, केवल अणु जो सबसे स्थानीयकृत थे चयन करके तूफान छवि की उपस्थिति में सुधार होगा । उदाहरण के लिए, स्थानीयकरण शुद्धता को 30 एनएम और पीएसएफ को 120-180 एनएम तक सीमित करें ।
  3. PAL-रेंडर टूल में 5 या 10 एनएम के पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करें, साथ ही साथ एक गाऊसी डिस्प्ले मोड, 1 पीएसएफ का विस्तार कारक के साथ । एक 95% मूल्य के साथ ऑटो गतिशील रेंज मानव संसाधन का चयन करें और एक 90% मूल्य के साथ ऑटो गतिशील रेंज SWF प्रस्तुत । श्रेष्ठ गुणवत्ता रेंडर करें चुनें.
  4. संसाधन टैब (पोस्ट-प्रोसेसिंग मोड) के पाम मेनू में, पाम कंवर्टचुनें । प्रेस चुनें और फिर लागूकरें । बनाई गई छवि को किसी स्वरूप से सहेजें । LSM (और न. czi, बहुत महत्वपूर्ण) ।
    नोट: छवि पुनर्निर्माण के अधिग्रहण के बाद तुरंत किया जा सकता है या बाद में अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की छवि प्रसंस्करण मोड का उपयोग कर । बंद लाइन के बाद प्रसंस्करण मोड में, यह मानकों के विभिंन मूल्यों (पीक मुखौटा आकार, शोर करने के लिए पीक तीव्रता) के साथ ढेर reश्लेष करने के लिए संभव है । हमेशा "अतिव्यापी अणुओं को त्यागें" और नहीं "स्थानीयकरण से पहले औसत" चुनें ।

8. एक तूफान छवि के स्थानीयकरण परिशुद्धता के अनुमान (10 मिनट)

  1. अपने तूफान रॉ डेटा खोलें और छवि प्रसंस्करण टैब का उपयोग करें. पाम विधि का चयन करें और फिर हथेली फिर से । का चयन करेंदबाएं ।
  2. 9 के पीक मास्क आकार का उपयोग करके पुनर्निर्माण प्रारंभ करने के लिए लागू करें दबाएं और 6 (या आपके द्वारा छवि के लिए चुने गए पैरामीटर्स) के लिए पीक तीव्रता ।
  3. आयत ग्राफिक्स उपकरण का चयन करें और कांच की सतह पर मौजूद एक एकल अणु के आसपास रॉ छवि पर एक आयत आकर्षित । वहां आम तौर पर कुछ एक अणु वहां हैं ।
  4. फिर से लागू करें दबाएँ, और केवल आयत क्षेत्र के अंदर मौजूद अणुओं का विश्लेषण किया जाएगा.
  5. PAL-सांख्यिकी टूल में, प्लॉट प्रकार का चयन करें: हिस्टोग्राम, और हिस्टोग्राम स्रोत: स्थिति हिस्टोग्राम को विज़ुअलाइज़ करने के लिए X स्थिति या Y स्थिति ।
  6. छवियों के नीचे बाईं ओर स्थानीयकरण की सूची के साथ तालिका सहेजें ।
  7. डेटा विश्लेषण के एक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, X और Y पदों (चित्र 1 d) के हिस्टोग्राम बनाएं ।
  8. वितरणों को एक गाऊसी द्वारा फ़िट करें और σX और σY मानों को सहेजें । स्थानीयकरण प्रेसिजन σSMLMX *σY) ^ 0.5 द्वारा अनुमानित है ।
  9. दोहराएँ चरण 8.3-8.8 पर संभव के रूप में कई अणुओं के रूप में और औसत σSMLM

9. चैनल पंजीकरण (5 मिनट)

  1. फिजी (छवि जे) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक रंग की तूफान छवि खोलें ।
  2. प्रत्येक tetraspeck मोतियों की स्थिति को मापने के लिए छड़ी उपकरण का चयन करें ।
  3. प्रत्येक मनका के लिए एक्स और वाई पाली की गणना और उन्हें औसत.
  4. परिकलित X और Y shifts के साथ दूसरी छवि का अनुवाद करने के लिए "अनुवाद" आदेश का उपयोग करें ।
  5. मर्ज चैनल आदेश का उपयोग कर दो छवियों को मर्ज करें ।

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Representative Results

एक माइक्रोस्कोप से सुसज्जित 50 मेगावाट 405 एनएम और 100 मेगावाट 488, 561 और 642 एनएम ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण, एक EMCCD 512x512 कैमरा, एक अल्फा योजना एपीओ 100X/1.46 उद्देश्य और बैंड दर्रा 570-650/लंबे पास 655 उत्सर्जन फिल्टर नीचे प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

चित्र 1a अणु घनत्व और शोर अनुपात है कि रॉ छवि अधिग्रहण के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए करने के लिए संकेत का एक उदाहरण देता है । अच्छी गुणवत्ता छवियों पड़ोसी अणुओं के बीच ~ 1 µm की एक ंयूनतम के साथ प्राप्त कर रहे हैं । अच्छी निमिष परिस्थितियों में, fluorophores केवल एक फ्रेम में मौजूद होना चाहिए । अच्छा निमिष इमेजिंग बफर शर्तों को समायोजित करने की आवश्यकता है (पीएच, प्रतिवाहिनी एजेंट, ऑक्सीजन सफाई प्रणाली) और लेजर शक्तियों, जो fluorophores की पर और बंद दरों को प्रभावित है, और इसलिए कर्तव्य चक्र (समय के अंश एक fluorophore में खर्च करता है ऑन द स्टेट)9,11. चित्र 1b, इसके विपरीत, कच्चे छवि का एक उदाहरण देता है जहां अणु घनत्व बहुत अधिक है और एक अणु का समाधान नहीं किया जा सकता है ।

चित्रा 1C पता चलता है और २० ००० फ्रेम के एक ढेर से निर्माता सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण के लिए स्थानीयकरण परिशुद्धता के एक ठेठ हिस्टोग्राम दिखाता है । यह हिस्टोग्राम चित्र बीमें दिखाए गए microtubule नेटवर्क की dSTORM छवि से मेल खाती है । निर्माता सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए स्थानीयकरण शुद्धता के मान चरण 8 के बाद अनुमानित मानों के साथ अच्छा अनुबंध में हैं, जो एक ही अणु की इंगित परिशुद्धता का उपयोग करते हुए अलग समय अंक22 (चित्र 1 d) में अनुवादित हैं ।

चित्रा 2a Alexa647 के साथ vimentin रेशा immunolabeled की dSTORM छवि का एक विशिष्ट उदाहरण से पता चलता है । संकल्प में वृद्धि स्पष्ट रूप से एक मानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप (चित्र बीसी) के साथ प्राप्त की छवि के साथ तुलना पर देखा जा सकता है । प्रतिदीप्ति तीव्रता चित्रा 2d शो में प्रतिनिधित्व किया है कि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग vimentin बंडलों को हल करने की अनुमति देता है प्रोफाइल । dSTORM संकल्प बंडलों में मौजूद रेशा की संख्या की गणना करने के लिए पर्याप्त है ।

चित्रा 3 vimentin और tubulin नेटवर्क immunolabeled के दोहरे रंग dSTORM छवि का एक विशिष्ट उदाहरण क्रमशः Alexa647 और Alexa555 के साथ दिखाता है । दो नेटवर्क के ओवरले से पता चलता है कि vimentin बंडलों अक्सर microtubules साथ स्थानीयकृत रहे हैं, दो cytoskeleton उपयंत्रों के बीच युग्मन पर महत्वपूर्ण संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं ।

चित्रा 4 गैर इष्टतम स्थितियों में प्राप्त microtubules के dSTORM छवियों के विभिंन उदाहरणों को दर्शाता है । सबसे पहले, Alexa488 और 143 mM बीटा-mercaptoethanol के साथ एक बफर का उपयोग कर (एक और प्रतिडक्टर9,10,11) के बजाय इस्तेमाल किया एजेंट और एक ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (0.5 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज oxidase और 40 µ ग्राम/ catalase), fluorophores निमिष थे, लेकिन काफी उज्ज्वल नहीं किया गया ठीक स्थानीयकृत (बहुत कम फोटॉन संख्या) (चित्र 4a) । दूसरा, 143 mm बीटा-mercaptoethanol, 50 मिमी मेे और एक ऑक्सीजन सफ़ाई प्रणाली के साथ Alexa555 का उपयोग कर, fluorophores उनके अंधेरे राज्य के लिए पंप नहीं किया जा सकता है और इसलिए नहीं किया जा अच्छी तरह से स्थानिकी अलग (बहुत उच्च कर्तव्य चक्र, यानी समय के अंश "पर" राज्य बहुत लंबा है) (आरेख 4B) । अंत में, 143 मिमी बीटा-mercaptoethanol, 50 मिमी मेे और एक ऑक्सीजन सफ़ाई प्रणाली के साथ, Alexa568 का उपयोग कर, fluorophores उज्ज्वल नहीं थे और धीरे बहुत लंबे समय के साथ निमिष थे "पर" और "बंद" राज्यों (कम फोटॉन संख्या और भी उच्च कर्तव्य चक्र) (चित्र 4c) । इन सभी गैर-इष्टतम स्थितियों में, microtubule नेटवर्क खराब सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों में रेंडर किया गया था । अंत में, इष्टतम शर्तों उच्च फोटॉन संख्या और कम शुल्क चक्र9,संबंधित इमेजिंग बफर में10 के साथ fluorophores की आवश्यकता है । ध्यान दें कि अनुकूलन लेबलिंग घनत्व और इमेजिंग बफर शर्तों अच्छा निमिष शर्तों को प्राप्त करने के लिए दोहरे रंग dSTORM के लिए एक मानक प्रक्रिया है और यदि-microtubule इमेजिंग करने के लिए विशिष्ट नहीं है ।

Nyquist-शैनन प्रमेय के अनुसार, यह आवश्यक है कि कम से fluorophores हर 10 एनएम के लिए 20 एनएम का संकल्प लें । 2d संरचनाओं के लिए विस्तारित, Dempsey एट अल अनुमान है कि एक लेबलिंग ~ 104 fluorophores प्रति µm2 आवश्यक है । के रूप में अगर नेटवर्क सघन है और इसके रेशा पतले है (10 एनएम बनाम 25 एनएम व्यास प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के बिना) microtubule नेटवर्क की तुलना, हमने देखा है कि दो बार और अधिक स्थानीयकरण यदि नेटवर्क का वर्णन करने के लिए आवश्यक हैं । हम ५ ००० स्थानीयकरण के साथ अच्छी छवियां प्राप्त/µm 2 के लिए यदि और 2500 स्थानीयकरण/microtubules के लिए µm ², ४० ००० फ्रेम और २० ००० फ्रेम क्रमशः के साथ प्राप्त की । उच्चतम संकल्प के साथ छवि σSMLM के एक स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ प्राप्त किया गया था ~ 8-12 एनएम प्रोटोकॉल के चरण 8 के बाद अनुमानित (एक भी अलग समय अंक में स्थानीयकृत अणु की परिशुद्धता इशारा करते हुए22) । स्थानीयकरण परिशुद्धता के इस आकलन में कच्चे डेटा ( चित्रा 1Cमें दिखाया गया उदाहरण) के सभी पता लगाया अणुओं से निकाले गए स्थानीयकरण परिशुद्धता के हिस्टोग्राम में दिखाया निर्माता सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की गई मूल्यों के साथ अच्छे समझौते में था. इस तरह के स्थानीयकरण परिशुद्धता ~ 30 एनएम के एक प्रस्ताव के साथ एक छवि प्रदान कर सकता है (2.35 * परिशुद्धता) यदि लेबलिंग घनत्व काफी अधिक है । हम नियमित रूप से आधा अधिकतम (FWMH) पर एक पूर्ण चौड़ाई के साथ vimentin रेशा मनाया ~ 40 एनएम और microtubules ~ 55 एनएम के एक चौड़ाई FWMH के साथ । के बाद से छवि संकल्प दोनों स्थानीयकरण परिशुद्धता और स्थानीयकरण घनत्व पर निर्भर करता है, हम प्रयोगात्मक शर्तों जो सबसे अच्छा खाते में दोनों मानदंडों को लेने के परिणामों की अनुमति प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : अधिग्रहण और स्थानीयकरण सटीक अनुमान के दौरान एकल अणुओं के इष्टतम घनत्व ।
(A-B)
बाएं: प्रतिनिधि उज्ज्वल राज्य में एकल अणुओं की एक इष्टतम घनत्व के साथ एक एकल फ्रेम से कच्चे छवियों (क) और एक बहुत उच्च घनत्व के साथ (ख) तूफान अधिग्रहण के दौरान (कदम ६.१२.) फिक्स्ड U373 कोशिकाओं के साथ दाग विरोधी vimentin और विरोधी माउस Alexa647 । सही: कच्चे छवियां जहां पीक तीव्रता के ऊपर प्रतिदीप्ति स्तर के साथ शोर दहलीज (6 के लिए सेट) के साथ एक अणु हलकों (सफेद या लाल) से घिरा हुआ है । सर्कल व्यास पीक मास्क आकार द्वारा सेट किया गया है (9 पिक्सेल के लिए सेट) और रंग निर्धारित करता है कि क्या अणुओं ओवरलैप (लाल) या नहीं (सफेद). ध्यान दें कि एकल अणुओं के उच्च घनत्व (में (ख)) अतिव्यापी अणुओं जो तूफान छवि पुनर्निर्माण के लिए ध्यान में नहीं लिया जाता है की एक उच्च राशि के लिए सीसा । एक इनसेट: लाल रंग में एक अणु के एक ठेठ प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल दिखा ग्राफ और काले रंग में अपनी गाऊसी फिट । इस उदाहरण में, स्थानीयकरण शुद्धता σx = 6.7 एनएम है । स्केल बार, 1 µm. (C) सभी अणुओं का पता लगाया और निर्माता सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण के लिए स्थानीयकरण परिशुद्धता के ठेठ हिस्टोग्राम । यह कल्पना की जा सकती है और ऑनलाइन प्रसंस्करण के लिए कच्चे डेटा धन्यवाद के अधिग्रहण के दौरान नियमित रूप से अद्यतन किया जाता है । यह हिस्टोग्राम चित्र बीमें दिखाए गए microtubule नेटवर्क की dSTORM छवि से मेल खाती है । (D) बाएं: तूफान की छवि एक ही अणु के पुनर्निर्माण के बाद कांच की सतह पर प्रस्तुत करता है । सही: गाऊसी फिटिंग के बाद प्राप्त एक्स और वाई पदों के हिस्टोग्राम । गाऊसी फिटिंग X और Y वितरण स्थानीयकरण शुद्धता का अनुमान दे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक vimentin नेटवर्क के प्रतिनिधि dSTORM छवि । dSTORM छवि (क), इसी मानक व्यापक क्षेत्र छवि (ख) और ओवरले (ग) एक U373 glial सेल के अग्रणी बढ़त दिखा के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है और Alexa647 के साथ vimentin के लिए दाग । बॉटम: हाइलाइटेड क्षेत्र का ज़ूम । (घ) एक और B. स्केल बार में ज़ूम छवियों पर पीली रेखा के साथ अनुप्रस्थ तीव्रता प्रोफाइल, 2 µm और ज़ूम में 500 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : vimentin और microtubule नेटवर्क के प्रतिनिधि दोहरी रंग dSTORM छवि । (क) Vimentin नेटवर्क Alexa647 के साथ दाग ( चित्र 2aके रूप में ही) । (B) Microtubule नेटवर्क Alexa555 के साथ लेबल । (ग) vimentin (लाल) और दाईं ओर एक ज़ूम क्षेत्र के साथ microtubule (सियान) नेटवर्क के ओवरले । vimentin के dSTORM छवि ४० ००० फ्रेम से बाहर स्थानीयकरण के ~ १,५००,००० के साथ प्राप्त किया गया था । microtubules के dSTORM छवि २० ००० फ्रेम से बाहर ~ ८५० ००० स्थानीयकरण के साथ प्राप्त किया गया था । स्केल बार, 2 µm और ज़ूम में 500 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : microtubules की गैर-इष्टतम इमेजिंग शर्तों के उदाहरण. जब fluorophores पलक लेकिन पर्याप्त उज्ज्वल नहीं है एक Alexa488 लेबलिंग के साथ tubulin में U373 glial कोशिकाओं और 143 mM BetaMercaptoethanol और ऑक्सीजन मेहतर इमेजिंग बफ़र में (A), जब fluorophores पर्याप्त उज्ज्वल हैं, लेकिन ठीक से नहीं किया जा सकता अंधेरे राज्य में समाप्त (अधिकतम लेजर उपलब्ध शक्ति पर) और Alexa555 के साथ धीरे पलक 143 mm BetaMercaptoethanol, 50 मिमी मेे और ऑक्सीजन मेहतर बफर में tubulin लेबल (ख) और जब fluorophores पलक धीरे और उज्ज्वल नहीं कर रहे है Alexa568 का उपयोग लेबल tubulin में एक तूफान बफ़र जिसमें 143 mm BetaMercaptoethanol, 50 mm मेे और ऑक्सीजन मेहतर (C) । इन सभी मामलों में, dSTORM छवियों का संकल्प नीचा है । स्केल बार, 2 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : प्रतिनिधि दोहरे रंग dSTORM एक U373 सेल के vimentin और microtubule नेटवर्क की छवि 5 मिनट के लिए ठंडे मेथनॉल के साथ तय की । (क) Vimentin और (ख) microtubules नेटवर्क Alexa647 और Alexa555 के साथ क्रमशः हाइलाइट किए गए ज़ूम के साथ लेबल । कोशिका द्रव्य में स्थानीयकृत कोशिकाओं के सामने एक अणुओं की उपस्थिति रेशा नेटवर्क के वैश्विक संकल्प को कम ध्यान दें । स्केल बार, 2 µm और ज़ूम में 500 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : dSTORM खंगाला छवियों की तुलना
निर्माता सॉफ्टवेयर (ए) और आंधी (फिजी प्लगइन) (बी) द्वारा dSTORM छवि को खंगाला । (ग) रानी में (क) के ओवरले और (ख) हरे रंग में. स्केल बार, 2 µm और ज़ूम में 500 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण

हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल जो glial कोशिकाओं में microtubules और आईएफएस की dSTORM छवियों में कलाकृतियों को कम करता है । कलाकृतियों नमूना तैयारी और इमेजिंग के हर कदम पर बनाया जा सकता है: निर्धारण, अवरुद्ध, immunolabeling, अधिग्रहण के दौरान बहाव, गैर-इष्टतम निमिष शर्तों23. हम सबसे महत्वपूर्ण चरणों के नीचे की सूची ।

coverslips की सफाई करने के लिए सतह पर fluorophores की गैर विशिष्ट बाध्यकारी सीमा और इसलिए dSTORM छवि में पृष्ठभूमि शोर सीमा के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।

हम glutaraldehyde और ट्राइटन का मिश्रण का उपयोग कर निकासी और निर्धारण समाधान के एक कदम के साथ नमूना फिक्सिंग का सुझाव है, और फिर पीएफए (paraformaldehyde) (चरण n ° 3) के साथ निर्धारण । निर्धारण प्रोटोकॉल Chazeau एट अल12से अनुकूलित किया गया था: हम निष्कर्षण/निर्धारण कदम मशीन 60 एस के लिए समय (3.4 चरण) में कमी आई, cytoskeleton बफर से ग्लूकोज को हटा दें, और permeabilization के अतिरिक्त कदम छोड़ दिया । इस विधि का लाभ यह है कि आज़ादी से चलती cytoskeletal उपइकाइयों दूर सूखा रहे हैं, की अनुमति सुपर कम पृष्ठभूमि के साथ संकल्प इमेजिंग12। अधिक आम तौर पर निर्धारण कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि बुरा निर्धारण (पुराने पीएफए का उपयोग कर, ठंड समाधान, बहुत लंबे/लघु गर्मी कदम) रेशा नेटवर्क का आंशिक विनाश करने के लिए सीसा (टूटी microtubules, microtubules जो सेल के सामने तक नहीं पहुंचते और/ कम घनत्व) । ध्यान दें कि यह भी मेथनॉल निर्धारण का उपयोग करना संभव है, खासकर अगर केवल vimentin नेटवर्क के रूप में Leduc एट अल15में वर्णित छवि है । हालांकि, पृष्ठभूमि शोर कक्ष के अंदर देखा जा सकता है (चित्र 5) । हालांकि dSTORM छवियों मेथनॉल निश्चित कोशिकाओं के साथ प्राप्त गरीब गुणवत्ता के हैं, वे अभी भी क्या दोनों अगर और microtubule नेटवर्क जैसे रेशा घनत्व की अवधि में देखना चाहिए के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । केवल glutaraldehyde के साथ निर्धारण आईएफएस के लिए बहुत गरीब परिणाम दिया है, हालांकि यह microtubule निर्धारण23के लिए सबसे अच्छा प्रोटोकॉल है ।

immunostaining भाग में, यह विरोधी माउस एंटीबॉडी का उपयोग करें जो चूहे में विकसित एंटीबॉडी के साथ पार की प्रतिक्रिया को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम इस कारण के लिए फैब टुकड़े (विरोधी माउस) का उपयोग नहीं कर सकते, क्योंकि वे पार-विशेष रूप से माउस विरोधी vimentin के अलावा चूहे विरोधी tubulin के साथ प्रतिक्रिया ।

सीमित लेजर शक्ति उपलब्ध होने के कारण, यह Alexa555 रंजक अंधेरे राज्य के लिए पंप करने के लिए 488 और 561 एनएम लेजर लाइनों दोनों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । उच्च 488 लेजर पावर (~ 50%) अधिग्रहण के दौरान भी आवश्यक है अच्छा निमिष और कम शुल्क चक्र का पालन (समय एक fluorophore पर राज्य में खर्च करता है के अंश), हालांकि यह पृष्ठभूमि शोर के रूप में अच्छी तरह से बढ़ जाती है । TIRF दीप्ति मोड एक पतली परत में fluorophores के उत्तेजना सीमा (~ ग्लास coverslip ऊपर 200 एनएम) । यह बैकग्राउंड लाइट कम होने से सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाता है, लेकिन उत्तेजना पावर में भी कमी आती है । हिलो मोड अक्षीय अनुभाग की अनुमति देता है और संकेत करने के लिए शोर अनुपात का अनुकूलन करने के लिए कुशल हो सकता है । इसलिए यह महामारी और TIRF के बीच एक अच्छा मध्यवर्ती है । हिलो मोड का उपयोग कुशलतापूर्वक Alexa555 fluorophores, जो उच्च लेजर शक्ति ठीक से झपकी की आवश्यकता को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक है ।

एक और महत्वपूर्ण कदम कच्चे डेटा के अधिग्रहण (6 कदम) है । यह अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करने के लिए आवश्यक है (एक्सपोजर, लाभ, TIRF और यहां तक कि जब कोई ध्यान ब्लॉक डिवाइस उपलब्ध है ध्यान केंद्रित) फिल्म का अधिग्रहण किया है, जबकि. उज्ज्वल fluorophores का एक इष्टतम घनत्व रखते हुए महत्वपूर्ण है (आंकड़ा 1a): यह काफी कम करने के लिए विशेष रूप से प्रत्येक डाई अलग किया जाना चाहिए, लेकिन पर्याप्त उच्च ४० ००० फ्रेम के बाद पूरे संरचना कल्पना । यदि सक्रिय अणुओं की संख्या बहुत कम है, अब ढेर प्राप्त किया जाना चाहिए । हम µm के लिए ² प्रति ~ 5000 स्थानीयकरण के साथ अच्छा चित्र प्राप्त, और microtubules के लिए प्रति सेमी ² २ ५०० स्थानीयकरण ।

संशोधन और विधि का निवारण

यह ताजा नमूनों और अनुकूलित इमेजिंग बफ़र्स के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । पीएच ठीक से समायोजित किया जाना चाहिए, विशेष रूप से विदेश मंत्रालय के लिए ।

Vimentin और microtubules समान रूप से लेबल जब मानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी तकनीक (WF) के साथ imaged दिखना चाहिए । अगर रेशा शास्त्रीय माइक्रोस्कोपी के साथ विराम/धराशायी देखो, यह सुपर संकल्प का उपयोग करते समय परिलक्षित किया जाएगा । इस मामले में नए नमूने तैयार करना बेहतर है । गैर-अनुकूलित निर्धारण शर्तें (पुरानी पीएफए आदि) के कारण microtubules में खंडित हो सकती है । कांच की सतह पर उच्च पृष्ठभूमि एक अकुशल अवरुद्ध से उत्पंन हो सकती है । उस मामले में, BSA (गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और प्रत्येक मशीन कदम में इस्तेमाल किया ।

यदि लेबलिंग घनत्व बहुत अधिक है (आंकड़ा 1b) और पर्याप्त रूप से अंधेरे में नहीं धकेला जा सकता है राज्य, यहां तक कि उच्चतम लेजर शक्ति के साथ, माध्यमिक एंटीबॉडी की मात्रा कम किया जाना चाहिए (प्राथमिक एंटीबॉडी की मात्रा कम से बेहतर). हालांकि, इसके लिए नए नमूनों की तैयारी की आवश्यकता है । सामांय में, यह माध्यमिक एंटीबॉडी की मात्रा का उपयोग करने के लिए empirically मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है ।

fluorophores सामान्य रूप से ब्लिंक नहीं करते हैं (वे केवल एक फ़्रेम के दौरान उज्ज्वल स्थिति में होना चाहिए), जाँच करें कि इमेजिंग बफ़र का पीएच सही है (पीएच 8.3). नई समाधान तैयार करें यदि समस्या बनी रहती है (विशेषतः मेे) । हमेशा जांच लें कि TIRF संधानक (TIRF u_HP) पर है । सीमित लेजर शक्ति के साथ, प्राप्त उचित निमिष चुनौतीपूर्ण हो सकता है (पर और बंद दरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डाई चमक लेजर शक्ति पर निर्भर करता है, के रूप में वान डी Linde एट अल11में वर्णित) । Alexa488 या Atto488 जैसे अन्य रंजक का पता लगाया जा सकता है अगर उत्तेजना लेजर की अधिक शक्ति उपलब्ध है14.

यदि fluorophores ४० ००० फ़्रेम्स के अंत से पहले ब्लिंक करना बंद कर दें, तो ऑक्सीकरण हो सकता है जो इमेजिंग बफ़र परिवर्तित करें । पुष्टि करें कि बफ़र और लिड के बीच कोई एयर बुलबुले बफर परिवर्तन के बाद है । एक रॉ में कुछ घंटों के लिए सील नमूनों की छवि हो सकती है ।

यदि तूफान फिल्में एक नियमित TIRF माइक्रोस्कोप एक EMCCD से सुसज्जित पर प्राप्त कर रहे हैं, यह24 आंधी का उपयोग करने के लिए छवियों को फिर से संगठित करने के लिए संभव है । इसी तरह के विकल्प बहाव सुधार, छवि फ़िल्टरिंग और छवि प्रतिपादन के लिए उपलब्ध हैं । आंधी एक प्लगइन फिजी/imageJ सॉफ्टवेयर के साथ प्रयोग किया जाता है । इसी तरह के परिणाम निर्माता सॉफ्टवेयर और आंधी (चित्रा 6) के साथ प्राप्त किया गया ।

खाट (cyclooctatetraene) इमेजिंग बफर के लिए जोड़ा जा सकता है एकल अणुओं के स्थानीयकरण परिशुद्धता में सुधार होगा । यह Alexa647 के लिए प्रति चक्र उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या को बढ़ाता है25. एक बेहतर स्थानीयकरण परिशुद्धता वास्तव में मनाया गया था (6 एनएम के लिए नीचे) 2 mm खाट जोड़ते समय चरण 5 में वर्णित तूफान बफर के लिए या 100 मिमी विदेश मंत्रालय के रूप में संदर्भ में वर्णित के साथ25। हालांकि, इन स्थितियों में, अधिग्रहण के दौरान उज्ज्वल अणुओं की संख्या बहुत तेजी से खाट के बिना की तुलना में कम हो जाती है, अधिग्रहण के अंत में अणु स्थानीयकरण की कुल संख्या को सीमित और संभावित के तहत अगर नेटवर्क के नमूने के लिए अग्रणी । अंय इमेजिंग बफ़र्स Alexa रंजक के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए, उदाहरण के लिए लैक्टेज और ऑक्सीजन सफाई प्रणाली के रूप में oxyrase का उपयोग कर रिपोर्ट किया गया26। इस प्रोटोकॉल में, हम बफर संरचना की रिपोर्ट जो हमारे प्रकार के नमूनों के लिए संकल्प की अवधि में सबसे अच्छा परिणाम दिया और इमेजिंग की स्थापना की, लेकिन प्रत्येक नमूना प्रकार लेबलिंग और निर्धारण की स्थिति अनुकूलन के अलावा, बफर अनुकूलन की आवश्यकता है ।

विधि की सीमाएं और संभावित सुधार

विधि यहां प्रस्तुत तय कोशिकाओं और 2d छवियों तक ही सीमित है । एक TIRF माइक्रोस्कोप और एक EMCCD के साथ स्थापित एक मानक इमेजिंग का उपयोग करना, सबसे सीमित कारक लेजर शक्तियों था (561 एनएम लेजर के लिए 100 मेगावाट Alexa555 रंजक पलक बनाने के लिए पर्याप्त नहीं था) । एक 532-एनएम लेजर लाइन अधिक इन रंगों को उत्तेजित करने के लिए कुशल हो सकता है । विधि के एक संभव सुधार के लिए 3 डी ऑप्टिकल दृष्टिवैषंय27का उपयोग कर dSTORM प्रदर्शन होगा । यह प्रोटोकॉल के ंयूनतम संशोधनों की आवश्यकता होगी, सिवाय एक कम लेबलिंग घनत्व और एक वृद्धि की फ्रेम संख्या के लिए । 3 डी दोहरी रंग तूफान छवि microtubules के चारों ओर लपेटा आईएफएस की एक बेहतर दृश्य प्रदान करेगा, विशेष रूप से बंडलों में । ध्यान दें कि actin रेशा भी एक ही निर्धारण विधि और फ्लोरोसेंट phalloidin की एक अनुकूलित राशि का उपयोग कर मनाया जा सकता है8। 3 रंग तूफान तीन cytoskeletal उपतंत्रों के संगठन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

माध्यमिक एंटीबॉडी लक्ष्य से 20 एनएम के लिए स्थानीयकृत है के बाद से प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग ब्याज की वस्तु का आकार बढ़ जाती है. आमतौर पर, एक 25 एनएम व्यास microtubule की चौड़ाई ~ 50 एनएम लेबल के बाद होगा । एक संभावना लक्ष्य और डाई के बीच की दूरी में सुधार करने के लिए सीधे उचित रंजक के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल है । आदर्श nanobodies कार्बनिक रंजक के साथ लेबल28इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

हम यहां प्रदान सिर्फ एक सरल तरीका Endesfelder एट अल22निंनलिखित एक अणु के औसत स्थानीयकरण परिशुद्धता अनुमान । चित्र है कि खाते में दोनों स्थानीयकरण सटीक और लेबलिंग घनत्व लेता है के समग्र संकल्प, भी रूपान्तर अंगूठी सहसंबंध दृष्टिकोण का उपयोग कर मापा जा सकता है29

चैनल पंजीकरण के बारे में, यह पूरी तरह से देखने के क्षेत्र में मौजूद सभी मोतियों ओवरले के लिए मुश्किल है. एक और अधिक जटिल सुधार Chazeau एट अल 12में पाया जा सकता है ।

fluorophores और ब्लीचिंग के ब्लिंकिंग की जांच से उत्पंन होने वाली सीमाएं डीएनए-पेंट (नेनो स्थलाकृति में इमेजिंग के लिए डीएनए अंक संचय)30का उपयोग करके दूर की जा सकती हैं । इस विधि में, एक अणु स्थानीयकरण के लिए आवश्यक निमिष अपने पूरक लक्ष्य के लिए लघु डाई-लेबल oligonucleotides के क्षणिक बाध्यकारी द्वारा बनाई गई है ।

निष्कर्ष

यह आलेख स्थिर कोशिकाओं में cytoskeletal रेशा के 2 आयामों में दोहरे रंग dSTORM इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । निर्धारण, हमारे नमूना प्रकार के लिए immunolabeling और इमेजिंग बफ़र के संदर्भ में इष्टतम पाया गया प्रयोगात्मक शर्तों विवरण में वर्णित हैं । फिर, कच्चे डेटा अधिग्रहण की प्रक्रिया और निमिष छवियों है कि दर्ज किया जाना है (अणु घनत्व, शोर अनुपात के लिए संकेत, fluorophore शुल्क चक्र आदि) के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत किया जाता है के रूप में कैसे dSTORM छवियों को फिर से संगठित करने के लिए, बहाव और फिल्टर डेटा सही । इन चरणों के लिए जेनेरिक दोहरे रंग dSTORM इमेजिंग और नहीं नमूना प्रकार विशिष्ट हैं । अंत में, यह दिखाया गया है कि कैसे इस तकनीक को दो युग्मित cytoskeletal नेटवर्क के घने संगठन को हल करने में मदद करता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgements

हम Mickael Lelek, Orestis Faklaris और निकोलस Bourg के लिए उपयोगी चर्चा, एंड्री Aristov और ऐलेना Rensen के लिए सुपर संकल्प तकनीक और शैलजा सीतारमन के साथ मदद के लिए पांडुलिपि के सावधान पढ़ने के लिए धंयवाद । हम कृतज्ञता UtechS नैनोवायर इमेजिंग (Imagopole) Institut पाश्चर के Citech (पेरिस, फ्रांस) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ्रांस-इमेजिंग बुनियादी ढांचा नेटवर्क फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-10-INSB-04 द्वारा समर्थित स्वीकार करते हैं; भविष्य के लिए निवेश), और Elyra माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए Région इले-डे-फ्रांस (प्रोग्राम domaine d'Intérêt Majeur-Malinf). यह काम Ligue Contre le कैंसर और फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-16-CE13-0019) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

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References

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