Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

Biology

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Summary

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen Versuchsbedingungen von Probenvorbereitung zur Bildaufnahme und zum Wiederaufbau zu geben, um 2D dual dSTORM Farbbilder von Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente in festen Zellen durchführen

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Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

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Abstract

Das Zellskelett, bestehend aus Aktin beschäftigt, Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente (IF), spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Polarität und Motilität. Die Organisation der Aktin und Mikrotubuli Netzwerke wurde ausgiebig studiert, aber der IFs ist noch nicht vollständig charakterisiert. IFs haben einen Durchmesser von 10 nm und bilden ein Netzwerk erweitern in der gesamten Zelle Zytoplasma. Sie sind physisch verbunden mit Aktin und Mikrotubuli durch molekulare Motoren und Zytoskeletts linker. Diese enge Verbindung ist das Herzstück der Regulationsmechanismen, die für die koordinierte Regulierung der drei Zellskelett Netze erforderlich für die meisten Zellfunktionen sorgen. Es ist daher entscheidend für IFs allein und auch gemeinsam mit den jeweiligen anderen Zellskelett Netzwerke zu visualisieren. IF-Netzwerke sind jedoch extrem dicht in den meisten Zelltypen, vor allem in Gliazellen, wodurch seine Auflösung sehr schwer zu erreichen mit standard Fluoreszenz-Mikroskopie (laterale Auflösung von ~ 250 nm). Direkte stochastische Wiederaufbau Lichtmikroskopie (dSTORM) ist eine Technik, so dass einen Gewinn in lateraler Auflösung um eine Größenordnung. Hier zeigen wir, dass seitliche dSTORM Auflösung ausreichend, um die dichten Organisation der IF Netze und vor allem IF-Bundles rund um Mikrotubuli zu beheben ist. Solche engen Assoziation wird voraussichtlich in der koordinierten Verordnung dieser zwei Netzwerke und Mai teilnehmen, erklären wie Vimentin IFs Vorlage und stabilisieren Mikrotubuli Organisation sowie Mikrotubuli abhängigen vesikuläre Menschenhandel beeinflussen könnten. Ganz allgemein zeigen wir, wie die Beobachtung des Zytoskeletts Zweikomponenten mit zweifarbige dSTORM Technik bringt neue Einblicke in ihren Wechselwirkungen.

Introduction

Zytoplasmatischen intermediate Filamente (IFs) sind 10 nm Durchmesser Homo- oder Heteropolymers einer Zelle Art spezifische Teilmenge von IF-Proteine. IFs Teilnahme an einer Vielzahl von zellulären Funktionen wie Zell-Motilität, Verbreitung und Stress-Reaktionen. Ihre wichtige Rolle wird durch die Tatsache hervorgehoben, die mehr als 90 Krankheiten beim Menschen direkt durch Mutationen im IF-Proteine verursacht werden; zum Beispiel Veränderungen in der Zusammensetzung der IF begleitet Tumorwachstum und Ausbreitung1,2,3. Es wächst Beweise, die die drei Zytoskelett-Systeme zusammen, um zelluläre Funktionen wie Zelle Polarisation, Teilung und Migration2,3 arbeiten. Da gibt es eine enge Kopplung zwischen Raumarchitektur und Funktionen, ist es entscheidend, erhalten Einblicke in die strukturelle Organisation des IF mit den anderen Filamenten und ein besseres Verständnis des Zytoskeletts Übersprechen. Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur Durchführung der Super-Resolution Technik zweifarbige dSTORM (direkte stochastische optische Rekonstruktion Microscopy)4 und wie es verwendet wird, um die Interaktion zwischen wenn zu untersuchen und Mikrotubuli in feste, kultiviert Zellen in 2 Dimensionen (2D).

Mehrere Super-Resolution-Techniken wurden in den vergangenen zehn Jahren und es gibt Entdeckungen wurden am Ursprung der Nobelpreis für Chemie im Jahr 20145. Unter all diesen Techniken liegt die Einzelmolekül Lokalisierung-basierte Methoden wie PALM6 (Photo-Activated Localization Microscopy) die photoschaltbare fluoreszierende Proteine verwendet STORM7 mit paar Fluorophore oder dSTORM4 mit konventionellen Fluorophore. Alle diese Methoden basieren auf dem gleichen Prinzip besteht aus (i) den Schalter für den Großteil der fluoreszierenden Reporter in einem "off" Zustand"(nicht-fluoreszierende), (Ii) die stochastische Aktivierung einer Teilmenge davon in einem fluoreszierenden Zustand um lokalisieren ihre räumliche Lage mit Nanometer-Genauigkeit und (Iii) die Wiederholung dieses Prozesses um so viele Teilmengen des Fluorophore wie möglich zu aktivieren. Eine endgültige Bild wird rekonstruiert, mit alle Lokalisierungen der aktivierten Moleküle, bietet einen lateralen Auflösung bis zu ~ 20-40 nm. Mehrere kommerzialisierten optische Systeme, so dass PALM/Sturm stehen jetzt für Biologen für routinemäßige Experimente. Hier wurde ein solches System verwendet, um die strukturellen Vereinigung von Mikrotubuli und IFs zu studieren. Unter all den Einzelmolekül-Lokalisierung-basierte Methoden, die zweifarbige dSTORM Technik wurde ausgewählt, weil es gut geeignet, um sehr dünne lamellare Bereiche zu beobachten ist (< 1 µm) von adhärenten Zellen und bieten signifikante Verbesserung der Bildauflösung mit minimale Investition von Zeit und Geld. DSTORM ist in der Tat eine sehr bequeme und vielseitige Technik, die kompatibel mit den standard organischen Farbstoffen zum zellulären Beizen und Immunfluoreszenz routinemäßig eingesetzt.

Während einer Farbe dSTORM Bilder relativ einfach sind zu erhalten, mit dem Fluorophor Alexa6478, erfordert doppelte Farbe dSTORM die Versuchsbedingungen so optimieren, dass zwei Farbstoffen richtig im gewählten Puffer blinken können, vor allem, wenn es begrenzt ist Laserleistung. Ausgezeichnete Papiere sind bereits auf die Methoden zum Einrichten von Multi-Color-Bildgebung mit dSTORM9,10,11,12,13, und diese Papiere im Detail erklären, die möglichen Fehlerquellen Artefakte und degradierten Bildauflösung sowie zu deren Überwindung. In diesem Artikel, der optimalen experimentellen Bedingungen in Bezug auf Zellen Fixierung, Immunostaining, Probenvorbereitung sind bildgebende Erwerb und Bildrekonstruktion beschrieben um Bilder von dichten zytoplasmatischen IF Netze und Mikrotubuli in erlangen Gliazellen mit zweifarbige dSTORM. Kurz, die Extraktion/Fixierung in Chazeau Et Al12 beschriebene Methode wurde an Gliazellen angepasst und mit einem Post-Fixierung Schritt optimierte Antikörper Konzentration verwendet, ein Sturm-Puffer mit 10 mM MEA beschrieben in Dempsey9 Et Al. optimal für den experimentellen Aufbau und Probentyp zu finden.

Gliazellen express vor allem drei Typen von IF-Proteine: Vimentin, nestin und GFAP (glial fibrillary sauren Protein). Diese drei Proteine erwiesen sich in Astrozyten14Co polymerisieren. Wir haben bisher gezeigt, mit Höchstauflösung strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SR-SIM), dass diese drei IF-Proteine in der gleichen einzelnen IF Faden zu finden und sie ähnliche Verteilung und Dynamik in Gliazellen 15anzeigen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den drei IF-Proteinen Vimentin Färbung als Reporter für das gesamte Netzwerk IF diente. Mit dSTORM, konnten wir zu beheben, wie IF Form Bündel entlang der Mikrotubuli, die war nicht möglich mit Beugung Mikroskopie-Techniken15begrenzt. Diese Beobachtungen können helfen, zu verstehen wie Vimentin IFs Vorlage Mikrotubuli und regulieren ihren Wachstumskurs, Förderung der Aufrechterhaltung einer Polarität Achse während Zelle Migration16. Super-Auflösung Schlüsselinformationen auf die gegenseitige Interaktion der beiden Zellskelett Subsysteme zur Verfügung gestellt und brachte einen Einblick in die Verbindung zwischen räumlichen Zuordnung und lokale Funktion Zelltyp spezifische17sein könnte. Im Allgemeinen kann zweifarbige dSTORM das Übersprechen zwischen Zellskelett Elemente oder andere Arten von Organellen, studieren verwendet werden, vorausgesetzt, dass gute Immunostaining Bedingungen in Bezug auf Dichte und Spezifität erreicht werden. Diese Technik nützlich sein wird, die Zytoskelett Änderungen beobachtet, während Astrogliosis und Glioblastom besser zu charakterisieren, die häufigste und bösartigste Tumor des zentralen Nervensystems, wo der Ausdruck von IF-Proteinen ist verändert 18 ,19,20,21.

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Protocol

(1) Deckgläsern Vorbereitung (Tag1, 30 min)

  1. Legen Sie die 18 mm nº1.5H (170 µm + / 5µm) Glasdeckgläser auf einem Kunststoff-Rack.
  2. Setzen Sie das Rack in einen 100-mL-Becherglas gefüllt mit Aceton und für 5 Minuten einweichen.
  3. Übertragung des Racks auf einen 100-mL-Becherglas gefüllt mit absoluten Ethanol und für 5 Minuten einweichen.
  4. Rack auf eine neue 100-mL-Becherglas gefüllt mit absoluten Ethanol übertragen und stellen Sie den Becher in einem Ultraschall-Reiniger-Gerät (siehe Tabelle der Materialien) bei Raumtemperatur. Drücken Sie "on" und warten Sie 10 Minuten.
  5. Rack unter einem Laminar-Flow-Haube und lassen Sie die Deckgläsern trocknen oder Deckgläsern mit gefilterten Luftstrom trocknen.
  6. Setzen Sie das Rack mit Deckgläsern in einem Plasma Reiniger Gerät. Schalten Sie die Vakuumpumpe, schließen Sie die Tür, 3 min. zu machen das Vakuum und schalten Sie das Plasma für 1 min. Einsatz der Deckgläsern kurz nach der Reinigung warten. Lagern Sie sie nicht.

2. Handy-Beschichtung (Tag1, 20 min)

  1. Wachsen Sie die Gliazelle Linie U373 im Minimum wesentliches Medium (MEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % nicht-essentielle Aminosäure in 10 cm Durchmesser Kunststoff Petrischale.
  2. 12-Well-Platten unter der Laminar-Flow-Haube entgegenbringen Sie sauber Glasdeckgläser und 1 mL vorgewärmten Zelle Medium pro Bohrloch.
  3. Nehmen Sie eine Schale mit Zellen aus der Zelle Inkubator (37 ° C, 5 % CO2).
  4. Entfernen Sie das Medium und 10 mL PBS.
  5. Entfernen Sie die PBS und 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA.
  6. Stelle die Schüssel wieder in den Inkubator für 2-3 min.
  7. Fügen Sie 10 mL warmen Medium bei 37 ° C auf dem Teller vorgewärmt und Aufschwemmen der Zellen.
  8. Samen etwa 100 000 Zellen pro Bohrloch (~ 150 µL Zellen) in der 12-Well-Platten, die die Deckgläsern enthalten.
  9. Warten Sie mindestens 6 Stunden (oder über Nacht) zu Zelle ausbreiten können.

3. Zelle Fixierung (Tag2, 2h)

  1. Bereiten Sie des Zytoskeletts Puffers mit 80-mM-Rohre, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl vor, und passen Sie den pH-Wert auf 6,9.
  2. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
  3. Entfernen Sie die PBS und sanft 1 mL pro Bohrloch Extraktion/Fixierung Lösung (0,25 % Glutaraldehyd, 0,3 % Triton x-100 im Zytoskelett Puffer) bei 37 ° c vorgewärmt
  4. Inkubieren 60 s bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen Sie die Lösung und sanft 1 mL pro Bohrloch vorgeheizten und frisch zubereitete 4 % PFA (Paraformaldehyd) Lösung im Zytoskelett Puffer verdünnt.
    Vorsicht: Benutzen Sie Handschuhe und arbeiten unter der chemischen Haube.
  6. Platz 12-Well-Platte wieder in den Inkubator bei 37° C für 10 Minuten.
  7. Entfernen Sie die PFA und 3 mL PBS pro Bohrloch.
    Hinweis: Unter der chemischen Haube mit Handschuhen arbeiten Sie und legen Sie die recycelte PFA in einem bestimmten Lagerplatz.
  8. Zweimal mit PBS waschen.
  9. Entfernen der PBS und frisch zubereiteten 10 mM NaBH4 Lösung verdünnt mit PBS-Puffer um die Autofluoreszenz Glutaraldehyd aus zu löschen.
  10. 7 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  11. Setzen Sie den recycelten NaBH4 in einem bestimmten Lagerplatz.
  12. Waschen Sie dreimal 5 min mit PBS.
  13. Entfernen Sie die PBS zu und fügen Sie die blockierende Lösung (5 % BSA mit PBS-Puffer).
  14. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4 ° C).
    Hinweis: Der Zellskelett Puffer kann für ein paar Monate bei Raumtemperatur gelagert. PFA, NaBH4 und Glutaraldehyd sollten mit besonderer Sorgfalt (Haube, Handschuhe und spezielle recycling-Behälter) behandelt werden. Lösungen sollten hinzugefügt und entfernt sanft um die Integrität der Zellen zu erhalten. Es ist wichtig, nicht die Zellen trocknen lassen.

4. Immunostaining (Tag 2, 5h)

  1. Bereiten Sie die Lösung der primären Antikörper mit Anti-Vimentin und Anti-Tubulin mit einer Verdünnung von 1: 500 in der blockierenden Lösung.
  2. 100 µL Tropfen verdünnter Primärantikörper auf eine Folienschicht Paraffin und stellen Sie die Deckgläsern auf ihnen mit Zellen nach unten.
  3. Inkubieren Sie Zellen mit Primärantikörpern für 2 h Put Deckgläsern zurück in ein 12-Well-Platte gefüllt mit PBS. 5 min jedes Mal mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler dreimal spülen.
  4. In der Zwischenzeit bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Lösung mit Anti-Maus-Alexa647 und Anti-Ratte-Alexa555 in einer Verdünnung von einem 1:1, 000 in der blockierenden Lösung. Inkubieren Sie Zellen mit Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur. Fahren Sie fort wie 4.2. schützt die Zellen vor Licht.
  5. Das Deckglas wieder an einem 12-Well-Platte mit PBS gefüllt. 5 min jedes Mal mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler dreimal spülen. Entfernen der PBS und 0,5 mL PBS mit 1 µL von 0,1 µm Tetraspeck Perlen gemischt.
  6. Setzen Sie die Brunnen auf einem Orbitalschüttler für 30 min. Spülen mit PBS. Entfernen Sie die PBS und inkubieren Sie die Zellen für 5 min mit 4 % PFA-Lösung mit PBS-Puffer. Spülen Sie dreimal mit PBS-Puffer.
    Hinweis: Fixe Zellen können für ein paar Wochen mit PBS-Puffer bei 4 ° c gelagert werden Immunostaining sollte in letzter Minute erfolgen.

(5) Probenvorbereitung (Tag3, 5 min)

  1. Geben Sie Aliquote MEA (Cysteamin, 1 M, pH 8,3), Glukose-Oxidase (100 X, 50 mg/mL), Katalase (500 X, 20 mg/mL) in ein Eis-Korb.
  2. Bereiten Sie 50 mL Tris-NaCl-Puffer (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) mit 10 % der Glukose (100 mg/mL) ergänzt.
  3. Bereiten Sie 1,2 mL von imaging-Puffer kurz vor Bildgebung mit 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) Glukose-Oxidase, 40 µg/mL Katalase (80-200 U/mL vor) in der Tris-NaCl-Puffer mit 10 % Glukose.
  4. Montieren Sie das Deckglas mit beschrifteten Zellen auf dem magnetischen Probenhalter (z.B. Chamlide-Kammer) und fügen Sie den bildgebenden Puffer, um die Kammer vollständig zu füllen. Setzen Sie den Deckel auf und stellen Sie sicher, dass gibt es keine Luftblasen zwischen den bildgebenden Puffer und den Deckel.
  5. Reinigen Sie die Unterseite der Probe mit absoluten Ethanol und stellen Sie sicher, dass es nicht Leck. Verwenden Sie Fett, um dem Probenhalter richtig ggf. versiegeln.
    Hinweis: Bereiten Sie 1 M Lager MEA-Lösung (pH 8,3 mit HCl eingestellt), Lager von Glukose-Oxidase bei 50 mg/mL und Bestand an Katalase bei 20 mg/mL in Wasser, Aliquote und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zu einem Monat für MEA und ein Jahr für Glukose-Oxidase und Katalase. Aliquote nicht wieder einfrieren. Den Tris-NaCl-Puffer im Voraus vorbereitet und es für mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern. Fügen Sie Glukose am Tag des Experiments (Schritt 5.3).

(6) Bildaufnahme (Tag3, ~ 1h pro Zelle)

  1. Schalten Sie das Mikroskop. Schalten Sie die Software zur Datenerfassung und drücken Sie Start System.
  2. Wählen Sie den Erwerb Tab. erweitern das Imaging-Setup -Tool in der Installations-Manager-Tool-Gruppe. Wählen Sie den Laser WF (weites Feld) Modus des Erwerbs. Wählen Sie das Ziel 100 X NA 1,46 . Wählen Sie den TIRF u-HP -Modus, der ein Kollimator verwendet, um das Sichtfeld beleuchteten zu verringern und konzentrieren Sie die Laserenergie in einen kleineren Bereich zu. Verwenden Sie die Optovar 1,6 X Objektiv , das eine Pixelgröße von 100nm gibt.
  3. Wählen Sie das Werkzeug Zeitreihen und Zeitraffer mit 50 000 Rahmen und 0,0 ms zwischen Frames einrichten. Erweitern Sie das Kanäle -Tool in der Parametergruppe Tool Erwerb und wählen Sie "alle anzeigen".
  4. Legen Sie die Alexa647-Strecke: Überprüfen Sie die 642 und 405 Laserlinien für Anregung und akzeptieren, um sie zu aktivieren. Wählen Sie den "655 LP" Emission Filter im Imaging-Setup. Benennen Sie "647".
  5. Klicken Sie auf "+" in der Kanäle -Werkzeug, um einen weiteren leichten Durchlauf hinzufügen und wählen den Modus "Schalter Track jeden: Frame" in der Imaging-Setup -Tool. Prüfen Sie 561, 488 und 405 Laserlinien und akzeptieren Sie, um sie zu aktivieren. Wählen Sie die "BP 570-650 + LP750" Emission filtern und Optovar Objektiv 1,6 X. Überprüfen Sie, dass die TIRF-uHP-Modus ausgewählt ist. Benennen Sie den Track "555".
  6. Wählen Sie das Werkzeug Akquisitionsmodus und legen Sie die Frame-Größe 200 x 200 Pixel. Wählen Sie das Tool Fokus Geräte und Strategie und setzen Sie den bestimmten Fokus auf 1 000 Frames (wenn vorhanden ein Fokus-Lock-System ist).
  7. Öl auf das Ziel und die Probe auf. Wählen Sie die Registerkarte " Suchen ", und öffnen Sie den Verschluss der Fluoreszenz Lampe. Suchen Sie den Fokus und die Zelle zum Bild mit dem Okular. Legen Sie es in der Mitte des Sichtfeldes der Joystick.
  8. Wählen Sie die Registerkarte " Erwerb ", um den Erwerb Modus zurückzukehren. Wählen Sie die "647" Spur, 642-Laserleistung auf 0,2 % festgelegt, die 405-Laserleistung auf 0 gesetzt, die Belichtungszeit auf 50 ms und der Gewinn von 50 festgelegt. Wählen Sie die kontinuierliche Akquisitionsmodus die Zelle auf dem Bildschirm beobachten. Schärfe einstellen. Stellen Sie sicher, es gibt mindestens einen Tetraspeck Wulst in das Blickfeld, erhöhen Sie den Kontrast um sie ggf. zu sehen. Verwenden Sie einen automatische Skalierung Modus für die Anzeige. Nehmen Sie ein Weitfeld-Epifluoreszenz Bild des Netzwerks Vimentin durch Anklicken snap und speichern Sie es. Um die TIRF Beleuchtung zu überprüfen, klicken Sie auf TIRF, passen Sie den Winkel der Beleuchtung bzw. Kollimator, ggf. zu einem homogenen Feld der Beleuchtung haben und speichern Sie es.
    Hinweis: Es ist wichtig, dass die TIRF und Epifluorescent Bilder von hoher Qualität sind, bevor die raw-Daten-Übernahme. Diskontinuierliche und ungleichmäßig beschriftete Borsten werden zu dSTORM Bilder in schlechter Qualität führen.
  9. Deaktivieren Sie die "647" Track wählen Sie und überprüfen Sie die "555" Strecke. Ein Epifluoreszenz Bild von Mikrotubuli-Netzwerk und speichern Sie es. Eine TIRF Bild nehmen und es zu speichern.
  10. Deaktivieren Sie die "555" Spur, wählen Sie und überprüfen Sie die "647" Track, und drücken Sie dann kontinuierlich. Den Gewinn auf 0 setzen und Belichtungszeit bis 10 ms 642 nm Laserleistung auf 100 % eingestellt, um die meisten der Alexa647 Farbstoffe in den dunklen Zustand (~ 2 kW/cm2) Pumpen. Sobald die Fluorophore beginnt zu blinken, setzen die Exposition gegenüber 15 ms und gewinnen auf 300. Wählen Sie die TIRF Beleuchtung. Verwenden Sie den Range Indikator Modus ohne automatische Skalierung, um sicherzustellen, dass Einzelmolekül-Signale die Kamera (durch die rote Farbe gekennzeichnet) nicht sättigen. In diesem Fall verringern Sie den Gewinn, bis die Sättigung verschwindet. Tetraspeck Perlen bleiben gesättigten zu Beginn des Erwerbs. Drücken Sie Stop , um die kontinuierliche Beobachtung der Zelle zu stoppen.
  11. Erweitern Sie die Verarbeitung von Online -Tool zu und überprüfen Sie Online Verarbeitung PALM um das Sturm-Bild während der Akquisition zu visualisieren. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 9 für die Peak Maskengröße (9 Pixel Durchmesser) und 6 für die Peak-Intensität zu Lärm. Thesen-Parameter bestimmen die Moleküle, die bei der Verarbeitung (hell genug und nicht überlappend) berücksichtigt werden. Wählen Sie in der PAL-Statistik -Tool Plot Typ: Histogrammund Histogramm Quelle: Präzision. Drücken Sie Start Erwerb.
  12. Während der Akquisition bei Bedarf (wenn keine Fokusverriegelung Gerät) zu konzentrieren. Passen Sie die Parameter (Exposition, Laserleistungen) und schließlich die 405 nm Laserlinie (ab 0,001 %), eine mittlere Dichte von Fluorophore mit einem Mindestabstand von 1 µm zwischen den einzelnen Molekülen zu halten Einschalten (> 9 Pixel von 100 nm, die Peak Maskengröße) ( Abbildung 1A-B). Wenn die Molekül-Dichte ein wenig zu hoch ist, verwenden Sie den HILO (stark geneigt und kaschiert optische Blatt) Modus der Beleuchtung statt TIRF. Dies wird die Laserleistung um 20 % erhöhen. Stellen Sie sicher, dass der Höhepunkt der Lokalisierung Präzision auf das Histogramm unter dem rekonstruierten Bild, um oder unter 10 zentriert ist nm.
    Hinweis: In der Regel die Anzahl der Moleküle sinkt mit der Zeit, und die 405 nm Laserleistung wird entsprechend langsam erhöht. Ziel ist es, die Genauigkeit der Lokalisierung (Histogramm angezeigt unter dem Super-Resolution-Bild) so viel wie möglich mit einer Spitzenleistung unter 10 verringern nm (Abbildung 1). Erhöhen Sie den Kontrast der PALM-Image, falls erforderlich, wenn zu viele helle Perlen in das Feld vorhanden sind.
  13. Drücken Sie Stop , um den Film zu stoppen, wenn mehr als 106 Lokalisierungen (in der Regel nach 40 000 Frames) erreicht haben. Setzen Sie den Laser wieder auf 0,2 % (642 nm) und 0 (405 nm). Speichern Sie die Rohdaten der Sturm-Übernahme mit dem .czi-Format. Deaktivieren Sie Track "647" Werkzeug "Kanäle" und wählen Sie und überprüfen Sie Track "555".
  14. Die Belichtungszeit auf 25 ms festgelegt und auf 0 zu gewinnen. Drücken Sie die Schaltfläche " fortlaufend " und 100 % auf Pumpe Alexa555 Farbstoffe in den dunklen Zustand (~ 2 kW/cm2 ) 488 und 561 Laser festgesetzt. Sobald die Fluorophore fängt an zu blinken, legte den Gewinn um 250, verwenden Sie den HILO -Beleuchtung-Modus und überprüfen Sie, ob einzelne Moleküle nicht, die Kamera mit der Range-Anzeige-Modus sättigen. Wenn das der Fall ist, verringern Sie den Gewinn. Drücken Sie Stop. Die 488 Laserleistung auf 50 % zu verringern.
  15. Drücken Sie Start Erwerb. Während der Akquisition schrittweise die Verstärkung immer an der Grenze der Sättigung zu erhöhen. Erhöhen Sie Schritt für Schritt die 405 nm Laserleistung, eine mittlere Dichte von Einzelmolekül in das Sichtfeld (siehe Schritt 6.18) zu halten. Die 488 Laserleistung auf 20-30 % zu verringern, wenn der 405 Laser höher als 15 %. Dann sinken Sie allmählich die 488 während der 405 Laserlinie zu erhöhen, um das Blinken der Moleküle so schnell wie möglich zu halten. 488 Laserlinie gepaart mit 561 Erregung Laser mit maximaler Intensität steigt auf sowohl die Tarife der Fluorophore, während 405 Laserlinie nur die weiter steigt.
  16. Die Übernahme, wenn mehr als 500 000 Lokalisierungen (nach ca. 20 000 Frames) erreicht haben, oder mehr zu stoppen, blinkende keine weitere Moleküle. Speichern Sie die Rohdaten der Sturm-Übernahme mit dem .czi-Format.
    Hinweis: Beginnen Sie immer mit der höheren Wellenlänge, Bleichen (oder Aktivierung) von den anderen Farben zu vermeiden. Da die Chamlide Kammer nicht versiegelt ist, ist es möglich den bildgebenden Puffer regelmäßig, z. B. zu ändern, verschiedene Pufferbedingungen zu testen. Mit 488 Laserlinie, die Alexa 555 Farbstoffe zum Abbau ist erforderlich, nur wenn die 561 Laserleistung (mit 100 mW Laser) beschränkt.

(7) Bildrekonstruktion (5 min)

  1. Verwenden Sie im PAL-Drift -Tool Modell-basierte Korrektur mit automatischen Segmente mit einer maximalen Größe von 8. Drücken Sie anwenden mehrmals hintereinander, bis die Drift korrigiert wird. Diese Modell-basierte Korrektur gilt einen Algorithmus basiert auf Kreuzkorrelation Analyse, die die Drift korrigiert.
  2. Mithilfe der Tools zur PAL-Filter verbessern Sie das Aussehen des Bildes Sturm durch die Auswahl nur Moleküle, die am besten lokalisiert wurden. Z. B. begrenzen die Genauigkeit der Lokalisierung bis 30 nm und die PSF auf 120-180 nm.
  3. Verwenden Sie eine Pixelauflösung von 5 oder 10 nm in der PAL-Render -Tool sowie einen "glockenförmig" Anzeigemodus mit Ausbau-Faktor 1 PSF Rendern wählen Sie automatische Dynamikbereich HR mit einem Wert von 95 % und Render Auto Auflösungsbereich SWF-Datei mit einem Wert von 90 %. Wählen Sie beste Qualität rendern.
  4. Wählen Sie PALM konvertieren, im PALM -Menü der Registerkarte " Ablauf " (Post-processing-Modus). Drücken Sie auf auswählen , und dann anwenden. Das erstellte Image mit einem Format zu speichern. LSM (und nicht .czi, sehr wichtig).
    Hinweis: Die Bildrekonstruktion kann unmittelbar nach dem Erwerb oder der späteren Verwendung des Bildverarbeitung-Modus der Datenerfassungs-Software durchgeführt werden. In den Off-Line Post-processing-Modus ist es möglich, die Stapel mit unterschiedlichen Werten der Parameter (Maskengröße Peak, Peak-Intensität zu Lärm) zu diagnostizieren. Wählen Sie immer "verwerfen überlappende Moleküle" und nicht "durchschnittliche vor der Lokalisierung".

(8) Schätzung der Lokalisierung Präzision eines Sturm-Images (10 min)

  1. Öffnen Sie Ihre Sturm-Rohdaten und verwenden Sie die Bildverarbeitung tab. Wählen Sie die PALM -Methode und dann PALM wieder. Drücken Sie, Wählen Sie.
  2. Klicken Sie auf anwenden um den Wiederaufbau unter Verwendung einer Maske Maximalgröße von 9 und eine Peak-Intensität Lärm von 6 (oder die Parameter wählen Sie für das Bild) zu starten.
  3. Wählen Sie das Rechteckwerkzeug Grafik und zeichnen Sie ein Rechteck auf das raw-Bild um ein einzelnes Molekül anwesend auf der Glasoberfläche. In der Regel gibt es dort ein paar einzelne Moleküle.
  4. Presse übernehmen wieder, und nur die Moleküle innerhalb des Rechtecks-Bereichs werden analysiert.
  5. Wählen Sie in der PAL-Statistik -Tool Plot Typ: Histogramm und Histogramm Quelle: X oder Y Position, um die Position Histogramme zu visualisieren.
  6. Speichern Sie die Tabelle mit der Liste der Lokalisierungen auf der linken Seite unter den Bildern.
  7. Mit Hilfe einer Software der Datenanalyse, erstellen die Histogramme der X und Y-Positionen (Abbildung 1).
  8. Passen Sie die Verteilungen von einem Gauß und speichern Sie die σX und σY -Werte zu. Die Lokalisierung Präzision σSMLM wird geschätzt durch (σX *σY) ^ 0.5.
  9. Wiederholen Sie Schritt 8,3 8,8 auf so viele Moleküle wie möglich und die durchschnittliche σSMLM

9. Kanal-Registrierung (5 min)

  1. Öffnen Sie das Sturm-Bild von jeder Farbe mit Hilfe der Software von Fidschi (Bild J).
  2. Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug, um die Positionen der einzelnen Tetraspeck Perlen zu messen.
  3. Berechnen Sie die X- und Y-Schichten für jede Perle und sie im Durchschnitt.
  4. Mit dem Befehl "Übersetzen", das zweite Bild mit den berechneten übersetzen X und Y Schichten.
  5. Verbinden Sie die beiden Bilder mit dem Befehl Kanäle zusammenfügen.

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Representative Results

Ein Mikroskop mit 50 mW 405 nm und 100 mW 488, 561 und 642 nm Festkörperlaser, einer EMCCD Kamera 512 x 512, Alpha Plan Apo 100 X / 1,46 Ziel und Band Pass 570-650 / lange Pass 655 Emission Filter diente für die repräsentativen Ergebnisse dargestellt.

Abbildung 1A gibt ein Beispiel für Molekül Dichte und Signal Rauschabstand, die während der raw-Bildakquisition verwendet werden sollte. Bilder in guter Qualität erhalten Sie mit einem Minimum von ~ 1 µm zwischen benachbarten Molekülen. In gutem blinkenden Zustand sollte Fluorophore in nur einem Bild vorhanden sein. Anpassung der bildgebenden Pufferbedingungen (pH-Wert, reduktive Agent, Sauerstoff Aufräumvorgang System) erfordert gute blinken und Laserleistungen, die Einfluss auf die auf - und ab-Preise der Fluorophore, und daher die Pflicht-Zyklus (der Anteil der Zeit verbringt ein Fluorophor in eingeschalteten Zustand)9,11. Abbildung 1 b, im Gegenteil, gibt ein Beispiel für raw-Bild wo die Molekül-Dichte ist zu hoch und einzelnen Moleküls nicht gelöst werden kann.

Abbildung 1 zeigt ein typisches Histogramm der Lokalisierung Genauigkeiten für alle Moleküle erkannt und analysiert von der Herstellersoftware aus einem Stapel von 20 000 Frames. Dieses Histogramm entspricht das dSTORM Bild von den Mikrotubuli Netzwerk in Abbildung 3 b. Werte der Lokalisierung Genauigkeiten der Hersteller-Software sind in guter Übereinstimmung mit Werten geschätzten folgenden Schritt 8, mit der zeigenden Genauigkeit eines einzelnen Moleküls lokalisiert in der anderen Zeit Punkte22 (Abbildung 1).

Abbildung 2A zeigt ein typisches Beispiel für dSTORM Bild von Vimentin Filamente Immunolabeled mit Alexa647. Die Erhöhung der Auflösung kann deutlich im Vergleich mit dem Bild erworben mit einem standard Weitfeld-Mikroskop (Abb. 2 b-C) beobachtet werden. Die Fluoreszenz-Intensität-Profile dargestellt in Abb. 2D zeigen, dass Super-Auflösung Mikroskopie Bildgebung ermöglicht Vimentin-Bundles zu lösen. Die dSTORM Auflösung ist ausreichend, um die Anzahl der Filamente in die Bündel vorhanden.

Abbildung 3 zeigt ein typisches Beispiel für zweifarbige dSTORM Bild von Vimentin und Tubulin Netzwerke-Immunolabeled mit Alexa647 und Alexa555 beziehungsweise. Die Überlagerung der beiden Netze zeigt, dass die Vimentin Bündel oft entlang der Mikrotubuli, wichtige strukturelle Information über die Kopplung der beiden Teilsysteme Zytoskelett lokalisiert sind.

Abbildung 4 zeigt verschiedene Beispiele von dSTORM Bildern von Mikrotubuli in suboptimale Bedingungen erhalten. Erstens verwenden Alexa488 und einen Puffer mit 143 mM Beta-Mercaptoethanol (eine andere reduktive Agent verwendet anstelle von MEA9,10,11) und ein Sauerstoff-scavenging-System (bestehend aus 0,5 mg/mL Glukose-Oxidase und 40 µg/mL Katalase), das Fluorophore wurden blinkt aber waren nicht hell genug, um genau lokalisierte (zu niedrig Photon Anzahl) werden (Abb. 4A). Zweitens, mit Alexa555 mit 143 mM Beta-Mercaptoethanol, 50 mM MEA und einer Sauerstoff-System aufräumen, das Fluorophore konnte nicht in ihren dunklen Zustand gepumpt werden und daher nicht gut räumlich getrennt (zu hohe Einschaltdauer, d.h. der Bruchteil der Zeit in den Zustand "an" ist zu lang) (Abbildung 4 b). Zu guter Letzt mit Alexa568, mit 143 mM Beta-Mercaptoethanol, 50 mM MEA und einer Sauerstoff-System aufräumen, das Fluorophore waren nicht hell und wurden blinkt langsam mit sehr lange "on" und "off" Staaten (niedrige Photon Nummer und zu hohe Einschaltdauer) (Abbildung 4). In diesen nicht optimalen Bedingungen wurde die Mikrotubuli-Netzwerk schlecht in die Super-Auflösung gerendert. Zusammenfassend, optimale Bedingungen erfordern Fluorophore mit hohem Photon und geringer Einschaltdauer9,10 in der entsprechenden bildgebenden Puffer. Beachten Sie, dass Optimierung Kennzeichnung Dichte und imaging Pufferbedingungen blinkenden gutem Zustand zu erhalten ein Standardverfahren für zweifarbige dSTORM ist und nicht spezifisch für IF-Mikrotubuli Bildgebung ist.

Nach dem Nyquist-Shannon-Theorem, ist es notwendig, Fluorophore mindestens alle 10 haben eine Auflösung von 20 nm nm. Erweiterte 2D Strukturen, schätzungsweise Dempsey Et al. eine Kennzeichnung von ~ 104 Fluorophore pro µm2 notwendig ist. Wie die IF-Netzwerk Dichter ist und die Filamente dünner (10 nm Vs 25 nm Durchmesser ohne die primären und sekundären Antikörper) im Vergleich zu den Mikrotubuli-Netzwerk sind, beobachteten wir, dass weitere Lokalisierungen doppelt notwendig sind, das IF-Netzwerk zu beschreiben. Wir erhalten gute Bilder mit 5 000 Lokalisierungen/µm2 für IF und 2500 Lokalisierungen/µm² für Mikrotubuli, bzw. mit 40 000 Rahmen und 20 000 Rahmen erhalten. Das Bild mit der höchsten Auflösung erhielt mit einer Genauigkeit der Lokalisierung von σSMLM ~ 8-12 nm geschätzt nach Schritt 8 des Protokolls (zeigenden Präzision eines einzelnen Moleküls lokalisiert zu anderen Zeitpunkt Punkte22). Diese Schätzung der Lokalisierung Präzision war in guter Übereinstimmung mit den Werten der Hersteller-Software in einem Histogramm der Lokalisierung Genauigkeiten extrahiert aus den erkannten Molekülen in den Rohdaten (Beispiel in Abb. 1gezeigt) gezeigt. Diese Lokalisierung Präzision könnten ein Bild mit einer Auflösung von ~ 30 nm (2,35 * Präzision) wenn die Kennzeichnung Dichte hoch genug ist. Wir beobachteten routinemäßig Vimentin Filament mit eine volle Breite am halben Maximum (FWMH) von ~ 40 nm und Mikrotubuli mit einer Breite FWMH von ~ 55 nm. Da die Bildauflösung auf die Genauigkeit der Lokalisierung und der Lokalisierung Dichte abhängt, bieten wir experimentelle Bedingungen, die die besten Ergebnisse unter Berücksichtigung beider Kriterien zu ermöglichen.

Figure 1
Abbildung 1 : Optimale Dichte der einzelnen Moleküle bei der Akquisition und Lokalisierung präzise Vorkalkulation.
(A-B)
Links: Repräsentative raw-Bilder von einem einzelnen Frame mit eine optimale Dichte an einzelne Moleküle im hellen Zustand (A) und eine zu hohe Dichte gebeizt (B) bei Sturm Akquisition (Schritt 6.12.) von festen U373 Zellen mit Anti-Vimentin und Anti-Maus Alexa647. Recht: RAW-Bilder wo die einzelnen Moleküle mit Fluoreszenz-Ebene über die Peak-Intensität zu Rauschschwelle (auf 6 eingestellt) Kreise (weiß oder rot) umgeben sind. Der Kreisdurchmesser von Peak Maskengröße (auf 9 Pixel gesetzt) festgelegt wird und die Farbe bestimmt, ob die Moleküle (rot) oder nicht überlappen (weiß). Beachten Sie, dass hohen Dichte an einzelne Moleküle (in (B)) führen zu ein hohes Maß an Überschneidungen Moleküle, die für die Bildrekonstruktion Sturm nicht berücksichtigt werden. A Einschub: Graph zeigt eine typische Fluoreszenz Intensität Profil eines einzelnen Moleküls in rot und seine Gauß in schwarz passen. In diesem Beispiel ist die Genauigkeit der Lokalisierung σX = 6,7 nm. Maßstabsleiste, 1 µm. (C) typische Histogramm der Lokalisierung Genauigkeiten für alle Moleküle erkannt und analysiert von der Herstellersoftware. Es visualisiert werden und aktualisiert regelmäßig beim Erwerb der raw-Daten dank der Online-Verarbeitung. Dieses Histogramm entspricht das dSTORM Bild von den Mikrotubuli Netzwerk in Abbildung 3 b. (D) Links: Sturm-Bild eines einzelnen Moleküls präsentiert auf der Glasoberfläche nach der Rekonstruktion. Recht: Die Histogramme der die X und Y-Positionen nach der Gaußschen Montage erhalten. Gauß passend die X- und Y-Distributionen geben eine Schätzung der Lokalisierung Präzision. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vertreter dSTORM Bild eines Netzwerks Vimentin. dSTORM Bild (A), entsprechende standard Weitfeld-Bild (B) und (C) zeigt die Vorderkante des U373 Gliazelle fixiert wie im Protokoll beschrieben und gebeizt für Vimentin mit Alexa647 zu überlagern. Unten: Zoom des markierten Bereichs. (D) quer Intensität Profile entlang der gelben Linie auf die vergrößerten Bilder in A und B. Scale bar, 2 µm und 500 nm im Zoom. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative duale dSTORM Farbbild Vimentin und Mikrotubuli Netzwerke. (A) Vimentin Netzwerk gebeizt mit Alexa647 (gleich wie in Abbildung 2A). (B) Mikrotubuli-Netzwerk mit Alexa555 beschriftet. (C) Überlagerung von Vimentin (rot) und Mikrotubuli (Cyan) Netzwerke mit einem Zoom-Bereich auf der rechten Seite. Das dSTORM Bild von Vimentin wurde mit ~1.5 Millionen von Lokalisierungen aus 40 000 Rahmen erhalten. Das dSTORM Bild der Mikrotubuli wurde mit ~ 850 000 Lokalisierungen aus 20 000 Rahmen erhalten. Skala bar, 2 µm und 500 nm im Zoom. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Beispiele für nicht optimale Bildgebung Bedingungen der Mikrotubuli. Wenn die Fluorophore blinkt aber nicht hell genug, mit einem Alexa488 Kennzeichnung von Tubulin in U373 Gliazellen und 143 mM BetaMercaptoethanol und Sauerstoff-Schnitzeljagd in der bildgebenden Puffer (A), wenn die Fluorophore hell genug sind, aber kann nicht richtig sein erschöpft in den dunklen Zustand (auf die maximale Laserleistung zur Verfügung) und Blink langsam mit Alexa555 mit der Bezeichnung Tubulin in 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA und Sauerstoff Fänger Puffer (B) und wenn Fluorophore langsam blinkt und sind nicht hell mit Alexa568 mit der Bezeichnung Tubulin in einem Sturm-Puffer, die 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA und Sauerstoff Schnitzeljagd enthält (C). In all diesen Fällen haben die dSTORM Bilder Auflösung abgebaut. Skala bar, 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Repräsentative zweifarbige dSTORM Bild von Vimentin und Mikrotubuli Netzwerke einer U373 Zelle fixiert mit kaltem Methanol für 5 min. (A) Vimentin und (B) Mikrotubuli Netze beschriftet mit Alexa647 und Alexa555 jeweils mit hervorgehobenen Zooms. Beachten Sie die Anwesenheit von einzelnen Molekülen an der Vorderseite der Zellen lokalisiert im Zytoplasma verringert die globale Auflösung der Filament-Netzwerke. Skala bar, 2 µm und 500 nm im Zoom. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Vergleich der dSTORM rekonstruiert Bilder
Rekonstruierte dSTORM Bild von der Herstellersoftware (A) und Gewitter (Fidschi-Plugin) (B). (C) Überlagerung von (A) in Magenta und (B) in grün. Skala bar, 2 µm und 500 nm im Zoom. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wichtige Schritte im Protokoll

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, das Artefakte in den dSTORM Bildern von Mikrotubuli und IFs in Gliazellen minimiert. Artefakte können erstellt werden, bei jedem Schritt der Probenvorbereitung und Bildgebung: Fixierung, Blockierung, Immunolabeling, treiben während der Akquisition, suboptimale blinkende Bedingungen23. Nachfolgend die wichtigsten Schritte auflisten

Reinigung der Deckgläsern ist ein wichtiger Schritt, die unspezifische Bindung des Fluorophore auf der Oberfläche zu begrenzen und damit die Geräuschkulisse im dSTORM Bild zu begrenzen.

Wir empfehlen Ihnen, Fixierung der Probenmaterials mit einem Schritt von Extraktion und Fixierung Lösungen mit einer Mischung aus Glutaraldehyd und Triton und Fixierung mit PFA (Paraformaldehyd) (Schritt Nr. 3). Die Fixierung-Protokoll wurde von Chazeau Et Al12: wir verringert die Extraktion/Fixierung Schritt Inkubationszeit bis 60 s (Schritt 3.4), entfernen Sie die Glukose aus dem Zytoskelett-Puffer und Permeabilisierung den Extra-Schritt übersprungen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass die frei beweglichen Zellskelett Untereinheiten, abgeführt werden Höchstauflösung Bildgebung mit weniger Hintergrund12ermöglicht. Ganz allgemein die Fixierung Schritt ist wichtig weil schlechte Fixierung (mit alten PFA, kalten Lösungen, zu lang/kurz Inkubationsschritte) führen zu teilweisen Zerstörung der Filament-Netze (gebrochene Mikrotubuli, Mikrotubuli, die Zelle vorne nicht erreichen und/oder in eine niedrige Dichte). Beachten Sie, dass es auch möglich, Methanol Fixierung, vor allem, wenn nur das Vimentin Netzwerk abgebildet wird, wie in Leduc Et Al15beschrieben. Hintergrundgeräusche kann jedoch innerhalb der Zelle (Abbildung 5) beobachtet werden. Obwohl dSTORM Bilder mit Methanol fixiert erhalten Zellen sind von geringerer Qualität, sie noch informieren über was beide wenn und Mikrotubuli Netzwerke aussehen sollten z. B. in der Bezeichnung des Filament-Dichte. Fixierung mit nur Glutaraldehyd gab sehr schlechte Ergebnisse für IFs, obwohl es das beste Protokoll für Mikrotubuli Fixierung23ist.

Im Immunostaining Teil ist es wichtig, Anti-Maus-Antikörper zu verwenden, die Kreuzreaktionen mit Antikörpern entwickelt in der Ratte zu minimieren. Aus diesem Grund konnten wir Fab-Fragmente (Anti-Maus) nicht nutzen, weil sie nicht speziell mit der Ratte Anti-Tubulin neben der Maus Anti-Vimentin Kreuzreaktion.

Aufgrund der begrenzten Laserleistung zur Verfügung ist es notwendig, 488 und 561 nm Laser-Linien zu benutzen, um die Alexa555 Farbstoffe in den dunklen Zustand zu Pumpen. Hohen 488 Laserleistung (~ 50 %) ist auch während der Akquisition, gute blinken und low Duty-Cycle (der Anteil der Zeit ein Fluorophor verbringt im eingeschalteten Zustand), zu beobachten, obwohl es erhöht sich die Geräuschkulisse als auch notwendig. Die TIRF Beleuchtung Modus schränkt die Anregung des Fluorophore in einer dünnen Schicht (~ 200 nm über die Glas-Deckglas). Es erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis durch eine Verringerung der Hintergrundbeleuchtung, sondern verringert auch die Erregerleistung. Der HILO-Modus kann erlaubt axiale schneiden und effizient, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren. Es ist daher eine gute Mitte zwischen Epi und TIRF. Mit dem HILO-Modus unbedingt effizient die Alexa555 Fluorophore, begeistern und diese erfordern hohe Laserleistung richtig zu blinken.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist der Erwerb von raw-Daten (Schritt 6). Es ist notwendig, passen die Aufnahmeparameter (Belichtung, Gewinn, TIRF und sogar Fokus wenn kein Fokus Block Device verfügbar ist) während des Films erworben wird. Eine optimale Dichte des hellen Fluorophore zu halten ist wichtig (Abbildung 1A): Es muss niedrig genug, um jede Farbe, aber hoch genug, um die gesamte Struktur nach 40 000 Frames visualisieren räumlich zu trennen. Wenn die Anzahl der aktivierten Moleküle zu niedrig ist, sollten länger Stapel erworben werden. Wir erhalten gute Bilder mit ~ 5000 Lokalisierungen pro µm² für IFs und 2 500 Lokalisierungen pro cm ² für Mikrotubuli.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode

Es ist wichtig, mit frische Proben arbeiten und optimierte imaging-Puffer. pH sollte genau angepasst werden, vor allem für die MEA.

Vimentin und Mikrotubuli sollte einheitlich beschrifteten aussehen, wenn mit standard Weitfeld-Mikroskopie-Technik (WF) abgebildet. Wenn Fäden unterbrochen/gestrichelt mit klassischen Mikroskopie schauen, wird dies bei super Auflösung verstärkt werden. In diesem Fall ist es besser, neue Proben vorzubereiten. Mikrotubuli suchen fragmentierten aufgrund nicht optimierte Fixierung zu berücksichtigen (alte PFA etc.). Hoher Hintergrund auf der Glasoberfläche entstehen aus einem ineffizienten blockieren. In diesem Fall kann BSA (bovine Serum Albumin) durch FBS (fetale Rinderserum) ersetzt und in jedem Inkubationsschritte verwendet werden.

Wenn die Beschriftung Dichte zu hoch ist (Abbildung 1 b) und kann nicht ausreichend geschoben werden in dunklen ausgeschalteten Zustand, auch mit der höchsten Laserleistung, die Menge an sekundären Antikörper (besser als die Verringerung der Menge an primären Antikörper) gesenkt werden sollte. Dies erfordert jedoch die Vorbereitung der neuen Proben. Im Allgemeinen ist es notwendig, die Menge der Sekundärantikörper verwenden empirisch zu bewerten.

Wenn die Fluorophore nicht normalerweise blinken (sie sollte im hellen Zustand während nur ein Frame), überprüfen Sie, dass der pH-Wert des Puffers Bildgebung ist korrekt (pH 8,3). Bereiten Sie neue Lösungen, wenn das Problem weiterhin besteht (vor allem MEA). Überprüfen Sie immer, dass die TIRF-Kollimator (TIRF U_HP) ist. Mit begrenzten Laserleistung, Erlangung richtige blinken kann schwierig sein (und Tarife sowie Farbstoff Helligkeit abhängig von Laserleistung, wie in beschrieben van de Linde Et al.11). Andere Farbstoffe wie Alexa488 oder Atto488 erkundet werden können, wenn mehr Leistung des Lasers Erregung verfügbar14.

Wenn die Fluorophore vor dem Ende der 40 000 Rahmen blinken, ändern des bildgebenden Puffers die oxidiert worden kann. Überprüfen Sie, ob keine Luftblasen zwischen den Puffer und den Deckel nach dem Puffer-Wechsel. Versiegelte Proben konnte für ein paar Stunden in einem rohen abgebildet werden.

Wenn Sturm Filme auf einem regelmäßigen TIRF Mikroskop, ausgestattet mit einer EMCCD erworben werden, ist es möglich, Gewitter24 verwenden, um die Bilder zu rekonstruieren. Ähnliche Optionen sind verfügbar für die Drift-Korrektur, Bildfilterung und Bildwiedergabe. Gewitter ist ein Plugin mit der Fidschi-Inseln/ImageJ-Software verwendet. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Herstellersoftware und Gewitter (Abbildung 6).

Kinderbett (Cyclooctatetraene) kann in den bildgebenden Puffer, die Lokalisierung Präzision der Einzelmoleküle zu verbessern hinzugefügt werden. Es erhöht die Anzahl der Photonen pro Zyklus für Alexa64725. Eine bessere Lokalisierung Präzision war in der Tat beobachtet (6 nm) als der Sturm-Puffer 2 mM Kinderbett hinzufügen in beschrieb Schritt 5 oder mit 100 mM MEA wie unter Verweis25. Unter diesen Bedingungen die Anzahl der hellen Moleküle während der Akquisition verringert sich jedoch viel schneller als ohne Kinderbett, Begrenzung der Gesamtzahl der Molekül-Lokalisierungen am Ende des Erwerbs und möglicherweise führend zu Under Probenahme des IF-Netzwerks. Anderen bildgebenden Puffer wurden gemeldet, auch mit Alexa Farbstoffe, zum Beispiel mit Laktase und Oxyrase als Sauerstoff Aufräumvorgang System26arbeiten. In diesem Protokoll wir berichten Puffer Komposition, die die besten Ergebnisse in Bezug auf die Auflösung für unsere Art von Proben und Bildgebung eingerichtet hat, aber jede Probe verlangt Puffer Optimierung, zusätzlich zu beschriften und Fixierung Bedingungen Optimierung.

Grenzen der Methode und mögliche Verbesserungen

Die hier vorgestellte Methode beschränkt sich auf feste Zellen und 2D Bilder. Mit einem Standard-imaging Set up mit einem TIRF-Mikroskop und eine EMCCD, der am meisten limitierende Faktor war die Laserleistungen (100 mW für den 561 nm Laser war nicht ausreichend, um die Alexa555 Farbstoffe blinken). Eine 532 nm Laserlinie möglicherweise effizienter, diese Farbstoffe zu begeistern. Eine mögliche Verbesserung der Methode wäre, 3D dSTORM mit optischen Astigmatismus27durchzuführen. Dies erfordert nur minimale Änderungen des Protokolls, außer eine geringere Kennzeichnung Dichte und eine höhere Frame-Nummer. 3D dual Color STORM Bild böte einen besseren Blick auf IFs Mikrotubuli, vor allem in bündeln umwickelt. Beachten Sie, dass die Actinfilamente auch beobachtet werden konnte, mit der gleichen Fixierung-Methode und eine Menge von fluoreszierenden Phalloidin8optimiert. 3-Farben-Sturm könnte verwendet werden, um die Organisation der drei Zellskelett Subsysteme zu beobachten.

Mit primären und sekundären Antikörper erhöht die Größe der das Objekt des Interesses, da der Sekundärantikörper, bis zu 20 lokalisiert ist nm vom Ziel. In der Regel einen Durchmesser von 25-nm-Mikrotubuli werden haben eine breite von ~ 50 nm nach Kennzeichnung. Eine Möglichkeit, den Abstand zwischen dem Ziel und der Farbstoff zu verbessern ist die primäre Antikörper mit der entsprechenden Farbstoffe direkt beschriften. Im Idealfall sollte Nanobodies beschriftet mit organischen Farbstoffen verwendeten28.

Wir stellen Ihnen hier nur eine einfache Methode zur Schätzung der durchschnittlichen Lokalisierung Präzisions eines einzelnen Moleküls nach Endesfelder Et al.22. Die Gesamtauflösung der Bilder, die berücksichtigt beide Lokalisierung Präzision und Dichte, Kennzeichnung kann auch gemessen werden mit Hilfe der Fourier Ring Korrelation Ansatz29.

Über die Kanalregistrierung ist es schwierig, perfekt alle Perlen im Sichtfeld zu überlagern. Eine komplexere Korrektur Chazeau Et Al 12entnehmen.

Einschränkungen aus dem Blinken der Fluorophore und Bleichen der Sonden können überwunden werden, mithilfe von DNA-PAINT (DNA-Punktestands für die Bildgebung im Nanobereich Topographie)30. Bei dieser Methode wird das Blinken notwendig für die Einzelmolekül-Lokalisierung durch vorübergehende Bindung von kurz-Farbstoff-markierten Oligonukleotide an ihre komplementäre Ziele erstellt.

Fazit

Dieser Artikel stellt ein robustes Protokoll zur zweifarbige dSTORM Bildgebung in 2 Dimensionen des Zytoskeletts Filamente in festen Zellen führen. Die experimentellen Bedingungen, die im Hinblick auf die Fixierung, Immunolabeling und Imaging Puffer für unsere Probentyp optimale gefunden wurden sind ausführlich beschrieben. Dann, den Prozess der raw-Daten-Erfassung und die Art der blinkende Bilder, die aufgenommen werden (Molekül Dichte, Signal-Rausch-Verhältnis, Fluorophor Pflicht Zyklus etc.) ist und wie Sie dSTORM Bilder zu rekonstruieren, korrigieren Sie die Drift und Filter Daten vorgestellt. Diese Schritte sind für die zweifarbige dSTORM Bildgebung generisch und nicht Probe Typ spezifischen. Schließlich wird gezeigt, wie diese Technik hilft, um die dichten Organisation der beiden gekoppelten Zellskelett Netze zu lösen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

Wir danken Mickael Lelek, Orestis Faklaris und Nicolas Bourg für fruchtbare Diskussionen, Andrey Aristov und Elena Rensen für Hilfe mit der Super-Resolution-Technik und Shailaja Seetharaman für sorgfältige Lektüre des Manuskripts. Wir erkennen dankbar UtechS photonische BioImaging (Imagopole) Citech des Institut Pasteur (Paris, Frankreich) sowie der Frankreich-BioImaging-Infrastruktur-Netzwerk unterstützt durch die französische National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investitionen für die Zukunft), und der Region Ile de France (Programmieren Domaine d'Intérêt Gewalt-Malinf) für den Einsatz des Mikroskops Elyra. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Ligue Contre le Cancer und der französischen nationalen Forschungsstelle (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

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References

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