人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

Immunology and Infection

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Summary

ここで分離し、その表現型および機能特性評価のための人間の女性の生殖器官の別の解剖学的なコンパートメントから樹状細胞を浄化する手法について述べる。このメソッドは、他の免疫細胞やその他の粘膜組織から樹状細胞を分離する合わせることができます。

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Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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Abstract

ひと樹状細胞 (Dc) 粘膜組織における居住者の特性は、サンプルの取得の難しさのために挑戦し、組織あたりの Dc の低い数字を提示します。まだ、組織環境によって表現型と Dc の機能を変更すると、組織 DC 住民を分析、血が不完全な Dc を得られるので組織で DCs の複雑さを反映する必要は。人間女性の生殖器官 (FRT) 子宮摘出標本を用いた表現型および機能解析を可能にするから Dc を分離するためのプロトコルをご紹介します。プロトコルは、肯定的な磁気ビーズの選択に続いて、細胞懸濁液を混合、1 つのセルを生成する組織消化で構成されます。私たちの組織の消化力のプロトコルはない表面マーカーを切断一晩培養や細胞活性化せず、定常状態における DCs の表現型および機能分析が可能。このプロトコルは、他の免疫細胞の種類の分離または他の組織からの Dc の分離の合わせることができます。

Introduction

Frt 社は、着床と妊娠1しながら病原体からの保護のデュアル機能を有しています。これを達成するためには、ユニークな組織学的、免疫学的、および機能特性1を表示するそれぞれの解剖学的領域で、frt 社を区分します。

Dc の粘膜表面に存在する肺、腸、生殖管における微生物との接触し、潜在的な病原体2免疫監視を提供します。DCs は、首相のナイーブ T 細胞と免疫3をトリガーするユニークな能力を持っています。Frt 社の Dc も専門にする精子や胎児、妊娠の成功4を許可するなどの外国の抗原を容認します。そのため、場所によっては、DC の表現型と機能が、異なっています。それは彼らの数、表現型、および関数は、3存在する組織環境によって変更するよう Dc が組織環境によって強く影響を受けている知られています。したがって、FRT Dc は、感染症、妊娠、および、FRT でがんに果たす役割を理解し、居住者の Dc を派生の DC モデルが FRT 組織に規制の複雑さに対処する十分な血から、勉強する必要があります。

人間の組織の評価バイオハザード Dc 細胞粘膜組織中に存在数が少ないと人間の組織サンプルを入手できないのために困難です。Dc は、免疫組織化学5,を使用して6にして、組織内のセル位置について通知が機能研究を排除、細胞マーカー分析することができますを識別する数に制限は FRT で研究されています。一度に。また、フローサイトメトリーによる解析のための単一のセル隔離のプロトコル開発7,8,9をされています。これらのプロトコルの一部は移行これらのセルを隔離する Dc の渡り鳥の容量を活用します。これらのメソッドは、通常夜通し孵化し活性化された Dc の選択を必要とするが、定常状態における DCs の研究を可能にしません。

ここでは、子宮摘出標本を使用して、子宮内膜 (EM)、FRT で異なる解剖学的サイトから Dc を分離するためのプロトコルを最適化されたコルポ (CX) と、子宮頸膣部 (ECX)、表現型および機能解析を可能にします。非蛋白分解酵素の消化力のプロトコルを使用して、細胞の活性化せず細胞分離と流れフローサイトメトリー評価組織消化後すぐに進めることができます。フローサイトメトリー マルチ カラーを使用して、機能に関する細胞の低い数字を適応、我々 を識別でき、ビームステアの異なるサイトの Dc のまれなサブセットを特徴付ける

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Protocol

ヒトを対象研究は、ヘルシンキ宣言の表現の原則に基づき実施されました。研究は、ダートマス大学治験審査委員会との人間被験者保護 (CPHS) の委員会によって承認されました。書面によるインフォームド コンセントは、ダートマス Hitchcock 医療センター (レバノン、ニューハンプシャー) で子宮を受ける HIV 陰性女性から術前に得られました。訓練を受けた病理医は、EM、CX、ECX には、病変と病理のサイトから遠いから組織サンプルを選択しました。ダートマス Hitchcock 医療センターで募集されたボランティアの健康なドナーから血液サンプルを得た。献血者は匿名だった。手術室から新鮮単離の EM、CX、ECX の組織は、分離と分類以前独立した滅菌ポリプロピレン チューブの研究室に転送するために移されました。

1 組織の酵素の消化力

注: 滅菌材料を使用し、生物学的安全キャビネットで働きます。

  1. 変更されたハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 1 x HBSS を用いたフェノール赤、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、0.35 g/L NaHCO3、および 20 mM HEPES を準備します。
  2. 酵素カクテルを準備 (2 mg/mL D-グルコース ・ HBSS、450 U/mL コラゲナーゼ IV, 0.01% [wt/巻] デオキシリボヌクレアーゼに変更)。ソリューションを滅菌 0.22 μ m フィルターを通過します。理想的には、消化酵素を使用、当日準備が、ストレージの-20 ° C で凍結することができます。繰り返しの凍結と融解の繰り返しは避けてください。
  3. 変更された HBSS 100 × 15 mm2シャーレ内の場所と組織をすすいでください。利用可能な組織の量に基づくシャーレ サイズと使用される酵素カクテルのボリューム調整 (1.4.2 以下の手順を参照してください)。
    注: 組織は、1 10 g に至る理から得られる手術のサンプルによってサイズが異なります。
  4. 使い捨てメスと鉗子の物理的な処理:
    1. 切削しながら乾燥を防ぐためにティッシュに消化酵素カクテル約 3 mL を追加します。
    2. 組織を安定化し、カクテルの消化酵素にさらされている組織の表面積を高めるためメスでミンチに鉗子を使用します。小さな断片 (側の < 2 mm) に組織を切断します。すべての組織の部分 (組織の 5 mL/g) をカバーする十分な消化酵素カクテルを追加します。シャーレに蓋を配置します。
    3. 45 分回転速度は徹底的にこぼしたり、泡を生産せず消化酵素カクテルをミックス確認のため約 80 rpm で回転上 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
    4. 4 X を倒立顕微鏡で組織の準備作業と 10 X 目標を視覚化します。
      注: 消化力の後小さな組織片と見える上皮腺を含む混合細胞懸濁液になければならない (図 1A参照)。

2 単一のセルの物理的な分離

  1. 無菌環境で 150 × 15 mm2シャーレにホルダーにピンと張った 250 μ m メッシュを配置します。メッシュがペトリ皿の表面上約 0.5 cm であることを確認します。
  2. ウェットは 2 ml の変更された HBSS のメッシュとメッシュに消化組織を転送します。
  3. 10 mL シリンジのプランジャーの平らな面を使用して、優しく、しっかりと、挽くメッシュを通して消化みじん切りにした組織です。
    注意: 研削も積極的にメッシュを損傷し、細胞の死亡率を高めます。この手順は、結合組織、粘液から上皮細胞と間質細胞 (免疫細胞を含む) が分離されます。
  4. 組織片を徹底的に分散させた、一度昇格メッシュとホルダー上にペトリ皿 3 mL でリンス 2 ~ 3 cm 変更 HBSS で追加のセルを回復します。
  5. 細胞懸濁液を収集します。ペトリ皿と変更された HBSS の 2 mL でウェットにホルダーを 20 μ m メッシュを配置します。メッシュを保持メッシュを通して細胞懸濁液を注ぐ 2-3 cm シャーレと変更された HBSS の 6 mL でリンス。
    メモ: この手順は、メッシュを通過する単一セルから、上に残されている上皮シートを区切ります。流れによる混合細胞懸濁液は免疫細胞や間質線維芽細胞です。
  6. 混合細胞懸濁液と 10 分間吸引液 500 × g で遠心分離を収集し、密度勾配遠心法修正 HBSS 4 mL にペレットを再懸濁します。
  7. ないブレーキ付け層の混合細胞懸濁液 3 mL 以上 polysucrose ソリューションと 500 x g で部屋の温度で 30 分間遠心します。Polysucrose ソリューションの上から白いバンドを収集し、PBS で洗浄します。
    注: この分数は濃縮混合細胞懸濁液、免疫細胞が豊富ですし、いくつかの間質線維芽細胞が含まれています。

3. 死んだ細胞の除去

注: 死んだ細胞 (> 20%) の大きいパーセントが密度勾配遠心分離後濃縮混合細胞懸濁液に存在する磁気ビーズの死んだ細胞の除去が推奨です。死んだ細胞は、彼らは肯定的な磁気ビーズの選択プロセスを妨げる可能性がありますので削除する必要があります。

  1. 対物レンズ 10 倍の顕微鏡で診断を使用してセルをカウントします。濃縮混合細胞懸濁液 (500 × g、10 分、4 ° C) のすべてのセルをスピンダウンします。完全に吸引し、上清を破棄します。1 x 107合計のセルごと (ライブとデッド)、製造元の指示に従って死んだ細胞除去ビーズの 100 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。
  2. 磁気の列に 30 μ m フィルターを配置、細胞懸濁液を適用し、ビード標識細胞は、磁気の列を該当します。
  3. 推奨 (3 mL) として死んだ細胞の除去バッファーの列をすすいでください。生きた細胞を含む流れを収集します。死んだ細胞を除去した後の細胞回復の範囲は、図 1 bに提示されます。
    注: これらの細胞は染色表現型研究 (セクション 5) のフローサイトメトリーを実行する使用ことができますまたは DC アイソレーション (セクション 4) に進みます。

4. DC 正磁気ビーズの選択による浄化

  1. 次の死んだ細胞の除去 (ステップ 3.2)、セルをスピンダウン、上清を除去、1 x 10 の7セル (PBS、0.5% 熱不活化 AB 血清 (HS)、2 ミリメートルの EDTA) あたり 80 μ L 磁気選択バッファー内細胞ペレットを再懸濁します。
  2. DC 集団の肯定的な選択は、製造元の指示 (20 1 x 10 の7セルあたり μ L 磁気ビーズ) に従って CD1a または CD14 の磁気ビーズを追加します。4° Cで 15 分間インキュベートします。
  3. 磁気選択バッファーを持つセルを洗って、スピンダウン バッファーを完全に削除します。500 μ L 磁気選択バッファーの最小の細胞を再懸濁します。
  4. 磁石に列を添付し、残りの細胞塊を保持する列の上に 30 μ m のフィルターを追加します。フィルターおよび列磁気選択バッファー推奨されているようにすすいでください。
  5. 細胞懸濁液を列に適用します。磁気選択バッファーで 3 回を洗い流してください。
  6. 15 mL チューブに列を転送磁気選択バッファー 5 mL を追加して、列の選択したセルを解放するプランジャーを適用します。
  7. 純度を高め、新しいカラムを使用して回復した細胞と手順 4.4 4.6 を繰り返します。磁気ビーズを選択した後の細胞回復の範囲は、図 1で示されます。

5. 細胞純度の評価: 流れの Cytometry と顕微鏡

  1. フローサイトメトリー用染色抗体:
    1. 20% を含む PBS 100 μ L の 10 の6セル × 1 まで再懸濁します熱非動化 Fc 受容体をブロックし、氷で 10 分間インキュベートする HS。
    2. 追加希望蛍光標識抗体と死んだ細胞の同定のための試薬 (例については、セクション 6.5 を参照してください)。蛍光マイナス ゲートを確立し、補償のための単一染色コントロールを準備する補償ビーズを使用する 1 つの (FMO) コントロールを設定します。抗体の例を表 1に示した。光から保護、4 ° C で 20 分間インキュベートします。
    3. 2 ml の磁気選択バッファーのセルを洗浄します。
      メモ: EDTA の存在は細胞のフローサイトメトリーによる解析の凝集の形成を避けるために重要です。スピン ・ ダウンと上澄みを廃棄します。
    4. チューブあたり 2% パラホルムアルデヒド溶液 100 μ L を追加することによって、セルを修復します。
    5. 流れの cytometer10,11のサンプルを分析します。
  2. (例えばcytospin) 列をスピンし、ギムザ染色形態を分析するを使用します。
    1. 磁気選択バッファーを 200 μ l 添加の細胞を再懸濁します。
    2. スピン列と 5 分スピンで読み込みます。スライドが完全に乾燥しなさい
    3. 脱イオン水でスライド浸漬リンス 2 分の 100% メタノールでスライドを修正し、それを空気乾燥を許可します。
    4. 標準ライト-ギムザ染色を行います。エオシンでセルをカバーし 10 分間インキュベート、脱イオン水で洗浄し、乾燥させてください。ライツ Geimsa 染色した細胞をカバー、1 分間インキュベート、脱イオン水ですすいでください、エアーで乾燥させます。
    5. 倒立顕微鏡 (図 2 a、40 × 対物) と準備を確認します。

6 DC 細胞機能を評価するために同種の刺激法

  1. 解凍冷凍の末梢血単核球 (PBMCs)
    1. 10% の細胞培養媒体を暖かい 37 ° c. に HS
    2. 凍結細胞培地量が少ないまま、cryotube までに、37 ° C の水浴中、cryotube を配置することによって、PBMCs を解凍します。無菌環境で、cryotube の内容を 10% に予め温めておいた細胞培地 10 mL に転送 15 mL チューブに HS。
    3. 遠心分離機 〜 500 x g で 7 分間、メディアを取り出して、ペレットを分散、10%、HS と遠心分離機の細胞培養媒体の 10 mL で、PBMCs を再懸濁しますセル。
    4. 洗浄ステップを 3 回繰り返します。セルをカウントします。
  2. ナイーブ T 細胞の選択:
    1. 負の淘汰磁気抗体細胞選択キットを使用すると、製造元のプロトコルに従ってナイーブ T 細胞を分離します。
    2. 分離後 CD45RA と CCR7 抗体を用いて純度を確認します。
      注: 一般的な純度です > 99% ナイーブ T 細胞です。
  3. ナイーブ T 細胞増殖染料染色:
    1. 細胞増殖の染料、染料を光への暴露から保護する 2 x 溶液の 600 μ L を準備します。
    2. ナイーブ T 細胞 2 を洗う PBS で x。500 μ L の PBS のセルを再懸濁します。
    3. 軽くボルテックス中キャビネット、バイオ セーフティにおける細胞はナイーブ T 細胞に増殖染料 500 μ L を追加します。
    4. 37° Cで 10 分間細胞をインキュベートします。
    5. 10% の細胞培養媒体の 5 mL を追加することによって細胞ラベリングを停止のセルに HS。光から保護、5 分間氷の上を孵化させなさい。
    6. 細胞を遠心分離機 ~ 7 分、500 x g メディアを吸引し、10% の細胞培養媒体の 4 ° C で細胞を再懸濁します HS。3 洗浄の合計にさらに 2 回を繰り返します。最後の遠心分離前にカウントするセルの因数を取る。
      注: 通常、最終的なナイーブ T 細胞の数は 5% と初期の PBMC 細胞数の 15% の間が範囲です。
    7. 10% の細胞培養媒体の細胞を再懸濁します目的細胞濃度で HS。
  4. DC 同種ナイーブ T 細胞共培養:
    1. 1:15 で孤立した Dc と 96 ウェル、丸底板のナイーブ T 細胞をプレート Dc T 細胞の比率。Dc 範囲 3,000 〜 5,000 細胞/ウェル間の最適な数を確認します。
    2. プレートを遠心分離機 ~ セルは、井戸の中心にあるように 3 分間 500 × g。細胞間接触が発生する適切なシグナリングのために重要です。
    3. 37 ° C で 6 日間インキュベートします。井戸のように増殖が発生した (図 3 a) 顕微鏡による細胞のクラスターを監視します。
  5. フローサイトメトリー評価増殖する染色します。
    1. 6 日後、フローサイトメトリーによる細胞を調べることができます。フローサイトメトリー用共培養を染色します。
    2. PBS で黄色性色素 (最大排出量 572 nm) の 2 x ソリューションを準備します。
      注: 血清なし PBS の使用は重要な血清としてタンパク質、色素を妨げる)。
    3. 細胞をプレートを遠心分離機 ~ 500 × g で 5 分。
    4. 上清の 100 μ L を削除します。
      注: この時点で収集し、可溶性因子の分離解析の上清を保存します。
    5. PBS で 2 回細胞を洗う: PBS の 150 μ L/ウェルを追加、遠心分離機 〜 5 分 500 × g を 150 μ L ピペットで上澄みの削除します。各ウェルに残った上清を 50 μ l 添加があることを確認します。
    6. 2 x 性色素の 50 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、10 分間室温でインキュベートします。
    7. 、インキュベーション中に目的とする抗体のマーカーのマスターの混合物を準備します。たとえば: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITCなど
    8. 各ウェルに抗体の混合物を追加します。光から保護、10 分間室温でインキュベートします。
    9. 2 セルを洗浄して PBS + 2% x HS: PBS + 2% の 150 μ L/ウェルを追加 HS。遠心分離機 〜 5 分削除 150 μ L ピペットで上澄みの 500 x g。
    10. 100 μ L/ウェル 2% パラ ホルムアルデヒドを追加することによって、セルを修復します。必要な場合: ポリプロピレン流れ cytometry チューブに細胞とメディアを転送します。チューブは 4 ° C で保管し、フローサイトメトリーによる解析まで、光から保護できます。
    11. 流れの cytometer で読み取りチューブ。

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Representative Results

図 1 a; のように、次の組織消化、上皮と腺のリリースを観察できます。この酵素の消化力が成功したことを示す肯定的なコントロールです。それぞれ、生菌数および組織の 1 グラムあたり回復の Dc の数は図 1 b図 1は表示も。5-30% 密度遠心分離12,13前に間質細胞の間の免疫細胞を表します。図 2は、(図 2 a) の形態と孤立した Dc の純度 (図 2 b, C) を示します。プロトコルに記載されている 2 つのラウンドの選択が実行されると、予想される純度範囲 85 92% (図 2)。回復した細胞数は可変して初期組織のサイズおよびドナーの変動によって異なります。隔離されたセルの特性は記述されていた13をされています。図 3は、DC 機能を評価するために代表的な同種の刺激法を示しています。図 3 aは、増殖が発生し、図 3 bは、フローサイトメトリーによる増殖数量を示して ときに表示される特徴的な T 細胞塊を示しています。ウイルスのキャプチャやサイトカイン、ケモカイン産生などの他の機能アッセイは、実行される13も可能です。図 4は、濃縮混合細胞懸濁液 (図 4 a) の流れ-フローサイトメトリー解析後 FRT の異なる解剖学的なコンパートメントで異なる Dc 個体を識別するためにゲートの戦略を示しています。陰性対照および抗体の滴定は、Dc とマクロファージ表示高蛍光として重要です。FMO コントロールは、図 4 bに表示されます。図 4は、CD1c +、CD207 +、または CD103 + Dc など、特定の DC サブセットを識別する方法の例を示します。

Figure 1
図 1: 組織の処理とセルの可用性。(A) 上皮や腺組織消化後にリリースの代表的なイメージ。ティッシュの処理と各 FRT 区画に死んだ細胞の除去後に生菌数の合計の (B) の範囲回復: 子宮内膜 (EM)、コルポ (CX)、子宮頸膣部 (ECX)。すべてのドットは、別の件名からセルを表します。(C) 数の Dc 磁気ビードの分離後に組織の 1 グラムあたり回復。B と C は、13 日から適応されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 形態と単離細胞の純度。(A) 次のギムザ染色顕微鏡検査によって決定分離細胞の樹状突起の形態。(B) 式の表現型マーカーのビーズ分離、フローサイトメトリーによる決定の前後に。(C) 代表的な純度 CD1a + と cd14 ビーズ分離後に得られます。13 日から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 拡散の試金。(A) 代表的な顕微鏡画像 T 細胞のクラスター形成増殖中: 位相差 (左)、増殖染色の (中央)、およびオーバーレイ (右)。(B) の共培養後増殖の誘導の代表例分離子宮内膜 CD1a + または cd14 Dc し同種ナイーブ T 細胞は冷凍 PBMCs。 B から得られる、13から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: ビームステアから細胞懸濁液を混合、濃縮で Dc の表現型特性(A) 混合細胞懸濁液中の Dc の同定のための戦略をゲートします。多色のプロットの各ゲートの人口は、次のパネルに表示されます。等高線は CD11c + CD11b + と CD11c + CD11b ゲートをそれぞれ示しています。解析から除外する同じチャネルを使用して、不要な細胞を識別するマーカーを汚すことができます。たとえば、死んだ細胞、CD3 +、および細胞 cd19。(B) FMO コントロールの適切なゲートを確立します。DC サブセット ゲーティングの戦略を次の (C) 差別。等高線は、セル番号の低い10頃人口分布をより正確に表す多色のプロットではなく選ばれました。低細胞の数は、組織 Dc が珍しい集団うにゲーティング戦略の終わりに予想されます。13 日から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

細胞のマーカー 螢光色素 クローン 濃度 サンプルあたりの抗体の量
(バッファーの 100 μ l) で
CD45 vioblue450 HI30 1.0 μ g/5µl 0.4 μ g
CD11b PE ICRF44 1.0 μ g/5µl 0.4 μ g
CD11c PerCp/Cy5.5 Bu15 200 μ g/ml 0.4 μ g
CCR5 PE Cy7 2 7 0.25 μ g/5µl 0.1 μ g
CCR7 PE Cy7 REA108 99 μ g/ml 0.2 μ g
HLA BV 570 L243 100 μ g/ml 0.2 μ g
HLA FITC AC122 82.5 μ g/ml 0.16 μ g
CD3 APC UCHT1 16 μ g/ml 0.03 μ g
CD3 viogreen REA614 137 μ g/ml 0.27 μ g
CD163 APC 実行する GHI/61 80 μ g/ml 0.16 μ g
CD207 APC 1OE2 200 μ g/ml 0.4 μ g
CD1a FITC HI149 0.5 μ g/5µl 0.2 μ g
CD1a AF 700 HI149 0.5 mg/ml 1.0 μ g
CD103 PE Cy7 B Ly7 0.25 μ g/5µl 0.1 μ g
CD83 PE HB15e 0.25 μ g/5µl 0.1 μ g
CD14 APC 火 63 の 3 400 μ g/ml 0.8 μ g
CD209 FITC、PE、APC 120507 1.25 μ g/0.25 ml 0.01 μ g
ゾンビ黄色性色素
7AAD 0.1 mg/ml 0.2ug

表 1:フローサイトメトリーによる frt 社の Dc の特性のための抗体の例

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Discussion

粘膜 Dc、組織3に入る彼らの表現型と機能が変更された組織の環境の影響を強く珍しいセル人口です。血が派生した Dc が非常に有用なモデル、完全に DC の個体数と組織での多様性を反映しません。そのため、粘膜 Dc のユニークな特性を理解する組織からの一次電池の分離が必要です。Frt 社の別の解剖学的サイトから Dc の分離では、DC 機能の in vitro研究し、DC サブセットおよび解剖学的位置を比較する機会を提供しています。

ここでは、機能性の in vitro評価のための人間の FRT ティッシュから Dc の精製を可能にするプロトコルを提供します。DCs は、低い数字で粘膜のサイトで発見され、以来、我々 は密度勾配遠心法と磁気ビーズの細胞分離前に死んだ細胞の除去による組織細胞調製を豊かにするプロトコルを開発しました。彼らはビードの分離を妨げるが、死んだ細胞の適切な除去は重要です。この手法では比較的短時間 (4-6 時間)、積極的に隔離されたセル (≈ 90%) の高純度、一晩インキュベート、体外培養、細胞分離前に移行のため必要とせずそれぞれの Dc をアクティブにできます、彼らの表現の特性を変更します。成熟マーカー (CD86、HLA-DR, CD83)13のアップ規制の欠如によって測定される、我々 のプロトコルは細胞の活性化をトリガーしません。別の利点は、表面マーカーを切断しないと即時セル分離または組織消化14表現型変化の解析では、非蛋白分解酵素消化使用です。

磁気の列の妨害を避けるために単一細胞懸濁液の生成はこのプロトコルに重要です。磁気細胞選択、磁気の列の上に使用されるフィルターの必要性の前に、そのために死んだ細胞を削除する必要がある、2 つの列の間 3 g を超える組織を割る必要があります。精製の第 1 ラウンド後に 2 番目の列の使用は、高い細胞純度鍵です。

分離メソッドの制限の 1 つ固有低数です Dc の FRT 組織で通常を許可しない組織の良い細胞回復の 1 g よりも小さい。こうしたもとで、ただし、表現型解析実行できますが使用して、濃縮細胞懸濁液を混合します。これは表面マーカーを切断しないと組織消化14後細胞表現型の即時解析は、非蛋白質分解消化メソッドを使用のために可能です。また、患者の年齢は、回復細胞の数に影響を与える要因をすることができます。

このプロトコルを使用すると、以前行った CD1a + アイソレーション cd14 選択13; よりも表現型より同質な人口を提供することただし、CD1a + Dc が CX と ECX から回復することは困難です。一方、CD14 もマクロファージに発現する、ことがわかった FRT CD14 + 隔離された人口は Dc、DC マーカーと Dc13の特徴機能である同種ナイーブ T 細胞を刺激するために彼らの能力の共同表現に基づく豊富です。

回復の Dc の数は一般的に低いので (< 100,000 総細胞) の機能研究は低細胞数の最適化が必要です。ここでのみ 3,000 Dc/ウェルで実行できる同種の刺激試金の最適化を紹介します。これらの細胞は、ホルモン応答性、サイトカイン、FRT Dc13HIV 刺激と HIV キャプチャ時に抗菌ペプチド生産などと他の関数の研究を行っています。Dc は、隔離され、メッキ、一度、試金は、その後減少すると細胞生存率 24 h 以内実行必要があります。

このプロトコルは異なる DC サブセットを分離に適応することができます。 または磁気ビーズや不要な細胞の種類を削除する結合シーケンシャルの正と負のビーズの選択に適切なマーカーを選択することによって他の細胞型に結合します。1 つの注意は、しかし、選択のすべてのラウンドで細胞のいくつかの割合が失われるという、FRT Dc の分離を既にまれで、ポケットティッシュ サイズは一般的に小さいので複数回の異なるマーカー (と必要な選択です。関連付けられている洗浄) は望ましくないです。さらに、このプロトコルは、他組織14,15から他の免疫細胞や Dc を分離する合わせることができます。

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Disclosures

著者がある何も開示するには

Acknowledgments

NIH がサポートした調査は、AI102838、AI117739 (CRW) を付与します。リチャード ・ Rossoll は、技術支援を感謝いたします。DartLab、Dartmouthsupported (P30CA023108 - 37) と (P30GM103415-15) で共有リソースのフローサイトメトリーによる解析を行った。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

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References

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