Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

Immunology and Infection

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Summary

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

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Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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Abstract

Die Charakterisierung der menschlichen dendritischen Zellen (DCs) Wohnsitz in Schleimhaut-Gewebe ist schwierig wegen der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von Proben und die geringe Zahl von DCs pro Gewebe zu präsentieren. Doch wie der Phänotyp und die Funktion der DCs wird durch das Gewebe Umfeld geändert, ist es notwendig zu analysieren Gewebe Wohnbevölkerung DC, da Blut DCs nicht vollständig abgeleitet spiegeln die Komplexität des DCs in Geweben. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DCs aus der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT) mit Hysterektomie zu isolieren, die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Das Protokoll besteht aus Gewebe Verdauung um eine einzelne Zelle gemischt Zellsuspension, gefolgt von positive magnetische Bead Auswahl zu generieren. Unsere Gewebe-Verdauung-Protokoll wird nicht Oberflächenmarker, cleave, wodurch phänotypische und funktionelle Analyse der DCs in der Steady-State, ohne Übernachtung Inkubationszeit oder Zelle Aktivierung. Dieses Protokoll kann für die Isolierung von anderen Immunzellen Typen oder Isolierung von DCs aus anderen Geweben angepasst werden.

Introduction

Die FRT hat die doppelte Funktion der Schutz gegen Krankheitserreger gleichzeitiger Implantation und Schwangerschaft1. Um dies zu erreichen, ist die FRT mit jeder anatomischen Region anzeigen histologischen, immunologische und funktionalen Besonderheiten1zersplittert.

DCs bei Schleimhaut-Oberflächen machen Kontakt mit Mikroben in der Lunge, Darm und Genitalbereich, und bieten Immunüberwachung für potenzielle Krankheitserreger2. DCs haben die einzigartige Fähigkeit, prime naive T-Zellen und adaptive Immunantworten3auslösen. DCs in der FRT sind auch darauf spezialisiert, um fremde Antigene, z. B. auf Sperma und den sich entwickelnden Fötus, ermöglichen erfolgreiche Schwangerschaft4zu dulden. Daher, je nach Standort, DC Phänotyp und Funktion deutlich werden. Es ist bekannt, dass DCs stark von der Gewebe beeinflusst sind, so dass ihre Anzahl, Phänotyp und Funktionen durch das Gewebe Umfeld geändert werden in denen sie3wohnen. Daher müssen um die Rolle zu verstehen, die FRT DCs bei ansteckenden Krankheiten, Schwangerschaft und Krebs in der FRT spielen, ansässige DCs zu untersuchenden abgeleiteten DC-Modelle nicht ausreichen sind, um die regulatorischen Komplexität in FRT Geweben gefunden zu adressieren, da Blut.

Die Charakterisierung des menschlichen Gewebes ansässige DCs ist schwierig, aufgrund der geringen Zahl von Zellen im Schleimhaut-Gewebe und die Schwierigkeit, die Erlangung menschlichen Gewebeproben. DCs sind untersucht worden, in der FRT mittels Immunhistochemie5,6, die informiert über die Zellenposition innerhalb des Gewebes, sondern schließt funktionelle Studien und beschränkt die Zahl der Identifizierung Zelle Marker, die analysiert werden können auf einmal. Darüber hinaus wurden einzelne Zelle isoliert Protokolle für durchflusszytometrischen Analyse entwickelten7,8,9. Einige dieser Protokolle nutzen die wandernden Kapazität des DCs, die Zellen zu isolieren, die migrieren. Diese Methoden in der Regel über Nacht Inkubationen und Auswahl der aktivierten DCs erfordern, aber lassen Sie nicht für das Studium der DCs in der Steady-State.

Hier, mit Hysterektomie, wir ein Protokoll, um DCs von verschiedenen anatomischen Standorten in den FRT der Gebärmutterschleimhaut (EM), isolieren optimiert die Endocervix (CX) und des Ectocervix (ECX), die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Ein nicht-proteolytischen enzymatische Verdauung-Protokoll verwenden, können wir sofort nach Gewebe Verdauung zu Zelle isoliert und Flow durchflusszytometrischen Charakterisierung ohne Zellaktivierung fortfahren. Mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie und Anpassung funktionelle Studien für eine geringe Anzahl von Zellen, wir erkennen und charakterisieren seltene Teilmengen von DCs in den verschiedenen Standorten der FRT

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Protocol

Nach den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebracht wurden Studien am Menschen durchgeführt. Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Review Board und dem Ausschuss für den Schutz der menschlichen Themen (CPHS) genehmigt. Schriftliche Einwilligung war HIV-negativ Frauen Hysterektomien am Dartmouth Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) vor der Operation entnommen. Ausgebildete Pathologen Gewebeproben aus der EM, CX und ECX, frei von pathologischen Läsionen und weit entfernt von den Stätten der Pathologie ausgewählt. Freiwilligen gesunden Spendern am Dartmouth Hitchcock Medical Center rekrutiert wurden Blutproben entnommen. Blutspender wurden anonym. Pathologie für Isolation und Klassifizierung vor, in unserem Labor in separaten, sterile Polypropylenröhrchen übertragen wurden frisch isolierte EM, CX und ECX Gewebe aus den OP-Saal übertragen.

(1) enzymatische Verdauung von Geweben

Hinweis: Verwenden Sie Sterilgut und arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank.

  1. Bereiten Sie eine modifizierte Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit 1 X HBSS mit Phenol rot, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 0,35 g/L Nahco33und 20 mM HEPES.
  2. Vorbereiten den enzymatischen Cocktail (HBSS, 450 U/mL Kollagenase IV, 0,01 % [wt/Vol] Deoxyribonuclease geändert, ich und 2 mg/mL D-Glucose). Eine sterile 0,22 µm-Filter durchlaufen Sie die Lösung. Im Idealfall bereiten die Verdauung Enzym am Tag der Nutzung, aber er bei-20 ° C zur Aufbewahrung eingefroren werden kann. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen Zyklen.
  3. Spülen Sie das Gewebe mit veränderter HBSS und in einer Petrischale 100 x 15 mm2 . Passen Sie die Petrischale Größe bezogen auf die Menge des Gewebes zur Verfügung und das Volumen des Enzyms cocktail verwendet (siehe Schritt 1.4.2 unten).
    Hinweis: Gewebe variieren in der Größe abhängig von der chirurgischen Probe aus der Pathologie, von 1 bis 10 g.
  4. Physikalische Aufbereitung mit Einweg Skalpell und Pinzette:
    1. Fügen Sie ca. 3 mL Verdauung Enzym cocktail des Gewebes zu verhindern Austrocknen während des Schneidens.
    2. Verwenden Sie Zange zur Stabilisierung des Gewebes und Hackfleisch mit einem Skalpell auf der Oberfläche des Gewebes, die Verdauung Enzym cocktail ausgesetzt zu vergrößern. Schneiden Sie das Gewebe, in kleine Stücke (< 2 mm auf einer Seite). Fügen Sie ausreichende Verdauung Enzym-Cocktail zur Deckung aller Gewebe Stücke (5 mL/g Gewebe). Setzen Sie den Deckel auf der Petrischale.
    3. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 auf ein Rotator mit ca. 80 u/min für 45 min. Stellen Sie sicher, dass die Rotor-Geschwindigkeit gründlich die Verdauung Enzym-Cocktail mischt ohne Verschütten oder Luftblasen zu produzieren.
    4. Die Gewebe-Vorbereitung mit einem inversen Licht Mikroskop mit 4 X und 10 X Ziele zu visualisieren.
      Hinweis: Nach der Verdauung, kleine Gewebefragmente und eine gemischte Zellsuspension einschließlich sichtbare epitheliale Drüsen sollte vorhanden sein (siehe Abbildung 1A).

(2) eine räumliche Trennung von Einzelzellen

  1. Legen Sie in einer sterilen Umgebung Netzchen straff 250 µm mit Halter in einer Petrischale 150 x 15 mm2 . Stellen Sie sicher, dass das Netz ca. 0,5 cm über der Oberfläche der Petrischale ist.
  2. Das Netz mit 2 mL modifizierte HBSS nass und das verdaute Gewebe auf das Netz zu übertragen.
  3. Verwenden die flache Oberfläche des einen 10-mL Spritzenkolben, sanft, aber bestimmt, Mahlen Sie das verdaute Hackfleisch / Gewebe durch die Maschen.
    Achtung: Schleifen zu aggressiv das Netz beschädigt und Zelle Sterblichkeit zu erhöhen. Dieser Schritt wird aus dem Bindegewebe und Schleim die Epithelzellen und Stromazellen Zellen (einschließlich Immunzellen) trennen.
  4. Sobald die Gewebefragmente gründlich verteilt wurden, haben zu erheben, das Netz und die Halter 2-3 cm oberhalb der Petrischale und Spülen mit 3 mL geändert HBSS, zusätzliche Zellen wiederherzustellen.
  5. Sammeln Sie die Zellsuspension. Legen Sie 20 µm-Mesh mit Halter in einer Petrischale und nass mit 2 mL modifizierte HBSS. Gießen Sie die Zellsuspension durch die Maschen des Netzes halten ca. 2-3 cm oberhalb der Petrischale und Spülen mit 6 mL modifizierte HBSS.
    Hinweis: Dieser Schritt wird die epithelialen Blätter trennen, die auf der Oberseite, aus einzelnen Zellen erhalten bleiben, die durch die Maschen zu übergeben. Der Durchfluss ist eine gemischte Zellsuspension, Immunzellen und Stromazellen Fibroblasten umfasst.
  6. Sammeln Sie die gemischte Zellsuspension und Zentrifuge bei 500 X g für 10 min. Absaugen der Flüssigkeit und aufzuwirbeln Sie das Pellet in 4 mL modifizierte HBSS für Dichte-Gradienten-Zentrifugierung.
  7. Schicht der gemischte Zellsuspension über 3 mL Polysucrose-Lösung und Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 500 X g für 30 min mit keine Bremse. Das weiße Band von der Spitze der Polysucrose Lösung zu sammeln und mit PBS waschen.
    Hinweis: Diese Fraktion ist angereicherten gemischte Zellsuspension, die reich an Immunzellen und enthält einige Stromazellen Fibroblasten.

3. tote Zelle entfernen

Hinweis: Wenn ein großer Prozentsatz der abgestorbenen Zellen (> 20 %) nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung in der angereicherten gemischte Zellsuspension vorhanden sind, empfiehlt sich tote Zelle entfernen mit magnetischen Beads. Abgestorbenen Zellen müssen entfernt werden, da sie das positive magnetische Wulst Auswahlverfahren stören können.

  1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer auf einem Lichtmikroskop mit 10 X-Objektiv. Spin-down alle Zellen in der angereicherten gemischte Zellsuspension (500 x g, 10 min, 4 ° C). Vollständig abzusaugen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 100 µL tote Zelle entfernen Perlen pro 1 x 107 total Zellen (lebenden und Toten), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
  2. Die magnetische Spalte 30 µm Filter aufsetzen, Auftragen der Zellsuspension und die Perle-markierten Zellen durch die magnetische Spalte fallen.
  3. Spülen Sie die Spalte mit Toten Zelle entfernen Puffer als empfohlene (3 mL). Sammeln Sie die Durchströmung mit lebenden Zellen. Das Sortiment der Zelle Erholung nach tote Zelle entfernen ist in Abbildung 1 bpräsentiert.
    Hinweis: Diese Zellen können zur Durchflusszytometrie Färbung für phänotypische Untersuchungen (Abschnitt 5) durchführen oder fahren Sie mit DC Isolierung (Abschnitt 4).

4. DC Reinigung durch Positive Magnetic Bead Auswahl

  1. Nach tote Zelle entfernen (Schritt 3.2) die Zellen spin-down, entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet 80 µL magnetische Auswahlpuffer pro 1 x 107 Zellen (PBS, 0,5 % Hitze-inaktivierten AB Humanserum (HS), 2 mM EDTA).
  2. Fügen Sie für positive Selektion der DC Bevölkerung CD1a oder CD14 magnetische Beads gemäß den Anweisungen des Herstellers (20 µL magnetische Beads pro 1 x 107 Zellen hinzu). 15 min bei 4° c inkubieren
  3. Waschen Sie die Zellen mit der magnetischen Auswahlpuffer, spin-down und Puffer vollständig zu entfernen. Die Zellen in einem Minimum von 500 µL des magnetischen Auswahlpuffer aufzuwirbeln.
  4. Legen Sie die Spalte auf der Magnet und fügen Sie einen 30 µm-Filter auf der Oberseite der Spalte, um alle verbleibenden Zelle Klumpen behalten. Spülen Sie den Filter und die Spalte mit magnetischen Auswahlpuffer wie empfohlen.
  5. Die Zellsuspension auf die Spalte anwenden. 3 Mal mit magnetischen Auswahlpuffer abspülen.
  6. Übertragen Sie die Spalte auf eine 15-mL-Tube, 5 mL des magnetischen Auswahlpuffer hinzufügen und Anwenden des Kolbens um die markierten Zellen in der Spalte freizugeben.
  7. Um die Reinheit zu erhöhen, wiederholen Sie Schritte 4,4-4,6 mit der wiederhergestellten Zellen unter Verwendung einer neuen Spalte. Das Spektrum der Zelle Erholung nach magnetic Bead Auswahl ist in Abbildung 1dargestellt.

5. Bewertung der Zelle Reinheit: Flow Cytometry und Mikroskopie

  1. Antikörper für die Durchflusszytometrie Färbung:
    1. Aufschwemmen bis 1 x 106 Zellen in 100 µL PBS mit 20 % Hitze-inaktivierten HS Fc-Rezeptoren zu blockieren und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
    2. Fügen Sie die gewünschten Eindringmittel "Antikörper" und das Reagenz für die Identifizierung der toten Zellen (ein Beispiel finden Sie in Abschnitt 6.5). Legen Sie Fluoreszenz minus ein (FMO) Kontrollen, um die Tore zu etablieren, und Entschädigung Perlen verwenden, um einzelne Fleck Steuerelemente auf Schadensersatz vorzubereiten. Beispiele der verwendeten Antikörper sind in Tabelle 1dargestellt. Inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL der magnetischen Auswahlpuffer.
      Hinweis: Vorhandensein von EDTA ist wichtig, die Bildung von Zelle für durchflusszytometrischen Analyse Klumpenbildung zu vermeiden. Spin-down und den Überstand verwerfen.
    4. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 µL 2 % Paraformaldehyd Lösung pro Röhre.
    5. Analysieren Sie die Proben in ein Fluß Cytometer10,11.
  2. Drehen Sie die Spalte (z.B. Cytospin) und verwenden Sie Giemsa Färbung Morphologie zu analysieren:
    1. Die Zellen in 200 µL des magnetischen Auswahlpuffer aufzuwirbeln.
    2. In einer Spalte Spin und Spin für 5 min laden. Lassen Sie die Folie vollständig trocknen.
    3. Befestigen der Folie durch Eintauchen in 100 % Methanol für 2 min. Spülen der Folie mit entionisiertem Wasser und lassen Sie es an der Luft trocknen.
    4. Führen Sie eine standard-Wrights-Giemsa-Färbung. Decken Sie die Zellen mit Eosin und 10 min inkubieren Sie, mit entionisiertem Wasser spülen Sie und trocknen lassen. Decken Sie die Zellen mit Wrights Geimsa Fleck, 1 min inkubieren mit entionisiertem Wasser spülen und an der Luft trocknen.
    5. Untersuchen Sie die Vorbereitungen mit einem inversen Mikroskop (Abb. 2A, 40 X Objektiv).

6. allogene Stimulation Assay DC Zellfunktion bewerten

  1. Tauen Sie die gefrorenen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)
    1. Wärmen die Zellkulturmedien mit 10 % HS bis 37 ° C.
    2. Tauen Sie die PBMCs, indem man die Cryotube in einem 37 ° C-Wasserbad, bis eine kleine Menge von gefrorenen Zelle Medien in der Cryotube bleibt. Der Inhalt der Cryotube auf 10 mL vorgewärmten Zellkulturmedien mit 10 % in einer sterilen Umgebung übertragen HS in eine 15-mL-Tube.
    3. Zentrifugieren bei ~ 500 X g für 7 min. Entfernen Sie das Medium, das Pellet zu zerstreuen, Aufschwemmen der PBMCs in 10 mL von Zellkulturmedien mit 10 % HS und Zentrifuge der Zellen.
    4. Wiederholen Sie der Waschschritt ein drittes Mal. Zählen der Zellen.
  2. Naïve T-Zell-Auswahl:
    1. Verwenden Sie eine negative Auslese magnetische Antikörper Zelle Auswahl Kit, um naive T-Zellen nach der Hersteller-Protokoll zu isolieren.
    2. Überprüfen Sie nach Isolierung die Reinheit mit CD45RA und CCR7 Antikörpern.
      Hinweis: Typische Reinheit ist > 99 % naive T-Zellen.
  3. Naïve T-Zell Proliferation Farbstoff Färbung:
    1. Bereiten Sie 600 µL 2 X Lösung der Zelle Verbreitung Farbstoff, den Farbstoff vor Lichteinwirkung schützen.
    2. Waschen Sie die naive T-Zellen 2 X mit PBS. Zellen in 500 µL PBS aufzuwirbeln.
    3. Während sanft aufschütteln hinzufügen Zellen im Kabinett, Biosafety 500 µL Verbreitung Farbstoff die naive T-Zellen.
    4. Inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei 37° c
    5. Stoppen der Zelle Kennzeichnung durch Zugabe von 5 mL Zellkulturmedien mit 10 % HS zu den Zellen. Inkubation auf Eis für 5 min, vor Licht geschützt werden.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellen an ~ 500 X g für 7 min aspirieren Sie die Medien und Aufschwemmen der Zellen bei 4 ° C von Zellkulturmedien mit 10 % HS. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen noch zweimal. Nehmen Sie ein Aliquot der Zellen vor der letzten Zentrifugation zählen.
      Hinweis: In der Regel reichen letzte naive T-Zell-Zahlen zwischen 5 % und 15 % der anfänglichen PBMC-Zellzahl.
    7. Die Zellen mit den Zellkulturmedien mit 10 % Aufschwemmen HS in die gewünschte Zelle Konzentration.
  4. DC-allogene naive T-Zelle Kokultur:
    1. Teller isoliert DCs und naive T-Zellen in einer 96-Well, Rundboden Platte bei einem 01:15-Verhältnis von DCs auf T-Zellen. Stellen Sie sicher, dass die optimale Anzahl für DCs liegt zwischen 3.000 und 5.000 Zellen/gut.
    2. Zentrifugieren Sie die Platte bei ~ 500 X g für 3 min um die Zellen befinden sich in der Mitte des Brunnens zu gewährleisten. Zell-Zell-Kontakt ist wichtig für die korrekte Signalisierung auftreten.
    3. 6 Tage bei 37 ° C inkubieren. Überwachen Sie die Ansammlung von Zellen, die in den Vertiefungen zu erscheinen, wie Verbreitung mit Mikroskopie (Abbildung 3A) auftritt.
  5. Flow Cytometry Färbung um Verbreitung zu bewerten:
    1. Nach 6 Tagen können Zellen durch Durchflusszytometrie untersucht werden. Färben der Kokultur für Durchflusszytometrie.
    2. Bereiten Sie eine 2 X Lösung des gelben Lebensfähigkeit Farbstoff (maximale Emission 572 nm) mit PBS-Puffer.
      Hinweis: Die Verwendung von PBS ohne Serum ist wichtig, als Serum Proteine stören den Farbstoff).
    3. Zentrifugieren Sie die Platte mit Zellen bei ~ 500 X g für 5 Minuten.
    4. 100 µL des Überstandes zu entfernen.
      Hinweis: an dieser Stelle sammeln und Speichern des Überstands für die separate Analyse der lösliche Faktoren.
    5. Die Zellen zweimal mit PBS waschen: Fügen Sie 150 µL/Well von PBS, Zentrifugieren bei ~ 500 X g für 5 min, 150 µL des Überstands mit einer Pipette entfernen. Sicherstellen Sie, dass es 50 µL überstand noch in jede Vertiefung.
    6. Jede Vertiefung 50 µL 2 X Lebensfähigkeit Farbstoff hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min, vor Licht geschützt werden.
    7. Während der Inkubation bereiten Sie eine master Mischung der gewünschten Antikörper Marker. Zum Beispiel: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITC, etc.
    8. Fügen Sie die Antikörper-Mischung in jede Vertiefung. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min, vor Licht geschützt werden.
    9. Waschen Sie die Zellen 2 X mit PBS + 2 % HS: Fügen Sie 150 µL/Well des PBS + 2 % HS. Zentrifugieren bei ~ 500 X g für 5 min. entfernen 150 µL des Überstands mit einer Pipette.
    10. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 µL/Well von 2 % Para-Formaldehyd. Bei Bedarf: die Zellen und Medien auf Polypropylen Flow Cytometry Rohre übertragen. Röhren können bei 4 ° C aufbewahrt und geschützt vor Licht, bis der durchflusszytometrischen Analyse.
    11. Lesen Sie Rohre in einem Durchflusszytometer.

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Representative Results

Folgende Gewebe Verdauung, die Freilassung von epithelialen Blätter und Drüsen kann beobachtet werden, wie in Figur 1Adargestellt; Dies ist eine positive Kontrolle, die angibt, dass die enzymatische Verdauung erfolgreich war. Die Anzahl der insgesamt vitaler Zellen und DCs pro Gramm Gewebe wiederhergestellt werden auch in Abbildung 1 b und Abbildung 1, bzw. angezeigt. Immunzellen sind zwischen 5-30 % der Stromazellen Zellen vor Dichte Zentrifugation12,13. Abbildung 2 zeigt die Morphologie (Abbildung 2A) und die Reinheit (Abb. 2 b, C) des isolierten pls. Wenn zwei Runden der Auswahl durchgeführt werden, wie im Protokoll angegeben, reicht die erwarteten Reinheit zwischen 85-92 % (Abbildung 2). Die Anzahl der wiederhergestellten Zellen ist variabel und hängt von der ursprünglichen Gewebe Größe und Spender Variabilität. Charakterisierung der isolierten Zellen wurden beschrieben13. Abbildung 3 zeigt einen repräsentativen allogene Stimulation Assay DC-Funktionalität zu bewerten. Abbildung 3A zeigt die charakteristischen T-Zell-Klumpen, die beim auftreten, Verbreitung und Abbildung 3 b die Verbreitung Quantifizierung von Durchflusszytometrie zeigt angezeigt. Andere funktionelle Assays, wie virale erfassen oder Cytokine und Chemokin Produktion kann auch durchgeführte13. Abbildung 4 zeigt die gating Strategie, verschiedene DCs-Populationen in den unterschiedlichen anatomischen Abteilen FRT nach Strömung durchflusszytometrischen Analyse der angereicherten gemischte Zellsuspensionen (Abb. 4A) zu identifizieren. Die Titration der Antikörper und negative Kontrollen sind wichtig, da DCs und Makrophagen hohe Autofluoreszenz anzuzeigen. FMO-Steuerelemente sind in Abbildung 4 bdargestellt. Abbildung 4 zeigt Beispiele für bestimmte DC Teilmengen wie CD1c +, CD207 + oder CD103 + DCs zu identifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Gewebe Verarbeitung und Zelle Verfügbarkeit. (A) repräsentatives Bild der epithelialen Bettwäsche und Drüsen nach Gewebe Verdauung veröffentlicht. (B) Auswahl der Anzahl der lebensfähigen Zellen erholt nach Gewebe Verarbeitung und Beseitigung der Toten Zelle in jedem Fach FRT: Endometrium (EM), Endocervix (CX) und Ectocervix (ECX). Jeder Punkt steht für Zellen aus einem anderen Thema. (C) Anzahl der DCs erholte sich pro Gramm Gewebe nach magnetischer Wulst isoliert. B und C sind aus13angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Morphologie und Reinheit der isolierten Zellen. (A) dendritischen Morphologie der isolierten Zellen durch Mikroskopie nach Giemsa Färbung bestimmt. (B) Ausdruck der phänotypischen Marker vor und nach der Perle Isolierung, Durchflusszytometrie bestimmt. (C) repräsentative Reinheit nach CD1a + und CD14 + Perle Isolierung erhalten. Adaptiert von13. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Verbreitung Assay. (A) repräsentative Mikroskopie Bilder von T-Zell cluster-Bildung während der Verbreitung: Phasenkontrast-(links), Verbreitung färben Färbung (Mitte) und overlay (rechts). (B) repräsentatives Beispiel der Induktion der Verbreitung nach Kokulturen von endometrial CD1a + oder CD14 + DCs isoliert und allogene naive T-Zellen von gefrorenen PBMCs. B erhalten ist von13angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: phänotypische Charakterisierung von DCs in der angereicherten Zellsuspensionen von der FRT gemischt (A) Strategie für die Identifizierung von DCs in die gemischte Zellsuspension Gating. Jeder geschlossene Bevölkerung in multicolor Parzellen wird im nächsten Fenster angezeigt. Isolinienplots zeigen die CD11c + CD11b + und CD11c + CD11b-Tore, beziehungsweise. Marker, die unerwünschte Zellen identifizieren können gefärbt werden, über den gleichen Kanal, sie von der Analyse auszuschließen; zum Beispiel abgestorbene Zellen, CD3 + und CD19 +-Zellen. (B) FMO Kontrollen, entsprechende Tore zu etablieren. (C) Diskriminierung von DC Teilmengen nach der gating-Strategie. Isolinienplots wurden gewählt, anstatt multicolor Grundstücke, genauer die Verteilung der Bevölkerung vertreten, wenn die Zelle zahlen niedrige10waren. Niedrige Zellzahlen werden am Ende der gating-Strategie erwartet, da Gewebe DCs selten Populationen sind. Adaptiert von13. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zellmarkierung Fluorochrom Klon Konzentration Menge des Antikörpers pro Probe
(in 100 µl Puffer)
CD45 vioblue450 HI30 1,0 µg/5µl 0,4 µg
CD11b PE ICRF44 1,0 µg/5µl 0,4 µg
CD11c PerCp/Cy5.5 Bu15 200 µg/ml 0,4 µg
CCR5 PE-Cy7 2 7 0,25 µg/5µl 0,1 µg
CCR7 PE-Cy7 REA108 99 µg/ml 0,2 µg
HLA-DR BV-570 L243 100 µg/ml 0,2 µg
HLA-DR FITC AC122 82,5 µg/ml 0.16 µg
CD3 APC UCHT1 16 µg/ml 0,03 µg
CD3 viogreen REA614 137 µg/ml 0,27 µg
CD163 APC GHI/61 80 µg/ml 0.16 µg
CD207 APC 1OE2 200 µg/ml 0,4 µg
CD1a FITC HI149 0,5 µg/5µl 0,2 µg
CD1a AF-700 HI149 0,5 mg/ml 1,0 µg
CD103 PE-Cy7 B-Ly7 0,25 µg/5µl 0,1 µg
CD83 PE HB15e 0,25 µg/5µl 0,1 µg
CD14 APC-Feuer 63 3 400 µg/ml 0,8 µg
CD209 FITC, PE, APC 120507 1.25 µg/0,25 ml 0,01 µg
Zombie-gelbe Lebensfähigkeit Farbstoff
7AAD 0,1 mg/ml 0.2ug

Tabelle 1: Beispiel von Antikörpern für die Charakterisierung von Domänencontrollern in der FRT durch Durchflusszytometrie.

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Discussion

Schleimhaut DCs sind eine seltene Zellpopulation stark beeinflusst durch die Gewebe-Umgebung, die deren Phänotyp und Funktion ändert, sobald sie das Gewebe3geben Sie. Während Blut abgeleitet DCs sind ein sehr nützliches Modell, sie repräsentieren nicht voll die Vielfalt der DC-Populationen in Geweben gefunden. Deshalb, um die einzigartigen Eigenschaften der Schleimhaut DCs zu verstehen, ist Isolierung von Primärzellen von Gewebe notwendig. Isolierung von DCs von verschiedenen anatomischen Standorten in der FRT bietet die Möglichkeit, DC Funktion in Vitro zu studieren und vergleichen Sie zwischen DC Subsets und anatomischen Standorten.

Hier bieten wir ein Protokoll, das die Reinigung des DCs von Humangewebe FRT für in-vitro- Beurteilung der funktionellen Eigenschaften ermöglicht. Da DCs in geringer Anzahl an Schleimhaut Standorten befinden, entwickelten wir ein Protokoll, um das Gewebe Zelle Vorbereitung durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und tote Zelle Entfernung vor der Zelle isoliert mit magnetischen Beads zu bereichern. Ordnungsgemäßen Entfernung von abgestorbenen Zellen ist der Schlüssel, wie sie mit Wulst Isolation beeinträchtigen werden. Diese Technik bietet hohen Reinheit des positiv isolierte Zellen (≈ 90 %), in relativ kurzer Zeit (4-6 h), und ohne die Notwendigkeit der Inkubation über Nacht, in Vitro Zellkultur oder Migration vor der Isolierung kann jeweils DCs aktivieren und verändern Sie ihre phänotypischen Eigenschaften. Unser Protokoll löst keine Zellaktivierung, gemessen durch den Mangel an Up-Regulierung des Reifung Marker (CD86, HLA-DR, CD83)13. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung einer nicht-proteolytischen enzymatische Verdauung, die nicht zerspalten Oberflächenmarker und ermöglicht sofortige Zelle isoliert bzw. phänotypische Analyse nach Gewebe Verdauung14.

Entscheidend für dieses Protokoll ist die Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die Blockade der magnetischen Spalten zu vermeiden. Um dies zu gewährleisten, müssen abgestorbene Zellen vor der magnetischen Zellenauswahl Filter müssen auf die magnetische Spalten verwendet werden entfernt werden und sollte größer als 3 g Gewebe zwischen zwei Spalten aufgeteilt werden. Die Verwendung einer zweiten Spalte nach der ersten Runde der Reinigung ist der Schlüssel zu hohen Reinheit.

Eine Einschränkung der Isolierung-Methode ist die inhärente geringe Anzahl von DCs in FRT Geweben, die in der Regel nicht für gute Zelle Wiederherstellung von Gewebe kleiner als 1 g zulässt. Unter diesen Umständen können jedoch phänotypische Analysen werden noch durchgeführt mit dem angereicherten Zellsuspension gemischt. Dies ist möglich durch die nicht-proteolytischen Verdauung-Methode verwendet, die nicht zerspalten Oberflächenmarker und ermöglicht die sofortige Analyse der Zelle Phänotyp nach Gewebe Verdauung14. Darüber hinaus kann das Alter des Patienten ein Faktor sein, der Einfluss auf die Anzahl der Zellen wiederhergestellt.

Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir bereits gezeigt, dass CD1a + Isolierung eine phänotypisch homogenere Bevölkerung als CD14 + Auswahl13 bietet; CD1a + DCs sind jedoch schwierig zu CX und ECX beheben. Während CD14 auf Makrophagen auch ausgedrückt werden kann, fanden wir, dass die FRT CD14 + isolierte Population reich an DCs ist, basierend auf Co Ausdruck von DC-Markern und ihre Fähigkeit, allogene naive T-Zellen zu stimulieren, ist ein Markenzeichen Funktion DCs13.

Da die Anzahl der DCs erholte sich in der Regel gering ist (< 100.000 Gesamt Zellen), funktionelle Studien für niedrige Zellzahlen optimiert werden müssen. Hier zeigen wir die Optimierung der eine allogene Stimulation Assay, die mit nur 3.000 DCs/gut durchgeführt werden kann. Wir haben andere Funktionsstudien mit diesen Zellen, einschließlich hormonelle Ansprechbarkeit, Cytokine und antimikrobiellen Peptid-Produktion auf HIV-Stimulation und HIV-Erfassung von FRT DCs13durchgeführt. Sobald die DCs isoliert und überzogen sind, sollten Assays durchgeführt werden innerhalb von 24 h, abnehmendem Zellviabilität nach Ablauf dieser Frist.

Dieses Protokoll lässt sich anpassen, verschiedene DC Teilmengen zu isolieren, oder andere Zelltypen durch die Auswahl der richtigen Marker gekoppelt mit magnetischen Beads und Kombination von sequentiellen positive und negative Wulst Auswahl entfernen unerwünschte Zelltypen. Vorsicht, ist jedoch, dass mit jeder Runde Auswahl einige Prozent der Zellen verloren, also für die Isolierung von FRT DCs, die sind schon selten, und das Gewebe sind in der Regel klein, mehrfache Umläufe der Auswahl mit verschiedenen Markern (und die notwendigen Wäschen verbunden sind) sind nicht erwünscht. Darüber hinaus kann dieses Protokoll andere Immunzellen oder DCs isolieren von anderen Geweben14,15angepasst werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Studie von NIH unterstützt AI102838 und AI117739 (CRW) gewährt. Wir danken Richard Rossoll für technische Hilfe. Durchflusszytometrischen Analyse erfolgte in DartLab, die gemeinsame Ressource am Dartmouthsupported (P30CA023108-37) und (P30GM103415-15).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

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References

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