ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, S., Tanzi, R. E., Li, A. Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila. J. Vis. Exp. (143), e57139, doi:10.3791/57139 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דנדריטים הן ההשתקפויות מסועף של נוירון, מורפולוגיה דנדריטים משקף סינפטית הארגון במהלך הפיתוח של מערכת העצבים. דרוזופילה זחל עצביים דנדריטים arborization (da) הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה של דנדריטים העצבית ותפקוד גנים בהתפתחות מערכת העצבים. ישנם ארבעה סוגי נוירונים da. השיעור הרביעי הוא שהמורכב ביותר עם דפוס מסעף המכסה כמעט את כל שטח הקיר גוף הזחל. אנחנו קודם לכן שאפיינו את השפעת להשתיק את דרוזופילה ortholog של SOX5 על השיעור הרביעי arborization דנדריטים עצביים המורכבות (NDAC) באמצעות ארבעת הפרמטרים: האורך של דנדריטים, את פני השטח של כיסוי דנדריט, המספר הכולל של ענפים, ואת המבנה מסעף. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה של ניתוח כמותי NDAC, המורכב לנתיחה זחל, מיקרוסקופיה קונפוקלית ושגרות התמונה ניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. תובנות חדשות ההתפתחות העצבית da ומנגנונים הבסיסית שלה לשפר את ההבנה של תפקוד ולספק רמזים אודות הסיבות הבסיסיות של נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות.

Introduction

דנדריטים, אשר ההשתקפויות מסועף של נוירון, לכסות את השדה שמקיף חישה וסינפטית תשומות של הנוירון אחרים1,של הנוירונים2. דנדריטים הם מרכיב חשוב של היווצרות סינפסה ולשחק תפקיד קריטי שילוב תשומות סינפטית, וכן הפצת הגירוי אלקטרוכימי של נוירון. Arborization דנדריטים (da) הוא תהליך שבו נוירונים בצורת הדנדריטים חדשות וסניפים ליצירת הסינפסות חדש. פיתוח, המורפולוגיה של דא, כגון צפיפות סניף ודפוסי הקיבוץ, הם תוצאה של תהליכים ביולוגיים רב שלבי, נמצאים בקורלציה גבוהה תפקוד. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה לניתוח כמותי של המורכבות arborization dendritric עצביים דרוזופילה.

המורכבות של דנדריטים קובעת את סוגי סינפטית, קישוריות, תשומות מן השותף נוירונים. מסעף דפוסים, הצפיפות של דנדריטים מעורבים עיבוד האותות מתכנסת אל שדות דנדריטים3,4. דנדריטים מקבל את הגמישות עבור התאמה בהתפתחות. למשל, איתות סינפטית יש השפעה על הארגון דנדריט נוירון המגע במהלך שלב התפתחותי, את מערכת העצבים בוגרת5. הקמת קישוריות עצביים מסתמך על מורפוגנזה ועל התבגרותם של דנדריטים. מום של דנדריטים מזוהה עם תפקוד לקוי. מחקרים הראו כי חריגות של da נוירון מורפוגנזה עשוי לתרום אטיולוגיה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), ומחלת לו גריג / נוירודגנרטיביות (ALS)6,7,8. שינויים סינפטיים מופיעים בשלב המוקדם של AD, בתאום עם הירידה ואת ירידת ערך של נוירון פונקציה7,8. עם זאת, הפרטים של איך דנדריט פתולוגיה תורמת פתוגנזה מחלות ניווניות אלה נשאר חמקמק.

הפיתוח של דנדריטים מוסדר על ידי גנים אשר קידוד רשת מורכבת של הרגולטורים, כגון משפחת ונ ט של חלבונים9,10, גורמי שעתוק ליגנדים התא קולטנים משטח11,12 . דרוזופילה da נוירונים מורכב ארבע כיתות (מחלקה אני, II, III, IV), של איזה מחלקה IV דה נוירונים יש מסעף הדפוסים המורכבים ביותר, יש כבר מועסקים כמערכת ניסיוני רב עוצמה עבור יותר הבנה מורפוגנזה13, 14. במהלך תחילת מורפוגנזה, ביטוי ו/או RNAi להחרשת גנים class IV דה נוירונים לגרום לשינוי דפוסי מסעף ודנדריט גיזום13. חשוב לפתח שיטה מעשית לניתוח כמותי של arborization הדנדריטים עצביים.

אנחנו הראו בעבר כי להחרשת דרוזופילה ortholog של SOX5, Sox102F, הוביל דנדריטים קצר יותר של נוירונים da, מורכבות מופחתת בשיעור הרביעי da נוירונים15. כאן, אנו מציגים את ההליך של ניתוח כמותי על המורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה. פרוטוקול זה, משנת המתודולוגיה המתוארת הקודם, מספק שיטה קצרה assay הפיתוח של נוירונים חושי דה. זה מדגים תיוג תמונות של נוירון da השלישי לחלל זחל לגוף החומה16,17,18,19. זה פרוטוקול יקר עבור חוקרים המעוניינים לחקור את NDAC ואת הבדלים התפתחותיים ויוו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה ניסיוני

  1. להכין את ריאגנטים הבאים: פוספט של Dulbecco buffered תמיסת מלח (PBS); טריטון X-100; 0.2 PBST % (PBS + 0.2% טריטון X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), מדולל 4% לפני השימוש; סיליקון elastomer בסיס והסוכן ריפוי; antifade הרכבה בינונית (למשל, להאריך זהב); לק....
  2. הכנת הציוד הבא: ניתוח מיקרוסקופ, שניים חדות מלקחיים וזוג מספריים עבור microdissection, מספר סיכות על microdissection, צלחת פטרי להכנת תבשיל לנתיחה, שקופיות מיקרוסקופ, coverslips, מיקרוסקופ קונפוקלי, ו- a מחשב עם מותקנת תוכנת ImageJ פיג'י.

2. הזחלים אוסף

  1. חבר UAS-Sox102F-RNAi זבובים עם UAS-GFP, ממ ק-GAL4 או W1118 פראי סוג זבובים, בהתאמה. תרבות זבובים בתנאים סטנדרטיים ב 25 º C.
  2. ~ 5-6 ימים, לאסוף את הזחל לחלל השלישי של UAS-Sox102F-RNAi / ממ ק-GAL4, UAS-GFP או UAS-GFP, ממ ק-GAL4 / + שליטה בזהירות עם המלקחיים על ניתוח.

3. ניתוח הזחלים

הערה: כל ההליכים בסעיף זה מופעלים תחת מיקרוסקופ microdissection. ההגדלה הוא החוקרים. לנסות להתאים את התצוגה ראייה אופטימלית. ~ 4-6 X הגדלה מומלצת.

  1. במקום זחל על צלחת הקרע העשוי סיליקון elastomer הבסיס ותרבות רקמות פטרי.
  2. להצמיד את הקרס בפה זחל כדי לאפשר את הצד הגבי להתמודד ולאחר מכן להדביק את הזנב של זחל. מניחים בצד הגבי באמצע ככל האפשר לחשוף את האמצע, אשר יהיה דה מרקר פתוח-up.
  3. להוסיף 200 µL ל- PBS הזחל כדי לשמור על לחות הגוף.
  4. לעשות חתך עם זוג מספריים לאורך הקו האמצעי הגבי בין tracheas שני, מסימטרית כדי rostral. לעשות חתך קטן בכל ארבע הפינות של הגוף זחל.
  5. המקום pin בכל ארבע הפינות של הגוף אז הגוף שקרים שטוח.
  6. לתקן את הקיר הגוף זחל 4% PFA במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לכבס במים PBST עבור 5 דק. חזור עוד פעמיים.
  8. הסר את הסיכות של הרקמה. ואז להעביר את הרקמה על זכוכית, לכסות עם הרכבה antifade בינוני, והר עם מכסה. האוויר יבש עבור 1 h, לאטום את הקצוות עם הלק.

4. עיבוד הדמיה

הערה: התמונות צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. המשתמש יכול לצלם את הדגימה באמצעות מטרה X 20 (מומלץ).

  1. לכידת תמונות מסדרת Z. פתח את תיבת הדו-שיח "ללכוד את Z-סדרת" בתוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי. לקבוע את הטווח עבור לכידת תמונות סדרת Z.
    1. לחץ על לחצן "העליון ואת התחתון". לקבוע העליון והתחתון למקם ולהזין את הערכים "התחתון:" ו "העליון:" תיבות. הגדר את "צעד" בתיבת הדו-שיח "ללכוד את Z-סדרת" 0.5 מיקרומטר. לאחר מכן לחץ על לחצן "הפעל כעת" כדי לרכוש את Z-סדרת תמונות.
  2. שמור את התמונות שהושג כקבצי *.tiff או *.nd2.
  3. אחסן את השקופיות בעל כהה ב 4 ° C לאחר דימות.

5. דנדריט הערכה

הערה: חלבון ה-GFP היה co-overexpressed ב UAS-GFP, ממ ק-GAL4 טס על הנוירונים da עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. אורך, מסעף ומבנה של da נוירונים בהזחלים לחלל השלישית היו לכמת. ניתוח פרמטרי כוללים אורך של דנדריטים (מיקרומטר), פני השטח (2מיקרומטר), המספר הכולל של ענפים ומבנה מסעף (%). איור 1 מציג את הפרמטרים ניתוח בפירוט.

  1. אורכו של דנדריטים
    הערה: האורך של דנדריטים הוא הסכום של דנדריטים כל המסומנות בתוסף מעקב.
    1. ההתקנה ולהפעיל תוכנות20 פיג'י ImageJ (https://fiji.sc/). ואז לפצל תמונות ערוצים נפרדים, אם קיימות מספר ערוצים של תמונות.
      הערה: התמונה בפרוטוקול זה יש רק ערוץ אחד של GFP.
    2. הפעלת "תמונה | ערימות | פרויקט Z"כדי לקבל תחזית Z; יופיע חלון חדש עם השם 'Z-הקרנה.' לחץ על "עוצמת מקסימום" עבור סוג ההקרנה וארגון של מספרים בין ההתחלה פרוסה עצירה פרוסה בהתאם על העדפות אישיות. לחץ על "אישור." תמונת Z-ההקרנה יופיעו הצגת התחזית דנדריט בבירור.
    3. לאתר את neurites.
      1. בחר "תוספים | פילוח | פשוט Neurites מעקב"בחלון לאתר של דנדריטים. למצוא את סומא נוירון ולאחר מכן לחץ על נקודה אחת-דנדריט החל לגוף התא, נקודה נוספת בקצה של זה דנדריט.
        הערה: התוכנית יחברו שתי הנקודות בקו כחול.
      2. הקש "Y" בחלון יישום plug-in אם הנתיב אינו ברור; הנתיב דנדריט נמצא במעקב עד הקצה של הנתיב שנבחר של תמונות גלויות. לחץ "הנתיב המלא" על תוסף באותו החלון; הקטע הושלמה (איור 2).
        הערה: מספר דנדריטים הסתיים רחוק יותר נקודות המוצא, בהם מסלול הייתה מחולקת למקטעים קטנים יותר. המקטעים חברו יחד כדי לספק נתיב מלא עבור רכיב המעקב.
    4. לאחר השלמת נתיב, לחזור לנקודת חדשה איפה הענפים. הנתיב החדש יכול להיות בנוי על; התיבה חלון "כל הדרכים" תציג את הערכים אורך כל הנתיבים (איור 3). שמור את קובץ מעקב והמשך עם עקבות לא גמורים כמוצג באיור2.
    5. ייצוא נתוני האורך דנדריט על ידי לחיצה, "קובץ | ייצוא כמו *.cvs"בחלון 'תוסף'. ואז לסכם את כל אורך נתיב, לייצא את הנתונים לניתוח נתונים/בתכנת. (איור 3).
  2. שטח הפנים של הנוירונים da
    1. בחרו בכלי ציור ביד חופשית בחלון 'פיג'י ImageJ'. הנתיב, ולאחר מכן חבר את נקודות הקצה. מתפריט ' 'נתח' ', בחר ' הגדר מדידות | באזור." לחץ על "מדד" מתוך תפריט 'נתח'. התוצאה מופיעה תיבה חדשה עם הערך עבור האזור שנבחר (איור 4). העתק זה תוכנת ניתוח נתונים.
  3. סה כ מספר של ענפים והמבנה הסתעפות של הנוירונים da
    1. לחשב את המספר הכולל של ענפים על-ידי פתיחת "ניתוח" ולאחר מכן "רינדור | לנתח נתיבי Skeletonized"בחלון תוסף של איתור (איור 5).
      הערה: מבנה סוכת הוא הסכום של הרמות של ענפים. הנתיב הוגדרו בין גוף התא העצות דנדריט, נתיב אחד יכול לכלול מספר ענפים, כגון ובשבילים העיקרי הן דנדריטים של הגוף התא של נוירון. ובשבילים משניים הם ענפים מן הראשית וכן הלאה עם ובשבילים רבעוני, quinary השלישון. המבנה של הסתעפות דנדריט מופרדים זה מזה בהתאם הרמות של סניפים. למשל, האחוזים העיקרי הוא מספר הסניפים מחולקת על ידי המספר הכולל של הסתעפות, וכן הלאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דנדריטים של נוירונים da הודבקו תוויות על-ידי GFP co-overexpressing (UAS-GFP; ממ ק-GAL4) סומא עצבית da ו דנדריטים ובשבילים עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. המורפולוגיה של דנדריטים נוירון da צולמה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 2).

דנדריטים של נוירונים da שנקשרו באמצעות תוכנת ImageJ פיג'י. הקובץ שימש כדי להעריך את אורך דנדריט (איור 3). להחרשת Sox102F בנוירונים da (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ממ ק-GAL4; UAS-GFP) הוביל לירידה משמעותית מספר דנדריטים ואורך ענף קצר עם מבנה פשוט יותר לעומת שולט (N = 20) (UAS-GFP; ממ ק-GAL4 / +) ב הזחל לחלל השלישי (איור 6). באופן ספציפי, זבובים שבה הושתק Sox102F הציג ירידה דנדריט ממוצע אורך 127 מיקרומטר לעומת 249 מיקרומטר בפקדים (p = 0.02), היה שטח פנים קטן יותר ממוצע ארבור של מיקרומטר 552,4762 לעומת מיקרומטר 847,5712 פקדים (p = 0.04). בנוסף, להחרשת Sox102F הביא מספר קטן יותר של ענפים ומבנה מסעף פשוטים יותר של, ובשבילים עם ענפים סך של 17 (17.3 ± 6.7), לעומת 28 (28.4 ± 9.5) בפקדים (p = 0.04). סטודנט t-בדיקות בוצעו כדי להשוות את ההבדלים בין הקבוצות, הוגדר ברמת המובהקות 0.05.

Figure 1
איור 1 : תרשים של דנדריט ניתוח הפרמטרים של נוירון da דרוזופילה . לוח (א) הוא התמונה המקורית של נוירון da. (B) אורך דנדריט היה הממוצע של כל האורכים דנדריט כל הנוירונים da נמדד. (ג) פני השטח של da נוירון דנדריט הוגדרה באופן ידני על-ידי הכלי ביד חופשית ImageJ. (ד) הסכמות מראה כיצד לספור את מספר סניפים וניתוח מבנה הסתעפות של נוירון da. 1: סוכת העיקרי. 2: סוכת משנית. 3: סוכת שלישוני. 4: סוכת רבעוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : נציג העקיבה של דנדריטים של נוירון דה- נוירון da צולמה עם מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. (א) העקיבה הראשון נוצר עם נקודת התחלה לגוף התא, נקודת הסיום של דנדריט באמצעות כלי תוסף/פילוח. הקו הכחול (חץ לבן) מייצג את הנתיב המוגדר. לאחר לחיצה על 'כן' (חץ אדום), הקו משתנה צבע מכחול לאדום. (B) לחיצה על "סיום נתיב" זה יופיע סגול (C). (א-ג) מציג את התהליך של איתור של דנדריט אחד; (ד) מלאה לאתר תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : מדידה של נתיבים עקיבה. התמונה משמאל מציגה כיצד למדוד את הנתיבים מעקב אחרי ריצה "ניתוח | למדוד נתיבים." ייצוא ערכי אורך הנתיב לקובץ הגיליון האלקטרוני, לחשב את הסכום של האורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : דוגמה של הגדרת שטח הפנים דנדריט ידנית. תמונה מוגדרת הושג באמצעות הכלי ביד חופשית בתפריט חלון ImageJ (מוצג על ידי חץ אדום). להגדיר את המידות על-ידי בחירה באזור. להפעיל את הפונקציה "מדידה" כדי להשיג את האזור מוצג בתיבה אדומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : דוגמה של ניתוח של מ. הפעלת "Analysis_Render | לנתח נתיבי Skeletonized"בחלון תוסף"פלח". השבילים שניתנו המספר שלהם התקבלו על-ידי בחירה "רינדור כל הנתיבים | להשיג סיכום". הנתיב הוגדרו בין גוף התא העצות דנדריט, נתיב אחד יכול לכלול מספר סניפים; למשל, ובשבילים העיקרי היו דנדריטים של הגוף התא של נוירון; ובשבילים משני היו ענפים מן הראשית וכן הלאה עם ובשבילים השלישון, רבעוני, quinary. המבנה של הסתעפות דנדריט הופרד בהתאם הרמות של סניפים. למשל, % העיקרי היה מספר הסניפים מחולקת על ידי המספר הכולל של הסתעפות, וכן הלאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : תוצאות נציג להחרשת Sox102F בנוירונים דה- להחרשת Sox102F בנוירונים da (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ממ ק-GAL4) הובילה באופן משמעותי מופחתת דנדריט אורך, קצר מ. עם מבנה פשוט הזחל לחלל השלישי לעומת שולט. ההבדלים בין Sox102F-RNAi זבובים (UAS-Sox102F-RNAi/UAS-GFP; ממ ק-GAL4, N = 21) ושליטה (UAS-GFP; ממ ק-GAL4 / +, N = 20) היו זבובים על (א) דנדריט אורך (B) ארבור שטח (C) המספר הכולל של סניפים, וכן (D, E ) מסעף מבנה של הנוירונים da. סטודנט-T-test היה ורצונו לשם ניתוח סטטיסטי. * מציין מובהקות סטטיסטית (p < 0.05). קווי השגיאה הם הממוצע ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דנדריטים זה innervate האפידרמיס הם אזורי קלט של נוירונים, מורפולוגיות שלהם לקבוע כיצד המידע התקבל, מעובד על ידי נוירונים בודדים. פיתוח דנדריט מורפולוגיה משקף ג'ין אפנון של הארגון דנדריט. הנוירון da זחל דרוזופילה של מערכת העצבים ההיקפית הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח דנדריט בגלל: 1) הדמיון פונקציונלי עם יונקים11,12; 2) ארבע הבחנות השיעור מבוסס על מבנה דנדריט11,12; ו- 3) גורמים גנטיים המווסתים מורפוגנזה. פרוטוקול זה, אנו מציגים את זרימת העבודה הזחלים מההכנה ועד ניתוח תמונות של נוירונים da דרוזופילה . השיטות לתאר את ארבעת הפרמטרים החשובים לניתוח דנדריטים בנוירונים da בפירוט, המהווים האורך של דנדריטים, את פני השטח, כלל מספר סניפים, ומבנה מסעף. השלב הקריטי היה להסיר רקמות רבות מהקיר זחל הגוף ככל האפשר כדי לחשוף באופן מלא את הנוירונים da עבור הדמיה וניתוחים. אולי יש כמה ענפים קצרים מנותקים בגלל מספר מוגבל של תמונות Z-ההקרנה. כמו בשיטה זו הוא המדד היחסי של דנדריטים אורך בהשוואה הפקדים, מספר גדול של תמונות עבור כל קבוצה של נוירונים da יש לנקוט כדי להגביר את אזורי הכיסוי של Z-הקרנת תמונות.

דרוזופילה class IV דה נוירונים היה המוקד של מחקר לגבי דנדריט ארבור מורפולוגיה15,21,22,23. מורפוגנזה התפתחות הדנדריטים ארבור תיתכן הפרעה על ידי הפסד או רווח של תפקוד הגן, הוכחת כי פיתוח נוירון דא הוא רגיש שינויים גנטיים24. על מחקרים גנטיים, חשוב לנתח מורפולוגיה במדויק על מנת להבין את ההשפעה שלו על הנוירונים da. Class IV דה הנוירונים הם מורכבים אך עדיין נגישות באיכות גבוהה הדמיה מכיוון שהם נמצאים מתחת לקיר גוף שקוף למחצה, סניף, כמעט לחלוטין שני מימדים. קרינה פלואורסצנטית דינמי GFP שכותרתו da נוירונים (ממ ק-GAL4; UAS-GFP) מספקות מודל מטמיעים בקלות לחקור את ההתפתחות העצבית. משתנה לכיוון של שינוי מורפולוגיה של, ובשבילים יכולים להיות overbranched או פשוטה. כאן, אנחנו מסווגים מורפולוגי אלה משתנה על-ידי quantitive פרמטרים, כגון אורך דנדריט, את פני השטח, כלל מספר סניפים, ומבנה הסתעפות של נוירונים da. התוצאות משקפות את התגובה בביטוי Sox102F ויסות ההתפתחות העצבית, כפי שמוצג במחקר זה.

פרוטוקול שלנו שימש כדי להציג את שינויים מורפולוגיים של class IV דה נוירונים בזבובים, אשר דרוזופילה ortholog של SOX5, Sox102F, הושתק, המציינת את תפקיד פונקציונלי חשוב של SOX5 בפיתוח דנדריט מורפוגנזה. החלבונים ונ ט הם משפחה של glycoproteins על ידי זה היו מעורבים בוויסות דנדריט morphogeneis. Wnt2, Wnt7b לקדם da ו המורכבות עצביים9,10. ב מסלול הקנוני ונ ט, הפעלה זה ואחריו הפעלה של GSK3β, קינאז סרין-טראונין, המפעיל בתורו β-catenin מתווכת שעתוק10,25. קודם לכן מצאנו כי להחרשת SOX5 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y אדם כתוצאה דיכוי משמעותית של פעילות איתות ונ ט, מווסתות את הביטוי של מספר גנים ונ ט כולל של ביטוי של GSK3β 15. ביטוי מוגבר של GSK3β היה קשור עם המאפיינים סימן ההיכר של AD, לרבות אובדן זיכרון, β-עמילואיד המכות hyperphosphorylation חריגה של טאו26. וכמובן SOX5 גדל GSK3β הביטוי, אשר עשוי להצביע על קשר פונקציונלי בין SOX5 ו- GSK3β.

הנוירונים da השיעור הרביעי יש את רוב דנדריטים מורכב של כל נוירונים סנסוריים. ב פרוטוקול זה, פיתחנו שיטה לנתח את המורכבות של סוכת וסניפים אל מופשט המאפיינים של class IV דה נוירונים בדרוזופילה בהתבסס על תוספים זמינים כמקובל ותוכנה. תמונות שנלקחו מן מיקרוסקופ קונפוקלי נותחו, וסיפק פילוח תוסף של מכשיר מעקב neurite פשוט כלי אידיאלי לאתר פיתוח ענפים27,28. בנוסף, שיטה זו כימות מאפשרת לניתוח מפורט של דנדריט מורכבות על ידי הצגת את היחס של רמות שונות של המסתעפת מ- soma פיתוח רחוקים יותר. יתר על כן, שיטה זו עשויה לשמש כדי לנתח את מחלקות אחרות של נוירונים da. למשל, מחלקה אני da נוירונים להרחיב דנדריטים משני לצד אחד של הקיר הגוף; class II יש סניפים bifurcating סימטרי; השיעור השלישי da נוירונים יש מורכבות רבה יותר של הסתעפות וחריגות. לסיכום, סיפקנו פרוטוקול הדמיה וניתוח של class IV דה נוירונים עבור ניתוחים דנדריט עצביים ב דרוזופילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ויליאם א אימר לסיוע טכני הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי לקרן תרופה לאלצהיימר [R.E.T], המכון הלאומי לבריאות [R01AG014713, R01MH60009 אל R.E.T; R03AR063271, R15EB019704 ל א. ל.], ואת הקרן הלאומית למדע [NSF1455613 ל א. ל.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline(PBS) Gibco Life Sciences 10010-023
TritonX-100 Fisher Scientific 9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA) Electron Microscopy Sciences 15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent Dow Corning Corportation 3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36931
Fingernail polish  CVS 72180
Stereo microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Petri dish Falcon 353001
Forceps Dumont 11255-20
Scissors  Roboz Surgical Instrument Co RS-5611
Insect Pins  Roboz Surgical Instrument Co RS-6082-25
Microscope slides and cover slips Fisher Scientific 15-188-52

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71, (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20, (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452, (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9, (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50, (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283, (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138, (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50, (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8, (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112, (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43, (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418, (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26, (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6, (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119, (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4, (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315, (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42, (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26, (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27, (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168, (1), 134-139 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics