ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

Neuroscience

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Summary

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析、ショウジョウバエ、樹状突起の形態形成の研究に使用することができます。

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Wang, S., Tanzi, R. E., Li, A. Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila. J. Vis. Exp. (143), e57139, doi:10.3791/57139 (2019).

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Abstract

樹状突起、ニューロンは、分岐予測、樹状突起の形態が神経系の開発の間にシナプス組織を反映しています。ショウジョウバエ幼虫の神経樹状パターン形成 (da) は、神経樹状突起、神経系の発達における遺伝子の機能の形態を研究するための理想的なモデルです。Da 細胞の 4 つのクラスがあります。クラス IV は larval ボディ壁のほぼ全領域をカバーする分岐パターンと最も複雑です。クラス IV の神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) 4 つのパラメーターを使用してSOX5ショウジョウバエ相同をサイレンシングの効果を特徴付けた以前: 樹状突起の長さ、デンドライト カバレッジの表面積、分岐、および分岐構造の合計数。このプロトコルは NDAC 定量分析、幼生解離、共焦点顕微鏡と ImageJ ソフトウェアを使用して画像解析手順で構成されるワークフローを示します。Da ニューロンの開発とその基になる機構にさらなる洞察力、神経機能の理解を改善し、神経の根本的な原因についての手がかりを提供して神経発達障害。

Introduction

樹状突起、ニューロンの分岐予測であるは、他のニューロン1,2からニューロンの感覚およびシナプス入力を含むフィールドをカバーします。樹枝状結晶はシナプスの形成の重要なコンポーネントおよびニューロンに電気刺激の伝播し同様、シナプスの入力の統合において重要な役割を果たします。樹状分枝 (da) は、新しいシナプスを作成する新しい樹状分枝ニューロンを形成するプロセスです。Da 支店密度などグループ化パターンの形態と開発多段階の生物学的プロセスの結果、神経機能に相関の高い。このプロトコルの目的はの神経 dendritric 楔形の複雑さの定量分析のためのメソッドを提供するショウジョウバエ

樹状突起の複雑さは、シナプスの種類、接続、およびパートナーのニューロンからの入力を決定します。分岐パターンおよび樹枝状結晶の密度は樹状フィールド3,4上に収束する信号処理に関与しています。樹状突起は、開発調整の柔軟性を持っています。例えば、シナプス合図では、体性感覚ニューロン発達段階と成熟した神経系5のデンドライト組織に影響を及ぼす。神経接続の確立は、形態形成と樹状突起の成熟に依存します。樹状突起の奇形は神経機能障害に関連付けられます。研究は、da ニューロンの形態形成の異常がアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD) を含む複数の神経変性疾患、ルー ・ ゲーリック病の病因に貢献することを示されている/筋萎縮性側索硬化症 (ALS)6,7,8。シナプス変化は衰退とニューロン機能7,8の減損とのコンサートで、広告の初期の段階で表示されます。ただし、デンドライト病理学がこれらの神経変性疾患の病因に貢献する方法の具体的な内容は、とらえどころのないままです。

規制当局、タンパク質9,10、転写因子、細胞表面の受容器11,12 配位子の Wnt ファミリーなどの複雑なネットワークをエンコードする遺伝子によって樹状突起の発達の制御します。.ショウジョウバエda ニューロンから成る 4 つのクラス (クラス I、II III、IV)、クラス IV の da ニューロンは最も複雑な分岐パターンを持っているし、より良い理解形態13、強力な実験的システムとして採用されています。 14。初期形態形成における過剰発現や RNAi はクラス IV の da ニューロンの遺伝子のサイレンシングは分岐パターンとデンドライト剪定13の変化の結果します。神経細胞の樹状突起パターン形成の定量分析のための実用的な方法を開発することが重要です。

我々 は以前にSOX5ショウジョウバエ相同を黙らせる、 Sox102F、導いた短い樹状突起の da ニューロンとクラス IV da ニューロン15の複雑さを軽減します。ショウジョウバエにおける神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析の手順を紹介します。このプロトコルは、以前説明した方法論からの適応は、da ニューロンの開発を試金する簡潔な方法を提供します。ロバストな画像のラベル付け、3 齢幼虫の体壁16,17,18,19の da ニューロンを示しています。NDAC と体内の発達の違いを調査したい人のための貴重なプロトコルです。

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Protocol

1. 実験準備

  1. 次の試薬の準備: ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (PBS);トリトン X-100;0.2 %pbst (PBS + 0.2% トリトン X-100);32% パラホルムアルデヒド (PFA) 4% 使用前に希釈シリコーンのエラストマー ベースと硬化剤;antifade マウント媒体 (例えば、延長金);指の爪のポーランド語。
  2. 次の機器を準備: 解剖顕微鏡 2 シャープな鉗子と顕微解剖、解剖皿、顕微鏡のスライドや coverslips、共焦点顕微鏡を作るためのシャーレ用ピン数顕微解剖用ハサミと、フィジー ImageJ ソフトウェアがインストールされたコンピューター。

2. 幼虫コレクション

  1. それぞれ W1118野生型ハエや ppk GAL4、UAS GFP と UA Sox102F RNAi ハエを仲間します。文化は、25 ° C で標準状態で飛ぶ
  2. 5 〜 6 日 UA Sox102F RNAi の 3 齢幼虫を収集/ppk GAL4 や UAS GFP、UAS GFP ppk GAL4/+ 解離ピンセットで慎重にコントロール。

3. 幼虫の郭清

注: このセクションのすべての手順は、顕微解剖顕微鏡の下で運営されています。倍率は調査官次第です。最適な視力表示を調整しようとします。4 〜 6 倍の倍率をお勧めします。

  1. 基本シリコーン ・ エラストマー製解剖皿と組織培養シャーレに幼虫を配置します。
  2. 背側、上向きにできるように幼虫口フックをピン留めし、幼虫の尾をピンします。オープン アップ マーカーである正中線を公開するためにできるだけ途中で背側を配置します。
  3. 本体の水分を維持するために幼虫に 200 μ L の PBS を追加します。
  4. 吻側に尾側から 2 つの気管の背側正中線に沿ってはさみでカットをします。幼虫の体の 4 つのコーナーのそれぞれで小さい切り傷を作る。
  5. 体が平らので体の 4 つのコーナーのそれぞれにピンを配置します。
  6. 4% で幼虫の体壁を修正する PFA 室温で 25 分。
  7. Pbst; 5 分繰り返し 2 回以上洗ってください。
  8. 組織からピンを削除します。組織を転送 antifade 実装中、スライド ガラスの上にカバーし、カバー スリップをマウントします。1 時間乾燥空気し、指の爪のポーランド語でエッジをシールします。

4. 画像の処理

注: 画像は倒立共焦点顕微鏡システムを使用して撮影されました。ユーザーは、(推奨) 20 × 対物を使用してサンプルを写真することができます。

  1. Z シリーズ画像をキャプチャします。共焦点顕微鏡のソフトウェアで「Z シリーズをキャプチャ」ダイアログ ボックスを開きます。Z シリーズのイメージをキャプチャする範囲を決定します。
    1. 「上と下」ボタンををクリックしてします。上部と下部位置し、入力する値を決定する「下:"と"トップ:"ボックス。0.5 μ m として「Z シリーズを取り込み」ダイアログ ボックスの「ステップ」を設定します。Z シリーズ画像を取得する「今すぐ実行」ボタンをクリックしてします。
  2. *.Tiff または *.nd2 ファイルとしてイメージを保存します。
  3. イメージング後、4 ° C で暗いホルダーにスライドを格納します。

5. 樹状突起の評価

注: GFP タンパク質だったが、UAS GFP で co 過剰発現、ppk GAL4 飛んで GFP 蛍光分析のための da ニューロン。長さ、分岐、および第 3 齢幼虫の da ニューロンの構造を定量化しました。解析パラメーターには、長さ樹状突起 (μ m)、表面積 (2μ m)、枝、および分岐構造 (%) の合計数が含まれます。図 1は、詳細に解析パラメーターを示します。

  1. 樹状突起の長さ
    注: 樹状突起の長さは、トレーサーのプラグインというラベルの付いたすべての樹状突起の合計です。
    1. セットアップおよびフィジー ImageJ (https://fiji.sc/)20ソフトウェアを実行します。画像のいくつかのチャンネルがある場合、別々 のチャンネルに画像を分割します。
      注: このプロトコルのイメージは、GFP の 1 つのチャンネルのみが。
    2. 実行"画像 |スタック |Z プロジェクト"Z 投影; を取得するには新しいウィンドウが表示され、名 ' Z-投影。投影型の「最大強度」をクリックしてしスタート スライスとスライスによっては停止間数を整理する個々 の好みに応じて。"OK"をクリックします。Z 投影画像樹状突起を明確に提示することが表示されます。
    3. 神経突起をトレースします。
      1. 選択して"プラグイン |分割 |単純な神経突起トレーサー"ウィンドウに樹状突起をトレースします。ニューロン相馬を見つけ、樹状突起細胞体とこの樹状突起の先端のもう一つの点からの 1 つのポイントをクリックします。
        注: 青い線と 2 つの点は、プログラムが接続されます。
      2. パスが明らか場合プラグイン ・ ウィンドウで"Y"キーを押しますデンドライトのパスは、可視画像で選択されたパスの端点までトレースされます。同じプラグイン ウィンドウを「完全なパス」をクリックします。セグメントが完了した (図 2)。
        注: いくつかの樹状突起は小さなセグメントに分割された経路の出発点から遠くなったセグメントは、トレーサーの完全なパスを提供するために結合されました。
    4. パスが完了した後は、枝が、新しいポイントに戻る。新しいパスを作成できるで。「すべてパス」ウィンドウ ボックス (図 3) すべてパス長さ値が表示されます。トレース ファイルを保存し、図 2に示すように、未完成のトレースを続行します。
    5. クリックすると、樹状突起の長さデータをエクスポート"ファイル |*.Cvs として"ウィンドウでエクスポート 'プラグイン'。次にすべてのパスの長さを合計し、データ分析/表計算ソフトへデータをエクスポートします。(図 3)。
  2. Da ニューロンの表面積
    1. ' フィジー ImageJ」ウィンドウでフリーハンド描画ツールを選択します。パスをトレースし、端点を接続します。[分析] メニューを選択"測定 |領域"です。[分析] メニューから「メジャー」をクリックします。選択領域 (図 4) の値を持つ新しいボックスに結果が表示されます。データ分析ソフトウェアにそれをコピーします。
  3. 合計の番号の枝と da ニューロンの分岐構造
    1. 「分析」を開くことによって枝の総数を計算し、「レンダリング |分析された白骨パス」[プラグイン] ウィンドウ (図 5) をトレースの。
      注: アーバの構造は、枝のレベルの合計です。細胞体と樹状突起先端間パスを定義し、1 つのパスはプライマリのアーバーは、ニューロンの細胞体から樹状突起など複数の分岐を含めることができます。セカンダリのアーバーは、第三紀、第四紀となおアーバーでプライマリからの分岐です。樹状突起の分岐の構造は、枝のレベルによって区切られています。たとえば、プライマリの % は、枝分岐の合計数で割った値と数です。

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Representative Results

Da ニューロンの樹状突起は、da 神経相馬と GFP 蛍光分析の樹状のアーバー (UA GFP; ppk GAL4) co 過剰発現の GFP でラベル付けされました。Da ニューロンの樹状突起の形態は、倒立共焦点顕微鏡 (図 2) でイメージしました。

Da ニューロンの樹状突起は、フィジー ImageJ ソフトウェアを使用して追跡しました。ファイルは、樹状突起長 (図 3) を推定する使用されました。Da ニューロン (N = 21) (UA-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; Sox102FのサイレンシングUAS-GFP) コントロールと比較してシンプルな構造をもつ樹枝状結晶および短い枝の長さの数の大幅な削減につながった (N = 20) (UA GFP; ppk GAL4/+) 3 齢幼虫 (図 6)。具体的には、 Sox102Fが沈黙されましたハエ展示 127 μ m コントロール 249 μ m と比較して平均樹状突起の長さの減少 (p = 0.02)、552,476 μ m2のより小さい平均アーバーの表面積は 847,571 μ m2と比較していたとコントロール (p = 0.04)。さらに、枝の数を減らして、17 (17.3 ± 6.7)、28 (28.4 ± 9.5) コントロールと比較しての総枝とアーバーの単純な分岐構造で起因したSox102Fのサイレンシング (p = 0.04)。学生の t テストを行った、グループ間の違いを比較して、有意水準は 0.05 に設定されました。

Figure 1
図 1:ショウジョウバエの da ニューロンの樹状突起の解析パラメーターの概略図(A)パネルは、da ニューロンの元のイメージです。(B)樹状突起の長さは、すべての測定の da ニューロンのすべての樹状突起の長さの平均値でした。(C) da ニューロン樹状突起の表面積は ImageJ フリーハンド ツールで手動で定義されました。(D)この回路図は、枝の合計数をカウントし、da ニューロンの分岐構造を解析する方法を示します。1: プライマリ植樹。2: セカンダリ植樹。3: 第三紀の植樹。4: 第四紀植樹。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: Da ニューロンの樹状突起の代表的なトレースします。共焦点レーザー蛍光顕微鏡システムの da ニューロンをイメージしました。(A)最初のトレース細胞体、樹状突起の終了点から開始点とプラグイン/分割ツールを使用して作成されました。ブルーライン (白い矢印) は、定義されているパスを表します。クリックして「はい」(赤矢印) 後、行は、色を青から赤に変わります。(B)それを「終了パス」をクリックすると紫(C)が表示されます。(A ~ C)単一の樹状突起; をトレースのプロセスを示しています(D)完全なイメージをトレースします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: トレースのパスの測定。左のイメージは、実行した後、トレースのパスを測定する方法を示しています、"分析 |「パスをを測定スプレッドシート ファイルにパスの長さの値をエクスポートし、長さの合計を計算します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: デンドライトの表面積を手動で定義する例です。(赤の矢印で表示) ImageJ ウィンドウ メニューの [フリーハンド] ツールを使用して定義された画像が得られました。測定値を設定するには、領域を選択します。赤いボックスに表示範囲を取得するには、「メジャー」関数を実行します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 分岐の分析の例です。実行"Analysis_Render |分析された白骨のパス"「セグメンテーション」プラグイン ウィンドウで。レンダリング パスとその数を選択することによって得られた「すべてのパスをレンダリング |「概要をを取得します。細胞体と樹状突起先端間のパスを定義し、1 つのパスは、複数の分岐を含めることができます。たとえば、プライマリのアーバーがニューロンの細胞体から樹状突起セカンダリのアーバーは、第三紀、第四紀となおアーバーでプライマリからの枝でした。樹状突起分岐の構造は、枝のレベルによって分かれていた。例えば、主 % 枝分岐の合計数で割った値というように数であった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: Da ニューロンSox102Fのサイレンシングの代表の結果。樹状突起の長さを削減大幅につながった da ニューロン (UA-Sox102F-RNAi/UA-GFP; ppk GAL4) Sox102Fのサイレンシングとコントロールに比べて短い第 3 齢幼虫で単純な構造で分岐します。Sox102F RNAi ハエの違い (UA-Sox102F-RNAi/UA-GFP; ppk GAL4、N = 21) と制御 (UA GFP ppk-GAL4/+、; N = 20) ハエは、(A) 樹状突起長 (B) 植樹面積 (C) との合計数枝、(D、E) da ニューロンの分岐構造。スチューデント T-検定を統計分析を施行しました。* 統計的有意性を示す (p < 0.05)。誤差は、平均 ± 標準偏差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

表皮を刺激する樹状突起、ニューロンの入力領域とどのように情報の受信を検出し、個々 のニューロンによって処理の形態を決定します。開発デンドライト形態は、デンドライト組織の遺伝子の調節を反映しています。末梢神経系のショウジョウバエ幼虫の da ニューロンは樹状突起の形成のための研究のための重要なモデル: 1) 哺乳類11,12; と機能の類似性2) 4 階級差別に基づいて樹状構造11,12;・ 3) の形態形成を調節する遺伝的要因。このプロトコルでは幼虫の準備からショウジョウバエda 細胞の画像解析までのワークフローを提案します。メソッドでは、分岐の構造、分岐数の合計表面積樹状突起の長さは、詳しくは、da ニューロンの樹状突起を分析するための 4 つの重要なパラメーターについて説明します。重要なステップは、幼虫の体壁から投射そして分析のための da ニューロンを完全に公開することが可能として多くのティッシュを取除くことだった。いくつかの短い枝 Z 投影像の限られた数のため切断可能性があります。このメソッドは、コントロールと比較して樹状突起の長さの相対的な測定値は、Z 投影像のカバレッジ エリアを高めるため da ニューロンのグループごとのイメージの大規模な数を取られるべき。

ショウジョウバエクラス IV da ニューロン樹状突起アーバー形態15,21,22,23に関する研究の焦点となっています。樹状アーバー開発の形態形成は、遺伝子の機能、da ニューロンの開発が遺伝子の変化24に敏感であることを示す損益によって混乱するでしょう。遺伝学的研究、da ニューロンへの影響を理解するために形態を正確に分析することが重要です。クラス IV da ニューロンは複雑なまだ高品質イメージング半透明体壁と 2 つの次元でほぼ完全分岐の直下にあるためバリアフリーです。動的の GFP 蛍光標識 da ニューロン (ppk GAL4;UAS-GFP) 神経の開発を調査するため容易に可視化モデルを提供します。アーバーを overbranched したり簡略化になる、形態変化の方向が異なります。ここでは、我々 はこれらの形態学的分類定量的パラメーター、例えば樹状突起の長さ、表面積、枝の合計の番号と da ニューロンの分岐構造を変更します。結果は、本研究で示すように、神経の開発を規制するSox102F式の応答を反映します。

ハエにクラス IV da ニューロンの形態学的変化を表示する使用された私たちのプロトコルであるSOX5Sox102Fショウジョウバエ相同沈黙されました、樹状突起形成におけるSOX5の重要な機能的役割を示す形態形成。Wnt タンパク質は、樹状突起 morphogeneis の調節に関与している分泌される糖タンパク質の家族です。Wnt2 と Wnt7b は、da と神経複雑さ9,10を促進します。Wnt の標準経路で、この活性化には GSK3β、β-カテニンを介した転写10,25を起動するセリン スレオニン ・ キナーゼの活性化が続きます。我々 は以前、SH SY5Y 神経芽細胞腫細胞におけるSOX5のサイレンシング Wnt シグナル伝達活性の有意な抑圧の結果、 GSK3β の過剰発現を含む Wnt 遺伝子の数の表現を規制を発見しました。15GSK3β の発現の増加は、記憶喪失、β アミロイドとタウ26の異常なタウを含む広告の特徴特性に関連付けられています。SOX5のサイレンシングGSK3β 式SOX5GSK3β 間の機能的なリンクを示す可能性があります増加します。

クラス IV の da ニューロン感覚ニューロンは、すべてのほとんどの非常に複雑な樹状突起があります。このプロトコルではアーバーのクラス IV ダ従来利用可能なプラグインとソフトウェアに基づいて、ショウジョウバエのニューロンの特性を抽象化する分岐の複雑さを解析する手法を開発しました。共焦点顕微鏡から撮影した画像を分析し、単純な突起トレーサーのプラグイン分割提供27,28の枝樹状をトレースするための理想的なツール。また、この数量化より遠い樹状に分岐、相馬からの様々 なレベルの比を示すことによってデンドライト複雑さの詳細な分析できます。さらに、このメソッドを利用して da ニューロンの他のクラスが分析される可能性があります。クラスのインスタンスの da ニューロン体壁の片側にセカンダリ樹状突起を拡張クラス II に分岐枝は対称的に、します。クラス III da ニューロン、分岐およびスパイクの複雑。要約すると、ショウジョウバエの神経細胞の樹状突起解析イメージングのプロトコルおよびクラス IV の da ニューロンの解析がきました。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 はイメージングの技術援助のためウィリアム A. Eimer を感謝したいです。この作品は 【 R.E.T] を治療アルツハイマー病の資金によって支えられた、国立衛生研究所の 【 R01AG014713 ・ R.E.T; に R01MH60009R03AR063271、アダムローリーに R15EB019704] 国立科学財団 [アダムローリーに NSF1455613]。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline(PBS) Gibco Life Sciences 10010-023
TritonX-100 Fisher Scientific 9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA) Electron Microscopy Sciences 15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent Dow Corning Corportation 3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36931
Fingernail polish  CVS 72180
Stereo microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Petri dish Falcon 353001
Forceps Dumont 11255-20
Scissors  Roboz Surgical Instrument Co RS-5611
Insect Pins  Roboz Surgical Instrument Co RS-6082-25
Microscope slides and cover slips Fisher Scientific 15-188-52

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References

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