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허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

Neuroscience

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Summary

이 절차의 전반적인 목표는 비보에 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 평가 대 한 높은 재현 기법을 제공 하는입니다.

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Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

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Abstract

허 혈 성 뇌졸중 vasogenic 대뇌 부 종 및 후속 기본 뇌 손상, 혈액-뇌 장벽 (BBB)의 파괴를 통해 중재 된다 이끌어 낸다. 유발 허 혈 성 뇌졸중 쥐 설립 되었고 BBB의 기능 무결성을 조사 하 비보에 모델로 사용. 허 혈 성 상해 두뇌 샘플에서 에반스 블루 (EB)의 spectrophotometric 감지 소설 치료 modalities의 개발과 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 정당성을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 재현성 결과 생성 하 고 특별 한 장비를 위한 필요 없이 어떤 실험실에 적용 됩니다. 여기, 선물이 쥐에서 허 혈 성 뇌졸중의 유도 따라 EB의 넘쳐 흐름의 검출에 시각 및 기술 지침.

Introduction

Vasogenic 뇌 부 종 혈액-뇌 장벽 (BBB) 중단으로 인해 허 혈 성 뇌졸중의 중요 한 합병증 및 뇌졸중 환자1,2에서 생존 율의 주요 결정 요인이 남아 있다. 혈액-뇌 장벽 (BBB)는 뇌 모 세관 내 피 세포 (BCECs)에 의해 형성 된 뚜렷한 혈관 구성 요소 (예: BCECs, pericytes, astroglial, 및 신경 세포3중 꽉 접합)의 구성, 제공 하는 중앙 신경 조직 (CNS) 말 초 혈액 순환4,5사이의 특수 하 고 역동적인 인터페이스. 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 등 모욕 BBB의 기능적 무결성을 방해 하 고 궁극적으로 트리거 대뇌 염증 및 기본 뇌 손상 뇌 실질에 순환 하는 백혈구의 침투를 후속으로 이어질 수 있습니다. 6 , 7. 뇌졸중의 발생에 따라 BBB의 부전의 정확한 검출을 위한 동물 모델 필요. 이러한 모델은 새로운 신경 보호 전략을 소개 하 고 기본 병 태 생리 기계 장치 공부에 대 한 매우 중요. 체 외에서 세포 문화 기반 모델 BBB의 높은 개발 하 고 되었습니다 BBB physiopathology8,,910의 분자 연구에 사용. 그럼에도 불구 하 고, vivo에서 동물 모델, 인간의 임상 조건에 비슷한 BBB의 허 혈 성 손상, 생산은 또한 매우 보람 이와. 에반스 블루 (EB)의 넘쳐 흐름의 정량적 검출은 잘 허용 하 고 민감한 기술 평가 BBB 무결성 및 신경 퇴행 성 질환, 허 혈 성 뇌졸중11, 를 포함 하 여 기능에 대 한 사용 되었습니다. 12 , 13 , 14.이 방법은 비용, 재현성, 및 완전히 적용 가능한 모든 실험 실험실에서. 그것의 구현 방사성 트레이 서15 또는 자기 공명 영상 (MRI)16다른 방법에 대 한 필수 구성 요소를 같은 고급 장비를 필요 하지 않습니다. 이 문서에서는, BBB 평가 EB 넘쳐 흐름을 사용 하 여 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서의 기본적인 기술적 프로세스 포괄적으로 설명 합니다.

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Protocol

모든 절차는 동물 연구를 실시 위한 아르다 빌 대학교 의료 과학 연구 위원회의 지침에 따라 수행한 (윤리적 ID 번호: 적외선 ARUMS입니다. REC.1394.08).이 시각된 연구에서 사용 하는 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐 (300-350 g) 목초지 연구소 (테헤란, 이란)에서 얻은.

1. 마 취와 Flowmetry

  1. 4 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도 하 고 수술 하는 동안 질소 산화물 (70 %v / v)와 산소 (30 %v / v)의 혼합물에 isoflurane (1-1.5%)으로 유지 합니다.
  2. 피드 백 제어 난방 담요에 발생 하기 쉬운 자세에서 anaesthetized 동물을 놓고이 난방 장치에 연결 된 프로브를 직장에 의하여 37±0.5 ° C에서 체온을 유지 합니다.
  3. 건조를 방지 하기 위해 양쪽 눈에 안과 연 고의 작은 금액을 적용 합니다.
  4. 전기 면도기와 두개골의 왼쪽에 외과 영역을 면도. 거 즈 패드와 함께 betadine 솔루션을 사용 하 여 피부를 소독. 린스이 지역 메 마른 패드 70% 에탄올을 포함 하 고 3 주기17두 단계를 반복 합니다.
  5. 진통, 대 수술 지역17에 0.5 %bupivacaine 0.2 mL을 피하 주사.
  6. (왼쪽된 눈의 측면 법에서의 왼쪽된 귀에 확장 되는) 두개골에 1cm 긴 피부 절 개를 하 고 두개골 노출 왼쪽된 temporalis 근육 해 부. 그런 다음 만들 작은 버 구멍 5mm 측면 하 고 1mm 도플러 유량 계 연필 프로브 팁의 용이성 배치 bregma18 후부.
  7. 경향이 부정사의 위치에서 쥐 바뀌고 레이저 연필 조사 지역 대뇌 혈 류 (rCBF)을 모니터링 하는 데 이전 드릴된 두개골 블라인드 구멍에 넣어.
  8. 각 동물의 초기 rCBF를 기록 하 고 100%로 이것을 고려 하십시오. 특히, 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) rCBF의 80%에 감소는 검색된19,20때마다 시작 됩니다.

2입니다. 초점 Cerebra 허 혈의 유도

  1. 목 영역을 면도 하 고 betadine 솔루션 및 70% 에탄올으로 피부를 소독. 진통17수술 사이트에서 피하 0.5 %bupivacaine 0.2 mL를 주사.
  2. 좌 일반 경 동맥 (LCCA) 액세스할 수 목의 복 부 표면에 2 cm 긴 외과 절 개를 확인 합니다. 외부 경 동맥 (ECA) 및 내부 경 동맥 (ICA)의 분기점에 액세스 하려면 인접 근 막과 미주 신경에서 LCCA를 격리 합니다.
  3. LCCA 또는 5-0 비단 봉합 사를 고용 하는 ECA 영구적으로 선 하 고 ICA pterygopalatine 동맥의 수준에 무료 부.
  4. 느슨하게 LCCA, 주위 5-0 비단 봉합의 넥타이 배치 후 일시적으로 사라지는 혈관 마이크로 클립 클램프.
  5. 이전 배치 느슨한 넥타이 이전 LCCA에 작은 절 개를 하 게 다음 ICA의 luminal 공간에 4-0 실리콘 코팅 나일론 봉합을 삽입 하 고 나일론 봉합 확보 및 혈액 누수 방지 LCCA 주위 봉합 조입니다.
  6. ICA에서 혈관 마이크로 클립을 제거 합니다. 그런 다음, MCA 근원의 폐색을 나타내는 rCBF에 표시 된 감소를 관찰까지 실리콘 코팅된 intraluminal 필 라 멘 트를 사전. 허 혈 성 기간 (90 분)의 끝에, intraluminal 봉합21철수 여 reperfusion를 시작 합니다.

3. 경 정 맥 Cannulation 및 에반스 블루 (EB) 주입

  1. 1 cm 세로 절 개를 목에는 중간의 왼쪽을 만들고 퉁 명 스럽게 왼쪽된 경 정 맥 (LGV)의 외부 분기 액세스 멀리 표면 근을 해 부. 다음, 영구적으로 5-0 비단 봉합으로 LGV의 두개골 끝 선. 느슨하게 주위 정 맥, 두 관계를 놓고 일시적으로 혈관 마이크로 클램프와 LGV의 심장 끝을 클램프.
  2. 두 봉합 사이 LGV에 작은 절 개를 하 게 그리고 LGV의 luminal 공간으로 가득 heparinized 혈 청 카 테 터 삽입 및 사전 그것은 약 10 m m. 나중, 조여 정 맥 카 테 터를 확보 하 고 출혈 방지 주위 합자. 적은 양의 정 맥 붕괴를 피하기 위해 혈 청을 주입.
  3. Reperfusion 기간 시작 되는 시점에서 5 분 동안 EB 염료 (식 염 수에 2 %EB 솔루션의 1 mL/kg) 주사 천천히. 그 후,는 정 0.5 mL 정상 식 염 수를 주입 하 여 세척 하 고 주입 정 맥12,22에서 철수.
  4. 마지막으로, 목과 머리의 절 개를 봉합 하 고 intraperitoneally buprenorphine 0.05 mg/kg을 주사 (IP) 수술 후 진통17reperfusion 기간 동안 모든 6-8 h 주사를 반복.
  5. 복구 케이지17수 화를 제공 하기 위해 미리 데워 진된 saline(IP)의 5 mL를 주사.
  6. 장소 특별 한 복구에 동물 온도 및 공기 조화 제어 하 고 마 취에서 동물의 복구를 모니터링 합니다.

4. 혈액 뇌 장벽 침투성의 평가

  1. Reperfusion의 24 h 후 깊이 thiopental 나트륨과 동물 anesthetize. 그런 다음, 흉 골 아래에 작은 구멍을 만들어 흉 강을 엽니다.
  2. 오른쪽 아 트리 움에 작은 개통을 확인 하 고 미리 따뜻하게 0.9% 식 염 수 (37 ˚C) 안마당에서 정상적인 염 분 출구23무색 될 때까지 순환에서 EB를 씻어 15 분 동안 좌 심 실을 통해 110 mmHg의 압력의 250 mL를 주입.
  3. 즉시 두개골에서 뇌를 제거 하 고 뇌 매트릭스에 배치. 후 각 전구 및 소 뇌를 해 부하 고 중간 선 따라 왼쪽 (Lesioned)에서 뇌의 오른쪽 반구를 분리 후 깨끗 한 면도날을 사용 하 여.
  4. 각 반구의 무게 하 고 별도로 버퍼링 하는 인산 염의 2.5 mL에 균질 trichloroacetic 산 (60%)의 2.5 mL 소용돌이 기계를 사용 하 여 2 분이 혼합.
  5. 1,322 x g에서 30 분 동안 뇌 샘플 원심 고 샘플 10 분 동안 4 ℃ 냉장고에 진정을 허용 합니다.
  6. 610 nm23에 분 광 광도 계에 의해 EB 흡 광도 추정 하는 supernatants를 사용 합니다.
  7. EB 농도 표준 곡선 및 표현 결과 대 한 뇌 조직의 µ g/g으로 계산 합니다.

5입니다. 생산 EB 표준 곡선의

  1. EB 버퍼링 하는 인산 염의 5 ml에서의 µ g 1-10의 농도와 EB의 10 샘플 솔루션을 준비 합니다.
  2. 610에 각 샘플의 흡 광도 값 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
  3. Y 축 (그림 1)에 스프레드시트와 X 축에 현재 EB 농도 흡 광도 값을 사용 하 여 분산형 차트를 확인 합니다.
  4. 곡선의 방정식에 대 한 선형 추세선을 정의 합니다. 그런 다음 샘플의 EB 농도를 사용 합니다.
  5. 뇌 조직 무게의 µ g/g으로 EB 넘쳐 흐름의 최종 결과 보고 합니다.

6. 가짜 작업

  1. 가짜 운영 그룹 (포함 절 개 목 지역에 EB 주입)에 쥐와 같은 수술 과정을 수행 하지만 MCAO는 제외.

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Representative Results

가짜 운영 쥐의 좌 반구와 우 반구에서 EB 수준에 중요 한 차이가 없었다 (1.06 ± 0.1 µ g/g과 1.1 ± 0.09 µ g/g, 각각). 그림 2A 2B, 일시적인 허 혈의 유도에서 같이 (90 분 허 혈 / 24 h reperfusion) EB 수준에 상당한 차이 발생 (10.41 ± 0.84 µ g/g, p < 0.001) 각각에 비해 허 혈 성 쥐의 왼쪽된 반구에 운영 하는 가짜 쥐에 반구입니다. 샨 다, 이러한 결과 나타냅니다 정상적인 조건 하에서 EB 쉽게 뇌 실질에 BBB를 교차할 수 없습니다 대뇌 허 혈 성 모욕 (그림 2A와 2B) BBB의 향상 된 침투성 통해 EB의 넘쳐 흐름을 유도.

Figure 1
그림 1 : 표준 곡선 흡 광도 값에서 EB 농도 결정 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : EB 넘쳐 흐름 허 혈 성 뇌졸중 후 24 시간에 의해 BBB 장애의 평가. 가짜 운영 및 허 혈 성 동물 (A)에서 두뇌의 사진. 뇌 조직 (파란색) 넘쳐 흐름 EB의 강도 lesioned에서 BBB 붕괴의 범위에서 발생합니다. EB 농도 (lesioned) 왼쪽에서 준비 하는 샘플에 가짜 운영 및 허 혈 성 동물 (B) 두뇌의 반구를 오른쪽 (n = 6, *p< 0.001 p가짜 그룹에서 왼쪽된 반구에 비해 < 0.001에 비해 동측 반구의 같은 그룹)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

지금까지, autoradiography 방사성 추적기24,25, 면역 형광 검사 현미경 검사 법26,27, EB 넘쳐 흐름 기술은20, 의 검출 등 다양 한 방법 23 혈액-뇌 장벽 손상을 평가 하는 데 사용 되었습니다. EB 염료 강력 하 게 혈 청 알 부 민에 바인딩할 수 이며 혈관 누설을 감지 하 고 측정 BBB 붕괴11,,2829는 추적 프로그램으로 사용 됩니다. 매우 허용 하 고 안정적인 방법으로 EB 넘쳐 흐름 기술 허 혈 성 뇌졸중을 포함 한 다른 뇌 부상에 의해 영향을 받는 BBB의 무결성에 직접 견적을 제공 합니다.

BBB의 vivo에서 평가 연구원을 허 혈 유발 vasogenic 뇌 부 종의 가능한 병 태 생리 기계 장치를 공부 하 고 새로운 치료 개입을 찾을 수 있습니다. 이 모델 특별 한 시설을 필요로 하지 않습니다 및 실험 (80% 이상)13,20의 높은 성공률을 신뢰할 수 있는 결과 얻을 수 있습니다. 뇌 조직에 직접 액세스,이 모델 BBB 무결성의 매우 정확한 평가 가능 하 게 하지만 장기 연구로 제한 됩니다.

허 혈 성 뇌졸중으로 인 한 BBB에 병 적인 변화 3 단계에서 개발: (시간), 급성 아 급성 (일 시간), 만성 (일 개월)30,31. 물론, 초기 치료 내정간섭 급성 병 적인 단계에서 귀중 한 보호 효과 생산. EB 복용량과 주입의 시간 포인트는 허 혈 성 모욕 다음 BBB의 동적 특성으로 인해 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위한 두 가지 중요 한 매개 변수. 따라서, reperfusion 기간의 시작 후 적절 한 복용량 (1 mg/kg의 식 염 수에 2 %EB 솔루션)을 사용 하 여 정 맥 정 맥을 통해 천천히 EB 염료의 주입 중요 한 요소 이며 뇌졸중의 초기 단계에서 병 태 생리 변화 연구를 수 .

여러 가지 실험 방법은 허 혈 성 뇌졸중 연구 도입 되었습니다. 이 실험 모델에서 우리 intraluminal 필 라 멘 트 메서드를 조건 인간의 선21,32와 비슷한 MCAO 사용. 이 기술은 간단 하 고 믿을 수 있다; 그러나, 실행 기술의 성능 향상의 정확성 수 몇 가지 기술 포인트를 고려 해야 합니다. 체온 유지 되어야 한다 생리 적 범위 내에서 수술 하는 동안 혈압과 혈액 가스 모니터링된33,,3435이어야 하는 동안. 레이저 도플러 유량 계와 rCBF의 기록 하 고 적합 한 준비를 사용 하 여 일정 한 실리콘 코팅 필 라 멘 트 수 MCAO 성공률 증가 뿐만 아니라 또한 사망 율을 줄이기 위해.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 재정 지원에 대 한 아르다 빌 대학 의료 과학 (아르다 빌, 이란)의 연구에 대 한 부 장관에 게 감사 (No를 부여: 9607).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

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References

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