Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Bioengineering

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Summary

Vi presentiamo un protocollo per studiare i biomarcatori di espressione di mRNA di cellule derivanti dal periostio (PDC) indotte da vitamina C (vitamina C) e 1,25-diidrossi-vitamina D [1,252D-3]. Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC.

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Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

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Abstract

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono presenti in una varietà di tessuti e possono essere differenziate in numerosi tipi cellulari, tra cui osteoblasti. Tra le fonti dentale di MSCs, il periostio è un tessuto facilmente accessibile, che è stato identificato per contenere MSCs nello strato cambiale. Tuttavia, questa fonte non è stato ancora ampiamente studiata.

Vitamina D3 e 1,252D-3 hanno dimostrati di stimolare la differenziazione in vitro di cellule staminali mesenchimali in osteoblasti. Inoltre, vitamina C facilita la crescita di collagene dell'osso e la formazione delle cellule. Tuttavia, nessuno studio ha ancora studiato gli effetti della vitamina D3 e la vitamina C su MSCs.

Qui, presentiamo un metodo per isolare MSCs dal periostio alveolare umano ed esaminare l'ipotesi che 1,25-2D3 può esercitare un effetto osteoinduttivo su queste cellule. Abbiamo anche indagare la presenza di cellule staminali mesenchimali nel periostio alveolare umano e valutare la proliferazione e l'adesione delle cellule staminali. Per valutare la capacità della vitamina C (come controllo) e le varie concentrazioni di 1,252D-3 (1010, 109, 108e 107 M) di alterare biomarcatori chiave di mRNA in l'espressione del mRNA di MSCs isolato della fosfatasi alcalina (ALP), osso sialoproteina (BSP), associazione nucleo fattore alfa-1 (CBFA1), collagene-1 e osteocalcina (OCN) sono misurati usando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR).

Introduction

Anche se negli ultimi anni sono state sviluppate numerose tecniche pertinenti, osso resti ricostruzione limitata da vincoli multipli e stimare che l'entità della ricostruzione necessaria è spesso impossibile. L'incremento dei tessuti duri è necessaria per raggiungere obiettivi sia estetici che funzionali, oltre a un tasso di successo a lungo termine favorevole. Metodi comunemente usati per tali procedure includono l'innesto dell'osso autologo e allogenico trapianto xenogenico e l'innesto dell'osso di alloplastic. Tra i vari tipi di innesto osseo, innesti di osso autologo sono considerati il più efficace. Tuttavia, la morbilità del sito donatore, vascolarizzazione compromessa e tessuto limitata disponibilità1 sono stati gravi inconvenienti per l'innesto di osso autologo. Inoltre, gli innesti dell'osso allogenico e gli xenotrapianti sono stati associati con la trasmissione della malattia. Attualmente, gli innesti di osso sintetico sono ampiamente utilizzati per risolvere questi problemi. Tuttavia, con la loro mancanza di potenziale osteogenico, i risultati clinici hanno variato ampiamente. Materiali quali cellulosa sono associati con fluttuazione di volume, infezione e una mancanza di forza.

Aumento osseo mediante ingegneria tissutale ha suscitato notevole interesse. In questa tecnica, cellule staminali mesenchimali (MSCs) vengono inizialmente utilizzate per promuovere la differenziazione degli osteoblasti, che sono poi trapiantati al sito di perdita dell'osso per ottenere riparazione ossea. Questa procedura è attualmente applicata nella terapia cellulare. Raggiungimento di ricostruzione ossea tramite l'estrazione di una quantità limitata di tessuto è più semplice e meno invasivo rispetto ad altri metodi.

Il ruolo potenziale di cellule staminali mesenchimali come uno strumento per le terapie basate sulle cellule mirate alla rigenerazione dentale è un crescente interesse tra i vari gruppi di ricerca. Gli studi hanno confermato che MSCs possono essere differenziati dai seguenti tipi di tessuto: midollo osseo, membrana sinoviale, adiposa, Pericita, trabecular dell'osso, del cordone ombelicale umano e tessuti dentali2,3. Fonti comuni di MSCs includono del midollo osseo, tessuto adiposo e tessuti dentali. Rispetto con MSCs derivate dal tessuto adiposo e midollo osseo, i vantaggi delle cellule staminali dentali sono di facile accessibilità e meno morbosità dopo la raccolta. Confrontato con le cellule staminali embrionali, MSCs derivate da tessuto dentale appaiono nonimmunogenic e non sono associati a preoccupazioni di ordine etico complesso3.

Nel 2006, l'International Society for Cellular Therapy consigliato utilizzando i seguenti standard per identificare MSCs: in primo luogo, è necessario che i MSCs sia in grado di associare alla plastica. In secondo luogo, è necessario che MSCs sia positiva per gli antigeni di superficie CD105, CD73 e CD90 e negativo per i marcatori per i monociti, macrofagi e cellule di B oltre alla ematopoietici antigeni CD45 e CD344. Come criterio finale, MSCs deve essere in grado di differenziarsi nei seguenti tre tipi di cellule in condizioni standard di differenziazione in vitro : osteoblasti, adipociti e condrociti4. Fin qui, sei tipi di cellule staminali dentali umane sono stati isolati e caratterizzati. Il primo tipo è stato isolato dal tessuto umano della polpa e definito di cellule staminali della polpa dentale postnatale5. Successivamente, ulteriori tre tipi di MSCs dentale sono stati isolati e caratterizzati: cellule staminali da denti decidui esfoliate6, il legamento parodontale7e la papilla apicale8. Più recentemente, derivato dal follicolo dentale9, gengivale tessuto-derivato10, germe dentale staminali cells(DBSCs)11e ciste periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 inoltre sono stati identificati.

Friedenstein fu il primo a definire MSCs13. MSCs esibiscono un'alta potenziale di proliferazione e può essere manipolato per differenziare prima di essere trapiantate, il che suggerisce che sono candidati ideali per procedure rigenerative10.

Anche se la maggior parte degli studi hanno utilizzato midollo osseo come fonte di cellule staminali, cellule derivanti dal periostio (PDC) sono stati anche recentemente utilizzata la dimensione14. Il periostio è più facilmente accessibile del è il midollo osseo. Pertanto, in questa tecnica, utilizziamo periostio alveolare per eliminare la necessità di ulteriori incisioni durante l'intervento chirurgico e per ridurre la morbosità postsurgical in pazienti. Il periostio è il tessuto connettivo che forma il rivestimento esterno delle ossa lunghe e comprende due strati distinti: lo strato fibroso esterno composto da fibroblasti, collagene e fibre elastiche15e lo strato interno cellula-ricco cambiale a diretto contatto con la superficie dell'osso. Lo strato cambiale contiene una popolazione di cellule miste, soprattutto fibroblasti16, osteoblasti17, periciti18e una sottopopolazione critica identificati come MSCs19,20,21. Maggior parte degli studi hanno segnalato che PDC sono paragonabili, se non superiore, a cellule staminali derivate da midollo osseo (BMSC) in osso guarigione e rigenerazione22,23,24. Il periostio è facilmente accessibile ed esibisce eccellente efficacia rigenerativa. Tuttavia, pochi studi hanno messo a fuoco il periostio25,26,27.

Per quanto riguarda la riparazione ossea, l'attuale pratica clinica coinvolge il trapianto di cellule progenitrici periosteal amplificato all'interno di impalcature di sostegno. Recenti studi hanno messo a fuoco su acquisizione di cellule staminali nelle regioni difettose e che impiegano cellule progenitrici per tessuto rigenerazione20. Dentisti anche anticipano la futura applicazione di rigenerazione ossea parodontale in trattamenti parodontali e impianti dentali. Per quanto riguarda il sito donatore, il periostio può essere facilmente raccolto dai chirurghi dentali generali. Ciò paragona favorevole contro le cellule stromali del midollo, come il periostio può accedervi durante intervento chirurgico orale di routine. Così, l'obiettivo di questo studio è di stabilire un protocollo per la raccolta del PDC e di valutare la morfologia, attaccamento, vitalità e proliferazione di cellule staminali umane periostio.

I metaboliti della vitamina D influenzano l'equilibrio dinamico in vivo minerale ossea. Uno studio ha riferito che il 24R,25-(OH)2D3 forma attiva della vitamina D è essenziale per la differenziazione osteoblastica di umano MSCs (hMSCs)28. Omeostasi dell'osso e riparazione sono regolati da una rete di metaboliti di vitamina D3 , di cui 1,252D3 (calcitriol) è il più biologicamente attivo e rilevante nella regolazione della salute dell'osso. Vitamina D3 è essenziale per la calcificazione29. In uno studio facendo uso dei topi di Kunming bianco 2-d-vecchi, i corpi embryoid nei topi hanno indicato che i supplementi di vitamina D e vitamina C efficacemente promossa la differenziazione degli osteoblasti derivati ESC30. Tra le sue altre attività biologiche, 1,25-2D3 stimola la differenziazione in vitro di hMSCs di osteoblasti, che possono essere monitorati basati sull'aumento nell'attività dell'enzima fosfatasi alcalina (ALP) o OCN gene espressione.

Pochi studi hanno rilevato una relazione dose-risposta di trattamenti combinati con vitamina C e 1,252D3 nell'umano PDC con un focus particolare sull'ingegneria del tessuto osseo. Pertanto, in questo studio, esaminiamo le concentrazioni ottimale per il trattamento singolo o combinato di 1,252D-3 e vitamina C per l'induzione del differenziamento osteogenico di PDC umano. L'obiettivo del presente protocollo è quello di determinare se una popolazione di cellule isolata dal periostio alveolare dentale contiene cellule con un fenotipo MSC e se queste cellule possono essere espanse in coltura (in vitro) e differenziate per formare il tessuto desiderato . Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC. La seconda parte dello studio valuta gli effetti di vitamina C e 1010, 109, 108e 107 M 1,25-2D3 sull'attività osteogenica del PDC. L'obiettivo primario di questo studio è di valutare le funzioni di vitamina C e2D 1,25-3 durante la differenziazione osteoblastica di PDC da attività ALP e geni pro-osteogenico, come ALP, collagene-1, OCN, BSP e CBFA1. Inoltre, questo studio determina le condizioni ottimali osteoinduttivo per PDC umano sulla base di questi risultati.

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Protocol

Il protocollo di studio è stato approvato dal Consiglio di revisione istituzionale di Chang Gung Memorial Hospital. Tutti i partecipanti fornito il consenso informato scritto.

1. tessuto preparazione

  1. Raccogliere i tessuti periosteal dai pazienti durante la chirurgia dentale (Figura 1). Dopo la riflessione di falda in anestesia locale, prendere un pezzo di tessuto del periostio dall'osso alveolare utilizzando un separatore periosteal31.
  2. Dopo la raccolta, è possibile memorizzare le fette di tessuti periosteal di circa 5 x 2 mm in una soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) con 300 U/mL di penicillina e 300 mg/mL di streptomicina. Trasferire i tessuti al laboratorio entro 24 h.
  3. Tritare i frammenti di tessuto periostale alveolare con bisturi fino a ben tritata e mantenere i campioni in mezzo passaggio 0 (composto di 300 U/mL di penicillina e 300 mg/mL di streptomicina, α-MEM e 5% di siero fetale bovino [FB]) coltivate in un incubatore a 37 ° C con aria umidificata (5% anidride carbonica). Nell'incubatrice, preparare una bacinella di acqua per mantenere l'umidità.
  4. Modificare il mezzo dopo 3 giorni e due volte alla settimana da allora in poi.
  5. Quando le cellule hanno raggiunto subconfluence (80%), rilasciare le cellule aderenti con 200 µ l di 0,25% tripsina nell'incubatrice (37 ° C) per 3 minuti e quindi utilizzare 4,5 mL di medium per terminare la reazione.
  6. Piastra le cellule ancora in fresco passaggio 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Piastra è 5 × 103 celle (a partire da un emocitometro).
  7. Eseguire ogni passaggio successivo dopo che le cellule di raggiungere 80% confluenza31.
    Nota: All'inizio, il mezzo sarà rosso arancio. Dopo circa tre giorni, il colore medio deve cambiare ad una tonalità giallastra. Il tempo di raddoppiamento delle cellule è di circa 30 – 40 h, che necessitano di 7 giorni per 3 – 5 generazioni.
  8. Cultura il PDC isolato in α-MEM supplementato con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina in un'incubatrice (37 ° C, 5% CO2).
  9. Osservare la crescita delle cellule di tutti i giorni e sostituire il mezzo di crescita due volte a settimana. Utilizzare per quinto-celle di terza generazione per tutte le ulteriori esperimenti.

2. flusso Cytometry

  1. Raccogli 1 × 106 cellule tramite digestione della tripsina:
    1. Aggiungere 200 µ l di 0,25% tripsina. Dopo 3 min, utilizzare 4,5 mL di mezzo di coltura contenente FBS per terminare la reazione di tripsina e raccogliere attraverso centrifugazione (1500 giri/min, 5 min, 22 ° C).
    2. Lavare il pellet cellulare tre volte con 1 x DPBS. Risospendere le cellule in 200 µ l 1x buffer di permeabilizzazione. Contare le celle con un emocitometro.
  2. Esaminare gli indicatori di superficie espressi espressi di PDC tramite flusso cytometry (ordinamento di fluorescenza-attivato delle cellule)32. Utilizzare anticorpi monoclonali (MAb) contro CD19 (isotiocianato di fluorescina (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) e HLA-DR (FITC)32.
    1. Aggiungere gli anticorpi per i campioni e la cultura al buio a 4 ° C per 30 min.
    2. Lavare le cellule con 1 x DPBS tre volte.
    3. Fissare le celle utilizzando 2% di formaldeide e procedere con analisi di flusso cytometry32.

3. allegato e vitalità con osteogenica, adipogenico e differenziazione Chondrogenic delle cellule

Indurre la differenziazione nelle cellule in osteogenica, adipogenico e lignaggi condrogenica coltivando le cellule periosteal in tutti i tre passaggi su sei pozzetti con media di differenziazione specifica.

  1. Per la differenziazione osteogenica, coltura le cellule in α-MEM ad una densità di 5000 cellule per pozzetto su piastre di coltura di sei-pozzo.
    1. Al raggiungimento di 80% confluenza, coltura le cellule nei media contenente α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10− 7 M desametasone (0,1 mM) e 5 mL di acido ascorbico (100 uM). Cultura del controllo negativo in media composto da α-MEM e 5% FBS.
    2. Modificare i media due volte a settimana.
    3. Dopo 4 settimane, valutare il potenziale delle cellule di differenziarsi in una linea osteogenica macchiando le cellule usando un'analisi di von Kossa, che contraddistingue la presenza di depositi calcificati in una cultura33.
      1. Aggiungere formalina al 10% per il fissaggio. Entro 30 minuti, aggiungere il 5% di nitrato di argento e trattare sotto luce ultravioletta (UV) per 1 h a temperatura ambiente.
      2. Aggiungere 5% Na2così4 quattro volte, permettendo 3 min per ogni reazione. Infine, lavare le cellule due volte con acqua distillata.
        Nota: Von Kossa macchiatura è una reazione di precipitazione dove gli ioni d'argento e fosfato reagiscono in presenza di materiale siliceo; Questa tecnica di colorazione non è specifica per il calcio. In questo studio, quando le cellule studiate sono state trattate con soluzione di nitrato d'argento, calcio — che è ridotto da luce UV forte — è stato sostituito da argento, che è diventato visibile come argento metallizzato.
  2. Per differenziazione adipogenico, coltura le cellule ad una densità di 5000 cellule per pozzetto su piastre di coltura sei pozzetti contenenti α-MEM.
    1. Al raggiungimento di 80% confluenza, coltura le cellule nei media contenente α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1%, penicillina, 10− 6 M desametasone (1 mM), insulina (5 mg/mL) e l'indometacina (60 mM).
    2. Cultura del controllo negativo in media composto da α-MEM e 5% FBS.
    3. Dopo 6 – 9 settimane, utilizzare olio rosso O per macchiare le cellule ed evidenziare gocce lipidiche, determinando la presenza di adipogenico differenziazione33:
      1. Aggiungere formalina al 10% per il fissaggio. Entro 30 min, macchia le cellule con 0,5% olio rosso O a temperatura ambiente per 10 minuti e poi lavare le cellule tre volte con 60% isopropanolo per 3 minuti ogni volta; Infine, lavare le cellule con acqua distillata.
        Nota: Olio rosso O è un lysochrome (liposolubili) diazo colorante utilizzato per la colorazione dei lipidi neutri, principalmente esteri di triacilglicerolo, lipoproteine e colesterolo. Il colorante si dissolve nelle goccioline del lipido nella cella, colore rosso di rotazione le goccioline del lipido.
  3. Per la differenziazione dei condrociti, cellule di coltura su piastre di coltura sei pozzetti con ciascuna contenente ben 5000 cellule.
    1. Aggiungere una media di differenziazione contenente α-MEM, 5% FBS, 10− 7 M desametasone (0,1 mM), piruvato di sodio (100 µ g/mL), insulina-transferrina-selenio-A (1 × ITS), fattore di crescita trasformante-β (10 ng/mL) e 5 mL di acido ascorbico (100 µM).
    2. Cultura del controllo negativo in media composto da α-MEM e 5% FBS.
    3. Dopo 4-5 settimane, utilizzare Alcian blu colorazione per evidenziare i polisaccaridi acidi, come glicosaminoglicani o alcuni tipi di mucopolisaccaridi, nella cartilagine delle celle per determinare la presenza di condrociti differenziazione33.
      1. Aggiungere formalina al 10% per il fissaggio. Entro 30 min, aggiungere acido acetico al 3% e 2 minuti per la reazione. Successivamente, lavare con acqua distillata tre volte, aggiungere 1% Alcian blu 8GX incubate per 30 min e poi lavare con acqua distillata. Infine, aggiungere acido acetico al 3% e lavare per 3 minuti e poi lavare con acqua distillata per finire.
        Nota: Le parti della cella che macchia specificamente di questo colorante diventano blu a blu-verde dopo la macchiatura e sono chiamate "alcianophilic."

4. effetti di 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-2D3) sull'osteogenesi

  1. Dividere il P3 a P5 PDC in sei gruppi e cultura su piastre da 6 pozzetti con vari terreni di coltura:
  2. gruppo negativo (α-MEM e 5% FBS);
  3. Gruppo vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM e 10− 7 M desametasone + 100 uM vitamina C);
  4. e 10− 7 M 1,252D3 gruppo (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM e 10− 7 M desametasone + 10− 7 M 1,252D-3).
  5. Aggiungere 2 mL di terreno a un incubatore (37 ° C) in ciascun pozzetto e modificare il mezzo due volte ogni settimana.

5. invertire la trascrizione/quantitativa reazione a catena della polimerasi in tempo reale

  1. Dopo 7 d di differenziazione degli osteoblasti, isolare il RNA totale sul ghiaccio utilizzando un reagente commerciale (Vedi Tabella materiali):
    1. Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento in ciascun pozzetto. Aggiungere 200 µ l di bromochloropropane e lasciare per 10 min generare RNA a strati e poi Centrifugare a 10.000 rpm per 15 min a 4 ° C.
    2. Dopo la centrifugazione, aggiungere 500 µ l di 2-propanolo a 500 µ l del supernatante contenente RNA. Precipiti il RNA sul ghiaccio e consentire 15 min per la reazione.
    3. Dopo la procedura, centrifugare a 12.000 rpm per 15 min a 4 ° C, dopo di che il RNA si trova nella parte inferiore del tubo. Successivamente, rimuovere il surnatante con 1 mL di alcool di 75% per lavaggio e centrifugare a 7.500 giri/min per 8 min a 4 ° C.
    4. Rimuovere il supernatante e utilizzare un concentratore a vuoto per produrre RNA dal fondo del liquido. Recuperare con acqua.
  2. Retromarcia trascrivere il RNA (1 μg) usando il transcriptase myeloblastosis aviaria virus. Impostare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per l'esecuzione a 25 ° C per 10 min seguita da 50 ° C per 60 minuti e poi 85 ° C per 5 min, prima infine di mantenere a 4 ° C.
  3. Sintetizzare il primo filo DNA complementare (cDNA). Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) utilizzando 5 μL di 01:10 diluito del cDNA. Condotta di RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) utilizzando primers per ALP, BSP, OCN, CBFA1 e collagene-1.
    Nota: Per evitare la contaminazione del DNA dai segnali, le sequenze di andata e d'inversione di ogni primer sono state progettate su distinti esoni.
  4. Eseguire qPCR utilizzando un commerciale PCR Master Mix (Vedi Tabella materiali) in conformità con le istruzioni del produttore. Impostare il termociclatore a 50 ° C per 2 min seguita da 95 ° C per 10 min e poi 40 cicli ciascuno a 95 ° C per 15 s seguita da 60 ° C per 60 s.
    Nota: Il protocollo SYBR richiede inoltre una fase di curva di fusione, che viene eseguita a 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 60 s e poi 95 ° C per 15 s.
  5. Normalizzare i valori di soglia del ciclo per ALP, BSP, CBFA1, collagene-1 e OCN a quella del gene housekeeping GAPDH. 34
  6. Coppie di primer sono elencate nella Tabella materiali.

6. attività della fosfatasi alcalina

  1. Valutare l'attività enzimatica ALP di celle utilizzando la tecnica precedentemente descritta35, che converte p- nitrofenil fosfato di p- nitrofenolo; p- nitrofenil fosfato è un substrato fosfatasi che diventa giallo quando defosforilata di ALP, come determinato alla lunghezza d'onda di 405 nm. Normalizzare il totale p- nitrofenolo formato basato sulla proteina totale come determinata mediante l'analisi di Bradford.
  2. Confrontare le attività ALP del controllo (α-MEM, 5% FBS), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM, 10− 7 M desametasone + 100 uM vitamina C), 1,25-2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM e 10− 7 M desametasone + 10− 8 M 1,252D-3) e vitamina C + 1,252D-3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM, 10− 7 M desametasone + 100 uM vitamina C +1,25-(OH)2D3) gruppi dopo 1, 2, 3 e 4 settimana della cultura.
  3. Eseguire una procedura di estrazione di proteine su ghiaccio:
    1. Raschiare le cellule dalle piastre 6 pozzetti e aggiungere 50 µ l di tampone di lisi. Successivamente, inserire le celle sul ghiaccio per 30 min distruggere le cellule e liberare la proteina.
    2. Dopo 30 min, centrifugare a 13000 rpm a 4 ° C per 15 min. Dopo la centrifugazione, estrarre il surnatante per deposito e utilizzare.

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Representative Results

Per tutte le analisi quantitative, i dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando dello studente t-test. In totale, 34 campioni sono stati ottenuti con un'età media di partecipanti di 48,1 ± y. 12,3 undici di questi campioni sono stati ottenuti da pazienti di sesso maschile e 23 da pazienti di sesso femminile. Ventotto campioni sono stati ottenuti dalle regioni molari e sei da regioni anteriori; 26 sono stati ottenuti dalla mascella superiore e 8 dalla mandibola. La durata media tra la procedura dentale e la cultura era 0,5 ± 0,1 h. Dei 34 campioni esaminati, 20 con successo ha reso colonie MSC, con un tasso di successo di isolamento del 58,8%. Sono state osservate differenze significative in c'è ne dei parametri tra il con successo e senza successo isolato PDC (età media: 48,8 ± 13,0 vs. 47,1 ± 11,5 y, sesso: 7 uomini [35%] vs 4 uomini [28,6%], posizione: 15 da regioni molari [75%] vs 13 [92,9%] e 15 da la mascella superiore [75%] vs 11 [78,6%], rispettivamente).

Isolamento e morfologia delle cellule: osteogenica, condrogenica e adipogenico differenziazione

Da giorni 1-9, PDC formano colonie e cluster sferici. La maggior parte delle cellule hanno esibito un'apparenza di mandrino ed erano omogenei sotto un microscopio a contrasto di fase (Figura 2). Dopo 14 quinquies della cultura, la morfologia cellulare è apparso fusiformi come osservato al microscopio a contrasto di fase. Seguendo le celle di prima generazione, le cellule non più è cresciuto in grappoli ma hanno esibito la proliferazione diffusa ed uniforme.

MSCs era fusiformi con processi irregolari e saldamente fissato alla piastra di coltura dopo 1-3 d di colture primarie (Figura 2a). La coltura ha esibito piccolo, rotondo cellule e cellule fusiformi sotto un microscopio ottico. Le cellule coltivate hanno esibito una forma omogenea, fibroblasto-come mandrino dal primo passaggio (Figura 2a). Lo studio di differenziazione ha rivelato che il PDC potrebbe essere subpassaged e differenziate in vitro in osteoblasti (Figura 2b), condrociti (Figura 2C) e adipociti (figura 2d).

Alla fine della differenziazione osteogenica, von Kossa macchiatura ha indicato la presenza di depositi di calcio e la differenziazione osteogenica (Figura 2b). Questi risultati hanno indicato fortemente che tra le popolazioni delle cellule periosteal, cellule progenitrici possiedono la capacità di differenziarsi in cellule osteogeniche.

Per valutare la produzione di proteoglicani, macchia blu di Alcian era utilizzato come indicatore per determinare la presenza di differenziazione dei condrociti (Figura 2C). Le cellule differenziano con successo in condrociti. Questi risultati hanno indicato che, tra le popolazioni delle cellule periosteal, cellule progenitrici possiedono la capacità di differenziarsi in cellule chondrogenic.

Le cellule sono state coltivate nei mezzi specifici menzionati in precedenza per attivare adipogenico differenziazione. Dopo 8 settimane, olio rosso che o sia usato per rilevare l'esistenza di lipidi intracellulari. La macchiatura seguente, grasso intracellulare di microscopica gocce sono state osservate in cinque campioni differenziati (figura 2d).

Analisi di espressione di superficie dell'indicatore di cytometric di flusso per PDC

Un test citofluorimetrico è stata condotta per confermare l'espressione di superficie dell'indicatore sulla superficie delle cellule mesenchimali. Gli indicatori MSC CD73, CD90, STRO-1 e CD44 erano fortemente positivi in PDC, considerando che gli indicatori di lineage ematopoietico CD19, CD34, CD45 e HLA-DR erano negativi.

Effetti di vari vitamina D 3 concentrazioni su osteogenesi

Anche se i risultati hanno confermato gli effetti positivi di 1,25-2D3 (calcitriol) sull'attività osteogenica, sono state osservate differenze statisticamente significative solo tra alcuni dei cambiamenti nelle espressioni di mRNA dell'osteogenica piega enzimi. Questa analisi potrebbe avere stata prevenuta da elevati valori di SD, che possono essere attribuiti per le deviazioni individuali tra i padroni di casa.

Espressione di RNA messaggero della fosfatasi alcalina

Le modifiche di piega nell'espressione del mRNA di ALP dopo 1 settimana della cultura era 7,43 (SD = 3,96) nel gruppo della vitamina C e 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5,63), 12.92 (SD = 7.95) e 6.60 (SD = 6,33) nei 1010, 109, 108 e 107 M 1,252D3 gruppi, rispettivamente (Figura 4a). I livelli di espressione di mRNA di ALP a 109 M 1,252D3 gruppi, 108 M 1,25-2D3e la vitamina C erano significativamente più alti (p < 0,05) rispetto a quelli negli altri gruppi, che indica l'espressione aumentata di ALP mRNA in questi gruppi. Il controllo è stato impostato il valore 1. I seguenti aumenti di piega nelle espressioni di ALP mRNA sono stati osservati in questo studio: 7.43-fold nel gruppo della vitamina C; 9.30-fold nel gruppo 109 M 1,252D3 ; e 12.92-fold nel gruppo 108 M 1,252D3 .

Anche se un cambiamento di piega maggiore nelle espressioni di ALP mRNA è stato osservato nel gruppo 108 M 1,252D3 , sono state osservate differenze statisticamente significative per quanto riguarda questi livelli di espressione tra questo gruppo e la negativo e gruppi della vitamina C (p = 0,20 e p = 0,52, rispettivamente).

ALP è un forte indicatore per determinare il precoce differenziamento osteogenico delle cellule. ALP serve anche come un ectoenzima per la degradazione del pirofosfato inorganico e rilascia fosfato durante la mineralizzazione36. Il PDC trattati con vitamina C e 108 e 109 M 1,252D-3 hanno esibito le differenze significative se confrontati con quelli degli altri gruppi (Figura 4a).

Espressione di RNA messaggero del sialoprotein dell'osso

I cambiamenti di piega nelle espressioni di mRNA di BSP dopo 1 settimana di cultura erano 3.21 (SD = 1.20) e 4.18 (SD = 2,55), 10.34 (SD = 10,31), 24.91 (SD = 23,44) e 5.24 (SD = 3,54) la vitamina C e i 1010, 109, 108 e 107 M 1,252D3 gruppi, rispettivamente (Figura 4b). Le espressioni di BSP mRNA erano più alte nel gruppo 108 M 1,252D3 , ma con nessuna significatività statistica rispetto con le espressioni corrispondenti negli altri gruppi.

Le espressioni di BSP mRNA in vitamina C e 1010 M 1,252D3 gruppi erano significativamente più alti (p < 0,05) rispetto a quelli degli altri gruppi, che indica che la vitamina C e 1010 M 1,25 2 D3 promosso espressione BSP. Il controllo è stato impostato su un valore pari a 1. La vitamina C e i 1010 M 1,252D3 gruppi hanno esibito un aumento a 3,21 e 4.18 volte nelle espressioni di mRNA BSP, rispettivamente. Il 109 M e 108 M 1,252D3 gruppi esposti espressioni di mRNA BSP superiore rispetto agli altri gruppi. Il 109 e 108 M 1,252D3 gruppi hanno esibito un aumento a 10,34 e 24.91 volte nelle espressioni di mRNA BSP, rispettivamente, ma questo aumento non era statisticamente significativa (p > 0,05). Una possibile spiegazione è che le cellule staminali non erano tutti ottenuti dal partecipante stesso. Così, le differenze di potenziale potrebbero aumentare la SD e di conseguenza ha interessato i risultati statistici.

Espressione di RNA messaggero di CBFA1

I cambiamenti di piega nelle espressioni CBFA1 mRNA dopo 1 settimana di cultura erano 0.96 (SD = 0.10) e 0.90 (SD = 0,26), 1.01 (SD = 0.25), 1,31 (SD = 0.32) e 1.12 (SD = 0,35) in vitamina C e i 1010, 109, 108 e 107 M 1,252D3 gruppi, rispettivamente (Figura 4c). 108 M 1,252D3 gruppo esposto superiore espressioni CBFA1 mRNA. Nessun profondi cambiamenti sono stati osservati nelle espressioni gene CBFA1 mRNA nei gruppi di trattamento o nel gruppo di controllo. Inoltre, è stato osservato alcun incremento significativo nell'espressione dei marcatori mRNA dopo l'aggiunta di vitamina C o 1,252D3. Inoltre, sono state osservate differenze intergruppo significative.

Espressione di RNA messaggero del collagene-1

Le variazioni piega l'espressione del mRNA di collagene-1 dopo 1 settimana della cultura sono 0,98 (SD = 0,17) e 0.85 (SD = 0.16), 1.05 (SD = 0.16), 1.52 (SD = 0,36) e 1.01 (SD = 0,33) la vitamina C e i 1010, 109, 108 e 107 M 1,252D3 gruppi, rispettivamente (Figura 4D). Le espressioni di collagene-1 mRNA erano più alti nel gruppo 108 M 1,252D3 ma senza differenze statisticamente significative rispetto con le espressioni corrispondenti negli altri gruppi.

I 108 M 1,252D3 e controllo gruppi hanno esibito le differenze statisticamente significative nei loro risultati (p < 0,05). Il controllo è stato impostato su un valore pari a 1. È stato osservato un 1.52-fold aumento le espressioni di collagene-1 mRNA. Il 1010 M 1,252D3 e i 108 M 1,252D3 gruppi esposti differenze significative nei loro risultati (p < 0,05).

Espressione di RNA messaggero di osteocalcina

I cambiamenti di piega nelle espressioni OCN mRNA dopo 1 settimana di cultura erano 0,60 (SD = 0.1) e 0,78 (SD = 0.18), 1.13 (SD = 0.55), 2,59 (SD = 1.59) e 1,61 (SD = 0,73) in vitamina C e i 1010, 109, 108 e 107 M 1,252D3 gruppi, rispettivamente (Figura 4e). Le espressioni di OCN mRNA erano più alti nel gruppo 108 M 1,252D3 ma senza differenze statisticamente significative rispetto con le espressioni corrispondenti negli altri gruppi.

Nessun aumento significativo è stato osservato nelle espressioni dei marcatori OCN mRNA dopo l'aggiunta di vitamina C o 1,252D3. Tuttavia, le espressioni di OCN mRNA è diminuito dopo il trattamento di vitamina C. Il controllo è stato impostato il valore 1. Le espressioni di OCN basale hanno esibito una diminuzione significativa di 0.6-fold (p < 0,05) durante il differenziamento osteoblastico. il mRNA OCN espressioni erano significativamente più alti (p < 0,001) nelle cellule coltivate in 108 M 1,25-2D3 rispetto nelle espressioni corrispondenti degli altri gruppi, che hanno esibito una piega media aumentare di 2.59. Tuttavia, questi risultati non erano statisticamente significativi (p > 0.05). Una possibile spiegazione è che le cellule staminali non erano tutti ottenuti dal partecipante stesso; così, le differenze di potenziale potrebbero aumentare la SD e di conseguenza ha interessato i risultati statistici.

Analisi di attività ALP

Uno studio precedente ha dimostrato che 1,252D-3 è più efficace ad una concentrazione di 108 M; di conseguenza, 108 M è stato utilizzato nel gruppo di test per confrontare la capacità osteogenica di 1,252D-3 con quello del negativo, vitamina C e vitamina C + 1,252D3 gruppi. La capacità osteogenica è stato espresso dall'attività ALP. Dopo 1 settimana della cultura (Figura 5a), le modifiche di piega in attività ALP erano 1,00 (SD = 0.00), 1.92 (SD = 0,89), 3.77 (SD = 1.66) e 1.46 (SD = 0.49) in negativo, C, D e C + D, rispettivamente. Tra tutti i gruppi, le differenze statisticamente significative sono state osservate solo tra i gruppi D e negativo (p = 0,03; Figura 5a). Dopo 2 settimane di cultura, il piega i cambiamenti nell'attività ALP (Figura 5b) erano 1,00 (SD = 0.00), 2.32 (SD = 1.68), 4.98 (SD = 3.02) e 4,86 (SD = 2,73) in negativo, C, D e C + D, rispettivamente. Sono state osservate differenze statisticamente significative in c'è ne dei gruppi. Dopo 3 settimane della cultura, il piega i cambiamenti nell'attività ALP (Figura 5C) erano 1,00 (SD = 0.00), 2.93 (SD = 2.15), 5,76 (SD = 3.60) e 5.61 (SD = 3,88) in negativo, C, D e C + D, rispettivamente. Ancora una volta, sono state osservate differenze statisticamente significative in c'è ne dei gruppi (Figura 5C). Dopo 4 settimane di cultura, il piega i cambiamenti nell'attività ALP (Figura 5d) erano 1,00 (SD = 0.00), 2,83 (SD = 1,97), 3,79 (SD = 0,77) e 4.24 (SD = 2,87) in negativo, C, D e C + D, rispettivamente. Qui, i gruppi D e negativo ha esibito le differenze statisticamente significative (p = 0,00; Figura 5 d).

In 1 settimana, solo il 108 M 1,252D3 gruppo esposto differenze significative rispetto al gruppo controllo (p = 0,03). In settimana 2, 108 M 1,252D-3 e vitamina C gruppi esposti differenze significative rispetto al gruppo controllo (p = 0.0498). Nella settimana 3, nessuno dei gruppi hanno esibito le differenze significative rispetto al gruppo di controllo. Nella settimana 4, il 108 M 1,252D3 gruppo esposto differenze significative rispetto al gruppo di controllo. Ciò ha indicato che 108 M 1,252D3 promosso attività ALP.

In breve, 108 M 1,252D3 gruppo hanno esibito aumentato ALP e l'espressione del mRNA di collagene-1; il gruppo di vitamina C ha esibito significativamente migliorata ALP e l'espressione del mRNA BSP; e il gruppo di 109 M 1,252D3 hanno esibito significativamente aumentata espressione di mRNA ALP. In 1 settimana, attività ALP aumentata è stata osservata nei2D3 gruppi della vitamina C e 1,25 ma senza differenze statisticamente significative rispetto ai corrispondenti livelli di espressione negli altri gruppi. Da 2 settimane a 4, 1,252D3 gruppi e vitamina C hanno esibito i risultati simili. Di conseguenza, questi risultati non potevano chiaramente delucidare gli effetti sinergici di vitamina C e2D 1,25-3 sul differenziamento osteogenico delle cellule (attività ALP).

Figure 1
Figura 1: periostio alveolare umano. Scollatore tessuti sono state raccolte durante la chirurgia dentale. L'asterisco indica la posizione del periostio alveolare.

Figure 2
Figura 2: Studio differenziazione. MSCs erano fusiformi con processi irregolari e saldamente fissato alla piastra di coltura dopo 1-3 d della coltura primaria (A; l'asterisco indica la posizione delle cellule staminali mesenchimali). In condizioni di coltura in vitro , MSCs sono stati subpassaged e differenziano in osteoblasti (B, l'asterisco nero indica la zona macchiata di von Kossa), condrociti (C, l'asterisco blu indica l'area macchiata da Alcian blu) e adipociti (D, l'asterisco rosa indica la zona macchiata di rosso O di olio). Nella figura 2 viene riutilizzato da Biomedical Research International, Volume 2016, 3529561 ID articolo25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: flusso cytometry. Gli indicatori di superficie espressi dal servizio MSCs erano CD73 (65,2%), CD90 (75,6%), STRO-1 (65,2%) e CD44 (88,1%) ma non CD45 (1,34%), CD34 (1,61%), CD19 (2,18%), o HLA-DR (2,20%). "%" nella figura denota un rapporto positivo. Il gruppo di controllo (α-MEM e 5% FBS) è rappresentato dalla linea rossa. Il gruppo sperimentale è rappresentato dalla linea blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: espressioni mRNA. espressioni del mRNA di differenziazione degli osteoblasti per 1 settimana. BSP ALP (B) (A), (C) CBFA1, (D) COL-ho e (E) OCN. p < 0,05 è *, p < 0.01 è * *, p < 0,001 è * * *. Il cambiamento di piega di mRNA è contro controllo (α-MEM e 5% FBS). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: attività della fosfatasi alcalina. Attività della fosfatasi alcalina del test di differenziazione degli osteoblasti per (A) settimana 1, (B) settimana 2, (C) settimana 3 e (D) settimana 4. p < 0,05 è *, p < 0.01 è * *, p < 0,001 è * * *. Il cambiamento di piega è contro controllo (α-MEM, 5% FBS). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Una modalità terapeutica sviluppata di recente, vale a dire che comportano MSCs, di ingegneria tissutale ha numerosi vantaggi. MSC, che sono presenti in diversi tipi di tessuto, sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in una varietà di tessuti mesodermal funzionale cellule37 e altre cellule quali osteoblasti.

Il periostio serve come una nicchia per cellule progenitrici e come un rifornimento ricco sistema vascolare per l'osso che avvolge38. Nel nostro studio, di 34 campioni esaminati, 20 ha prodotto con successo colonie MSC, con un tasso di successo di isolamento del 58,8%. MSCs derivate dal periostio sono stati selezionati in questo studio basato sulla loro proliferazione e differenziamento osteogenico abilità. Il tasso di proliferazione delle cellule periosteal era molto superiore a quello delle cellule stromali del midollo22. Per quanto riguarda la capacità osteogenica del periostio, Ousual24 sostenne che la capacità osteogenica delle cellule staminali derivate dal periostio (PMSC) era inferiore a quella di BMSCs. Tuttavia, Yoshimura attestato che la capacità osteogenica delle PMSC ha superato quella di BMSCs39. Hayashi et al. MSCs adulto periosteal dimostrata come candidati ideali per di rigenerazione del tessuto osseo24. Inoltre, periosteal MSCs adulto sono considerati utili per abbreviare il periodo di coltura delle cellule, riducendo così i costi e il rischio di contaminazione22. Secondo quanto riferito, l'invecchiamento colpisce anche l'attività mitogenica dei osteoprogenitor cellule40. Uno studio riferito 1,252D-3 hanno indotto una maggiore stimolazione di in vitro differenziazione degli osteoblasti in hMSCs da più giovani partecipanti (65 anni < y)41. Lo studio presente ha coinvolto l'uso di periosteal cellule ottenute da giovani adulti (età < 65 y). Ulteriori studi sono richiesti per confrontare la capacità di rigenerazione dell'osso delle cellule periosteal tra vecchi e giovani donatori.

In questo studio, una popolazione delle cellule era isolata basato sulla relativa proprietà di plastica-aderenti, come descritto da Friedenstein et al. 13. the PDC raccolte qui aderito alla plastica della coltura delle cellule. I marcatori di esenchymal (CD 73, CD 90, STRO-1 e CD 44) di antigeni di superficie di queste cellule di colture primarie esposte significative espressioni. Inoltre, marcatori ematopoietici (CD 45, CD 34, CD 19 e HLA-DR) erano assenti, che indica che le cellule coltivate erano di origine mesenchimale. La differenziazione osteogenica, condrogenica e adipogenico di PDC potrebbe essere indotto utilizzando supporti di differenziazione specifica, come descritto in altri studi che valutano i campioni ottenuti da midollo osseo e del tessuto gengivale42. I risultati del presente studio conformi alle norme minime per la definizione fenotipica e funzionale di cellule staminali mesenchimali umane accettato dalla società internazionale per la terapia cellulare4. Nello studio presente, le MSCs dal periostio umana sono stati isolati e ampliato, che ha rivelato le caratteristiche simili a quelle descritte in genere di BMSCs.

Gli studi hanno proposto che il desametasone, ascorbato e β-glicerofosfato causare BMSCs subire la differenziazione osteogenica43. Un altro studio ha dimostrato che 1 α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-2D3) in combinazione con l'acido ascorbico promosso cellule staminali differenziazione44. Di conseguenza, desametasone, ascorbato e β-glicerofosfato sono stati aggiunti in questo studio per promuovere la differenziazione delle cellule staminali. I modelli osservati erano simili in tutti e tre i campioni paziente delle cellule. In questo studio, MSCs sono stati correttamente identificati dal periostio alveolare con un tasso di isolamento del 58,8%. Nel tasso di successo per quanto riguarda l'età, il sesso e posizione sono state osservate differenze statisticamente significative.

Il presente studio sperimentale ha studiato due sostanze, cioè 1,252D-3 e vitamina C, entrambi i quali possono stimolare il differenziamento osteogenico delle cellule staminali. Un 2008 Studio45 indicato che 1,252D-3 è essenziale per il metabolismo dell'osso e l'omeostasi del calcio e colpisce il sistema cardiovascolare attraverso meccanismi ancora per essere pienamente compresa. In un altro precedente studio46, 1,25-2D3 stimolata la differenziazione in vitro di cellule staminali mesenchimali umane in osteoblasti. La capacità di 1,25-2D3 per indurre BMSCs indifferenziato di differenziarsi in osteoblasti-come le cellule in vitro è stata dimostrata in diversi studi esplorando vari sistemi46. Alcuni studi hanno dimostrato anche che, quando aggiunto a colture di osteoblasti-come le cellule, 1,252D-3 inibisce la proliferazione cellulare ma aumenta l'espressione di marcatori osteoblastic come ALP, osteopontina, OCN e matrice Gla proteina47,48. Uno studio precedente ha riferito che 1,25-2D3 in genere inibisce la proliferazione cellulare e induce la differenziazione di osteoblasti49. Uno studio in vitro condotto su cellule murine indicato che 1,25-2D3 può promuovere le fasi iniziali di osteoblastogenesis9. Inoltre, un altro studio in vitro ha suggerito che, per MSCs,1,25-(OH) sia precoce e tardiva2D3 può stimolare gli indicatori di differenziazione osteogenica, compreso ALP, osteopontina, BSP e OCN43.

Entrambi OCN — considerato responsabile per il controllo della sintesi della matrice — e collagene 1A1 — la proteina più abbondante matrice — è cruciali dell'osso acida proteine della matrice che svolgono un ruolo fondamentale nella sintesi della matrice. Inoltre, essi sono caratteristici maturi matrix-formando osteoblasti. 50 uno studio precedente ha riferito che 1,252D3 trattamento stimolata espressione 1A1 aumentata del collagene ma non CBFA1 o ALP gene espressione34. Le valutazioni dei geni coinvolti nel differenziamento osteoblastico hanno rivelato che 1,252D3 trattamento ha aumentato l'espressione di OCN51,52,53. Nel nostro studio, i risultati hanno indicato che 1,25-2D3 esercita effetti positivi sull'attività osteogenica. Rispetto agli altri gruppi, 10− 8 M 1,252D-3 hanno dimostrato una maggiore espressione del mRNA di ALP, BSP, CBFA1, OCN e Col1. Tra questi, i risultati per ALP e Col1 raggiungono significatività statistica. Pertanto, le condizioni ottimali sono state ottenute quando si utilizza 10− 8 M 1,252D-3. espressione del mRNA di BSP nel 10− 10 M 1,252D3 gruppo aumentato significativamente (p < 0,05). Tuttavia, sono state osservate differenze statisticamente significative nei cambiamenti piega le espressioni di mRNA di CBFA1 e OCN. Per recensire l'espressione di mRNA del gene, i risultati dell'esperimento hanno indicato in vitro la differenziazione osteogenica. Sulla base di questi risultati, l'osteogenesi osservato in senso negativo, vitamina C e 10− 10, 10− 9, 10− 7 M 1,252D3 gruppi era più debole di quella in 10− 8 M 1,252D3 gruppo. Questi risultati hanno condotto alla speculazione che 1,25-2D3 numeri primi PDC aumentando le proteine della matrice necessarie per mineralizzazione (collagene 1A1).

Uno studio precedente ha riferito OCN come un obiettivo primario di 1,252D-3, che è aumentato contrassegnato OCN espressione52. Deposizione di OCN può essere visto come un indicatore per il differenziamento osteogenico di PDC. Inoltre, espressione di OCN è stata valutata come un marcatore osteogenica tardo54. OCN è un indicatore affidabile per osso formazione e osteogenesi55. Di conseguenza, OCN espressione è generalmente collegata l'abilità di mineralizzazione delle cellule. OCN è un biomarcatore sensibile dell'osteoblasto maturo. Per un confronto osteogenica in vitro , marcatamente elevati OCN mRNA espressione è stata osservata nel gruppo 10− 8 M 1,252D3 .

Uno studio ha indicato che attività ALP è stata inibita da trasformare growth factor beta (0.1-10 ng/mL) e promosso con 1,252D-3 (50 nM)46. Questi risultati implicano che 10− 8 M 1,252D3 promuove lo sviluppo di maturazione e dell'osso di cellule staminali. Attività ALP alle concentrazioni osservate ottimale di 10− 8 M 1,252D-3 che è stato paragonato alle corrispondenti concentrazioni di vitamina c. Il PDC ha espresso attività ALP. Inoltre, l'aggiunta di 1,252D-3 ha aumentato l'attività ALP e promosso la differenziazione osteoblastic in PDC. In tutte le tre impostazioni, vitamina C, 10− 8 M 1,25-2D3e vitamina C + 10− 8 M 1,252D3 aumento ALP attività al settimane 1 (Figura 4a), 2 (Figura 4b), 3 ( Figura 4c) e 4 (Figura 4D) di diverse volte rispetto a quella del gruppo di controllo negativo. Nelle settimane 1 e 4, ALP attività aumentata significativamente nel gruppo 10− 8 M 1,252D3 . In settimana 2, ALP attività aumentata significativamente in vitamina C e 10− 8 M 1,252D3 gruppi.

Attraverso uno studio comparativo delle varie MSC umane al passaggio 3, Sakaguchi et al. 56 trovato che BMSCs e PMSC possiedono abilità osteogenica simili. Pertanto, il periodo di coltura cellulare probabilmente può essere ridotto utilizzando cellule periosteal, che a sua volta ridurrebbe il rischio di costi e contaminazione. L'uso di passaggio precoce hMSCs evita gli effetti senescenti di espansione nella cultura. Ousual e Yoshimura usato MSCs al passaggio 3 e subcoltivata per 2 settimane sotto la differenziazione osteogenica condizioni35. Di conseguenza, il tempo del passaggio dovrebbe essere considerato quando si confrontano le attività cellulari di varie fonti di cellule. In questo studio, PDC di terza generazione sono stati utilizzati perché il potenziale osteogenico delle cellule staminali delle generazioni successive di PDC è inferiore a quello delle cellule staminali del PDC di terza generazione.

Quando coltivate in un medium di siero umano, cellule staminali periostio può non solo mantengono la loro forma, ma può anche allegare, mantenere l'attività e realizzare la crescita delle cellule. In sintesi, basato su questi risultati, PDC umani possiedono la capacità di sopravvivere, proliferare e differenziarsi nella linea osteogenica in vitro, che è fondamentale nella valutazione di efficacia in vivo. Il periostio è ricco di MSCs e così è adatto per l'ingegneria tissutale. Il periostio ottenuto dalla gengiva pone meno complicazioni. Di conseguenza, l'osso alveolare è considerato un sito donatore ideale. I risultati hanno dimostrato chiaramente la possibilità allo stesso modo isolare MSCs dal periostio e conseguire il loro differenziamento in osteoblasti, condrociti e adipociti. In questo studio, gli effetti della vitamina C sul potenziale osteogenico di PDC sono stati confrontati con quelli di 1,25-2D3 a varie concentrazioni. La concentrazione più efficace era 10− 8 M 1,252D-3. Il 10− 8 M 1,252D3 trattamento durante tutto il periodo di cultura era un metodo efficace ed economico di indurre differenziazione osteogenica in PDC. In conclusione, sia la vitamina C e2D 1,25-3 promuovono la differenziazione osteogenica di PDC. Tuttavia, questi hanno esibito nessun effetto sinergico significativo nei risultati di attività ALP. Considerando la piccola dimensione del campione, campioni supplementari sono necessari per un'ulteriore valutazione. Così, PDC coltivato nelle circostanze osteogeniche potrebbe essere utile per l'ingegneria tissutale ossea e offrono il vantaggio di maggiore proliferazione cellulare.

Fasi critiche del presente protocollo comprendono punti 1.2 e 1.3 (iniziare la procedura di coltura entro 24 ore dalla raccolta e una corretta manutenzione da allora in poi). Contaminazione del tessuto deve essere evitata ed è necessario utilizzare una tecnica asettica. Una limitazione di questo protocollo è che, confrontato con le cellule staminali da midollo osseo o tessuto adiposo di sourcing, sourcing cellule staminali dal tessuto dentale è limitato in termini di basso numero di cellule che possono essere ottenuti attraverso questa tecnica.

L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule staminali periosteal possono fornire informazioni preziose per quanto riguarda le funzioni e le capacità rigenerative di questo tessuto, come pure la sua applicabilità in terapia rigenerativa. Una condizione ottima è stata ottenuta usando 10− 8 M 1,252D-3. Pertanto, il trattamento di PDC con 10− 8 M 1,252D-3 promuove il differenziamento osteogenico. Gli studi futuri dovrebbero esaminare l'applicazione in vivo di 10− 8 M 1,252D3 per l'ingegneria tissutale ossea efficace ed economico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Il protocollo di studio è stato approvato da Institutional Review Board per clinica ricerca di Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B e C 103-4223). Questo studio è stato supportato da Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Questo manoscritto è stato modificato da Wallace accademico Editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

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References

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