Isolering av Mesenchymal stamceller fra menneskelige Alveolar Periosteum og effekter av Vitamin D på Osteogenic aktivitet i Periosteum-avledet celler

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterer en protokoll for å undersøke mRNA uttrykk biomarkers periosteum-avledet celler (PDC) av vitamin C (vitamin C) og 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. I tillegg vil vi sjekke bostedets PDC evnen til å differensiere i osteocytes, chondrocytes og adipocytter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stamceller (MSCs) finnes i en rekke vev og kan differensieres ut flere celletyper, inkludert osteoblasts. Dental kildene til MSCs er periosteum en lett tilgjengelig vev, som er funnet for å inneholde MSCs i cambium laget. Men har denne kilden ikke ennå blitt mye studert.

Vitamin D3 og 1,25-(OH)2D3 har vist seg for å stimulere i vitro differensiering av MSCs i osteoblasts. I tillegg forenkler vitamin C kollagen dannelse og bein cellevekst. Men har ingen studie likevel undersøkt effekten av Vitamin D3 og Vitamin C på MSCs.

Her presenterer vi en metode for å isolere MSCs fra menneskelige alveolar periosteum og undersøke hypotesen at 1,25-(OH)2D3 kan utøve en osteoinductive effekt på disse cellene. Vi undersøke tilstedeværelsen av MSCs i den menneskelige alveolar periosteum og vurdere stamcelleforskningen vedheft og spredning. Å vurdere muligheten av vitamin C (som en kontroll) og ulike konsentrasjoner av 1,25-(OH)2D3 (1010, 109, 108og 107 M) for å endre nøkkelen mRNA biomarkers i isolert MSCs mRNA uttrykk for alkalisk fosfatase (ALP), Ben sialoprotein (BSP), core bindende faktor alfa-1 (CBFA1), kollagen-1 og osteocalcin (OCN) måles ved hjelp av sanntids polymerasekjedereaksjons (RT-PCR).

Introduction

Selv om mange relevante teknikker har blitt utviklet i de senere årene, bein gjenoppbygging er fortsatt begrenset av flere begrensninger, og beregne omfanget av nødvendig gjenoppbygging er ofte umulig. Hard-vev augmentation er nødvendig for å oppnå både estetiske og funksjonelle mål i tillegg til en gunstig langsiktige suksessrate. Metoder brukt for Slike prosedyrer er gjestfrihet og allogenic Bentransplantering, xenografting og alloplastic Bentransplantering. Blant de ulike typene bein pode, gjestfrihet bone lærhud og fett er betraktet som den mest effektive. Donor-område sykelighet, kompromittert vascularity og begrenset vev tilgjengelighet1 har imidlertid vært store ulemper for gjestfrihet Bentransplantering. I tillegg har allogenic bone lærhud og fett og xenografts vært knyttet til sykdommer overføring. Foreløpig er syntetiske bone lærhud og fett mye brukt til å løse disse problemene. Men med deres mangel på osteogenic potensial, har kliniske utfall variert mye. Materialer som cellulose er tilknyttet svingninger i søkevolum, infeksjoner og mangel på styrke.

Bein augmentation bruker tissue engineering har generert betydelig interesse. I denne teknikken, er stamceller (MSCs) opprinnelig brukt til å fremme osteoblast differensiering, som er deretter transplanted til området av bentap å oppnå bein reparasjon. Denne fremgangsmåten brukes i cellen terapi. Oppnå bein rekonstruksjon trekker ut en begrenset mengde vev er enklere og mindre invasiv sammenlignet med andre metoder.

MSCs potensielle rolle som et verktøy for cellen-basert behandling rettet mot dental gjenfødelse er en voksende interesse blant forskjellige forskningsgrupper. Studier har bekreftet at MSCs kan være differensiert fra følgende typer vev: benmargen, adipose, synovial membran, pericyte, trabekulært bein, menneskelige navlestreng og dental vev2,3. Vanlige kilder til MSCs omfatter benmargen og fettvev dental vev. Sammenlignet med MSCs avledet fra fettvev og benmarg, er fordelene med dental stamceller lett tilgjengelighet og mindre sykelighet etter høsting. Sammenlignet med embryonale stamceller, MSCs avledet fra dental vev vises nonimmunogenic og er ikke assosiert med komplekse Etiske bekymringene3.

I 2006, anbefales det internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi bruker følgende standarder for å identifisere MSCs: først MSCs må være i stand til å feste til plast. Andre må MSCs være positivt for overflate antigener CD105, CD73 og CD90 og negative for markører for monocytter, makrofager og B-cellene i tillegg til blodkreft antigener CD45 og CD344. Som et siste kriterium, MSCs må være i stand til å skille ut følgende tre typer celler under standard betingelser for i vitro differensiering: osteoblasts, adipocytter og chondrocytes4. Hittil har seks typer menneskelig dental stamceller isolert og preget. Den første typen ble isolert fra menneskelige masse vev og betegnet postnatal tannlegekontoret masse stamceller5. Deretter tre flere typer dental MSCs er isolert og preget: stamceller fra skrubbet løvfellende tenner6, periodontal ligament7og den apikale papilla8. Flere nylig, dental hårsekken-avledet9, gingival vev-avledet10, dental bud stammen cells(DBSCs)11og periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 har også blitt identifisert.

Friedenstein var først til å definere MSCs13. MSCs viser en høy spredning potensielle og kan manipuleres for å skille før blir transplantert, noe som antyder at de er velegnet for regenerativ prosedyrer10.

Selv om de fleste studier har brukt benmarg som en kilde til stamceller, periosteum-avledet celler (PDC) har også vært brukt nylig14. Periosteum er lettere tilgjengelig enn benmargen. Derfor i denne teknikken bruker vi alveolar periosteum å eliminere behovet for ytterligere snitt under kirurgi og redusere postsurgical sykelighet i pasienter. Periosteum er connective vev som danner ytre foring av lange ben og består av to forskjellige lag: det ytterste fibrøse laget består av fibroblaster kollagen og elastisk fiber15og indre celle-rike cambium laget i direkte kontakt med bein overflaten. Cambium laget inneholder en mikset-celle befolkningen, hovedsakelig fibroblaster16, osteoblasts17, pericytes18og en kritisk subpopulasjon identifisert som MSCs19,20,21. De fleste studier har rapportert at PDC er sammenlignbare, om ikke bedre, Ben margtransplantasjon-avledet stilk celler (bMSCs) i bein healing og regeneration22,23,24. Periosteum er lett tilgjengelig og utstillinger utmerket regenerativ effektivitet. Imidlertid har få studier fokusert på de periosteum25,26,27.

Om bein reparasjon innebærer dagens klinisk praksis transplantasjon av periostal progenitor celler forsterket i støttende stillaser. Nyere studier har fokusert på å anskaffe stamceller i defekt regioner og sysselsetter progenitor celler for vev gjenfødelse20. Tannleger også forutse fremtidige anvendelse av periodontal bein gjenfødelse periodontal behandlinger og tannimplantater. Om donor området, periosteum kan enkelt høstes av generelle dental kirurger. Dette sammenligner gunstig mot margtransplantasjon stromal celler, som periosteum kan nås i løpet av praksis oral kirurgi. Dermed er målet med denne studien å etablere en protokoll for høsting PDC og å vurdere morfologi, vedlegg, levedyktighet, og spredning av menneskelig periosteum stamceller.

Vitamin D metabolitter påvirker i vivo bein-mineral dynamisk likevekt. En studie rapportert at 24R,25-(OH)2D3 aktiv form av Vitamin D er avgjørende for osteoblastic differensiering av menneskelig MSCs (hMSCs)-28. Bein homeostase og reparasjon er regulert av et nettverk av Vitamin D3 metabolitter, hvilke 1,25-(OH)2D3 (kalsitriol) er den mest biologisk aktive og relevant i regulering av beinhelse. Vitamin D3 er avgjørende for forkalkninger29. I en studie bruker 2-d-gamle Kunming hvite mus, indikerte embryoid organer i mus at Vitamin C og Vitamin D kosttilskudd effektivt fremmet differensiering av ESC-avledet osteoblasts30. Blant de andre biologiske aktivitetene stimulerer 1,25-(OH)2D3 i vitro differensiering av hMSCs til osteoblasts, som kan overvåkes basert på økningen i alkalisk fosfatase (ALP) enzym aktivitet eller OCN genet uttrykk.

Noen studier har oppdaget en dose-respons-forhold av kombinert med Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 i human PDC med særlig fokus på bein vev engineering. Derfor i denne studien undersøke vi optimal konsentrasjonen for enkel eller kombinert behandling 1,25-(OH)2D3 og Vitamin C for å indusere osteogenic differensiering av menneskelig PDC. Målet med denne protokollen er å avgjøre om en celle befolkningen isolert fra den dental alveolar periosteum inneholder celler med en MSC fenotypen og om disse cellene kan utvides kultur (i vitro) og differensiert for å danne ønskede vevet . I tillegg vil vi sjekke bostedets PDC evnen til å differensiere i osteocytes, chondrocytes og adipocytter. Den andre delen av studien evaluerer effekten av Vitamin C og 1010, 109, 108og 107 M 1,25-(OH)2D3 på osteogenic aktiviteten til PDC. Det primære målet med denne studien er å vurdere funksjonene av Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 under osteoblastic differensiering av PDC ved ALP aktivitet og pro-osteogenic gener, som ALP, kollagen-1, OCN, BSP og CBFA1. Dessuten, bestemmer denne studien optimale osteoinductive for menneskelig PDC basert på disse resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studien protokollen ble godkjent av de institusjonelle gjennomgang styret av Chang Gung Memorial Hospital. Alle deltakerne gitt skriftlig samtykke.

1. vev forberedelse

  1. Høste periostal vev fra pasienter under tannkirurgi (figur 1). Etter klaff refleksjon under lokalbedøvelse, ta et stykke periosteum vev fra alveolar benet ved hjelp av en periostal skilletegn31.
  2. Etter høsting, lagre periostal vev skiver ca 5 mm × 2 mm i Dulbeccos fosfat bufret saltvann (DPBS) med 300 U/mL av penicillin og 300 mg/mL streptomycin. Overføre vev til laboratoriet innen 24 timer.
  3. Hakke alveolar periostal vev fragmenter med skalpeller til godt hakket og vedlikeholde prøvene i passasjen 0 medium (består av 300 U/mL av penicillin og 300 mg/mL streptomycin, α-MEM og 5% fosterets bovin serum [FBS]) kultivert i en inkubator på 37 ° C med fuktet luft (5% karbondioksid). I inkubator, Forbered en vannbassenget å opprettholde fuktighet.
  4. Endre mediet etter 3 dager og to ganger per uke etterpå.
  5. Når cellene har nådd subconfluence (80%), slipp tilhenger cellene med 200 µL av 0,25% trypsin i inkubator (37 ° C) for 3 min, og deretter bruke 4,5 mL av medium for å avslutte reaksjonen.
  6. Plate cellene igjen i frisk passering 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 enheter/mL av penicillin og 100 μg/mL streptomycin). Platen er 5 × 103 celler (som telles etter en hemocytometer).
  7. Utføre hver senere avsnitt etter celler oppnå 80% samløpet31.
    Merk: I begynnelsen, mediet blir oransje rød. Etter omtrent tre dager, bør middels fargen endre en gulaktig skygge. Dobling tid cellene er omtrent 30 – 40 h, trenger 7 dager for 3-5 generasjoner.
  8. Kultur i isolerte PDC i α-MEM supplert med 10% FBS, 100 U/mL av penicillin og 100 mg/mL streptomycin i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  9. Observere cellevekst daglig og erstatte vekstmediet to ganger per uke. Bruke tredje til femte-generasjons celler for alle ytterligere eksperimenter.

2. flowcytometri

  1. Harvest 1 × 106 celler gjennom trypsin fordøyelsen:
    1. Legge til 200 µL av 0,25% trypsin. Etter 3 min, bruke 4,5 mL kultur medium som inneholder FBS avslutte reaksjonen av trypsin og samle gjennom sentrifugering (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
    2. Vask celle pellets tre ganger med 1 x DPBS. Resuspend cellene i 200 µL 1 x permeabilization buffer. Telle celler med en hemocytometer.
  2. Undersøke de uttrykte overflate markørene uttrykt av PDC gjennom flyt cytometri (fluorescens-aktivert celle sortering)32. Bruke monoklonale antistoffer (MAb) mot CD19 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE) og slag-1 (Alex) HLA-DR (FITC)32.
    1. Legge til antistoffer prøver og kultur i mørket på 4 ° C i 30 min.
    2. Vask cellene med 1 x DPBS tre ganger.
    3. Fastsette cellene med 2% formaldehyd og fortsett med flyt cytometri analyse32.

3. celle vedlegg og Viability med Osteogenic, Adipogenic og Chondrogenic differensiering

Indusere differensiering i cellene i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic linjene av dyrking periostal cellene i alle tre passasjer på seks brønnslisser plater med bestemte differensiering media.

  1. For osteogenic differensiering, kultur cellene i α-MEM på en tetthet av 5000 celler per brønn på seks-brønnen plater.
    1. Oppnå 80% samløpet, kultur cellene i mediet som inneholder α-MEM, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M deksametason (0,1 mM), og 5 mL askorbinsyre (100 uM). Kultur kontrollen negative i media α-MEM og 5% FBS.
    2. Endre media to ganger per uke.
    3. Etter 4 uker, vurdere potensialet av cellene å differensiere i en osteogenic avstamning av flekker cellene med en von Kossa analysen, som skiller av tilstedeværelsen av calcified i en kultur33.
      1. Legge til 10% formalin for å fikse. 30 min, legge til 5% Sølvnitrat og behandle under ultrafiolett (UV) lys 1t ved romtemperatur.
      2. Legge til 5% Na24 fire ganger, slik at 3 min for hver reaksjon. Til slutt, vask cellene to ganger med destillert vann.
        Merk: Von Kossa flekker er en nedbør reaksjon hvor sølv ioner og fosfat reagere i nærvær av Sure materiale; Denne flekker teknikken er ikke spesifikke for kalsium. I denne studien når undersøkte cellene ble behandlet med sølv nitrat løsning, kalsium, som er redusert med sterk UV lys, ble erstattet av sølv, som ble synlig som metallic sølv.
  2. For adipogenic differensiering, kultur cellene på en tetthet av 5000 celler per brønn på seks-brønnen plater som inneholder α-MEM.
    1. Oppnå 80% samløpet, kultur cellene i mediet som inneholder α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicillin, 10−6 M deksametason (1 mM), insulin (5 mg/mL) og indomethacin (60 mM).
    2. Kultur kontrollen negative i media α-MEM og 5% FBS.
    3. Etter 6 – 9 uker, kan du bruke olje røde O flekken cellene og markere lipid dråper, dermed bestemme tilstedeværelsen av adipogenic differensiering33:
      1. Legge til 10% formalin for å fikse. Innen 30 min, beis cellene med 0,5% olje røde O ved romtemperatur for 10 min og deretter vaske cellene tre ganger med 60% isopropanol for 3 min hver gang; til slutt, vask cellene med destillert vann.
        Merk: Olje rød O er et lysochrome (fettløselige) diazo fargestoff brukes til farging av nøytrale lipider, hovedsakelig triacylglycerol, lipoprotein og kolesterol estere. Fargestoff oppløses i lipid dråper i cellen, slå lipid dråper rød.
  3. For chondrocyte differensiering, kultur celler på seks-brønnen plater med hver godt med 5000 celler.
    1. Legg en differensiering middels inneholder α-MEM, 5% FBS, 10−7 M deksametason (0,1 mM), natrium pyruvate (100 µg/mL), insulin-transferrin-selen-A (1 × ITS), transformere vekst faktor-β (10 ng/mL) og 5 mL av askorbinsyre (100 µM).
    2. Kultur kontrollen negative i media α-MEM og 5% FBS.
    3. Etter 4-5 uker, kan du bruke Alcian blå flekker for å markere de Sure polysakkaridene, som glycosaminoglycans eller noen typer mucopolysaccharides, i brusken i cellene for å fastslå tilstedeværelsen av chondrocyte differensiering33.
      1. Legge til 10% formalin for å fikse. 30 min, legge 3% eddiksyre og tillate 2 min for reaksjonen. Senere vaskes med destillert vann tre ganger, Legg 1% Alcian blå 8GX ruges i 30 min, og så vaske med destillert vann. Endelig legge 3% eddiksyre og vask for 3 min, og så vaske med destillert vann til slutt.
        Merk: Deler av cellen som spesielt flekker av denne dye blir blå til blå-grønne etter farging og kalles "alcianophilic."

4. effekter av 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) på Osteogenesis

  1. Delt P3 å P5 PDC i seks grupper og kultur på 6-vel plater med ulike kultur medier:
  2. negativ gruppe (α-MEM og 5% FBS);
  3. Vitamin C gruppe (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate og 10−7 M deksametason + 100 uM Vitamin C);
  4. og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 gruppe (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, og 10−7 M deksametason + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Legg 2 mL mediet til en inkubator (37 ° C) i hver brønn og endre mediet to ganger hver uke.

5. omvendt transkripsjon/kvantitative sanntid polymerasekjedereaksjons

  1. Etter 7 d av osteoblast differensiering, isolere den totale RNA på isen ved hjelp av en kommersiell reagens (se Tabell for materiale):
    1. Legge 1 mL av isolasjon reagens til hver brønn. Legge til 200 µL av bromochloropropane og la stå i 10 min å generere lagdelt RNA og deretter virvel på 10.000 rpm i 15 min på 4 ° C.
    2. Etter sentrifugering, legge til 500 µL av 2-propanol 500 µL av den supernatant som inneholder. Utløse RNA på isen og la 15 min for reaksjonen.
    3. Etter inngrepet, sentrifuge på 12 000 rpm i 15 min ved 4 ° C, hvoretter RNA ligger på bunnen av røret. Deretter fjerne nedbryting med 1 mL av 75% alkohol for vask og sentrifuge 7500 RPM i 8 min i 4 ° C.
    4. Fjerne nedbryting og bruke en vakuum konsentrator for å produsere RNA fra bunnen av væsken. Gjenopprette med vann.
  2. Omvendt transkribere av RNA (1 μg) bruker avian myeloblastosis virus revers transkriptase. Angi polymerasekjedereaksjons (PCR) skal kjøres ved 25 ° C i 10 min etterfulgt av 50 ° C for 60 min og deretter 85 ° C i 5 minutter, før endelig opprettholde på 4 ° C.
  3. Syntetisere første-strand komplementære DNA (cDNA). Utføre kvantitativ PCR (qPCR) bruker 5 μL 1:10 fortynnet cDNA. Utføre kvantitativ RT PCR (qRT-PCR) bruker primere for ALP, BSP, OCN, CBFA1 og kollagen-1.
    Merk: For å unngå DNA forurensning av signaler, revers sekvenser av hver primer ble utformet på forskjellige exons.
  4. Utføre qPCR ved hjelp av en kommersiell PCR-Master Mix (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner. Sette den termiske cycler ved 50 ° C for 2 min etterfulgt av 95 ° C i 10 min og deretter 40 sykluser hver på 95 ° C i 15 s etterfulgt av 60 ° C i 60 s.
    Merk: SYBR protokollen krever også en smelte kurve scenen, som drives på 95 ° C i 15 s, 60 ° C for 60 s, og deretter 95 ° C i 15 s.
  5. Normalisere syklus terskelverdier for ALP, BSP, CBFA1, collagen-1 og OCN som housekeeping genet GAPDH. 34
  6. Primer parene er oppført i Tabellen for materiale.

6. alkalisk fosfatase aktivitet

  1. Vurdere ALP enzymaktiviteten cellene med den tidligere beskrevet teknikken35, som konverterer p- nitrophenyl fosfat til p- nitrophenol; p- nitrophenyl fosfat er en fosfatase substrat som blir gult når dephosphorylated av ALP, som bestemmes av en 405-nm bølgelengde. Normalisere totalen p- nitrophenol dannet basert på total protein som Bradford analysen.
  2. Sammenligne ALP aktiviteter kontrollen (α-MEM, 5% FBS), Vitamin C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M deksametason + 100 uM Vitamin C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, og 10−7 M deksametason + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), og Vitamin C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M deksametason + 100 uM Vitamin C +1,25-(OH)2D3) Grupper etter 1, 2, 3 og 4 uke kultur.
  3. Utføre en protein utvinning prosedyre på is:
    1. Skrape cellene fra 6-vel platene og legge 50 µL av lyseringsbuffer. Deretter plasser cellene på isen i 30 minutter til ødelegger cellene og gratis protein.
    2. Etter 30 min, sentrifuge på 13000 rpm på 4 ° C i 15 min. Etter sentrifugering, nedbryting for lagring og bruker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For alle kvantitativt analyser presenteres dataene som gjennomsnittlig ± standardavviket (SD). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student t-test. Totalt 34 prøver ble oppnådd med en deltaker gjennomsnittsalder på 48,1 ± 12.3 y. elleve av disse prøvene var oppnådd fra mannlige pasienter og 23 fra kvinnelige pasienter. Tjueåtte eksempler Hentet fra molar regioner og fra de fremre regionene. 26 var Hentet fra maxilla og 8 fra mandible. Mener varigheten mellom prosedyren og kulturen var 0,5 ± 0,1 h. 34 undersøkte prøvene gitt 20 er MSC koloniene, med en vellykket isolasjon sats på 58.8%. Ingen signifikante forskjeller ble observert i noen av parameterne mellom den vellykket og mislykket isolert PDC (middelalder: 48.8 ± 13.0 vs 47.1 ± 11.5 y, sex: 7 menn [35%] vs 4 menn [28,6%], plassering: 15 fra molar regioner [75] vs 13 [92.9%], og 15 minutter fra maxilla [75] vs 11 [78,6%], henholdsvis).

Isolasjon og morfologi: Osteogenic, chondrogenic, og adipogenic differensiering

Fra dager 1-9, dannet PDC kolonier og sfæriske klynger. De fleste cellene utstilt en spindel utseende og var homogen under fase kontrast mikroskop (figur 2). Etter 14 d kultur dukket cellen morfologi spindel-formet observert under kontrast mikroskopet. Etter de første generasjon cellene, cellene ikke lenger vokste i klynger men utstilt utbredt og ensartet spredning.

MSCs var spindel-formet med uregelmessig prosesser og festet godt til kultur rett etter 1-3 d primære kultur (figur 2a). Første kulturen utstilt små, runde cellene og spindel-formet under en optisk mikroskop. Kultivert cellene utstilt en homogen, fibroblast-lignende spindel figur første passering (figur 2a). Differensiering studien viste at PDC kunne være subpassaged og differensiert i vitro i osteoblasts (figur 2b), chondrocytes (figur 2 c) og adipocytter (figur 2d).

På slutten av osteogenic differensiering angitt von Kossa flekker kalsium innskudd og osteogenic differensiering (figur 2b). Disse resultatene indikerte sterkt at blant periostal celle populasjoner, stamfar celler har potensial til å differensiere i osteogenic celler.

Å vurdere produksjonen av proteoglycans, Alcian blå flekker ble brukt som en indikator for bestemme tilstedeværelsen av chondrocyte differensiering (figur 2 c). Cellene er differensiert i chondrocytes. Disse resultatene antydet at blant periostal celle populasjoner, stamfar celler har potensial til å differensiere i chondrogenic celler.

Cellene ble kultivert i nevnte bestemt media å utløse adipogenic differensiering. Etter 8 uker, olje rød O ble brukt til å oppdage eksistensen av intracellulær lipider. Følgende flekker, intracellulær mikroskopiske fett dråper ble observert i fem forskjellige prøver (figur 2d).

Flow cytometric overflaten markør uttrykk analyse for PDC

En flyt cytometric analysen ble gjennomført for å bekrefte uttrykket av mesenchymal overflaten markør på overflaten av cellene. MSC markører CD73, CD90, slag-1 og CD44 var sterkt positive i PDC, mens blodkreft lineage markører CD19, CD34, CD45 og HLA-DR var negative.

Effekter av ulike Vitamin D 3 konsentrasjoner på osteogenesis

Selv om resultatene bekreftet positive effekter av 1,25-(OH)2D3 (kalsitriol) på osteogenic aktivitet, ble statistisk signifikante forskjeller observert bare blant noen av Brett endringene i mRNA uttrykk for det osteogenic enzymer. Denne analysen kan ha blitt partisk av de høye SD-kort, som kan tilskrives de enkelte avvikene blant.

Budbringer RNA uttrykk for alkalisk fosfatase

Fold endringene i mRNA uttrykk for ALP etter 1 uke kultur var 7.43 (SD = 3.96) i gruppen Vitamin C og 7.15 (SD = 4,88), 9,30 (SD = 5.63), 12.92 (SD = 7.95), og 6.60 (SD = 6.33) i 1010, 109, 108 , og 107 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4a). MRNA uttrykk nivåer av ALP i Vitamin C, 108 M 1,25-(OH)2D3og 109 M 1,25-(OH)2D3 grupper var betydelig høyere (p < 0,05) enn de i andre grupper, som indikerer økt ALP mRNA uttrykk i disse gruppene. Kontrollen ble satt til verdien 1. Den følgende fold økningen i ALP mRNA uttrykkene ble observert i denne studien: 7.43-fold i C-Vitamin gruppen; 9.30-fold i 109 M 1,25-(OH)2D3 gruppen; og 12.92-fold i 108 M 1,25-(OH)2D3 -gruppen.

Selv om en større fold endring i ALP mRNA uttrykkene ble observert i 108 M 1,25-(OH)2D3 -gruppen, ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert om disse uttrykk nivåer mellom denne gruppen og negativ og Vitamin C grupper (p = 0,20 og p = 0.52, henholdsvis).

ALP er en god indikator for å bestemme den tidlige osteogenic differensieringen av celler. ALP også fungerer som en ectoenzyme for nedbrytning av uorganiske pyrophosphate og utgivelser fosfat under mineralisering36. PDC behandlet med Vitamin C og 108 og 109 M 1,25-(OH)2D3 utstilt betydelige forskjeller sammenlignet med de fra andre gruppene (figur 4a).

Budbringer RNA uttrykk for bein sialoprotein

Fold endringene i mRNA uttrykkene bsp etter en uke med kultur var 3.21 (SD = 1,20) og 4.18 (SD = 2.55), 10.34 (SD = 10.31), 24.91 (SD = 23.44), og 5,24 (SD = 3,54) i Vitamin C og 1010, 109, 108 , og 107 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4b). BSP mRNA uttrykkene var høyere i 108 M 1,25-(OH)2D3 gruppen, men med ingen statistisk signifikans sammenlignet med tilsvarende uttrykkene i de andre gruppene.

BSP mRNA uttrykkene i Vitamin C og 1010 M 1,25-(OH)2D3 grupper var betydelig høyere (p < 0,05) enn i andre grupper, som indikerer at Vitamin C og 1010 M 1,25-(OH) 2 D3 forfremmet BSP uttrykk. Kontrollen ble satt til verdien 1. Vitamin C og 1010 M 1,25-(OH)2D3 grupper utstilt en 3.21 - og 4.18 ganger økning i BSP mRNA uttrykkene, henholdsvis. 109 M og 108 M 1,25-(OH)2D3 grupper stilt høyere BSP mRNA uttrykk enn de andre gruppene. 109 og 108 M 1,25-(OH)2D3 grupper utstilt en 10.34 - og 24.91 ganger økning i BSP mRNA uttrykkene, henholdsvis, men denne økningen var ikke statistisk signifikant (p > 0,05). En mulig forklaring er at stamceller ikke var alle fra samme deltakeren. Dermed de potensielle forskjellene kunne ha forhøyet SD og påvirket dermed de statistiske resultatene.

Budbringer RNA uttrykk for CBFA1

Fold endringene i CBFA1 mRNA uttrykk etter en uke med kultur var 0.96 (SD = 0,10) og 0,90 (SD = 0.26), 1.01 (SD = 0,25), 1,31 (SD = 0,32), og 1,12 (SD = 0,35) i Vitamin C og 1010, 109, 108 , og 107 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (Figur 4 c). 108 M 1,25-(OH)2D3 gruppen viste høyere CBFA1 mRNA uttrykk. Merkede endringer ble observert i CBFA1 mRNA genet uttrykkene i behandlingsgrupper eller i kontrollgruppen. I tillegg ble ingen betydelig økning observert i uttrykket av mRNA markører etter tillegg av Vitamin C eller 1,25-(OH)2D3. Videre ble ingen vesentlig forskjell hverken mellom grupper observert.

Budbringer RNA uttrykk for kollagen-1

Fold endringene i mRNA uttrykket av kollagen-1 etter en uke med kultur var 0,98 (SD = 0,17) og 0,85 (SD = 0,16), 1.05 (SD = 0,16), 1,52 (SD = 0,36), og 1.01 (SD = 0,33) i Vitamin C og 1010, 109, 108 , og 107 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (Figur 4 d). Kollagen-1 mRNA uttrykkene var høyere i 108 M 1,25-(OH)2D3 -gruppen, men med ingen statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med tilsvarende uttrykkene i de andre gruppene.

108 M 1,25-(OH)2D3 og kontroll grupper utstilt statistisk signifikante forskjeller i resultatene (p < 0,05). Kontrollen ble satt til verdien 1. En 1.52-fold økning i kollagen-1 mRNA uttrykkene ble observert. De 1010 M 1,25-(OH)2D3 og 108 M 1,25-(OH)2D3 grupper utstilt betydelige forskjeller i resultatene (p < 0,05).

Budbringer RNA uttrykk for osteocalcin

Fold endringene i OCN mRNA uttrykk etter en uke med kultur var 0.60 (SD = 0.1) og 0.78 (SD = 0,18), 1.13 (SD = 0,55), 2,59 (SD = 1,59), og 1.61 (SD = 0.73) i Vitamin C og 1010, 109, 108 , og 107 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4e). OCN mRNA uttrykkene var høyere i 108 M 1,25-(OH)2D3 -gruppen, men med ingen statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med tilsvarende uttrykkene i de andre gruppene.

Ingen betydelig økning ble observert i av OCN mRNA markører etter tillegg av Vitamin C eller 1,25-(OH)2D3. Imidlertid OCN mRNA uttrykkene redusert etter Vitamin C behandling. Kontrollen ble satt til verdien 1. Basal OCN uttrykkene viste en signifikant 0.6-fold nedgang (p < 0,05) under osteoblastic differensiering. OCN mRNA uttrykk var betydelig høyere (p < 0,001) i cellene kulturperler i 108 M 1,25-(OH)2D3 enn i de tilsvarende uttrykkene av andre grupper, som viste en gjennomsnittlig fold økning av 2,59. imidlertid disse resultatene var ikke statistisk signifikant (p > 0,05). En mulig forklaring er at stamceller ikke var alle fra samme deltakeren; dermed de potensielle forskjellene kunne ha forhøyet SD og påvirket dermed de statistiske resultatene.

ALP aktivitet analysen

En tidligere studie vist at 1,25-(OH)2D3 er mest effektiv i en konsentrasjon av 108 M; Derfor ble 108 M brukt i testgruppen sammenligne osteogenic evne 1,25-(OH)2D3 at negative, Vitamin C og Vitamin C + 1,25-(OH)2D3 grupper. Osteogenic evne ble uttrykt i ALP aktiviteten. Etter en uke med kultur (figur 5a), kaste endringene i ALP aktivitet var 1,00 (SD = 0,00), 1,92 (SD = 0.89), 3.77 (SD = 1.66), og 1.46 (SD = 0.49) i Negative, C, D, og C + D, henholdsvis. Blant alle grupper, statistisk signifikante forskjeller ble kun observert mellom D og Negative (p = 0,03; Figur 5a). Etter 2 uker med kultur, brett endringene i ALP aktivitet (figur 5b) var 1,00 (SD = 0,00), 2.32 (SD = 1.68), 4.98 (SD = 3.02), og 4.86 (SD = 2,73) i Negative, C, D, og C + D, henholdsvis. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert i noen av gruppene. Etter 3 uker med kultur, brett endringene i ALP aktivitet (figur 5 c) var 1,00 (SD = 0,00), 2,93 (SD = 2,15), 5.76 (SD = 3,60), og 5,61 (SD = 3.88) i Negative, C, D, og C + D, henholdsvis. Igjen, ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert i noen av gruppene (figur 5 c). Etter 4 uker av kultur, brett endringene i ALP aktivitet (figur 5 d) var 1,00 (SD = 0,00), 2.83 (SD = 1.97), 3.79 (SD = 0,77), og 4.24 (SD = 2.87) i Negative, C, D, og C + D, henholdsvis. Her, D og Negative gruppene utstilt statistisk signifikante forskjeller (p = 0,00; Figur 5 d).

I uke 1 bare 108 M 1,25-(OH)2D3 gruppen viste betydelige forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (p = 0,03). I Uke2 av 108 M 1,25-(OH)2D3 og Vitamin C grupper utstilt betydelige forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (p = 0.0498). I uke 3 viste ingen av de betydelige forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen. I uke 4 viste 108 M 1,25-(OH)2D3 gruppen betydelige forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen. Dette indikerte at 108 M 1,25-(OH)2D3 forfremmet ALP aktivitet.

I korthet, økt 108 M 1,25-(OH)2D3 gruppen utstilt ALP og kollagen-1 mRNA uttrykk. gruppen Vitamin C vist betydelig forbedret ALP og BSP mRNA ytringsfrihet. og 109 M 1,25-(OH)2D3 gruppen viser betydelig forbedret ALP mRNA uttrykk. I uke 1, ble økt ALP aktivitet observert i Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 grupper, men med ingen statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med tilsvarende uttrykk nivåer i de andre gruppene. Fra uker 2 til 4 utstilt både Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 grupper lignende resultater. Derfor kan disse resultatene ikke klart belyse synergistic effekter av Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 på osteogenic differensiering cellene (ALP aktivitet).

Figure 1
Figur 1: Human alveolar periosteum. Periostal vev ble høstet under tannkirurgi. Stjernen angir plasseringen av alveolar periosteum.

Figure 2
Figur 2: differensiering studie. MSCs var spindel-formet med uregelmessig prosesser og godt festet til kultur rett etter 1-3 d primære kultur (A; stjernen angir plasseringen av mesenchymal stamceller). I vitro kultur tilfeller av MSCs var subpassaged og differensiert i osteoblasts (B, svart stjernen angir området farget av von Kossa), chondrocytes (C, i blå stjerne angir området farget av Alcian blå), og adipocytter (D, rosa stjernen angir området farget av olje røde O). Figur 2 brukes på nytt fra biomedisinsk forskning International, volum 2016, artikkel-ID 352956125. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Flow cytometri. Overflate markører uttrykt av MSCs var CD73 (65.2%), CD90 (75.6%), slag-1 (65.2%) og CD44 (88.1%) men ikke CD45 (1,34%), CD34 (1,61%), CD19 (2,18%), eller HLA-DR (2,20%). "%" i figuren angir en positiv ratio. Kontrollgruppen (α-MEM og 5% FBS) representeres av den røde linjen. Forsøksgruppen representeres av den blå linjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: mRNA uttrykk. mRNA uttrykk for osteoblast differensiering for uke 1. (A) ALP (B) BSP, (C) CBFA1, (D) COL-jeg og (E) OCN. p < 0,05 er *, p < 0.01 er **, p < 0,001 er ***. MRNA fold endringen er versus kontroll (α-MEM og 5% FBS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: alkalisk fosfatase aktivitet. Alkalisk fosfatase aktivitet analysen av osteoblast differensiering for (A) uke 1, (B) uke 2, (C) uke 3 og (D) uke 4. p < 0,05 er *, p < 0.01 er **, p < 0,001 er ***. Fold endringen er versus kontroll (α-MEM, 5% FBS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et nylig utviklet terapeutisk modalitet, nemlig tissue engineering innebærer MSCs, har mange fordeler. MSCs, som finnes i forskjellige vev, er multipotent celler som kan skille ut en rekke funksjonelle mesodermal vev celler37 og andre celler som osteoblasts.

Periosteum fungerer som en nisje for stamfar celler og som en rik blodkar forsyning for benet det omslutter38. I vår studie av 34 undersøkte prøvene, gitt 20 er MSC koloniene, med en vellykket isolasjon sats på 58.8%. MSCs avledet fra periosteum ble valgt i denne studien basert på deres spredning og osteogenic differensiering evner. Spredning frekvensen av periostal cellene var mye høyere enn margtransplantasjon stromal celler22. Om osteogenic evne til periosteum, Ousual24 hevdet at osteogenic evne til periosteum-avledet stilk celler (PMSCs) var dårligere enn det av BMSCs. Imidlertid bekreftet Yoshimura at osteogenic evne til PMSCs oppnådd for BMSCs39. Hayashi et al. vist periostal voksen MSCs som velegnet for bein vev gjenfødelse24. I tillegg anses periostal voksen MSCs nyttig i korte celle kultur perioden, dermed redusere både kostnadene og risiko for kontaminering22. Angivelig, aldring påvirker også mitogenic aktiviteten til de osteoprogenitor celler40. En studie rapporterte 1,25-(OH)2D3 indusert en høyere grad av stimulering av i vitro osteoblast differensiering i hMSCs fra yngre deltakere (< 65 år y)41. Studien omfattet bruk av periostal celler fra unge voksne (alderen < 65 y). Videre studier er nødvendig å sammenligne bein gjenfødelse evne til periostal cellene mellom gamle og unge givere.

I denne studien ble celle innbyggere isolert basert på egenskapen plast-tilhenger som beskrevet av Friedenstein et al. 13. det PDC høstet her overholdt celle kultur plast. Esenchymal markørene (CD 73, CD 90, slag-1 og CD 44) av overflaten antigener i disse primære kulturer cellene utstilt betydelig uttrykk. Videre var blodkreft markører (CD 45, CD 34, CD 19 og HLA-DR) fraværende, indikerer at kulturperler cellene var en mesenchymal opprinnelse. Osteogenic, chondrogenic og adipogenic differensiering av PDC kan bli indusert ved hjelp av bestemte differensiering medier, som beskrevet i andre studier vurdere prøver innhentet fra gingival vev og bein margtransplantasjon42. Resultatene av studien overholde minimale standarder for fenotypiske og funksjonelle definisjonen av menneskelig MSCs akseptert av det internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi4. Studien, var MSCs fra menneskelige periosteum isolert og utvidet, som avslørte egenskaper som ligner på vanligvis beskrevet av BMSCs.

Studier har foreslått at dexamethasone og ascorbate β-glycerophosphate forårsake BMSCs å gjennomgå osteogenic differensiering43. En annen studie viste at 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) i kombinasjon med askorbinsyre forfremmet stamcelleforskningen differensiering44. Derfor ble dexamethasone og ascorbate β-glycerophosphate lagt i denne studien å fremme stamcelleforskningen differensiering. Mønstrene observert var lik i alle tre pasienten celle prøver. I denne studien ble MSCs identifisert fra alveolar periosteum med en isolasjon sats på 58.8%. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert i suksessraten med hensyn til alder, kjønn og plassering.

Eksperimentell studien undersøkt to stoffer, nemlig 1,25-(OH)2D3 og vitamin C, begge kan stimulere osteogenic differensiering av stamceller. En 2008 studien45 indikerte at 1,25-(OH)2D3 er avgjørende for bein metabolisme og kalsium homeostase og påvirker det kardiovaskulære systemet gjennom mekanismer ennå å bli fullt ut forstått. I en tidligere studie46stimulert 1,25-(OH)2D3 i vitro differensiering av menneskelig MSCs i osteoblasts. 1,25-(OH)2D3 evnen til å indusere udifferensierte BMSCs å skille ut osteoblast som celler i vitro har vist i flere studier utforske ulike systemer46. Noen studier har også vist at når lagt til kulturer av osteoblast-lignende celler, 1,25-(OH)2D3 hemmer mobilnettet spredning men øker uttrykket for osteoblastic som ALP, osteopontin, OCN og matrix Gla protein47,48. En tidligere studie rapportert at 1,25-(OH)2D3 vanligvis hemmer mobilnettet spredning og induserer osteoblast differensiering49. En i vitro studie utført på murine celler indikerte at 1,25-(OH)2D3 kan fremme de tidlige stadiene av osteoblastogenesis9. I tillegg, antydet en annen i vitro studie at til både tidlig og sent MSCs,1,25-(OH)2D3 kan stimulere osteogenic differensiering markører, inkludert ALP, osteopontin, BSP og OCN43.

Begge OCN-vurdert ansvarlig for kontroll av matrix syntese- og kollagen 1A1 — rikeste matrix protein-er avgjørende Sure bein matrix proteiner som spille viktige roller i matrix syntese. I tillegg er de karakteristiske modne matrix-forming osteoblasts. 50 en tidligere studien rapporterte at 1,25-(OH)2D3 behandling stimulert økt kollagen 1A1 uttrykk, men ikke CBFA1 eller ALP gene expression34. Vurderinger av gener involvert i osteoblastic differensiering har avdekket at 1,25-(OH)2D3 behandling økt uttrykk for OCN51,52,53. I vår studie viste resultatene at 1,25-(OH)2D3 har positive effekter på osteogenic aktivitet. Sammenlignet med andre grupper, demonstrert 10−8 M 1,25-(OH)2D3 økt mRNA uttrykk for ALP, BSP, CBFA1, OCN og Kol1. Blant disse var resultatene for ALP og Kol1 statistisk signifikant. Derfor ble optimale forhold oppnådd ved 10−8 M 1,25-(OH)2D3. mRNA uttrykk bsp i 10−10 M 1,25-(OH)2D3 -gruppen økte betydelig (p < 0,05). Imidlertid ble ingen statistisk signifikante forskjeller observert i fold endringene i mRNA uttrykk for CBFA1 og OCN. Når du gjennomgår mRNA genuttrykk, indikerte resultatene av eksperimentet i vitro osteogenic differensiering. Basert på disse funn, osteogenesis observert i negativt, Vitamin C og 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper var svakere enn i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppe. Disse resultatene førte til spekulasjoner om at 1,25-(OH)2D3 primtall PDC ved upregulating matrix proteiner kreves for mineralisering (kollagen 1A1).

En tidligere studie rapportert OCN som en ettertraktet mål 1,25-(OH)2D3, som økte markant OCN uttrykk52. OCN deponering kan sees som en markør for osteogenic differensiering av PDC. I tillegg er OCN uttrykk evaluert som en sen osteogenic markør54. OCN er en pålitelig indikator for bein dannelse og osteogenesis55. Derfor er OCN uttrykk vanligvis knyttet til mineralisering evnene til cellene. OCN er en følsom biomarkør av eldre osteoblasts. For en i vitro osteogenic sammenligning ble markert opphøyet OCN mRNA uttrykket observert i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen.

En studie viste at ALP aktivitet ble hemmet av transformasjon av vekstfaktor beta (0,1-10 ng/mL) og markedsført med 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Disse resultatene antyde at 10−8 M 1,25-(OH)2D3 fremmer stamcelleforskningen modning og bein utvikling. ALP aktivitet på optimal observert konsentrasjonen av 10−8 M 1,25-(OH)2D3 ble sammenlignet med det på tilsvarende konsentrasjonen av Vitamin C. PDC uttrykt ALP aktivitet. Videre tillegg av 1,25-(OH)2D3 økt ALP aktiviteten og fremmet osteoblastic differensiering i PDC. I alle tre innstillinger, Vitamin C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, og Vitamin C + 10−8 M 1,25-(OH)2D økt3 ALP aktivitet på uker 1 (figur 4a), 2 (figur 4b), 3 ( Figur 4 c), og 4 (Figur 4 d) av flere flippen forhold til negative kontrollgruppen. I ukene 1 og 4, ALP aktivitet økt betydelig i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 . I Uke2, ALP aktivitet økt betydelig i Vitamin C og 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper.

Gjennom en sammenlignende studie av ulike menneskelige MSCs på passering 3, Sakaguchi et al. 56 fant at BMSCs og PMSCs har liknende osteogenic ferdigheter. Derfor kan celle kultur perioden trolig bli forkortet ved hjelp av periostal celler, som i sin tur reduserer kostnader og forurensning risikoen. Bruk av tidlig passering hMSCs unngår senescent effektene for ekspansjon i kulturen. Ousual og Yoshimura brukt MSCs på passering 3 og subcultured i 2 uker under osteogenic differensiering forhold35. Derfor bør passeringstider vurderes når du sammenligner ulike celle kilder mobilnettet aktiviteter. I denne studien ble tredje generasjon PDC brukt fordi osteogenic potensialet i stamceller av senere generasjoner av PDC er lavere enn stamceller av tredje generasjons PDC.

Når kultivert i et humant serum medium, kan periosteum stilk celler ikke bare beholde sin form, men kan også knytte, vedlikeholde aktivitet og oppnå cellevekst. I sammendraget, basert på disse resultatene, menneskelige PDC har muligheten til å overleve, spre og differensiere i den osteogenic avstamning i vitro, som er avgjørende i å vurdere effekten i vivo. Periosteum er rik på MSCs og er derfor egnet for tissue engineering. Periosteum fra gingiva utgjør færre komplikasjoner. Derfor regnes alveolar benet som et ideelt donor-område. Resultatene tydelig demonstrert at tilsvarende isolere MSCs fra periosteum og oppnå deres differensiering i osteoblasts, chondrocytes og adipocytter. I denne studien var effekten av Vitamin C på osteogenic potensialet i PDC sammenlignet med de 1,25-(OH)2D3 i ulike konsentrasjoner. Den mest effektive konsentrasjonen var 10−8 M 1,25-(OH)2D3. 10−8 M 1,25-(OH)2D3 behandling i hele kultur perioden var en effektiv og økonomisk metode for å indusere osteogenic differensiering i PDC. Som konklusjon, fremme både Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 osteogenic differensiering av PDC. Men utstilt disse ingen betydelige synergieffekter i ALP aktiviteten resultatene. Vurderer liten utvalgsstørrelsen er flere prøver nødvendig for videre evaluering. Dermed kan PDC kultivert under osteogenic forhold være nyttig for bein vev engineering og tilbyr fordelen av høyere mobilnettet spredning.

Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere trinnene 1.2 og 1.3 (starter culturing prosedyren innen 24 timer etter høsting og riktig vedlikehold etterpå). Forurensning av vev må unngås og bruk av steril teknikk er obligatorisk. En begrensning av denne protokollen er, sammenlignet med sourcing stamceller fra benmarg eller fettvev, sourcing stamceller fra dental vev er begrenset i lavt antall celler som kan oppnås gjennom denne teknikken.

Identifisering og karakterisering av periostal stamceller kan gi verdifull informasjon om funksjoner og regenererende potensialet i dette vevet samt brukbarheten i regenerativ therapy. En optimal tilstand ble oppnådd med 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Derfor fremmer behandling av PDC med 10−8 M 1,25-(OH)2D3 osteogenic differensiering. Fremtidige studier bør undersøke programmet i vivo 10−8 M 1,25-(OH)2D3 effektiv og økonomisk bein vev engineering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Studien protokollen ble godkjent av institusjonelle Review Board for klinisk forskning av Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B og 103-4223C). Denne studien ble støttet av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 og NMRPG3C0151). Dette manuskriptet ble redigert av Wallace akademiske redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9, (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53, (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27, (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122, (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65, (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics