共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

Biochemistry

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Summary

環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。

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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

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Abstract

共有結合 DNA 付加体の化学物質によって形成される発がん性の薬は発がんプロセスの初期段階で最も重要な要因の一つと判断されたか。癌の原因を考えると、この結合は、今化学発がんのセントラル ドグマとして評価されます。ここでは、チトクローム P450 によって触媒反応を用いた方法を説明し、付加体の化学物質や代謝産物がこれらの DNA を形成するの活性化のための薬の効力を調査するその他の微生物による分解酵素。体内酵素シトクロム P450 に他体内の酵素、すなわちペルオキシダーゼ、NADPH: チトクローム P450 (ミクロゾーム及びサンプルを有する細胞画分の分離を記述する手順を紹介してNAD (P) h: キノン酸化還元酵素、またはキサンチン酸化酵素酸化還元酵素)。メソッドの説明また、分析化学物質の代謝活性化のための DNA の隔離のためのそれらと同様、これらの酵素によって使用できます。さらに、検出および化学/医薬品由来 DNA の定量化できる適切な方法は、すなわち32p-ポストラベル法のさまざまな変更を内転、放射性ラベルの雇用の化学物質を分析、詳細に表示されます。

Introduction

(環境化学物質や薬物) は化学物質の代謝は 2 つのフェーズ1で発生します。フェーズ I と II はもともと疎水性 (水溶性) 化合物をより親水性にレンダリングする目的 (水溶性)、汗や尿、糞便を介して容易に excretable のため。フェーズ I (化) 反応は、酸化、還元、およびペルオキシダーゼ (p450、アセチルトランスフェラーゼ)、シトクロム p450 などの酵素によって触媒される水酸化反応 (すなわち、シクロオキシゲナーゼ、コックス)、アルド-ケト還元酵素 (AKRs)、および肝ミクロゾーム。フラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMOs)。様々 な還元すなわち、ミクロソーム NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) と細胞内 NAD (P) h: キノン酸化還元酵素 (NQO1)、キサンチン酸化酵素 (XO)、アルデヒド酸化酵素 (AO)1による還元反応の内容はまた相.2 番目のフェーズ (活用) 段階に付けられた官能基は極性をさらに高める小さい極性分子の共役にされます。フェーズ II は、硫酸転移酵素 (結果)、 N、O- コリンアセチルトランスフェラーゼ (Nat)、メチル基転移酵素カテコール -O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) グルタチオンS- などの反応で参加と酵素の例トランスフェラーゼ (観光科学研究)、ウリジン二リン酸不明瞭 (UGTs)1。段階で酵素の分類 I または II は、しかし、堅くないし、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリに恐らく間違いなくグループ化できます。

P450 酵素 (EC 1.14.14.1)、ヘム蛋白質の変換3,4を触媒多くの化学物質の生体内変換に参加する様々 な生物の存在を含んでいます。P450 酵素触媒反応を 1 つの酸素原子を分子薬物動態、導入する中の酸素 2 原子が 2 つの電子 [式 (1 を必要とする反応によってフォーム水に還元される場所の多くの基質のヒドロキシル化)]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → 盧 + H2O + NADP+ (1)

P450 酵素 (ミクロゾーム P450 系) 哺乳類細胞の小胞体膜に局在 NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) とチトクロムb5がさらに含まれている酵素のモノオキシゲナーゼ系のメンバーであります。、NADH: チトクロームb5還元酵素と呼ばれる酵素の基板。一般に認められた理論の仮説、P450 に必要な 2 つの電子のドナーは、NADPH/POR システム。それにもかかわらず、チトクロームb5可能性がありますとしても電子のドナー チトクローム P450 のすなわち 2 還元の反応サイクルの P450 を削減電子のドナーとして NADH: チトクロームb5と共に機能する場所還元酵素の2,3,4

哺乳類利用各種 P450 酵素 (例えば家族 5、8、11、17、19、21、24、26、および 27 の酵素) ステロイド類などの貴重な内因性化合物の合成のため天然物2,3の異化作用のために使用し、.他の CYP の哺乳類酵素などヒト CYP1A2、2 9、2 19 2 6 と 3A4、代謝薬として使用される外因性の化学物質。5,6薬の代謝を触媒する最も重要な酵素は、特に CYP3A4 3A 亜科の広いです。プロ発ガン性物質などプロ-毒性、薬物動態の変換は、ヒト CYP1A1、1 a 2、1B1、2A6、2E1、3A42,5によって仲介されます。これらのアセチルトランスフェラーゼのほとんどは (CYP1A1 1B1 除く) 肝臓に存在です。それにもかかわらず、広いはいくつかの肝外臓器にも表されます。このような p450 意義は大きい、主にあるかもしれないときこれら臓器7の反応中間体を化学物質 (薬物) の生理活性代謝に彼らを参加します。各種 p450 は、これは必ずしもそうではありませんが、基板は、いくつかの化合物によって引き起こされます。

多くの P450 酵素は、毒性化学物質 (薬物) の役割を果たします。彼らは彼らの解毒代謝だけでなく、物質に変換することができますがもさらに通常彼らの毒性を引き起こす別の生物学的特性を示す内在性の高分子を変更反応性の種にそれらを有効に。DNA、脂質、タンパク質は、反応性の求電子剤と活性化学物質から生成されたラジカル調節の目標かもしれない。DNA の場合いくつかの重要な遺伝子応答とそのメカニズムを解決されている2,3,4,5

DNA の変化は細胞成長の制御の減少につながるし、この現象が支配的な要因の発がんプロセスの開発につながると見なされます。共有結合 DNA の生成付加体の化学物質の発ガン性の初期段階で最も重要な手順の 1 つを処理する8,9,10,11発がん性を持つと判断します。それを示した付加体の DNA の形成との関係、腫瘍の発生、付加体の DNA の量の減少に対し、化学予防8,9,10,11,12,13,14. 発癌物質/薬物由来の形成 DNA 付加体の DNA の塩基に依存して DNA のこれらの塩基の配列によって影響されます。付加体の DNA の修理の場所 (上転写または非転写される DNA 鎖) と修正されたヌクレオチド シーケンス8,11,12,15の型に依存しています。 16

この資料で述べる変更 DNA 代謝産物にアクティブにする彼らの力を調査するため化学物質 (薬物) の酵素触媒変換を利用した (生成する DNA 付加体)。DNA 結合テスト混合物をする必要があります通常個々 の薬物に応じて、酸化、または還元反応によってアクティブになります。テスト対象化学物質の酸化や還元活性化ミクロソームの細胞分画に存在する P450 依存性酵素システムを介したまたは還元還元ミクロソーム (POR、NADH: チトクロームb5の両方に存在還元酵素、P450 酵素)、細胞質細胞内分 (NQO1、XO、アオ、ペルオキシダーゼ)。反応性代謝物その後バインド DNA 付加体の DNA を形成します。酸化及び還元反応はこれらの反応種にいくつかの薬をアクティブにすることが重要なので酸化/還元酵素システムを用いた実験の手順を示します。さらに、検出し、これらの DNA を定量化できる適切なメソッドが付加体で詳しく説明します。

酵素システムによってテスト化学がアクティブかどうかを決定する 2 つの独立した手順は DNA 行きをお勧めします: 32p-ポストラベル法と利用した放射性標識化合物 (e.g3H または14。C)。最初はパイロット、 32p-ポストラベル試験をスクリーニングをお勧めします。ソリューションでは、正確に評価される、DNA 量の定量は、両方の方法を付ける必要があります。

32p-ポストラベル法による非放射性化学物質 (発がん性物質・医薬品) 3´-phosphodeoxynucleosides、5´-放射性リン (32P) と追加のリン酸化修飾核酸の酵素加水分解を利用してください。ああ位置、および化学 deoxynucleotide の分離通常の (非修飾) 弱まりからによる付加クロマトグラフィー17 (図 1)。ミクロコッカスヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼとして知られている混合物で化合物の化学修飾 DNA を加水分解します。(未変更の状態) 両方の法線を含む、変更デオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates [γ-32P] フォーム 5´ pH 9.5 でキャリア (非放射性) ATP と T4 ポリヌクレオチド キナーゼの存在下で ATP と反応し、加水分解 DNA の混合物32P ラベル 3´、5´ bisphosphates (図 1の「標準」プロシージャ)。使用されるアルカリ pH は T4 ポリヌクレオチドの位置 3´ でデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates dephosphorylate キナーゼの酵素活性を最小限に抑えることが可能です。分離と32の解像度から付加体 P ラベルの化学薬品によって変更されていないラベルの弱まりはポリエチレンイミン (PEI) セルロース (図 2 多陰イオン交換薄層クロマトグラフィー (TLC) によって遂行).最初と 2 番目の溶出の手順 (D1 および D2 方向) で、短い部分に電解質の水溶液を用いた TLC PEI セルロース板の最初からラベル付き通常 (非修飾) 弱まりとして [32P] リン酸を溶出します。ガスクロマト グラフ用紙 (発がん性物質/薬物-アダクト) 疎水性特性を示すバインドされた化学物質を含む弱まりはさらに解決すべき PEI セルロース プレートのスタートで維持されるに対し、TLC プレート上に適用されます。D3 と D4 の方向 (図 2) でいくつか異なる溶媒システム。付加体の局在強化画面オートラジオグラフィー; を使用して実行されます付加体の分離された x 線フィルムの認識可能な黒ずみとして検出されます。スポットのエリアはプレートから摘出した、液体シンチレーションまたはカウント チェレンコフによって放射能を定量化する使用されます。クロマト グラム検出された付加体のイメージング法のマップし、DNA の定量化に適応されているストレージりん32p-ポストラベル試験が今も使用されます。18インスタント イメージャ マシンは頻繁にそのような検出のため、付加体の DNA の定量化。このメソッドでは、画面の技術強化オートラジオグラフィー19よりも32P を検出するための 10 倍以上の感度を提供します。

量の DNA 付加体の付加物の相対値分類 (RAL) の方程式 (2) を使用して次のように計算、定め。

インプレッション。弱まりを付加します。
RAL =---(2)
32P ATP の特定活動 (cpm で/pmol) x pmol 弱まり

RALs の値が内転の弱まりのカウント レートの比 [内転と通常 (非修飾) 弱まり] の合計カウント率弱まり20,21。ただし、この計算は平等に基づいて付加体の効率のラベリングと通常弱まり2232p-ポストラベル法の古典的な (「標準」) プロシージャは適切様々 な DNA 付加体 (および/または非かさばるかさばる付加) しかし、その感度は満足のいく付加体の dna の少量を検出しますします。この手順を使用して、DNA (0.3 fmol 付加/μ g DNA) の 10 の7そのまま弱まりで抱合体の生成量は検出します。

この古典的な32p-ポストラベルのプロシージャの変更の様々 な技術の感度を高めるため利用されています。32で付加体の定量の 10-100 倍高感度まで P ラベルは [γ-32P] ATP (強化のプロシージャ) の制限レベルを使用して達成されています。23,24 32p-ポストラベル法の感度の増加を利用して DNA を含む消化の潜伏を提供するそれ以上のプロシージャ付加ヌクレアーゼ P1 (活性) から21 (図 1)。この酵素は、バインドされた化学物質 (内転のヌクレオチド) と弱まり、本質的にないこの酵素の基板に対し未修正デオキシリボヌクレオシド 3´-monophosphates、dephosphorylate を好みます。したがって、脱燐酸化されたデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates (すなわちdeoxyribonucleosides) がない γ-32P から [32P] リン酸塩による T4 ポリヌクレオチド キナーゼによるリン酸化] ATP。しかし、いくつかの化学物質が、ヌクレオチドのバインド (内転弱まり)、デオキシグアノシン、この酵素によってすることができます bedephosphorylated の C8 で置換アリールが付加体のよう。対照的に、他のほとんどは付加体 (例えば、付加体のデオキシグアノシンのN2を代入) ヌクレアーゼ P1 でない脱燐酸化します。32p-ポストラベルのこの変更によりこのメソッドのかなり敏感、以上 3 つの一桁によってその感度を増加します。32p-ポストラベルのこのバージョンがメソッドを提供しますが、さらに DNA (5-10 μ g)、キャリア フリーの過剰量 [γ- 32P] ATP を利用することができます。

豊かにする別の方法、付加体、グプタ25によって記述されている、物理化学的性質を利用してかさばる deoxynucleotide のプロパティが付加体、 nに何を抽出することがでく-相転送エージェント テトラブチル アンモニウム存在下でブタノール[32P] リン酸ラベリング、未変更の弱まりがこの有機溶媒によって抽出される悪いに対し前に塩化 (未定) (図 1)。しかし、少ない疎水性付加で構成される残基、非芳香族扱いにくい部分や小さなアルキルと変更された弱まりの例効果的に抽出されませんn-ブタノール。したがって、彼らは32p-ポストラベル法のこの変更によって分析されるとき本質的に検出されません。

109,10通常当たり、前述の両方のバージョン32p-ポストラベル増加感度と DNA の定量化は非常に (3 桁) 最大付加体、1 つを検出できること付加物ヌクレオチド (0.3 - 3 amol/μ g DNA)。自明で DNA を効率性の化学薬品をテストのこれらの 2 つの方法が推奨され、したがって、彼らは詳細にこの作品のとおり。

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Protocol

ケアと使用の実験動物 (311/1997 年、農業省チェコ共和国)、ヘルシンキ宣言に準拠しているため規則に従ってすべての動物実験を行った。

1. 肝ミクロゾームとゾル性細胞質分画の分離

  1. シンプルな差動遠心分離 (105,000 x g) ラット肝細胞下分画 (ミクロゾーム P450 酵素や還元酵素または可溶性のペルオキシダーゼが豊富なサイトゾルで豊富な) を準備します。
    注: ペレットと清が撮影ミクロソームとサイトゾル、それぞれ。
    1. PH 7.4 150 mM KCl のバッファー (バッファー 1) を含む 50 mM トリス塩酸バッファーで 2 回肝臓サンプル (1-10 g) を洗う (組織、すなわちの体重よりも 10 倍高いボリューム 10 100 mL)、組織を小さな断片に切断し、(の 2 x 2 mm サイズの周り)。
    2. このバッファーの存在下で組織をホモジナイズしてください (> 3 容積/重量 mL/g) 5 分と廃棄のための 4 ° C でホモジナイザのろ過を使用して組織の残りの非均質化部分のフィルター ペーパーを。4 ° C で 10 分間 600 x gでホモジネートを遠心分離し、上澄みを別の遠心分離管に転送します。
    3. バッファー 1 (組織 1 g 当たり 1 mL) にペレットを再均質、1.1.3 の手順を繰り返します。、ペレットを破棄します。遠心分離機の 4 ° C で 20 分間 15,000 × gでプールされた清上清を別の遠心分離管に転送します。
    4. 4 ° C で 60 分 105,000 x gで上清を遠心分離します。上清 (細胞質) を収集して因数 (1-10 mL)-80 ° C で保存します。ブラッドフォード26で説明したメソッドを使用して蛋白質の量の細胞質を特徴付けます。
    5. 100 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.4 でペレットを再停止 (> 2 容積/重量 mL/g)、105,000 x gで 4 ° C で 60 分間遠心上清を捨てます。50 mM トリス塩酸バッファー、pH 7.4 150 mM KCl と 20% グリセロールを含む再ペレット (ミクロゾーム) を均質化 (< 5 容積/重量 mL/g) で 4 ° C でホモジナイザーミクロソームを 0.5 - 1 mL 因数-80 ° C で保存します。ブラッドフォード26で説明したメソッドを使用して蛋白質のコンテンツのミクロソームを特徴付けます。
    6. ミクロゾームのチトクローム P450 の濃度を決定します。
      注: 大村と佐藤27一酸化炭素 (CO) の還元 P450 の複合体の吸収の決定のとおり、ミクロゾーム P450 酵素の濃度、測定します。一酸化炭素は毒性化合物は、ケアとフードで処理します。

2. 孵化酵素システムの存在下で dna テストの化学物質 (発ガン性物質/薬) の

  1. テストの化学物質 (発ガン性物質/薬) DNA のチトクローム P450 酸化酵素系の存在下での孵化
    1. インキュベーション混合物含む、4 ° C で 0.75 mL の最終巻、次の化合物および酵素システムを準備します。
      1. ミックス 10 mM NADPH または NADPH 生成システム (10 mM MgCl2, 10 mM D-グルコース 6-リン酸、10 mM NADP+、1 U/mL D-グルコース 6-リン酸脱水素酵素) と 100 mM リン酸緩衝、pH 7.4、(0.375 mL) (75 μ L)。
      2. この混合物のミクロソームに追加または純粋な組換え昆虫細胞から分離されたミクロソームである Supersomes P450 発現組み換え P450 酵素、50 μ L のミクロゾームの supersomal 50 pmol P450 酵素の cDNA を含むバキュロ ウイルス構築-実験室でまたは商業ソースから分離された肝ミクロソーム画分の調製品
      3. 1 mg 子牛の胸腺 DNA (原液 - 3.3 mg/mL の蒸留水での 0.3 mL) を追加し、5 の渦シェーカーを振る s。
      4. 最後に、追加 7.5 μ L 0.1 mM テスト エリプチシン薬 DMSO と 42.5 μ L に溶解した蒸留水 0.75 mL の培養混合物の量に達する。使用化学物質の付いた3H や14C や DNA の検出手順に応じて、ラベルのない化学物質の付加します。
      5. 30-60 分の 37 ° C で開かれた管内 5 s. 加温の渦シェーカーを振る。
      6. また活性化システム (ミクロゾーム サンプル) または (ii) それと、なく化合物のテストなし (i) が、同様に、2 つのコントロールの孵化を準備します。
  2. 還元酵素システムの存在下で dna テスト物質 (発ガン性物質/薬) の孵化
    1. インキュベーション混合物含む、4 ° C で 0.75 mL の最終巻、次の化合物および酵素システムを準備します。
      1. 4 ° C でミックス 100 mM トリス塩酸バッファー、pH 7.4 0.2% を含むトゥイーン 20、(0.375 mL) NQO1 還元酵素 (NADPH) の補酵素の 10 ミリメートルのソリューション (75 μ L)、細胞質画分 (肝細胞質画分の分離実験室でまたは、細胞質を用いた場合画分タンパク質 1 mg (50 μ L) を含む商業ソースから取得された個々 の人間のドナーから分離された)。
      2. 1 mg の子牛の胸腺 DNA (原液 - 3.3 mg/mL の蒸留水 0.2 mL) を追加し、5 のシェーカーを振る s。
      3. 最後に、7.5 μ L 0.1 mM 化学物質 (化合物の溶解度に応じて蒸留水、メタノール、エタノールまたは、DMSO に溶解) とインキュベーションの混合物の 0.75 mL の量に達する 42.5 μ L 蒸留水を追加します。使用化学物質の付いた3H や14C や DNA の検出手順に応じて、ラベルのない化学物質の付加 (下記参照)。
      4. アルゴン 1分間 30-60 分の 37 ° C で閉じた管内 5 s. 加温のシェーカーでシェイクに反応混合物をパージします。
      5. また活性化システム (細胞質画分) または (ii)、それとなくテスト化学薬品なし (i) が、同様に、2 つのコントロールの孵化を準備します。
  3. 潜伏テストの化学物質の過剰を削除する有機溶剤の混合物の抽出
    1. これらの溶媒を追加することにより酢酸エチルまたはジエチル エーテル (ヘキサン) の同じボリュームにキャップと試験管内培養混合物を混ぜます。エマルジョン形までシェーカーで管の内容を振る。
    2. 常温遠心分離機で 1,600 x gで (3 分) を回転します。水相が正しく分離された場合、はスピン 1 回以上の長い期間または遠心分離速度。
    3. ピペットで集める上、有機相を削除します。場合少量 (< 400 μ L)、適切な先端装備自動ピペットを活用を使用する。この有機相を捨てます。
    4. 2.3.1 の手順を繰り返します。、2.3.2。、2.3.3 と。窒素ガスの流れによって残留有機溶剤を削除 (取り外しの少なくとも 5 ~ 10 分が必要)。
  4. 孵化からの DNA の隔離
    1. フェノール/クロロホルム ソリューションおよびエタノールの沈殿物からの DNA の抽出
      1. フェノール、フェノール/クロロホルム (1:1)、DNA の溶液からタンパク質を抽出して培養混合物から DNA を分離し、次に示す手順によってクロロホルム タンパク質を排除します。
      2. フェノール又はフェノール/クロロホルム (1:1) 鷹のエッペン チューブ キャップと同じ量とインキュベーションの混合物を組み合わせます。エマルジョン形まで混合物をかき混ぜます。
      3. 常温遠心分離機で 1,600 x gで (3 分) を回転します。水相が正しく区切られていませんが長い期間、または遠心分離に高い速度でもう一度スピンします。
      4. 新しいポリプロピレン管にピペットの上部水相を転送します。場合少量 (< 400 μ L)、適切な先端装備自動ピペットを活用を使用する。有機相と共にタンパク質インターフェイスを削除します。
      5. フェノールおよびクロロホルム (1:1) の混合物の同じ量と上層の水相を組み合わせます。2.4.1.2 の手順を再現します。-2.4.1.4。
      6. 同じ量のクロロホルムと手順 2.4.1.2 と上層の水相を組み合わせます。-2.4.1.4。風邪 (-20 ° C) エタノールの 2 つの容積と沈殿物によって DNA を回復します。DNA 溶液の量を決定します。
      7. 最後の 5 M 塩化ナトリウムの添加により 1 価の陽イオンの濃度を合わせる 0.1 M の濃度は積極的にかき混ぜます。風邪 (-20 ° C) エタノールの 2 つの容積と組み合わせるし、正しくミックスします。-20° Cに冷却します。
      8. DNA を沈殿するまで-20 ° C で保存します。浮遊中に DNA が断片化されているとき (e.g、酵素的活性化反応における酸素ラジカルの生成によって) または小さい DNA のサイズ分離のプロシージャの間に (< 1 kb) または DNA が少量であるとき (< 0.1 mg/。mL)、冷却の時間が増加して、-70 ° c. に温度が低下しました。
      9. 1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。DNA が小さな断片の形式、または低濃度で存在する場合は、長い期間 (30 分) もう一度スピンします。上清を捨てます。
      10. 存在可能性もある溶質 (や化学のテストの残留痕跡) を削除するには、DNA、70% エタノールとジエチル エーテル洗浄 DNA を沈殿させた。洗浄は、寒さ (-20 ° C) で DNA を沈殿 70% エタノール。1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。上清を捨てます。
      11. 2.4.1.10 の手順を繰り返します。洗浄は、寒さ (-20 ° C) で DNA を沈殿 70% エタノール。1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。上清を捨てます。
      12. 2.4.1.10 の手順を繰り返します。残留の上清を除去する吸収紙の上、垂直状態に管を置きます。DNA の分離から化学の試験の潜在的な残基を破棄するジエチル エーテル 1 mL を追加することによって DNA の餌を洗います。1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。上清を捨てます。
      13. 適切な量の DNA ペレットを溶解 (0.5 - DNA 濃度を達成するために 100-400 μ L で通常 1 μ g/μ L) 蒸留水 (または 0.15 mM 1.5 mM のクエン酸ナトリウム塩化ナトリウム)。DNA ソリューションは、一晩、4 ° C で立つことができるまたは DNA を溶解させる 10-30 分の 37 ° C に加熱することができます。
      14. ストレージ、前に DNA 溶液の濃度を付加物の減少の結果可能性があります凍結融解が繰り返されたために、DNA を小さい因数 (10-20 μ L) に分けます。ストア-80 ° c またはより冷たい。
        注: DNA の吸光光度定量: シンプルで正確なメソッド、サンプルは、純粋な場合準備の DNA 量を測定するために広く用いられている (すなわちタンパク質、フェノール、その他などの汚染物質の大量なし核酸)、(前に説明した手順を参照してください) 拠点によって吸収される DNA の紫外線照射量の吸光光度測定は、28
  5. 付加体形成を DNA の検出のための手順
    1. 32P-ポストラベル試験
      注: 加水分解 DNA 付加体の解析 (2.5.1) のと同様、通常の (非修飾) 弱まり (2.5.7) のこの段階で準備加水分解物を利用しています。
      1. ~ 450 単位 (U) の濃度で水にミクロコッカスヌクレアーゼ (MN) を溶解/mL。蒸留水に対して dialyze、300 U/mL に調整します。Dialyze 脾臓ホスホジエステラーゼ (SPD) ソリューション、4 U/mL に調整します。
      2. 最終濃度 150 mU/μ L MN と 2.5 mU/μ L SPD (MN/SPD ソリューション) にミネソタおよび SPD をミックスします。12.5 μ g を含む DNA 溶液を取るし、蒸発器内減圧乾固します。6.5 μ L 蒸留水に溶解します。
      3. 5.0 μ L MN/SPD ソリューションを追加 (ミネソタの最終濃度は 60 mU/μ L、SPD の最終濃度が 1 mU/μ L) と 1.0 μ L 消化バッファー (コハク酸ナトリウムの最終濃度は 20 mM、CaCl2の最終濃度が 8 mM)。混合物の最終巻は、12.5 μ L. ミックスし、37 ° C で 3 時間反応
      4. さらに希釈と未変更の弱まり (2.5.7) の分析のための 2.5 μ L (別の管への転送) を削除します。
    2. ヌクレアーゼ P1 濃縮
      1. 加水分解物の残りの 10.0 μ L を追加 0.65 μ L ナトリウム酢酸バッファー (最終濃度、40 mM)、0.65 μ L ZnCl2ソリューション (最終濃度 0.1 mM)、1.25 μ L NP1 ソリューション (最終濃度、0.385 μ g/μ L)、および 0.45 μ L 蒸留水します。混合物の最終巻は 13 μ L です。
      2. 37 ° C で 30 分間反応混合物を許可し、トリス溶液 3 μ l を添加した反応を終了します。
    3. n-ブタノール濃縮
      1. DNA の加水分解物の残りの 10.0 μ L、11.6 mM, ギ酸アンモニウム溶液、pH 3.5、および 25 μ L 10 mM 未定塩化物溶液の 215 μ L を追加します。250 μ L n抽出-積極的な混合によるブタノール (水で飽和)。別々 の画層とnの上の離陸に 1,600 x gで (3 分) のスピン-ブタノール層。250 μ nともう一度抽出-ブタノール (水で飽和)、スピン、上のnを取る-ブタノール層、および元のエキスと組み合わせる。
      2. 400 μ L の水を追加 ( nで飽和-ブタノール) これに抽出、および積極的にミックスします。スピンは、別々 のレイヤーと下の水層を削除します。水の 400 μ L を使用してこの洗浄手順を繰り返します ( nで飽和-ブタノール)。Nに 250 mm トリス塩酸溶液、pH 9.5 3 μ L を追加-ブタノール層。Nを蒸発させる-ブタノール常温蒸発器内の乾燥に。
      3. 100 μ L n残余を分解-ブタノール、再度、乾燥に蒸発し、16.0 μ L の水に溶解します。
    4. ラベリング、アダクト
      1. ビシン緩衝液 (ラベリング バッファー) の 1 μ L と 100 µCi [γ-32P] ATP、冷たい atp 45 pmol、10.0 を含むミックスの 4.5 μ L を追加 U の T4-PNK (T4 phosphonucleotide キナーゼ) 16.0 μ L 溶液に NP1 またはブタノール濃縮ミックスから。試薬の最終濃度は次のようになります: 20 mM ビシン、10 mM MgCl2や 10 mM dithiotreitol、0.5 mM スペルミジン 0.5 U/μ L T4-PNK、3 μ M の ATP。混合物の合計量は 20 μ L です。
      2. 室温で 30 分間反応混合物を許可します。全体のサンプルを適用 (すなわち。 20 μ l) PEI セルロース TLC プレート (2.5.6。)。
    5. NP1 またはnの効果の評価-ブタノールの手順を強化
      1. 50 μ L の水で管の底を洗います。30 s とスピン (1 分) 1,600 × gで遠心分離機には積極的に存在を確立するミックスには、蓋の上の汚染はありません。PEI セルロース TLC プレート (20 × 20 cm) に 5 μ L をスポットします。(NH4)2で 280 mM のソリューションを使用してガスクロマト グラフ4と 50 mM の NaH2PO4、pH 6.8。
    6. 内転の弱まりの TLC 分離
      1. 蒸留水に TLC の版を前洗い。特に自家製の板のことをお勧めします。
        注: この洗浄実施されなければならない板、特に溶媒フロント、バック グラウンドに昇格させる色から黄色の色を削除します。
      2. PEI セルロース TLC プレート上に全体のサンプルをスポットし、クロマトグラフィーを開始 (2.5.4);。付加体のクリーンアップが D1 と D2 の方向 (図 2) でプレートを開発することによって実行されます。
      3. D1 方向 (図 2) でプレートを開発します。1.7 M ナトリウム リン酸バッファーを使用、DNA が付加体確保するため pH 6.8, TLC プレートの開始時に残っています。同様にこのバッファーを使用して D2 方向に板を開発します。プロシージャの可能なバッファーについては、いくつかの種類の解像度の説明を参照してくださいソリューション付加体の20,28
        注: D2 方向板の開発を省略できます。
      4. 脱イオン水で 2 つの連続したバスで約 5 分のためのクロマトグラフィーの後、洗浄します。その後、プレートを乾燥します。
      5. 3.5 M リチウム ギ酸バッファー、pH 3.5 を使用して D3 および D4 の方向に板を開発、D3 方向に 8.5 M 尿素と 0.5 を含む M トリス塩酸バッファー、pH 8.0、D4 方向 (図 2) のための 0.8 M LiCl と 8.5 M 尿素を含みます。溶剤を調整して、TLC プレート上付加スポットを開発する必要があります。D3 と D4 の開発手順の可能なバッファーの詳細については、ソリューションのいくつかの種類の解像度は23,24,25,28付加体で説明を参照してください。
      6. D4 方向と水洗浄の開発後、D4 の問題を避けるため、1.7 M リン酸ナトリウム、pH 6.0 (通常は D5 の方向で開発として割り当て)、紙芯 (12 x 11.5 cm) の上に (D4) に沿って板を開発します。
        注: D5 方向を省略もできます。この場合、溶媒は、TLC の上部に達したときに TLC タンクを開き、最大 60 分のために実行を許可必要です。このメソッドは芯 (D4 の任意の問題を削除する多くの実験室で頻繁に使用法) を追加するよりも。
    7. 加水分解後通常の (非修飾) 弱まりの定量化
      1. 加水分解物の因数を希釈 (から2.5.1。 DNA の加水分解を記述する)、蒸留水 (すなわち。、2.5 μ l から消化の混合物の2.5.1。 250 μ l に調整、150 μ l に 10 μ l このソリューションの調整)。
      2. このダイジェストの分注 5 μ L (10 pmol 通常弱まり) を取る、2.5 μ L 10 mM トリス塩酸バッファー、pH 9.0 では、およびようにラベル追加2.5.4 。(混合物の最終巻は 10 μ L である) です。室温で 30 分間反応できるようにします。
      3. 混合物の分注 4 μ L を取り、10 mM トリス-HCl、pH 9.0 750 μ L に希釈します。ミックスとスピンは蓋の汚染がないことを確立します。PEI セルロース TLC プレートに 5 μ L を適用します。だから 280 mM (NH4)2の溶液に TLC プレートを開発4と 50 mM の NaH2PO4、pH 6.5。TLC 後乾燥することができます。
      4. 4 そのまま deoxynucleotide ビス リン酸塩をローカライズする周囲温度の約 45 分の実行は放射線写真法を使用します。液体シンチレーションやチェレンコフ計数による定量化のためのスポットをカットします。
    8. 親戚の計算は、ラベリング (RAL) 付加物します。
      1. 付加点の数とラベルの変更されていない (通常の) 弱まりの因数の数の値を決定します。
        注: 後者は少ない前者、未変更の (通常) 弱まり付加レベルの RAL 値を評価するための数に適用する変換係数は図より材料 180,000 カウントに覚悟しなければなりません。RAL の DNA 付加体の上記 (2) の式に従って計算されます。
    9. テストの発ガン性物質や dna 標識放射性薬剤を使用して薬物の結合の検出
      1. 3H や14C 液体シンチレーション カウンターによる化学修飾 DNA の放射能を評価します。
      2. シンチレーション バイアルにシンチレーション溶液 3 mL に DNA 溶液の 10-50 μ L を追加します。よく混ぜます。シンチレーション カウンターを使って放射能を測定します。

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Representative Results

中間体の共有結合の結果に代謝される化学物質 (発ガン性物質/薬) の効力を調査する (すなわちP450、ペルオキシダーゼ、還元酵素) の活性化酵素触媒の利用のためにはここで説明したプロトコルを使用してください。DNA に結合 (世代の DNA 付加物)、(i) (ため検討を見る、29,30,31)、抗悪性腫瘍剤エリプチシンの薬理作用の新規のメカニズムを解決することができました (ii) 2 つの病因植物 (のレビューを参照してください、32,33,34、アリストロキア酸をアルカロイド (アリストロキア酸腎とバルカン流行性腎症) による上部尿路管癌に関連付けられている nephropathies 35,36,37,38,39)、および (iii)、遺伝毒性メカニズムなど、大気汚染物質 3-いくつかの発がん物質の発がん性のニトロベンズアントロン (3-NBA)40,41,42,43,44,45とその還元版 3 大気 (3-ABA)、46 ,47,48植物アルカロイド アリストロキア酸、32,33,34,35,36,37,38,39 . 芳香族アミンのo- アニシジン49,50,51,52さらに、これらの化学物質の生物学的効果を決定する酵素を求めた記述手法します。

ここでは、代表の p450 によってエリプチシンの酸化的活性化の結果し、ペルオキシダーゼの共有結合の生成で生じる付加では、DNA と共有結合 DNA を変更、表示される代謝物 3-NBA の低減に関する。

植物アルカロイドのエリプチシン (5,11-ジメチル-6Hピリド [4, 3 -b] カルバゾール) とその誘導体は、抗腫瘍、細胞周期の停止との誘導に含まれているいくつかのメカニズムを介して DNA 損傷薬として機能します。(概要についてを参照してください29,30,31) のアポトーシス。抗癌性の薬剤が共有結合 DNA を生成することを行ったこの作品で説明されているプロトコルを使用して、付加体の触媒ミクロゾーム p450 による代謝活性化後 (図 3) とペルオキシダーゼ (図 4)29,30,31,53,54,55,56,57,58,59,60,61, この癌細胞30に対して本剤の強力な効率を説明します。[3H]-radiolabeled エリプチシンと32p-ポストラベル法ヌクレアーゼ P1 バージョンは主に研究29,30,31,53 に使われました。 ,61。細胞内酵素システム、酵素阻害剤、記述されていたプロトコル、優勢な P450 酵素活性種の DNA を形成する酸化エリプチシンに対する付加体との構造を用いた実験で純粋な酵素の複雑な研究を使用してください。これらの反応種が特徴付けられる29,30,31,55。検討した p450、ヒトの CYP3A4 酵素はエリプチシンに対する酸化エリプチシン 12 ylium とエリプチシン 13 ylium に自発的に分解するエリプチシンに対する代謝物、13 hydroxyellipticine 12 hydroxyellipticine で最も効率的ですDNA に結合する (図 5)。55,61 CYP 酵素生成も 9-hydroxyellipticine、解毒代謝物、7 hydroxyellipticine、エリプチシンN2であるなど更なる代謝産物-未成年者として形作られる酸化物エリプチシンに対する代謝物。9 hydroxyellipticine、7 hydroxyellipticine、エリプチシンN2-酸化物が主にそれぞれ CYP1A1 と CYP2D6、によって形成されます。55,57,58

ペルオキシダーゼ (すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)、ラクトペルオキシダーゼ (LPO)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、シクロオキシゲナーゼ (コックス 1 およびコックス 2)) 同じを生成するエリプチシンに対する代謝エリプチシンに対する DNA 付加体 (図 4)61図 5に示す機構。

Nitroaromatic 3 NBA (3-ニトロ-7H-ベンツ・ デ ・温-7-1) ディーゼル排気のコンポーネントであり、浮遊粒子状物質62,63,64であります。この汚染物質 3-ABA、64,65の主要代謝物は、長い間63ディーゼル排出量にさらされた塩の鉱山の労働者の尿で検出されました。この発見は、これらの労働者が 3 NBA にさらされたことを示した。この nitroaromatic は、気管内投与67後ラットの肺腫瘍を引き起こします。3 NBA はこのひずみ62ナノモルあたり以上 600 万タンパク質を生成する (でニトロとOを過剰発現株 YG1024 - アセチルトランスフェラーゼ) エイムスサルモネラテストの変異原としても機能します。遺伝毒性、その効力も示した生成による共有結合付加体の DNAの生体外で活性化した後この作業、および生体内で齧歯動物の動物 (図 6 の複数の器官に記載されているプロトコルを使用して、いくつかの酵素によって)39,40,41,42,43,44,45,46,47 64,,6768

3-NBA 由来 DNA 付加体のヌクレアーゼ P1 とn3 NBA のアクティブ化 (すなわちNQO1) ゾル性細胞質の還元を行った後に形成-ブタノール濃縮法32p-ポストラベル法プロトコルで説明本研究で提示されます。示唆された、5 つまで DNA 付加体生成 (図 7にスポット 1-5 付加体) とそれらの 3 つは 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl) 3 大気に特徴付けられた (Nダ -6-C2-ABA; 付加物スポット 1)、 N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl) 3 大気 (dG -N2-C2-ABA; スポット 3 を付加体) とN-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8 -N-ABA; スポットを付加物 4。・ 5) (図 7 図 8)。32p-ポストラベル法、dG のヌクレアーゼ P1 バージョンを活用-C8 -N-ABA (4 と 5 の点を付加体) は検出できない (図 7 図 8)。32p-ポストラベルのこのバージョンのいくつかの制限が発生する、すなわちこの結果下線、内転の弱まりの (もしあれば) 低検出ヌクレアーゼ P1 によって脱燐酸化 (すなわち、付加体中に形成されます。N- hydroxyarylamine 誘導体デオキシグアノシンの C8 で置換芳香族 nitroderivatives の低減、アリールアミン類の酸化)。エリプチシンに対する研究と同様に、細胞内酵素システム、酵素阻害剤、純粋な酵素、DNA との複雑な研究を活用した付加体優勢この作業で説明されているプロトコルを用いた実験で標準細胞3 NBA によって生成された還元酵素代謝物 3-NBA を代謝生成する DNA 付加体、すなわち、3 NBA (N- オハイオ州-ABA) の減少によって形成される反応性代謝物・付加体の 3 つの DNA の構造だった (図 7の特徴図 8)。肝臓、体外3 NBA の生理活性と NQO1 のラットを人間に主に起因することが判明した (図 7)、人間N中、O- コリンアセチルトランスフェラーゼ (Nat) NAT2、NAT1、硫酸転移酵素 (破損) SULT1A1 へと、少ない程度に、SULT1A2 は、フェーズ II 3 NBA42のアクティブ化の支配的な酵素です。肝ミクロゾーム POR 3 NBA の41の活性化に効果的ですが、3 NBA は、マウス、このミクロソーム POR42よりもむしろ NQO1 によって主に bioactivated。3 NBA 発がん性67の標的臓器である肺 NQO1 と XO 生成する DNA 付加体の代謝物 3-NBA を減らします。しかし、XO は、このオルガン69のマイナー 3 NBA の活性化酵素として機能するようです。

Figure 1
図 1:32 p-ポストラベル試験法 32p-ポストラベル法とその拡張プロシージャの個々 のステップが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: DNA のパターン付加 PEI セルロース TLC プレートに溶出します。PEI セルロースに対する付加体の DNA の多方向による薄層クロマトグラフィーのプレートが表示されます。起源は PEI セルロース TLC プレート上の開始位置です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:32 p-ポストラベル解析 DNA アダクト エリプチシン、NADPH とラット (A) (B) ひと肝ミクロソームと培養子牛の胸腺 DNA の形成、(C) コントロール サンプル ミクロソームなし。付加体 1 と 2 の矢印によって割り当てられたは、DNA 中のデオキシグアノシンのエリプチシン ミクロソームで活性化によって生成されます。32ヌクレアーゼ P1 バージョンのメソッド (手順 2.5.2。) を採用し実行された p-ポストラベル下の左隅に起源がある (下から上部と右に左から D4 を D3)。D2 は省略されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:32 p-ポストラベル解析エリプチシンを介した DNA 付加体します。Adducts 子牛の胸腺 DNA のエリプチシン (100 μ M) と西洋ワサビペルオキシダーゼ (A) 反応で形成される人間のシクロオキシゲナーゼ 2 (羊シクロオキシゲナーゼ 1 (D)、人間ミエロペルオキシダーゼ (C) 牛ラクトペルオキシダーゼ (B)E) (5 μ g ペルオキシダーゼ、孵化に存在していた)、肝臓のエリプチシンに対するヒト CYP3A4 と子牛の胸腺 DNA からキログラムの体重 (bw) (F) あたり 40 mg のエリプチシンに対する投与ラットの DNA が反応したから (G) 13-hydroxyellipticine(H), エリプチシンN2-酸化物 ()、および 12-hydroxyelipticine (J)。試金 (ステップ 2.5.2。) のヌクレアーゼ P1 バージョンを使用して実験を行った原点は、下の左隅 (上部と右に左から D4 に下から D3)。D2 は省略されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ペルオキシダーゼによってエリプチシンの酸化とアセチルトランスフェラーゼ エリプチシンに対する代謝物とそれらを示す示唆付加体の DNA を生成する。かっこで化合物がないまだされて、実験で使用される実験条件下で検出、求電子的代謝物究極種 DNA に結合すると考えられています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 3-ニトロベンズアントロンによる付加体形成の代謝的活性化や DNA 。3-NBA 3-ニトロベンズアントロン;NQO1、NAD (P) h: キノン酸化還元酵素;NAT、 NO- コリンアセチルトランスフェラーゼ;諮り、硫酸転移酵素;CYP、チトクローム P450;ポー、NADPH: チトクローム P450 の還元酵素;HRP、西洋わさびの過酸化酵素;LPO、ラクトペルオキシダーゼ;MPO、ミエロペルオキシダーゼ;コックス 1、シクロオキシゲナーゼ 1。R = - コッホ城3または荘3H;ダ -N6ABA - 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl) 3-大気;dG -N2-ABA、 N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-大気;dG-C8 -N-ABA、 N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7:32 p-ポストラベル解析 3-NBA 由来 DNA の付加します。ヌクレアーゼ P1 - (左のパネル)、 n-メソッドのブタノール抽出バージョン (右側のパネル) が活かされています。A b、付加体で形成された子牛の胸腺 DNA は活性化ラット肝サイトゾルと後 3 NBA (300 μ M) と反応します。Bb B子牛の胸腺 DNA、人間の肝細胞質 (プールされた分数) で活性化した後 3 NBA (300 μ M) との反応で形成されました。C のb C子牛の胸腺 DNA、純粋なラット肝で活性化後 3 NBA (300 μ M) との反応で形成された NQO1 (0.09 単位)。DDb子牛の胸腺 DNA、人間の組換え NQO1 の活性化後 3 NBA (30 μ M) との反応で形成された (0.06 台)。E Eb、付加体で形成されたサケ精巣 DNA 処理Nの-オハイオ州によって。FFb、アダクトの形成された肝 kg マリンスイーツあたり 3 NBA の 2 mg にさらされる C57BL/6 背景に野生型同腹子の DNAこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8:32 p-ポストラベル解析 3-NBA 由来 DNA の付加基準 [dG -N2-C2-ABA (A)、Nダ -6-C2-ABA (B) と dG-N-ABA C8-(C)] (パネルを) 3 NBA とこれら 3 NBA DNA の構造の付加 (とパネル b)。 N-ブタノール抽出バージョンのメソッドを用いている (パネルで、)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

この論文では付加体の共有結合 DNA の生成で生じる代謝の中間体に bioactivated をする化学物質の効能を研究する広くアクセス可能な方法論を示した。これは重要な問題です、付加体の環境化学物質の効力または共有結合 DNA を生成する代謝産物への酵素的活性化の薬の評価ために、がんとその治療法の開発に重要なフィールドは。腫瘍の開発の原因と考えられる発ガン性物質による DNA の変更は今発ガン性物質による発がんのセントラル ドグマとして判断されます。この提案は様々 な現象などの所見によって確認される: 様々 な発ガン性物質の発ガン性 (i) プロパティ反応求核 DNA センター代謝物にこれらの化合物の生理活性に依存(ii) DNA のレベルは頻繁に付加体多くの発癌性反応に対応(iii) およびある特定の腫瘍のサプレッサー遺伝子のプロトオンコジーンのいくつかの活性化突然変異は、発がん性のポーテンシーと化学物質とその修正によって引き起こされるかもしれない。さらに、抗がん剤によって DNA の共有結合修飾は、最も効率的な DNA 損傷の影響これらの薬がん治療での使用結果の 1 つとして実証されています。

特に、遺伝毒性プロパティ、すなわち共有結合 DNA を形成する彼らのポーテンシーが付加体の化学物質の正常な評価を決定する 2 つの重要なポイントがある: (i) 見つけるために、解決、および酵素の効率を特徴付ける求電子種結合 DNA の開発し、発がん性物質・薬物-DNA 付加体の最も適当な方法を使用する (ii) 求核センターがあるし、その構造を特徴とする発ガン性物質/薬をアクティブにすることができるシステム。本研究では、両方の機能のための適切な方法を説明します。

体内酵素 (ミクロソームあるいは細胞質サンプル p450 と追加 bioactivating は、すなわち酵素ペルオキシダーゼやポー、NQO1、XO、AO は還元酵素を有する)、細胞分画の分離のプロシージャのためのプロトコル発ガン性物質/酵素システム (DNA で孵化) とその使用方法は、代表的な結果によって示されるように示され、この仕事に示す化学物質の遺伝毒性の特性の評価のための適合性によって薬の活性化。

さらに、メソッドの検出と定量化のため適切な付加32p-ポストラベル法 (ヌクレアーゼ P1 ・ nブタノール抽出手順) の 2 つの濃縮バージョンなどの使用 DNA放射能標識テスト化合物は発がん性物質・医薬品の化学物質の遺伝毒性を評価する試験のために適切に示されていた。

付加体の共有結合 DNA の決定に関する、付加体の DNA の検出と測定に適した他の方法では、これらの 2 つの方法だけでなく、確立された8,70,71,72 をされています。 ,,7374,75,76,77,78,79,80,81,82。 1981 年まで DNA の定量化付加利用放射性化学物質 (発ガン性物質/薬)、 3H や14C でラベル付けされた総合的に用意されています。この作品で説明されているように、エリプチシンに対する研究のようなメソッドを有効利用されている (,5354を参照してください)。それにもかかわらず、通常の成功使用73,80,81の高放射能の誘導体を準備することは困難です。したがって、にもかかわらず、まだこの手順を使用すると、残念ながら生体外で実験はここで説明したような制限です。その他の技術、質量分析法、電子スプレー イオン化 (ESI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)、加速器質量分析法 (AMS),蛍光免疫測定法、 32などの生物学的方法開発された p-ポストラベルこの研究では、詳細に説明されている (レビュー、816,70,71,72,73,を参照してください。74,75,76,77,78,79,80,,8182)。

この作品のプロトコルに記載されている32p-ポストラベル試験が表示されているだけでなく体外実験の適用性を持つ (テスト参照してください代表結果)、すなわち、新規化合物の遺伝毒性または機械的発がん性物質・医薬品活性化の調査はまたさらに使用率環境発癌物質への曝露の評価など内因性による損傷の DNA を調べること、DNA の修復を監視、腫瘍の開発の機構に関する研究化合物や酸化反応、調査への応答の患者の細胞毒性抗がん剤薬72,83

このテクニックには、しかし、いくつかの制限の73 です。これは monodeoxynucleotides として安定した DNA では、病変を確実に判断できません。32p-ポストラベル法で DNA の構造を識別することができるはない付加物します。したがって、DNA の構造解析は頻繁に付加体既知構造の合成の標準に彼らの共同クロマトグラフィーを証明するのに依存しています。確かに、このようなメソッドは、この作業 (エリプチシン、3 NBA) の代表的な結果の両方の例で使用されました。

結論としては、この作品に示されているプロトコルは、環境化学物質の効力を評価する適切な方法として考慮されるかもしれないまたは薬酵素によって代謝物の共有結合 DNA を生成する bioactivated の付加体、非常に重要なプロセスのため、がんとその治療法の開発。

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Disclosures

著者は、何を開示します。

Acknowledgments

本研究は、チェコ科学財団 (GACR、グラント 17 12816S) によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

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References

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