Bildandet av kovalent DNA addukter av enzymatiskt aktiverade carcinogener och droger In Vitro och deras beslutsamhet av 32P-postlabeling

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Utvärdera styrkan av miljömässiga kemikalier och läkemedel, vara enzymatiskt bioaktiverade till intermediärer genererar kovalent DNA addukter, är ett viktigt område i utvecklingen av cancer och dess behandling. Metoderna beskrivs för sammansatta aktivering att bilda DNA addukter, samt tekniker för deras upptäckt och kvantifiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kovalent DNA addukter bildas av kemikalier eller läkemedel med cancerframkallande potential bedöms som en av de viktigaste faktorerna i den inledande fasen av cancerframkallande processer. Denna kovalent bindning, vilket anses vara orsaken till tumourigenesis, bedöms nu som en centraldogm av kemisk carcinogenes. Här metoder beskrivs sysselsätter de reaktioner som katalyseras av cytokrom P450 och ytterligare biotransformationsenzymer att undersöka styrkan av kemikalier eller mediciner för sin aktivering metaboliter utgör dessa DNA addukter. Förfaranden presenteras som beskriver isolering av cellulära fraktioner som har biotransformationsenzymer (mikrosomala och cytosoliska prover med cytokrom P450 eller andra biotransformationsenzymer, dvsperoxidaser, NADPH: cytokrom P450 mitokondriskt, NAD (P) H:quinone mitokondriskt eller xantin oxidas). Dessutom beskrivs metoder som kan användas för metabolisk aktivering av analyserade kemikalier av dessa enzymer samt för isolering av DNA. Ytterligare, lämpliga metoder kan detektera och kvantifiera kemiska/drog-derived DNA addukter, dvsolika modifieringar av 32P-postlabeling teknik och sysselsättning av radioaktivt märkt analyseras kemikalier, är visas i detalj.

Introduction

Metabolismen av xenobiotika (miljö kemikalier eller droger) sker i två faser1. Faserna I och II syftar till att återge de ursprungligen hydrofoba (inte vattenlösliga) föreningarna mer hydrofil (vattenlösligt), vilket gör dem lätt excretable via urin, avföring eller svett. Fas I (funktionalisering) reaktioner inkluderar oxidation, reduktion, och hydroxylering katalyseras av enzymer såsom cytokrom P450s (P450s, CYP), peroxidaser (dvs., cyklooxygenas, COX), aldo-keto reductases (AKRs), och mikrosomalt flavin-innehållande monooxygenases (ram av ömsesidiga åtaganden). Fas jag även reduktion reaktioner, medieras av en mängd reductases dvs, mikrosomalt NADPH: cytokrom P450-reduktas (POR) och cytosoliska NAD (P) H:quinone mitokondriskt (NQO1), xantin oxidas (XO) och aldehyd oxidas (AO)1 . I den andra fasen (Konjugation), de funktionella grupperna som fästes i fas är jag brukade konjugat små polära molekyler för att ytterligare öka polariteten. Exempel på enzymer anses delta i reaktionen av fas II inkluderar sulfotransferaser (resultat), N, O- acetyltransferaser (NAT), metyltransferaser såsom katekol -O- metyltransferas (COMT), glutation S- transferaser (GSTs) och uridin diphosphate difosfoglukuronosyltransferaser (UGT)1. Klassificering av enzymer i fas I eller II är, dock, inte strikt, och vissa enzymer kan utan tvekan grupperas i antingen kategori.

P450-enzymer (EG 1.14.14.1) är den heme innehållande proteiner närvarande i olika organismer, som deltar i metabolismen av många kemikalier, katalysera deras konvertering3,4. P450 enzymerna katalyserar hydroxylering av många substrat, med en reaktion där en atom av dioxygen införs i molekyl av xenobiotika, medan den andra Atomen av syre reduceras till formuläret vatten genom en reaktion som kräver två elektroner [ekvationen (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450-enzymer lokaliserade i endoplasmatiska retikulet membranet i däggdjursceller (mikrosomala P450-system) är medlemmar i multienzymkomplex monooxygenas systemet, som innehåller ytterligare NADPH: cytokrom P450-reduktas (POR) och cytokrom b5 , substraten av enzymet betecknas som NADH: cytokrom b5 reduktas. En allmänt accepterad teori hypothesizes att givare av de två elektroner som behövs för P450 är NADPH/POR systemet. Dock kan cytokrom b5 också agera som givare av elektroner för P450, nämligen som givare av elektronen att minska P450 under andra minskning av dess reaktion cykel, där den fungerar tillsammans med NADH: cytokrom b5 reduktas2,3,4.

Däggdjur utnyttja olika P450-enzymer (t.ex. familjer 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 och 27-enzymer) för syntesen av värdefulla endogena föreningar, såsom steroider, och använda dem för katabolismen av naturliga produkter2,3 . De andra CYP däggdjur enzymerna, såsom mänskliga CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2 d 6 och 3A4, metabolisera exogena kemikalier som används som droger. 5 , 6 de viktigaste enzymer som katalysera metabolism av läkemedel är CYP 3A och, speciellt CYP3A4. Omvandlingarna av xenobiotika, såsom pro-cancerframkallande ämnen och pro-gifter, medieras av mänskliga CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 och 3A42,5. De flesta av dessa CYP finns i levern (förutom CYP1A1 och 1B1). Dock uttrycks CYP också i flera extrahepatiska organ. Sådana P450s kan vara av stor betydelse, huvudsakligen när deltar de i bioaktivering metabolismen av kemikalier (droger) till reaktiva intermediärer i dessa organ7. Olika P450s induceras av flera föreningar som är deras substrat, men detta inte är nödvändigtvis fallet.

Många P450 enzymer spelar en roll i kemiska (drog) toxicitet. De kan omvandla xenobiotika inte bara till deras avgiftning metaboliter, men också aktivera dem reaktiva arter, som ändrar endogena makromolekyler som dessutom uppvisar olika biologiska egenskaper, oftast orsakar deras giftighet. DNA, lipider och proteiner kan vara mål för sin modifiering av reaktiv elektrofil och radikaler som genereras från aktiverade kemikalier. När det gäller DNA, lösa flera viktiga genen svaren och deras mekanismer är redan kända2,3,4,5.

Förändringar i DNA kan resultera i en minskning av värdcellens tillväxtkontroll, och detta fenomen anses vara den dominerande faktorn som leder till utveckling av cancerframkallande processer. Generering av kovalent DNA addukter med kemikalier att ha cancerframkallande potential bedöms som en av de viktigaste stegen i den inledande fasen av cancerframkallande bearbetar8,9,10,11. Det visades att relationer mellan bildandet av DNA addukter och tumourigenesis inträffa, medan en minskning av mängden DNA addukter ansvarar för chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. bildandet av cancerframkallande/drog-derived DNA addukter beror på individuella grunder av DNA, och påverkas av sekvenserna av dessa baser i DNA. Reparationer av DNA addukter är beroende av deras läge (på de transkriberade eller icke-transkriberas DNA-strängen) och typer av modifierade nukleotid sekvenser8,11,12,15, 16.

I den här artikeln beskriver vi förfaranden utnyttja enzymkatalyserade omvandlingen av kemikalier (narkotika) för att undersöka deras styrka aktiveras till metaboliter som modifierad DNA (generera DNA addukter). För kovalent DNA-bindning, test föreningen bör vanligtvis aktiveras antingen genom oxidativ eller reduktiv reaktioner, beroende på enskilda läkemedel. Oxidativa eller reduktiv aktivering av testade kemikalier medieras av ett P450-beroende enzymatiska system finns i den mikrosomala subcellulära fraktionen eller genom reduktion med reductases presentera båda i mikrosomer (POR, NADH: cytokrom b5 reduktas, P450-enzymer) och cellulära cytosoliska subcellulär fraktioner (NQO1 XO, AO, peroxidas). Reaktiva metaboliter därefter binda till DNA bildar DNA addukter. Eftersom både oxidativ och reduktiv reaktioner är viktigt att aktivera flera läkemedel till dessa reaktiva arter, de experimentella anställa oxidation/reduktion enzymatisk systemet beskrivs närmare. Dessutom lämpliga metoder kan detektera och kvantifiera dessa DNA addukter beskrivs i detalj.

Två oberoende förfaranden för att avgöra om testkemikalien, aktiveras av enzymatiska system, är bunden till DNA rekommenderas: 32P-postlabeling teknik och utnyttja radioaktivt märkt substans (t.ex., 3H eller 14 C). För först rekommenderas pilot, screening 32P-postlabeling analysen. Bestämning av DNA innehållet i lösningar, exakt utvärderas, måste föregå båda metoderna.

32P-postlabeling teknik använder tredjeparts enzymatisk hydrolys av DNA genom icke-radioaktiva kemikalier (cancerframkallande/läkemedel) till 3´-phosphodeoxynucleosides, ytterligare fosforylering med radioaktivt fosfor (32P) vid den 5´- Åh addukter position och separation av kemisk-deoxynucleotide från normal (oförändrad) deoxinukleotider av kromatografi17 (figur 1). DNA som ändras av en kemisk förening hydrolyseras av en blandning av Amiiiiin, micrococcal nuclease och exonuclease, känd som mjälte fosfodiesteras. Blandningen av hydrolyserat DNA som innehåller både normal (oförändrad) och modifierade deoxyribonucleoside 3´-monophosphates är reagerade med [γ -32P] ATP i närvaro av transportören (icke-radioaktiva) ATP och T4-polynucleotide kinase vid pH 9,5 till formuläret 5´- 32P-märkt 3´, 5´-bisphosphates (”standard” förfarande i figur 1). Används alkaliska pH kan minimera enzymaktiviteten T4-polynucleotide-Kinas till dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på position 3´. Separation och upplösning av 32P-märkt addukter från märkt deoxinukleotider som inte ändras av kemikalier utförs av mångfacetterat anjon-exchange tunnskiktskromatografi (TK) på polyethyleneimine (PEI) cellulosa (figur 2 ). I första och andra eluering steg (i D1 och D2 riktning) elueras märkt normal (oförändrad) deoxinukleotider samt [32P] fosfat från början av TLC-PEI-cellulosa plattan med vattenlösningar av elektrolyt på en kort bit kromatografiska papper tillämpas på toppen av TLC plattan, medan de deoxinukleotider som innehåller bundna kemikalier uppvisar hydrofoba egenskaper (cancerframkallande/drog-addukter) bibehålls i början av PEI-cellulosa plattan dessutom lösas med flera olika lösningsmedel system i D3 och D4 riktningar (figur 2). Lokalisering av addukter utförs med hjälp av skärmen enhanced autoradiografi; de separerade addukter upptäcks som mörka igenkännliga fläckar på X-ray filmer. Områdena av fläckar är censurerade från plattan och används för att kvantifiera radioaktiviteten av liquid scintillation eller Cerenkov räknar. En lagring fosfor imaging metod som har anpassats för att kartlägga och kvantifiera DNA addukter på kromatogram som upptäckts av de 32P-postlabeling assay nu används också. 18 the Instant Imager maskin utnyttjas ofta för sådan detektion och kvantifiering av DNA addukter. Denna metod ger mer än 10 gånger högre känslighet för att upptäcka 32P än tekniken med skärmen enhanced autoradiografi19.

Mängder av DNA addukter bestäms som värden på relativ addukt märkning (RAL), beräknas med hjälp av ekvation (2) enligt följande:

CPM. i addukt deoxinukleotider
RAL =---(2)
specifik aktivitet i 32P-ATP (i cpm. / pmol) x pmol deoxinukleotider

Värden i RAL är förhållandet mellan räkna andelen adducerad deoxinukleotider över räkna andelen totalt [adducerad och normal (oförändrad) deoxinukleotider] deoxinukleotider20,21. Dock beräkningen är baserad på lika märkning effektivitetsvinsterna av addukter och normala deoxinukleotider22. Klassisk (”standard”) förfarandet för 32P-postlabeling teknik är lämplig för olika DNA addukter (skrymmande eller icke-skrymmande addukter), dess känslighet är dock inte tillfredsställande att upptäcka addukter finns i låga mängder i DNA. Med den här proceduren, detekteras mängden en addukt i 107 oförändrad deoxinukleotider i DNA (0.3 fmol addukt/µg DNA).

En mängd olika modifieringar av denna klassiska 32P-postlabeling förfarande har använts för att höja känsligheten av tekniken. Upp till 10 - till 100 gånger högre känslighet för bestämning av addukter av 32P-märkning har uppnåtts med hjälp av begränsande nivåer av [γ -32P] ATP (intensifiering förfarandet). 23 , 24 ett ytterligare förfarande som ger en ökad känslighet för 32P-postlabeling metoden använder tredjeparts en inkubation av smält DNA innehållande addukter med nuclease P1 (från Penicillium citrinum)21 (figur 1). Detta enzym föredrar att dephosphorylate oförändrad deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, medan deoxinukleotider med bundna kemikalier (adducerad nukleotider) är i huvudsak inte substratesna för detta enzym. Därför defosforyleras deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) är inte fosforyleras av T4-polynucleotide kinase av [32P] fosfat från γ -32P] ATP. Men några av nukleotider där kemikalier är bunden (adducerad deoxinukleotider), såsom arylamine addukter ersätts på C8 av deoxyguanosine, kan bedephosphorylated av detta enzym. Däremot de flesta andra addukter (t.ex., addukter ersätts på N2 av deoxyguanosine) är inte defosforyleras av nuclease P1. Denna ändring av 32P-postlabeling gör denna metod betydligt känsligare, ökar dess känslighet med mer än tre tiopotenser. Dessutom, denna version av 32P-postlabeling ger en metod där högre mängder DNA (5-10 µg) och ett överskott av carrier-fri [γ - 32P] ATP kan utnyttjas.

En annan metod att berika den addukter, beskrivs av Gupta25, utnyttjar de fysikalisk-kemiska egenskaperna för skrymmande deoxynucleotide addukter, som kan utvinnas i n-butanol i närvaro av en fas överföring agent tetrabutylammonium klorid (TBA) (figur 1) före [32P] fosfat märkning, medan oförändrad deoxinukleotider extraheras dåligt av detta organiska lösningsmedel. Dock mindre hydrofoba addukter, bestående för exempel på deoxinukleotider modifierade med icke-aromatiska skrymmande beståndsdelarna eller små alkyl rester, inte effektivt extraheras med n-butanol. De är därför i huvudsak omätbara när analyseras av denna ändring av den 32P-postlabeling metod.

Både tidigare nämnda versioner av 32P-postlabeling ökar känsligheten och kvantifiering av DNA addukter enormt (upp till tre tiopotenser), att kunna upptäcka en addukt per 109,10 normala nukleotider (0.3 - 3 amol/µg DNA). Dessa två metoder rekommenderas för testning av kemikalier för deras effektivitet kovalent binda till DNA och, därför, de beskrivs i detta arbete i detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök har utförts enligt föreskrifter för skötsel och användning av försöksdjur (311/1997, ministeriet för jordbruk, Tjeckien), vilket är i enlighet med Helsingforsdeklarationen.

1. isolering av hepatisk mikrosomal och cytosoliska fraktioner

  1. Förbereda levern subcellulär fraktioner (mikrosomer rik på P450-enzymer eller cytosols rik på reductases eller lösliga peroxidaser) från råttor genom enkel differentiella centrifugering (105 000 x g).
    Obs: Den pellet och supernatanten tas som mikrosomer och cytosols, respektive.
    1. Tvätta de lever proverna (1-10 g) två gånger med 50 mM Tris-HCl buffert, pH 7,4 innehållande 150 mM KCl buffert (buffert 1) (10-gånger högre volymer än vikten av vävnad, dvs 10-100 mL) och skär vävnader i små bitar (av runt storleken 2 x 2 mm).
    2. Homogenisera vävnaden i närvaro av denna buffert (> 3 volym/vikt mL/g) i Homogenisatorer vid 4 ° C i 5 min, och kassera resterande icke-homogeniserad bitar av vävnad med hjälp av filtrering filtrera papper. Centrifugera Homogenatet vid 600 x g i 10 minuter vid 4 ° C och överför supernatanten till en annan centrifugering tube.
    3. Re homogenisera pelleten i buffert 1 (1 mL per 1 g vävnad), upprepa steg 1.1.3., och kassera pelleten. Centrifugera poolade supernatanterna vid 15 000 x g i 20 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till en annan centrifugering tube.
    4. Centrifugera supernatanten vid 105 000 x g under 60 minuter vid 4 ° C. Samla in supernatanten (cytosol) och lagra den i portioner (1-10 mL) vid-80 ° C. Karakterisera cytosol för mängden protein med den metod som beskrivs av Bradford26.
    5. Resuspendera pelleten i 100 mM natriumfosfat buffert, pH 7,4 (> 2 volym/vikt mL/g), Centrifugera vid 105 000 x g under 60 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Re homogenisera pelleten (mikrosomer) i 50 mM Tris-HCl buffert, pH 7,4 innehållande 150 mM KCl och 20% glycerol (< 5 volym/vikt mL/g) i Homogenisatorer vid 4 ° C. Lagra mikrosomer i 0,5 - 1 mL portioner vid-80 ° C. Karakterisera mikrosomer för innehållet av proteiner med hjälp av den metod som beskrivs av Bradford26.
    6. Bestämma koncentrationen av cytokrom P450 i mikrosomer.
      Obs: Koncentrationen av P450-enzymer i mikrosomer mäts som beskrivs av Omura och Sato27, fastställande av absorptionen av komplex av minskad P450 med kolmonoxid (CO). Kolmonoxid är en giftig förening och måste hanteras med omsorg och med huva.

2. inkubationer Test kemikalier (cancerframkallande ämnen/droger) med DNA i närvaro av enzymatiska system

  1. Inkubering av prov kemikalier (cancerframkallande ämnen/droger) med DNA i närvaro av oxidativ enzymatiska system som innehåller cytokrom P450
    1. Förbereda inkubation blandningar innehållande, i en slutlig volym av 0,75 mL vid 4 ° C, följande föreningar och enzymatiska system.
      1. Blanda 100 mM fosfatbuffert, pH 7,4, (0,375 mL) med 10 mM NADPH eller NADPH-genererar systemet (10 mM MgCl2, 10 mM D-glukos 6-fosfat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glukos 6-fosfat dehydrogenas) (75 µL).
      2. Lägg in denna blandning mikrosomer eller ren rekombinant P450 i supersomer, som är mikrosomer isolerade från insekt celler transfekterade med en baculoviridae konstruktion som innehåller cDNA rekombinant P450-enzymer, 50 pmol P450 enzymer i 50 µL mikrosomalt eller supersomal förberedelser - hepatisk mikrosomal fraktioner isolerade i laboratoriet eller från en kommersiell källa.
      3. Tillsätt 1 mg kalv bräss DNA (0,3 mL av stamlösningen - 3,3 mg/mL i destillerat vatten), och skaka på en vortex shaker för 5 s.
      4. Slutligen lägger till 7,5 µL 0,1 mM test ellipticine drog upplöst i DMSO och 42,5 µL destillerat vatten för att nå en volym av inkubering blandning av 0,75 mL. Använda kemikalier märkt med 3H eller 14C eller omärkta kemikalier, beroende på förfarandet för upptäckt av DNA addukter.
      5. Skaka på en vortex shaker för 5 s. Inkubera i öppnade rör vid 37 ° C i 30-60 min.
      6. Också förbereda två kontroll inkubationer likaså, men (i) utan en aktiverande systemet (mikrosomala prover) eller (ii) med det, men utan testet förening.
  2. Inkubationer test kemikalier (cancerframkallande ämnen/droger) med DNA i närvaro av reduktiv enzymatiska system
    1. Förbereda inkubation blandningar innehållande, i en slutlig volym av 0,75 mL vid 4 ° C, följande föreningar och enzymatiska system.
      1. Vid 4 ° C, blanda 100 mM Tris-HCl buffert, pH 7,4, som innehåller 0,2% Tween-20, (0,375 mL), 10 mM lösning av kofaktor NQO1 reduktiv enzym (NADPH) (75 µL), cytosoliska bråkdel (nedsatt cytosoliska fraktioner - isolerade i laboratoriet eller i fallet med den cytosoliska fraktioner som isolerats från enskilda människors givare som de erhölls från kommersiella källan innehållande 1 mg protein (50 µL)).
      2. Lägg till 1 mg kalv bräss DNA (0,2 mL av stamlösningen - 3,3 mg/mL destillerat vatten) och låt skaka i en shaker för 5 s.
      3. Slutligen tillsätt 7,5 µL 0,1 mM testkemikalien (löses i destillerat vatten, metanol, etanol eller DMSO, beroende på löslighet av föreningen) och 42,5 µL destillerat vatten för att nå en volym 0,75 ml för inkubation blandningen. Använda kemikalier märkt med 3H eller 14C eller omärkta kemikalier, beroende på förfarandet för upptäckt av DNA addukter (se nedan).
      4. Rensa reaktionsblandningen med argon för 1 min. skaka på en shaker för 5 s. Inkubera i slutna rör vid 37 ° C i 30-60 min.
      5. Också förbereda två kontroll inkubationer likaså, men (i) utan en aktiverande systemet (cytosoliska fraktioner) eller (ii) med det, men utan de Testkemikalierna.
  3. Utvinning av inkubering blandningar med organiska lösningsmedel för att ta bort överskottet av test kemikalier
    1. Blanda inkubation blandningen i ett provrör med en mössa med samma volym av etylacetat (eller dietyleter eller hexan) genom att lägga till dessa lösningsmedel. Skaka innehållet i tuben på en skakapparat tills en emulsion former.
    2. Snurra (3 min) vid 1600 x g i en centrifug vid rumstemperatur. Om de organiska och vattenaktig faserna inte ordentligt separerade, snurra gång för en längre period eller vid en högre centrifugering hastighet.
    3. Ta bort den övre, organiska fasen samla med en pipett. Om små volymer (< 400 µL) är används, använda en automatisk pipett försedd med en lämplig spets. Kasta bort detta organiska fasen.
    4. Upprepa steg 2.3.1., 2.3.2., och 2.3.3. Ta bort återstående organiska lösningsmedel av en ström av kvävgas (minst 5-10 min för avlägsnande behövs).
  4. Isolering av DNA från inkubationer
    1. Extraktion av DNA från lösningar med fenol/kloroform och dess nederbörd med etanol
      1. Eliminera proteiner för att isolera DNA från inkubation blandningar genom att extrahera proteiner från lösningar av DNA med fenol, fenol/kloroform (1:1), och kloroform genom det förfarande som visas nedan.
      2. Kombinera inkubation blandningen med samma mängd fenol eller fenol/kloroform (1:1) i en Falk eller Eppendorf-rör med en mössa. Rör blandningen tills en emulsion former.
      3. Snurra (3 min) vid 1600 x g i en centrifug vid rumstemperatur. Om organiska och vattenaktig inte ordentligt separeras faserna, snurra en gång till under en längre tid eller vid en högre centrifugering hastighet.
      4. Överföra den övre vattenfasen med en pipett till en ny polypropylen tub. Om små volymer (< 400 µL) är används, använda en automatisk Pipettera försedd med en lämplig spets. Ta bort protein gränssnittet tillsammans med den organiska fasen.
      5. Kombinera den övre vattenfasen med samma mängd av en blandning av fenol och kloroform (1:1). Reproducera steg 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Kombinera den övre vattenfasen med samma mängd kloroform och upprepa steg 2.4.1.2. -2.4.1.4. Återställa DNA genom fällning med 2 volymer kallt (-20 ° C) etanol. Bestäm volymen av den DNA-lösningen.
      7. Anpassa koncentrationen av monovalenta katjoner genom tillsats av natriumklorid 5 M till finalen koncentrationer av 0.1 M. rör kraftigt. Kombinera med 2 volymer kallt (-20 ° C) etanol och blanda ordentligt. Kyl ned till-20° C.
      8. Förvaras vid-20 ° C tills DNA fälls ut. När DNA är splittrad under inkubationer (t.ex., genom bildandet av syreradikaler under enzymatisk aktivering reaktionen) eller under förfarandet isolering till storleken av DNA som är liten (< 1 kb) eller när DNA finns i små mängder (< 0,1 mg / mL), tidpunkten för kylning måste ökas och temperaturen sjönk till-70 ° C.
      9. Snurra (10 min) vid 1600 x g vid 0 ° C i en centrifug. Om DNA förekommer i låga koncentrationer eller i form av små fragment, snurra en gång under en längre tid (30 min). Kassera supernatanten.
      10. Ta bort koncentrationsfördelningen (eller rester av testet kemiska) som kan finnas i utfällda DNA, tvätta DNA med 70% etanol och dietyleter. Tvätta fälls ut DNA med kallt (-20 ° C) 70% etanol. Snurra (10 min) vid 1600 x g vid 0 ° C i en centrifug. Kassera supernatanten.
      11. Upprepa 2.4.1.10. Tvätta fälls ut DNA med kallt (-20 ° C) 70% etanol. Snurra (10 min) vid 1600 x g vid 0 ° C i en centrifug. Kassera supernatanten.
      12. Upprepa 2.4.1.10. Försätt röret i en vertikal läge på absorberande papper att ta bort kvarvarande supernatanten. Tvätta DNA pelleten genom att tillsätta 1 mL dietyleter att kassera de eventuella resterna av kemiska från isolerade DNA testet. Snurra (10 min) vid 1600 x g vid 0 ° C i en centrifug. Kassera supernatanten.
      13. Lös upp DNA pelleten i lämplig volym (vanligen i 100-400 µL att uppnå en DNA-koncentration av 0,5 - 1 µg/µL) destillerat vatten (eller i 0,15 mM natriumcitrat och 1,5 mM natriumklorid). Den DNA-lösningen kan stå vid 4 ° C över natten, eller kan värmas till 37 ° C i 10-30 min att öka upplösning DNA.
      14. Före förvaring, separera DNA i små portioner (10-20 µL), eftersom upprepad frysning och upptining av DNA lösningar kan resultera i en minskning av addukt koncentrationer. Förvaras vid-80 ° C eller kallare.
        Obs: Spektrofotometrisk bestämning av DNA: metoden enkel och exakt, som ofta används för att mäta mängden DNA i en beredning om provet är ren (dvs.utan betydande mängder föroreningar såsom protein, fenol eller andra nukleinsyror), absorberas spektrofotometrisk mätning av mängden DNA av UV-bestrålning av baserna (se procedurerna som beskrivs tidigare)28.
  5. Förfaranden för upptäckt av DNA addukt bildandet
    1. 32 P-postlabeling assay
      Obs: DNA hydrolys använder tredjeparts Hydrolysatet beredd på detta stadium för analysen av addukter (2.5.1.) as well as av normala (oförändrad) deoxinukleotider (2.5.7.).
      1. Lös micrococcal nuclease (MN) i vatten vid en koncentration på ~ 450 enheter (U) / mL. Dialyze mot destillerat vatten och justera till 300 U/mL. Dialyze mjälte fosfodiesteras (SPD) lösning och justera till 4 U/mL.
      2. Blanda MN och SPD till slutliga koncentrationer 150 mU/µL MN och 2.5 mU/µL SPD (MN/SPD lösning). Ta DNA lösning innehållande 12,5 µg och Indunsta till torrhet i förångare. Lös i 6,5 µL destillerat vatten.
      3. Lägg till 5,0 µL MN/SPD lösning (koncentration på MN är 60 mU/µL, slutlig koncentration av SPD är 1 mU/µL), och 1,0 µL matsmältningen buffert (slutliga koncentrationen av natrium succinat är 20 mM, slutlig koncentration av CaCl2 är 8 mM). Den slutliga volymen av blandningen är 12,5 µL. Mix och tillåter reaktioner för 3 h vid 37 ° C.
      4. Ta bort 2,5 µL (överföring till en annan tube) för ytterligare utspädning och analys av oförändrad deoxinukleotider (2.5.7.)
    2. Nuclease P1 anrikning förfarande
      1. Den återstående 10,0 µL av hydrolysat, lägga till 0,65 µL natrium acetatbuffert (slutlig koncentration, 40 mM), 0,65 µL ZnCl2 lösning (slutlig koncentration 0,1 mM), 1.25 µL NP1-lösning (koncentration, 0.385 µg/µL) och 0,45 µL destillerat vatten. Den slutliga volymen av blandningen är 13 µL.
      2. Låt blandningen reagera i 30 minuter vid 37 ° C, och avsluta reaktionen med tillägg av 3 µL av Tris lösning.
    3. n-Butanol anrikning förfarande
      1. Till de återstående 10,0 µL av DNA hydrolysat, tillsätt 215 µL av 11.6 mM ammonium formate lösning, pH 3,5 och 25 µL 10 mM TBA natriumkloridlösning. Extrahera med 250 µL n-butanol (mättad med vatten) genom kraftfull blandning. Snurra (3 min) vid 1600 x g till separata lager, och ta bort den övre n-butanol lager. Extrahera en gång till med 250 µL n-butanol (mättad med vatten), snurra, ta av den övre n-butanol skikt, och kombinera med tidigare extrakt.
      2. Tillsätt 400 µL vatten (mättad med n-butanol) extrahera, och blanda kraftigt. Snurra för att separera lager och ta bort nedre vattenskiktet. Upprepa proceduren tvätt med 400 µL av vatten (mättad med n-butanol). Lägga till 3 µL av 250 mM Tris-HCl-lösning, pH 9,5, n-butanol lager. Avdunsta n-butanol till torrhet i förångare vid rumstemperatur.
      3. Lös upp restmaterialet i 100 µL n-butanol, avdunstar till torrhet igen, och lös upp restmaterialet i 16,0 µL vatten.
    4. Märkning av den addukter
      1. Lägg till 1 µL bicine buffertlösning (Labelling buffert) och 4,5 µL av en blandning innehållande 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol av kall ATP och 10,0 U av T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinase) till 16,0 µL lösning från NP1 eller butanol anrikning mix. De slutliga koncentrationerna av reagenser blir följande: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM spermidine och 0.5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Den totala volymen av blandningen är 20 µL.
      2. Låt blandningen reagera i 30 min i rumstemperatur. Gäller hela provet (dvs. 20 µL) på den PEI-cellulosa TLC-plattan (2.5.6.).
    5. Utvärdering av effekten av NP1 eller n -butanol förbättra förfaranden
      1. Tvätta botten av röret med 50 µL vatten. Blanda kraftigt i 30 s och spinn (1 min) på 1.600 x g i en centrifug att etablera där är ingen förorening på locket. Spot 5 µL på en PEI-cellulosa TLC-platta (20 x 20 cm). Kolonnen med en lösning 280 mM i (NH4)24 och 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. TLC separation av adducerad deoxinukleotider
      1. Förtvätt TLC plattor med destillerat vatten. Det rekommenderas särskilt för hemmagjorda plattor.
        Obs: Denna wash bör utföras att ta bort den gula färgen från plattor, en färg som kan höja bakgrunden, särskilt lösningsmedel framtill.
      2. Plats hela provet på den PEI-cellulosa TLC-plattan och starta kromatografi (2.5.4.); sanering av addukter utförs genom att utveckla plattan i D1 och D2 riktning (figur 2).
      3. Utveckla plattan i en D1 riktning (figur 2). Användning 1,7 M natrium fosfatbuffert, pH 6.8, att säkerställa att DNA addukter finns kvar i början av den TLC-plattan. Analogt, utveckla plattan i en D2 riktning använder denna buffert. För information om möjliga buffertar för förfaranden addukter Se lösningar beskrivs för upplösning av flera typer av20,28.
        Obs: Utveckling av plattan i en D2 riktning kan utelämnas.
      4. Tvätta plattan i avjoniserat vatten efter kromatografi i ca 5 min i två på varandra följande bad. Efter att torka plattorna.
      5. Utveckla plattorna i D3 och D4 riktning med 3,5 M litium formate buffert, pH 3.5, som innehåller 8,5 M urea för D3 riktning och 0,5 M Tris / HCl buffert, pH 8,0, innehållande 0,8 M LiCl och 8,5 M urea för D4 riktning (figur 2). Lösningsmedel som måste justeras för att utveckla addukt fläckarna över på TLC-plattan. För information om möjliga buffertar för D3 och D4 utveckla förfaranden, se de lösningar som beskrivs för upplösning av flera typer av addukter23,24,25,28.
      6. För att undvika eventuella problem i D4, efter utvecklingen i en D4 riktning och en vattentvätt, utveckla plattorna (längs D4) på 1,7 M natriumfosfat, pH 6,0 (vanligtvis tilldelas som utvecklingen i riktning D5), till toppen av en papper veke (12 x 11,5 cm).
        Obs: D5 riktning kan också utelämnas. I det här fallet är det nödvändigt att öppna TLC tanken när lösningsmedlet har nått toppen av TLC och tillåta en körning för upp till 60 min. Denna metod är ännu bättre än att lägga till en veke (metoden ofta används i många laboratorier för att ta bort eventuella problem i D4).
    7. Kvantifiering av normala (oförändrad) deoxinukleotider efter hydrolys
      1. Späd en alikvot av hydrolysat (från 2.5.1. beskriva DNA hydrolys) med destillerat vatten, (dvs., 2,5 µL av matsmältningen blandningen från 2.5.1. justeras till 250 µL, och 10 µL av denna lösning anpassas till 150 µL).
      2. Ta en 5 µL (10 pmol normal deoxinukleotider) delmängd av denna digest, tillsätt 2,5 µL 10 mM Tris-HCl buffert, pH 9,0 och etikett som i 2.5.4. (sista volymen av blandningen är 10 µL). Tillåta för att reagera i 30 min i rumstemperatur.
      3. Ta en 4 µL delmängd av blandningen och späd till 750 µL med 10 mM Tris-HCl, pH 9,0. Mix och snurra för att fastställa det finns ingen förorening av locket. Tillsätt 5 µL på en PEI-cellulosa TLC-platta. Utveckla den TLC-plattan i en lösning av 280 mM (NH4)24 och 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Låt torka efter TLC.
      4. Använd autoradiografi som utförs för ca 45 min i rumstemperatur att lokalisera fyra oförändrad deoxynucleotide bis-fosfater. Skär plats för kvantifiering av liquid scintillation eller Cerenkov räknar.
    8. Beräkning av relativt addukt märkning (RAL)
      1. Bestämma värdena räknas i addukt fläckarna och räknas i alikvoten av märkt omodifierade (normal) deoxinukleotider.
        Obs: Den senare måste bestämmas på 180.000 räknar mindre material än förra, en siffra som är konverteringsfaktorn gälla till Greven av oförändrad (normal) deoxinukleotider för att utvärdera RAL värdena addukt nivåer. RAL av DNA addukter beräknas enligt ekvation (2) ovan.
    9. Påvisande av bindande test carcinogener eller droger att DNA med hjälp av radioaktivt märkt drog
      1. Utvärdera 3H eller 14C radioaktivitet DNA modifierad med kemikalier genom liquid scintillation räkning.
      2. Tillsätt 10-50 µL av DNA lösning 3 ml av en scintillation lösning i injektionsflaskan scintillation. Blanda väl. Mäta radioaktiviteten använder scintillationsräknare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med de protokoll som beskrivs här för utilizationen av enzymkatalyserade aktivering (dvs P450, peroxidas, reduktas) för att undersöka styrkan av kemikalier (cancerframkallande ämnen/droger) för att vara metaboliseras till intermediärer vilket resulterar i deras kovalent bindning till DNA (generering av DNA addukter), vi skulle kunna lösa en ny mekanism av den farmakologiska verkan av den mot cancer agent ellipticine (för en granskning se29,30,31), (ii) etiologi av två nefropatier associerade med övre urothelial tarmkanalen cancer orsakad av växt alkaloid Aristolochiasyra (Aristolochic acid nefropati och Balkan endemiska nefropati) (för en granskning se,32,33,34, 35,36,37,38,39), och (iii) genotoxiskt mekanismer för cancerogenitet av flera cancerframkallande ämnen såsom en luftförorening 3 - nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 och dess reduktiv motsvarighet, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 växt alkaloid aristolochic syra,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 och en aromatisk Amin o- anisidin. 49 , 50 , 51 , 52 Dessutom enzymerna att fastställa biologiska effekterna av dessa kemikalier fastställdes sysselsätter de beskrivna metoderna.

Här representativa resultat på oxidativ aktivering av ellipticine av P450s och peroxidaser som resulterar i generation av kovalent addukter med DNA och minskning av 3-NBA metaboliter som kovalent modifierad DNA, visas.

Den växt alkaloid ellipticine (5,11-dimetyl-6H- pyrido [4,3 -b] karbazol) och dess derivat är antitumöreffekt agenter, som fungerar som DNA-skadande droger genom flera mekanismer, ingår i gripandet av cellcykeln och induktion av apoptos (för en översikt, se29,30,31). Med de protokoll som beskrivs i detta arbete, vi visat att cancer drogen genererar kovalent DNA addukter efter metabolisk bioaktivering katalyseras av mikrosomalt P450s (figur 3) och peroxidaser (figur 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61och detta förklarade denna agent mot cancer celler30stark effektivitet. [3H]-radioaktivt märkt ellipticine och nuclease P1 version av den 32P-postlabeling teknik utnyttjades främst i studier29,30,31,53 ,61. Med komplexa studien med subcellulär enzymsystem, enzymhämmare och rena enzymer i de experiment som använder protokollen beskrivs, den dominerande P450 enzymer oxiderande ellipticine till reaktiva arter bildar DNA addukter och strukturer dessa reaktiva arter skulle kännetecknas29,30,31,55. Av den P450s undersökt, är mänskliga CYP3A4 enzymet mest effektiva i ellipticine oxidation till 12-hydroxyellipticine och 13-hydroxyellipticine, ellipticine metaboliter, som spontant sönderfaller till ellipticine-12-ylium och ellipticine-13-ylium bindning till DNA (figur 5). 55 , 61 den CYP-enzymer även generera ytterligare metaboliter såsom 9-hydroxyellipticine, som anses vara en avgiftning metabolit, 7-hydroxyellipticine och ellipticine N2-oxid, som bildas som underårige ellipticine metaboliter. Den 9-hydroxyellipticine samt 7-hydroxyellipticine och ellipticine N2-oxid bildas främst genom CYP1A1 och CYP2D6, respektive. 55 , 57 , 58

Peroxidaser (dvspepparrotsperoxidas (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidas (MPO) och lingonsylt (COX-1 och COX-2)) metabolisera ellipticine för att generera samma ellipticine-derived DNA addukter (figur 4)61 av de mekanismer som visas i figur 5.

Nitroaromatic 3-NBA (3-nitro-7H-benzdeanthracen-7-en) är en komponent i dieselavgaser och återfinns i luftburna partiklar62,63,64. Den huvudsakliga metaboliten av denna förorening, 3-ABA,64,65 upptäcktes i urinen av arbetstagare som saltgruvorna som utsattes för diesel utsläppen för en lång tid63. Detta fynd har visat att dessa arbetstagare utsattes för 3-NBA. Denna nitroaromatic orsakar lungtumörer hos råttor efter intratrakeal instillation67. 3-NBA fungerar också som en mutagen i Ames Salmonella typhimurium testet (i stam YG1024 överuttryck av nitroreductase och O- kolinacetyltransferas), genererar mer än 6 miljoner betala per nanomole i denna stam62. Mitoser genotoxiska visades också av generation kovalent addukter med DNA in vitro, efter aktivering av flera enzymer, med de protokoll som beskrivs i detta arbete, och i vivo i flera organ av gnagare djur (figur 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,67,68.

3-NBA-härledda DNA addukter bildas efter 3-NBA aktiveringen med cytosoliska reductases (dvs. NQO1) mättes av nuclease P1 och n-butanol anrikningsmetoder av den 32P-postlabeling metod som beskrivs i protokollen presenteras i denna studie. Resultaten indikerade bildandet av upp till fem DNA addukter (addukt fläckar 1-5 i figur 7), och tre av dem präglades för att vara 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (dA -N6-C2-ABA; addukt plats 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (GD -N2-C2-ABA; addukt plats 3) och N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (GD-C8 -N-ABA; addukt ställen 4. och 5) (figur 7 och figur 8). Utnyttja den nuclease P1 versionen av den 32P-postlabeling metod, GD-C8 -N-ABA (addukt ställen 4 och 5) var omätbara (figur 7 och figur 8). Detta resultat understryker att vissa begränsningar av denna version av 32P-postlabeling uppstå, nämligen, den låg (om någon) upptäckten av adducerad deoxinukleotider som är defosforyleras av nuclease P1 (dvs, addukter bildas under oxidation av arylaminer eller genom reduktion av aromatiska nitroderivatives N- hydroxyarylamine-derivat ersätts på C8 av deoxyguanosine). Liknar studien med ellipticine, utnyttja komplexa studien med subcellulär enzymsystem, enzymhämmare, rena enzymer och DNA addukt standarder i de experiment som sysselsätter de protokoll som beskrivs i detta arbete, den dominerande cytosoliskt minskning enzymer metaboliserar 3-NBA metaboliter generera DNA addukter, nämligen den reaktiva metaboliten bildas genom reduktion av 3-NBA (N-OH-ABA), och strukturer av tre DNA addukter genereras av 3-NBA var kännetecknas (figur 7 och (Se figur 8). I levern, bioaktivering av 3-NBA in vitro- befanns vara främst hänförlig till människa och råtta NQO1 (figur 7), medan mänskliga N,O- acetyltransferaser (NAT), NAT2, NAT1, sulfotransferas (SULT), SULT1A1 och, till en mindre utsträckning, SULT1A2 är de dominerande enzymerna av fas II aktivera 3-NBA42. Hepatisk mikrosomal POR är också effektivt vid aktivering av 3-NBA41, men hos möss, 3-NBA är huvudsakligen bioaktiverade av NQO1 i stället för denna mikrosomalt POR42. I lungan, vilket är målvävnaden för 3-NBA cancerogenitet67, minska både NQO1 och XO 3-NBA metaboliter generera DNA addukter. XO verkar dock fungera som en mindre 3-NBA aktiverande enzym i detta organ69.

Figure 1
Figur 1: System för 32P-postlabeling analys. De enskilda stegen i 32P-postlabeling metoden och dess förbättrade förfaranden visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: mönster av DNA addukt eluering på PEI-cellulosa TLC plattor. Mångfacetterat kromatografi av DNA addukter på PEI-cellulosa plattor visas. URSPRUNGET är startpositionen på den PEI-cellulosa TLC-plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: 32P-postlabeling analyser av DNA addukter bildades kalv bräss DNA inkuberas med ellipticine, NADPH och råtta (A) och (B) mänskliga levermikrosomer, (C) en kontrollprovet utan mikrosomer. Addukter 1 och 2 som tilldelats av pilar genereras i deoxyguanosine i DNA av ellipticine aktiveras med mikrosomer. 32 P-postlabeling utfördes sysselsätter den nuclease P1 versionen av metoden (steg 2.5.2.) Ursprunget är belägna på nedre vänstra hörnen (D3 från botten till toppen och D4 från vänster till höger). D2 utelämnades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: 32P-postlabeling analyser av ellipticine-medierad DNA addukter. Adducts bildas i kalv bräss DNA reagerat med ellipticine (100 µM) och pepparrotsperoxidas (A), nötkreatur lactoperoxidase (B), mänskliga myeloperoxidas (C), får cyklooxygenas-1 (D), mänskliga cyklooxygenas-2 () E) (5 µg peroxidaser var närvarande i inkubationer), från levern DNA hos råttor som behandlades med 40 mg ellipticine per kg kroppsvikt (bw) (F), från kalv bräss DNA reagerat med ellipticine och mänskliga CYP3A4 (G), med 13 - hydroxyellipticine()H), ellipticine N2-oxid (jag) och 12-hydroxyelipticine (J). Experimenten utfördes med nuclease P1 versionen av analysen (steg 2.5.2.) Ursprunget är på den nedre vänstra hörnen (D3 från botten till toppen och D4 från vänster till höger). D2 utelämnades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Oxidation av ellipticine av peroxidaser och CYP visar ellipticine metaboliter och de föreslog att generera DNA addukter. Föreningarna som inom parentes inte har fortfarande varit upptäckt de experimentella villkor som används i experiment, och de är elektrofil metaboliterna postulerade som ultimate arter bindning till DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: metabolisk aktivering av och DNA addukt bildandet av 3-nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone mitokondriskt; NAT, N,O- acetyltransferaser; SULT, sulfotransferas; CYP, cytokrom P450; POR, NADPH: cytokrom P450 mitokondriskt; HRP, pepparrotsperoxidas; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidas; COX-1, cyklooxygenas-1. R = - COCH3 eller -SO3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; GD -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; GD-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: 32P-postlabeling analyser av 3-NBA-härledda DNA addukter. Nuclease P1-(vänster paneler) och n-butanol utvinning versioner (rätt panelerna) av metoden utnyttjades. Aen och Ab, addukter bildade i kalv bräss DNA reagerade med 3-NBA (300 µM) efter aktiveringen med råtta nedsatt cytosols. Ben och Bb, addukter bildades kalv bräss DNA, reagerade med 3-NBA (300 µM) efter aktiveringen med mänskliga nedsatt cytosol (poolade fraktion). Cen och Cb, addukter bildades kalv bräss DNA, reagerade med 3-NBA (300 µM) efter aktivering med ren råtta nedsatt NQO1 (0,09 enheter). Den och Db, addukter bildades kalv bräss DNA, reagerade med 3-NBA (30 µM) efter aktiveringen med humant rekombinant NQO1 (0,06 enheter). Een och Eb, addukter bildade i lax testiklarna DNA behandlas med N-OH-ABA. Fen och Fb, addukter bildas i levern DNA av vildtyp kullsyskon på C57BL/6 bakgrund utsätts för 2 mg 3-NBA per kg b.w. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: 32P-postlabeling analyser av 3-NBA-härledda DNA addukt standarder [GD -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) och GD-N-ABA C8 - (C)] (paneler en) och strukturer av 3-NBA och dessa 3-NBA-DNA addukter () paneler (b). N-butanol utvinning version av metoden utnyttjades (paneler i en). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta papper, är det visat en lättillgänglig metod att studera styrkan av kemikalier för att vara bioaktiverade till metabola intermediärer, vilket resulterar i generation av kovalent DNA addukter. Detta är en avgörande fråga, eftersom utvärderingen av styrkan av miljömässiga kemikalier eller droger av sin enzymatisk aktivering metaboliter genererar kovalent DNA addukter är ett viktigt område i utvecklingen av cancer och dess behandling. Modifiering av DNA av cancerframkallande ämnen anses vara orsaken till tumörutveckling bedöms nu som en centraldogm av carcinogenes orsakas av cancerframkallande ämnen. Detta förslag bekräftas av en mängd fynd, såsom fenomen som: (i) de cancerframkallande egenskaperna hos olika cancerframkallande ämnen beror på bioaktivering av dessa föreningar till metaboliter reagerar med nukleofil centra i DNA; (ii) nivåer av DNA addukter ofta motsvarar många cancerframkallande svar; (iii) och mutationen i vissa tumörsuppressorgener och aktivering av flera proto-onkogener kan orsakas av ändringar med kemikalier med cancerframkallande potenser. Kovalent modifiering av DNA av cytostatika har dessutom visats som en av de mest effektiva DNA-skadande effekterna av dessa läkemedel, vilket resulterar i deras användning i behandling av cancer.

Det finns två kritiska punkter som är avgörande för framgångsrik utvärdering av kemikalier för deras genotoxiska egenskaper, dvs deras potenser att bilda kovalenta DNA addukter, specifikt: (i) att hitta, lösa och karakterisera effektiviteten av enzymatisk system kan aktivera cancerframkallande ämnen/droger till elektrofil arter bindande nukleofil centrerar av DNA, och (ii) att utveckla och använda den mest lämpliga tekniker, som cancerframkallande/drogen – DNA addukter hittas och strukturellt kännetecknas. Lämpliga metoder för båda funktionerna beskrivs i denna studie.

Isolering förfaranden för cellulära fraktioner som innehåller biotransformationsenzymer (mikrosomala eller cytosoliska prov som innehar P450s och ytterligare bioactivating enzymer dvs peroxidaser eller reductases POR, NQO1, XO och AO), protokollen för Bioaktivering av test cancerframkallande ämnen/droger de enzymatiska system (inkubationer med DNA), och deras användning som visas i detta arbete anges, vilket framgår av de representativa resultat, deras lämplighet för utvärdering av genotoxiska egenskaper av kemikalier.

Ytterligare, metoderna som är lämpliga för detektion och kvantifiering av addukter med DNA som två anrikning versioner av 32P-postlabeling tekniken (de nuclease P1- och n -butanol extraktionsprocessen) och användning av radioaktivt märkt testade föreningar visade sig vara lämpliga för studier utvärdera genotoxicitet cancerframkallande/drog xenobiotika.

Om fastställande av de kovalenta DNA addukter, inte bara dessa två metoder, men även andra metoder som lämpar sig för detektering och mätning av DNA addukter har varit etablerade8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. fram till 1981, kvantifiering av DNA addukter utnyttjad radioaktiva kemikalier (cancerframkallande ämnen/narkotika), märkt av 3H eller 14C, som har utarbetats syntetiskt. Sådana metoder har använts med fördel för studier med ellipticine som beskrivs i detta arbete (se53,54). Det är dock vanligtvis svårt att förbereda derivat med hög radioaktivitet för deras framgångsrika användning73,80,81. Därför, även om detta förfarande fortfarande används, är det tyvärr begränsat i vitro experiment liknande dem som beskrivs här. Andra tekniker, masspektrometri, electron spraya jonisering (ESI), matrix-assisted laser desorption jonisering (MALDI), accelerator masspektrometri (AMS), fluorescens, biologiska metoder såsom immunoassay, och 32 P-postlabeling beskrivs i denna studie i detalj, framkallades (för genomgång, se8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

32P-postlabeling analysen beskrivs i protokollet av detta arbete visas, som inte bara har tillämplighet i in vitro- experiment (se representativa resultat), nämligen, testa nya föreningar för genotoxicitet eller mekanistisk utredningar av cancerframkallande/drog aktiveringen, men har också ytterligare användningar som utvärderingen av människors exponering för miljömässiga carcinogener, studier på mekanismer för tumörutveckling, övervakning reparation av DNA, att undersöka DNA skada av endogena föreningar och oxidativa reaktioner och undersöker att bemöta patienter cytotoxiskt anticancer droger72,83.

Denna teknik är dock inte utan några begränsningar73. Lesioner i DNA, som inte är stabil som monodeoxynucleotides, inte kan fastställas på ett tillförlitligt sätt. 32P-postlabeling metod är inte kan identifiera strukturerna för DNA addukt. Därför, strukturell karaktärisering av DNA addukter ofta förlitar sig på visar deras co-kromatografi med syntetiska standarder av kända strukturer. Sådan metod användes faktiskt i båda exemplen av representativa resultaten i detta arbete (ellipticine, 3-NBA).

Sammanfattningsvis, de protokoll som visas i detta arbete kan betraktas som lämpliga metoder att utvärdera styrkan av miljömässiga kemikalier eller droger vara enzymatiskt bioaktiverade metaboliter genererar kovalent DNA addukter, en mycket viktig process för den utveckling av cancer och dess behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av tjeckiska vetenskapsstiftelsen (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14, (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21, (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29, (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25, (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14, (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57, (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213, (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5, (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6, (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577, (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14, (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30, (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13, (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3, (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7, (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12, (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6, (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231, (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45, (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8, (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150, (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814, (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21, (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17, (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28, (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658, (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73, (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158, (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14, (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90, (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23, (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63, (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65, (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18, (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118, (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23, (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17, (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234, (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500, (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116, (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726, (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127, (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62, (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16, (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64, (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82, (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2, (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302, (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37, (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148, (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20, (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31, (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204, (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20, (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221, (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26, (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34, (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247, (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4, (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14, (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378, (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35, (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23, (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27, (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2, (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334, (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics