Bildung von kovalenten DNA Addukte durch enzymatisch aktivierten Karzinogene und Drogen In Vitro und ihre Entschlossenheit von 32P-postlabeling

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bewertung der Wirksamkeit des Umweltchemikalien und Drogen, enzymatisch, zu sein Bioactivated, Zwischenprodukte, die Generierung von kovalenten DNA Addukte, ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Für zusammengesetzte Aktivierung zu bilden werden Methoden beschrieben, die DNA-, die sowie Techniken für die Erkennung und Quantifizierung Addukten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kovalenten DNA Addukte gebildet durch Chemikalien oder Drogen mit krebserzeugenden Potenz sind als einer der wichtigsten Faktoren in der Initiierungsphase krebserzeugende Prozesse beurteilt. Diese kovalente Bindung, die die Ursache der Tumorgenese angesehen wird, wird nun als ein zentrales Dogma der chemischen Karzinogenese ausgewertet. Hier werden Methoden beschrieben, mit den Reaktionen, die durch Cytochrom P450 katalysiert und zusätzliche Biotransformation Enzyme zu untersuchen, die Potenz von Chemikalien oder Medikamente für ihre Aktivierung Metaboliten bilden diese DNA Addukte. Verfahren werden vorgestellt, beschreibt die Isolation der zellulären Fraktionen besitzen Biotransformation Enzyme (mikrosomale und cytosolischen Proben mit Zellfarbstoffe P450 oder anderen Biotransformation Enzymen, d. h., Peroxidasen, NADPH: Cytochrom P450 Oxidoreductase, NAD (P) H:quinone Oxidoreductase oder Xanthin-Oxidase). Darüber hinaus werden Methoden beschrieben, kann für die Stoffwechselaktivierung analysierten Chemikalien durch diese Enzyme sowie zur Isolierung von DNA verwendet werden. Darüber hinaus die entsprechenden Methoden zur Erkennung und Quantifizierung von Chemie-/Drogen-abgeleitete DNA Addukte d.h.verschiedene Modifikationen der 32P-postlabeling-Technik und Einsatz von radioaktiv-markierten analysiert, Chemikalien, sind detailliert dargestellt.

Introduction

Der Stoffwechsel von Xenobiotika (Umweltchemikalien oder Drogen) erfolgt in zwei Phasen1. Phasen I und II sollen die ursprünglich hydrophoben (nicht wasserlöslichen) Verbindungen mehr hydrophile Rendern (wasserlöslich), wodurch sie leicht excretable über Urin, Kot oder Schweiß. Phase-I-Reaktionen (Funktionalisierung) gehören Oxidation, Reduktion, und Hydroxylierung katalysiert durch Enzyme wie Cytochrom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (i.e., Cyclooxygenase COX), Aldo-Keto Reduktasen (AKRs) und mikrosomale Flavin-haltigen Monooxygenases (RGV). Phase I beinhaltet auch Reduktionsreaktionen, vermittelt durch eine Vielzahl von Reduktasen z.B. mikrosomale NADPH: Cytochrom P450-Reduktase (POR) und cytosolischen NAD (P) H:quinone Oxidoreductase (NQO1), Xanthin-Oxidase (XO) und Aldehyd Oxidase (AO)1 . In der zweiten Phase (Konjugation), der funktionellen Gruppen, die in Phase angefügt wurden früher habe ich sind kleine polare Moleküle weiter zu steigern, die Polarität zu konjugieren. Beispiele für Enzyme, die als zur Teilnahme an der Reaktion der Phase II gehören Sulfotransferasen (Ergebnisse), N, O- Acetyltransferases (NATs), Methyltransferasen wie Brenzcatechins -O- Methyltransferase (COMT), Glutathion- S- Transferasen (GSTs) und Uridin-diphosphat Glucuronosyltransferases (UGTs)1. Die Klassifizierung von Enzymen in Phase I oder II ist, jedoch, nicht starr, und einige Enzyme können wohl in beiden Kategorien gruppiert werden.

P450 Enzyme (EG 1.14.14.1) sind die Häm, enthält Proteine, die in verschiedenen Organismen, die Teilnahme an der Biotransformation von vielen Chemikalien katalysieren ihre Umwandlung3,4. Die P450 Enzyme katalysieren Hydroxylierung viele Substrate mit einer Reaktion, wo ein Atom des Dioxygen in das Molekül von Xenobiotika, vorgestellt wird, während der zweite Atom Sauerstoff zu Wasser durch die Reaktion reduziert wird, die zwei Elektronen [der Gleichung (1 erfordert [)]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH +H2O+ NADP+ (1)

P450-Enzymen lokalisiert in der Membran des endoplasmatischen Retikulum von Säugerzellen (mikrosomale P450 Systeme) sind Mitglieder des Systems der multienzyme Monooxygenase, enthält weitere NADPH: Cytochrom P450-Reduktase (POR) und Cytochrom b5 , das Substrat des Enzyms als NADH: Cytochrom b5 Reduktase bezeichnet. Eine allgemein akzeptierte Theorie stellt die Hypothese auf, dass die Spender der zwei Elektronen benötigt für P450 das NADPH/POR System. Dennoch könnte Cytochrom b5 auch fungieren als Spender von Elektronen für P450, nämlich als Spender des Elektrons reduziert P450 bei zweiten Reduktion von seiner Reaktionszyklus wo wirkt es zusammen mit NADH: Cytochrom b5 Reduktase2,3,4.

Säugetiere nutzen verschiedene P450 Enzyme (z. B. die Enzyme der Familien 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 und 27) für die Synthese von wertvollen endogenen Verbindungen, wie Steroide, und verwenden Sie sie für Katabolismus von Naturprodukten2,3 . Die anderen CYP Säugetier-Enzymen, wie menschliche CYP1A2, 2 9, 2 19, 2-6 und 3A4, verstoffwechseln exogene Chemikalien, die als Arzneimittel verwendet werden. 5 , 6 die wichtigsten Enzyme katalysieren Metabolismus von Medikamenten sind CYPs der Unterfamilie 3A, vor allem CYP3A4. Die Konvertierungen von Xenobiotika wie Pro-Karzinogene und Pro-Giftstoffe werden durch menschliches CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 und 3A42,5vermittelt. Die meisten dieser CYPs sind vorhanden in der Leber (mit Ausnahme von CYP1A1 und 1B1). Dennoch sind die CYPs auch in mehrere extrahepatische Organe zum Ausdruck. Diese P450s möglicherweise von großer Bedeutung, vor allem wenn sie beteiligen, reaktive Zwischenprodukte in diesen Organen7Bioaktivierung Stoffwechsel von Chemikalien (Drogen). Verschiedenen P450s werden durch mehrere Verbindungen, die deren Substrate sind, induziert, obwohl dies nicht unbedingt der Fall ist.

Viele P450 Enzyme spielen eine Rolle in chemischen (Medikament) Toxizität. Die Xenobiotika nicht nur in ihrer Entgiftung Stoffwechselprodukte umwandeln können, sondern auch zu reaktiven Spezies, die endogene Makromoleküle zu, die zusätzlich unterschiedliche biologische Eigenschaften ändern zeigen, verursacht in der Regel ihre Toxizität zu aktivieren. DNA, Lipide und Proteine könnten die Ziele für ihre Änderung durch reaktive Electrophiles und radikale aus aktivierten Chemikalien erzeugt werden. Im Falle von DNA mehrere wichtige gen Reaktionen und ihre Mechanismen zu lösen sind bereits bekannt,2,3,4,5.

Die Veränderungen in der DNA führt zu einer Abnahme der Zelle Wachstumskontrolle, und dieses Phänomen wird als der vorherrschende Faktor der Entwicklung von Karzinogenen Prozessen. Die Generation der kovalenten DNA Addukte mit Chemikalien mit krebserzeugenden Potenz wird beurteilt, wie einer der wichtigsten Schritte in der Anfangsphase des krebserregenden8,9,10,11verarbeitet. Es konnte gezeigt werden, dass die Beziehungen zwischen der Bildung von DNA-Addukten und Tumorgenese auftreten, während eine Abnahme der Menge an DNA Addukte verantwortet Chemoprävention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. die Bildung von Karzinogen/Drogen-abgeleitete DNA Addukte hängt von einzelnen Basen der DNA und wird beeinflusst durch die diese Basen in der DNA-Sequenzen. Die Reparatur von DNA-Addukten sind abhängig von ihrer Lage (auf der transkribierten oder nicht transkribiert DNA-Strang) und Arten von modifizierten Nukleotid-Sequenzen8,11,12,15, 16.

In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren unter Verwendung der Enzym-katalysierte Umwandlung von Chemikalien (Drogen) zu untersuchen, ihre Potenz in Metaboliten aktiviert werden die DNA verändert (Erzeugung von DNA-Addukten). Für die kovalente Bindung der DNA, die Testverbindung sollte in der Regel entweder durch oxidativ oder reduktiv Reaktionen, je nach individuellen Drogen aktiviert. Oxidativ oder reduktiv Aktivierung des getesteten Chemikalien wird durch eine enzymatische System vorhanden in der subzellulären mikrosomale Fraktion P450-abhängigen vermittelt oder durch Reduktion mit Reduktasen präsentieren sowohl in Microsomen (POR, NADH: Cytochrom b5 Reduktase, P450 Enzyme) und zelluläre cytosolischen subzellularen Brüche (NQO1, XO, AO, Peroxidase). Reaktive Metaboliten danach an DNA binden bilden DNA Addukte. Da oxidative und reduktive Reaktionen wichtig, mehrere Medikamente um diese reaktive Spezies zu aktivieren sind, werden die experimentellen Verfahren beschäftigt die enzymatische Oxidation/Reduktion-System beschrieben. Darüber hinaus die entsprechenden Methoden zur Erkennung und Quantifizierung dieser DNA Addukte werden detailliert beschrieben.

Zwei unabhängige Verfahren um festzustellen, ob die Testchemikalie durch enzymatische Systeme aktiviert ist an DNA gebunden werden empfohlen: 32P-postlabeling Technik und Verwendung radioaktiv markierten Substanz (z. B.., 3H oder 14 C). Zum ersten ist Pilot, screening- 32-P-postlabeling-Test empfohlen. Die Bestimmung der DNA-Gehalt in Lösungen, genau ausgewertet, muss beide Methoden vorausgehen.

Die 32P-postlabeling-Technik nutzt die enzymatische Hydrolyse von DNA durch nicht-radioaktiven Chemikalien (karzinogen/Medikament), 3´-Phosphodeoxynucleosides, weitere Phosphorylierung mit radioaktivem Phosphor (32P) an der 5´ - modifiziert OH Addukte Position und die Trennung von chemischen Deoxynucleotide von normalen (unveränderten) Deoxynucleotides durch Chromatographie17 (Abbildung 1). DNA, die durch die chemische Verbindung geändert wird durch eine Mischung von Endonuklease, micrococcal Nuklease und Exonuclease, bekannt als Milz Phosphodiesterase hydrolysiert. Die Mischung aus hydrolysierten DNA enthält beide Normal (unverändert) und Deoxyribonucleoside, die 3´-Monophosphates mit [γ -32P] ATP in Gegenwart von Träger (nicht radioaktiv) ATP und T4-Polynukleotid-Kinase bei pH 9,5 für Form 5´- reagiert wird geändert 32P-Label 3´, 5´-Bisphosphates ("standard" Verfahren in Abbildung 1). Die verwendeten alkalische pH-Wert ist in der Lage die Enzymaktivität der T4-Polynukleotid-Kinase, Deoxyribonucleoside 3´-Monophosphates in Position 3´ dephosphorylate zu minimieren. Trennung und Auflösung von 32P-Label von Addukten beschrifteten Deoxynucleotides, die nicht durch Chemikalien verändert werden erfolgt durch multidirektionale Anion-Austausch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Polyethyleneimine (PEI) Cellulose (Abbildung 2 ). In der ersten und zweiten Elution Schritte (D1 und D2) sind beschriftete normal (unveränderten) Deoxynucleotides sowie [32P] Phosphat von Anfang an die TLC-PEI-Zellulose-Platte mit Wasserlösungen von Elektrolyten auf ein kurzes Stück eluiert. chromatographische Papier auf der Oberseite der TLC Platte angewendet, während die Deoxynucleotides mit gebundenen chemischen ausstellenden hydrophobe Eigenschaften (karzinogen/Drogen-Addukte) zu Beginn des PEI-Zellulose-Platte zusätzlich gelöst werden gepflegt werden mit mehreren verschiedenen Lösungsmittel Systemen in D3 und D4 Richtungen (Abbildung 2). Lokalisierung von Addukten erfolgt mittels Autoradiographie Bildschirm erweitert; die getrennten Addukte als erkennbare Pigmentflecken auf Röntgenfilme erkannt werden. Die Flecken sind von der Platte herausgeschnitten und verwendet, um Radioaktivität quantifizieren von liquid funkeln oder Cerenkov zählen. Eine Lagerung Phosphor bildgebendes Verfahren, das wurde angepasst zu ordnen und zu quantifizieren DNA Addukte auf Chromatogramme erkannt durch die 32P postlabeling Assay wird nun auch genutzt. 18 the Instant Imager Maschine wird häufig genutzt, für solche Erkennung und Quantifizierung von DNA-Addukten. Diese Methode bietet mehr als 10 - Mal höheren Empfindlichkeit zur Erkennung von 32P, als die Technik der Bildschirm Autoradiographie19erweitert.

Mengen von DNA-Addukten werden als Werte der relativen Kennzeichnung (RAL) Addukt, berechnet unter Verwendung der Gleichung (2) wie folgt ermittelt:

CPM. im Addukt deoxynucleotides
RAL =---(2)
spezifische Aktivität von 32P-ATP (in cpm. / Pmol) X pmol Deoxynucleotides

Die Werte der RAL sind das Verhältnis der Zählraten von adduziert Deoxynucleotides über Zählraten von insgesamt [adduziert und normal (unveränderten) Deoxynucleotides] Deoxynucleotides20,21. Allerdings ist diese Berechnung basiert auf gleich Kennzeichnung Wirkungsgrade von Addukten und normalen Deoxynucleotides22. Das klassische ("standard") Verfahren der 32P-postlabeling-Technik eignet sich für verschiedene DNA-Addukten (sperrige und/oder nicht sperrige Addukte), seine Empfindlichkeit ist jedoch nicht zufriedenstellend zu erkennen Addukte gefundene in geringe Mengen in der DNA. Bei diesem Verfahren ist die Menge an ein Addukt in 107 unverändert Deoxynucleotides in DNA (0,3 Fmol Addukt/µg DNA) nachweisbar.

Eine Vielzahl von Modifikationen von dieser klassischen 32P postlabeling Verfahren wurden genutzt, um erhöhen die Empfindlichkeit der Technik. Bis zu 10 bis 100 Mal höhere Empfindlichkeit der Bestimmung der Addukte von 32P-Kennzeichnung wurde erreicht mit begrenzenden Ebenen von [γ -32P] ATP (Intensivierung-Verfahren). 23 , 24 ein weiteres Verfahren, vorausgesetzt, dass eine Erhöhung der Empfindlichkeit der 32P-postlabeling-Methode nutzt eine Inkubation von verdaute DNA-haltigen Addukte mit Nuklease P1 (aus Penicillium Citrinum)21 (Abbildung 1). Dieses Enzym lieber unveränderten Deoxyribonucleoside 3´-Monophosphates, dephosphorylate, während die Deoxynucleotides mit gebundenen Chemikalien (adduziert Nukleotide) im Wesentlichen nicht die Substrate dieses Enzyms sind. Daher Rezeptorsignals Deoxyribonucleoside 3´-Monophosphates (d.h., Deoxyribonucleosides) sind nicht phosphoryliert durch T4-Polynukleotid-Kinase durch [32P] Phosphat von γ -32P] ATP. Jedoch einige der Nukleotide wo Chemikalien sind gebunden (adduziert Deoxynucleotides), wie z. B. Arylamine Addukte an C8 Deoxyguanosine, kann Bedephosphorylated durch dieses Enzym ersetzt. Im Gegensatz dazu, die meisten anderen Addukte (z. B.Addukten ersetzt N2 der Deoxyguanosine) sind nicht durch Nuklease P1 Rezeptorsignals. Diese Änderung von 32P-postlabeling macht diese Methode wesentlich empfindlicher, die Empfindlichkeit zu erhöhen, um mehr als drei Größenordnungen. Darüber hinaus diese Version von 32P-postlabeling bietet eine Methode, wo höhere Mengen von DNA (5-10 µg) und ein Übermaß an trägerfreien [γ - 32P] ATP genutzt werden.

Eine andere Methode zur Bereicherung der Addukte, von Gupta25beschrieben, nutzt die physikalisch-chemischen Eigenschaften von sperrigen Deoxynucleotide Addukte, die in nextrahiert werden können-Butanol in Anwesenheit einer Phase Transfer Agent Tetrabutylammonium Chlorid (TBA) (Abbildung 1) vor [32P] Phosphat Kennzeichnung, während unveränderte Deoxynucleotides schlecht durch diese organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Allerdings weniger hydrophob Addukte, bestehend aus Beispiel Deoxynucleotides mit nicht-aromatischen sperrige Moieties oder kleine Alkyl Rückstände, geändert werden nicht effektiv extrahiert mit n-Butanol. Daher sind sie im Wesentlichen nicht nachweisbar, wenn durch diese Änderung der 32P-postlabeling Methode analysiert werden.

Den zuvor genannten Versionen von 32P postlabeling Steigerung der Empfindlichkeit und Quantifizierung von DNA-Addukten enorm (bis zu drei Größenordnungen), pro 109,10 normale Addukt man erkennen Nukleotide (0,3 - 3 Amol/µg DNA). Diese beiden Methoden sind zu empfehlen für die Prüfung der Chemikalien für ihre Effizienz, kovalent an DNA zu binden, und daher werden sie in diesem Werk ausführlich beschrieben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren (311/1997, Ministerium für Landwirtschaft, Tschechien), die in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki ist.

1. Isolierung der hepatischen mikrosomale und cytosolischen Brüche

  1. Bereiten Sie Leber subzellularen Brüchen (Microsomen reich an P450 Enzyme oder Cytosols reich an Reduktasen oder lösliche Peroxidasen) von Ratten durch einfache differentielle Zentrifugation (105.000 X g).
    Hinweis: Das Pellet und überstand sind Microsomen sowie Cytosols, bzw. übernommen.
    1. Waschen Sie die Leber Proben (1-10 g) zweimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7.4 mit 150 mM KCl Buffer (Puffer 1) (10-mal höhere Volumina als Gewicht des Gewebes, d. h. 10-100 mL) und die Geweben in kleine Stücke schneiden (von etwa 2 x 2 mm groß).
    2. Das Gewebe in der Gegenwart dieses Puffers zu homogenisieren (> 3 Volumen/Gewicht mL/g) im Homogenisator bei 4 ° C für 5 min und entsorgen nicht homogenisiert Reststücke des Gewebes durch Filtration mit Filterpapier. Homogenat 600 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand auf eine andere Zentrifugation Rohr übertragen.
    3. Das Pellet in Puffer 1 (1 mL pro 1 g Gewebe) erneut zu homogenisieren, wiederholen Sie Schritt 1.1.3., und entsorgen Sie die Tablette. Zentrifugieren Sie zusammengefasste Überstände bei 15.000 X g für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand auf ein weiteres Zentrifugieren Rohr.
    4. Zentrifugieren des Überstands bei 105.000 X g für 60 min bei 4 ° C. Erheben Sie den überstand (Zytosol) und speichern Sie es in Aliquote (1-10 mL) bei-80 ° C. Charakterisieren Sie Zytosol für den Betrag von Protein mit der Methode von Bradford26beschrieben.
    5. Wieder aussetzen das Pellet in 100 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7.4 (> 2 Volumen/Gewicht mL/g), Zentrifuge bei 105.000 X g für 60 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Neu Pellet (Microsomen) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7.4 mit 150 mM KCl und 20 % Glycerin zu homogenisieren (< 5 Volumen/Gewicht mL/g) im Homogenisator bei 4 ° C. Speichern Sie Microsomen in 0,5 - 1 mL-aliquoten bei-80 ° C. Charakterisieren Sie Microsomen für den Inhalt der Proteine, die mit der Methode von Bradford26beschrieben.
    6. Die Konzentration von Cytochrom P450 in Microsomen zu bestimmen.
      Hinweis: Die Konzentration der P450 Enzyme in Microsomen wird gemessen, wie von Omura und Sato27, Bestimmung der Absorption des Komplexes der reduzierten P450 mit Kohlenmonoxid (CO) beschrieben. Kohlenmonoxid ist eine giftige Substanz und muss mit Sorgfalt und in eine Kapuze behandelt werden.

(2) Inkubationen von Prüfchemikalien (Karzinogene/Drogen) mit DNA in Anwesenheit von Enzymsysteme

  1. Inkubation von Prüfchemikalien (Karzinogene/Drogen) mit DNA in Anwesenheit von oxidative Enzymsysteme mit Zellfarbstoffe P450
    1. Bereiten Sie Inkubation-Mischungen, die, in einem Endvolumen von 0,75 mL bei 4 ° C, die folgenden Verbindungen und enzymatische Systeme vor.
      1. Mischen Sie 100 mM Phosphat-Puffer, pH 7,4, (0,375 mL) mit 10 mM NADPH oder NADPH erzeugenden System (10 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose-6-Phosphat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase) (75 µL).
      2. Fügen Sie in diese Mischung Microsomen oder reine rekombinante P450 in Supersomes, die Microsomen isoliert von Insektenzellen sind transfiziert mit einem Baculovirus Konstrukt mit cDNA des rekombinanten P450 Enzyme, 50 Pmol P450 Enzyme in 50 µL mikrosomale oder supersomal Vorbereitungen - hepatische mikrosomale Brüche im Labor oder aus kommerziellen Quellen isoliert.
      3. Fügen Sie 1 mg Kalb Thymus DNA (0,3 mL Stammlösung - 3,3 mg/mL in destilliertem Wasser), und schütteln auf einen Wirbel Shaker für 5 s.
      4. Zu guter Letzt fügen Sie 7,5 µL 0.1 mM Test Ellipticine Medikament aufgelöst in DMSO und 42,5 µL destilliertes Wasser um ein Volumen von Inkubation Mischung von 0,75 mL erreichen. Verwendung Chemikalien beschriftet mit 3H oder 14C oder ungekennzeichnete Chemikalien, je nach Verfahren zum Nachweis von DNA-Addukten.
      5. 5 S. Inkubation in geöffneten Röhren bei 37 ° C für 30-60 min auf einem Vortex-Shaker schütteln.
      6. Auch bereiten Sie zwei Kontrolle Inkubationen ähnlich, aber (i) ohne ein aktivierendes System (mikrosomale Proben) oder (Ii) mit ihm, aber ohne die Testverbindung.
  2. Inkubationen Prüfchemikalien (Karzinogene/Drogen) mit DNA in Anwesenheit von reduzierenden Enzymsysteme
    1. Bereiten Sie Inkubation-Mischungen, die, in einem Endvolumen von 0,75 mL bei 4 ° C, die folgenden Verbindungen und enzymatische Systeme vor.
      1. Mischen Sie bei 4 ° C, 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, mit 0,2 % Tween 20, (0,375 mL), 10 mM-Lösung der Cofaktor NQO1 reduzierenden Enzyms (NADPH) (75 µL), cytosolische Fraktion (hepatische cytosolischen Fraktionen - isoliert, im Labor oder im Falle der Verwendung der cytosolischen Bruchteile von einzelnen menschlichen Spendern erhalten sie von der kommerziellen Quelle, enthält 1 mg Protein (50 µL) wurden isoliert).
      2. Fügen Sie 1 mg Kalb Thymus DNA (0,2 mL der Stammlösung - 3,3 mg/mL destilliertes Wasser), und schütteln im Shaker für 5 s.
      3. Schließlich fügen Sie 7,5 µL 0.1 mM Prüfchemikalie (gelöst in destilliertem Wasser, Methanol, Ethanol oder DMSO, abhängig von der Löslichkeit der Verbindung) und 42,5 µL destilliertes Wasser auf ein Volumen von 0,75 mL für die Inkubation Mischung zu erreichen. Verwendung Chemikalien beschriftet mit 3H oder 14C oder ungekennzeichnete Chemikalien, je nach Verfahren zum Nachweis von DNA-Addukten (siehe unten).
      4. Spülen Sie das Reaktionsgemisch mit Argon für 1 min. lang 5 S. Inkubation in verschlossenen Röhrchen bei 37 ° C für 30-60 min auf einem Shaker schütteln.
      5. Auch bereiten Sie zwei Kontrolle Inkubationen ähnlich, aber (i) ohne ein aktivierendes System (cytosolischen Fraktionen) oder (Ii) mit ihm, aber ohne die Testchemikalien.
  3. Extraktion der Inkubation Mischungen mit organischen Lösungsmitteln, den Überschuss der Prüfchemikalien entfernen
    1. Mischen Sie die Inkubation Mischung in einem Reagenzglas mit einer Kappe mit dem gleichen Volumen von Ethylacetat (oder Diethylether oder Hexan) durch das Hinzufügen dieser Lösungsmittel. Schütteln Sie den Inhalt des Röhrchens auf einen Shaker, bis sich eine Emulsion bildet.
    2. Drehen Sie (3 min) mit 1.600 X g in einer Zentrifuge bei Umgebungstemperatur. Wenn die organischen und wässrigen Phasen nicht richtig getrennt sind, drehen Sie noch einmal für einen längeren Zeitraum oder mit einer höheren Geschwindigkeit der Zentrifugation.
    3. Entfernen Sie die obere, organische Phase sammeln mit einer Pipette. Wenn kleine Mengen (< 400 µL) werden verwendet, nutzen Sie eine automatische Pipette mit einem entsprechenden Hinweis versehen. Diese organische Phase beiseite.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1., 2.3.2., und 2.3.3. Entfernen Sie verbleibende organische Lösungsmittel durch einen Strom von Stickstoffgas (mindestens 5-10 min Entfernung sind erforderlich).
  4. Isolierung der DNA aus Inkubationen
    1. Extraktion von DNA aus Lösungen mit Phenol/Chloroform und seinen Niederschlag mit ethanol
      1. Beseitigen Sie Proteine, um DNA aus Inkubation Mischungen durch die Gewinnung von Proteinen aus Lösungen der DNA mit Phenol, Phenol/Chloroform (1:1), zu isolieren und chloroform nach dem unten gezeigten Verfahren.
      2. Kombinieren Sie die Inkubation-Mischung mit der gleichen Menge von Phenol oder Phenol/Chloroform (1:1) in einem Falken oder Eppendorf-Röhrchen mit einer Kappe. Rühren Sie die Mischung, bis sich eine Emulsion bildet.
      3. Drehen Sie (3 min) mit 1.600 X g in einer Zentrifuge bei Umgebungstemperatur. Wenn die organischen und wässrigen Phasen nicht richtig getrennt sind, drehen Sie noch einmal über einen längeren Zeitraum oder mit einer höheren Geschwindigkeit der Zentrifugation.
      4. Übertragen Sie die oberen Wasserphase mit einer Pipette auf eine neue Polypropylen-Rohr. Wenn kleine Mengen (< 400 µL) werden verwendet, verwenden ein automatisches Pipettieren mit einem entsprechenden Hinweis versehen. Entfernen Sie die Protein-Schnittstelle zusammen mit der organischen Phase.
      5. Kombinieren Sie die oberen Wasserphase mit der gleichen Menge an eine Mischung aus Phenol und Chloroform (1:1). 2.4.1.2 Schritte zu reproduzieren. -2.4.1.4.
      6. Kombinieren Sie die oberen Wasserphase mit der gleichen Menge von Chloroform und wiederholen Sie die Schritte 2.4.1.2. -2.4.1.4. Erholen Sie die DNA durch Fällung mit 2 Bände von Ethanol kalt (-20 ° C). Bestimmen Sie die Lautstärke der DNA-Lösung.
      7. Passen Sie die Konzentration der monovalente kationen durch Zugabe von Natriumchlorid 5 M ins Finale Konzentrationen von 0,1 M. kräftig rühren. Mit 2 Bände von Kälte (-20 ° C) Ethanol kombinieren Sie und mischen Sie richtig. Cool bis-20° C.
      8. Speichern Sie bei-20 ° C bis DNA ausgefällt wird. Wenn DNA während der Inkubationen fragmentiert ist (zB., durch Bildung von Sauerstoffradikalen während der enzymatischen Aktivierung Reaktion) oder bei der Isolierung der Größe der DNA, die klein ist (< 1 kb) oder als DNA ist in geringen Mengen (< 0,1 mg / (mL), die Zeit der Kühlung muss erhöht werden und die Temperatur sank auf-70 ° C.
      9. Drehen Sie (10 min) mit 1.600 X g bei 0 ° C in einer Zentrifuge. Wenn DNA in geringen Konzentrationen oder in Form von kleinen Fragmenten vorliegt, spin noch einmal über einen längeren Zeitraum (30 min). Verwerfen Sie den überstand.
      10. Um alle gelösten Stoffen (oder Restspuren des chemischen Tests) entfernen die in ausgefällte DNA vorhanden sein könnte, waschen Sie DNA mit 70 % Ethanol und Diethylether. Wash ausgefällt DNA mit Kälte (-20 ° C) 70 % Ethanol. Drehen Sie (10 min) mit 1.600 X g bei 0 ° C in einer Zentrifuge. Verwerfen Sie den überstand.
      11. Wiederholen Sie den Schritt 2.4.1.10. Wash ausgefällt DNA mit Kälte (-20 ° C) 70 % Ethanol. Drehen Sie (10 min) mit 1.600 X g bei 0 ° C in einer Zentrifuge. Verwerfen Sie den überstand.
      12. Wiederholen Sie den Schritt 2.4.1.10. Habe das Rohr in einen vertikalen Zustand auf saugfähigem Papier, den verbleibenden überstand zu entfernen. Waschen Sie das DNA-Pellet durch Zugabe von 1 mL Diethylether, mögliche Rückstände von Chemikalien aus der isolierten DNA Test zu verwerfen. Drehen Sie (10 min) mit 1.600 X g bei 0 ° C in einer Zentrifuge. Verwerfen Sie den überstand.
      13. Das DNA-Pellet in das entsprechende Volumen auflösen (meist in 100-400 µL zu einem DNA-Konzentration von 0,5 - 1 µg/µL) von destilliertem Wasser (oder 0,15 mM Natriumcitrat und 1,5 mM Natrium-Chlorid). Die DNA-Lösung kann bei 4 ° C über Nacht stehen, oder auf 37 ° C für 10-30 min zu erhöhen, Auflösen von DNA erhitzt werden kann.
      14. Trennen Sie vor der Einlagerung die DNA in kleine aliquoten (10-20 µL), weil wiederholtes Einfrieren und Auftauen des DNA-Lösungen führen zu einem Rückgang der Konzentrationen Addukt könnte. Speichern Sie bei-80 ° C oder kälter.
        Hinweis: Photometrische Bestimmung der DNA: die einfache und genaue Methode, die weit verbreitet ist, die Menge von DNA in einer Zubereitung zu messen, wenn die Probe rein ist (d.h., ohne erhebliche Mengen an Schadstoffen wie Protein, Phenol oder andere Nukleinsäuren), zieht die photometrische Messung der Menge an DNA von UV-Bestrahlung durch die Basen (siehe die zuvor beschriebenen Verfahren)28.
  5. Verfahren zum Nachweis von DNA-Addukt Bildung
    1. 32 P-postlabeling-assay
      Hinweis: DNA Hydrolyse nutzt das Hydrolysat bereit zu diesem Zeitpunkt für die Analyse der Addukte (2.5.1.) sowie der normalen (unveränderten) Deoxynucleotides (2.5.7.).
      1. Micrococcal Nuklease (MN) in Wasser mit einer Konzentration von ~ 450 Einheiten (U) auflösen / mL. Dialyse gegen destilliertes Wasser und passen Sie bis 300 U/mL. Dialyse Milz Phosphodiesterase (SPD) Lösung und stellen Sie bis 4 U/mL.
      2. Mischen Sie MN und SPD Endkonzentrationen 150 mU/µL MN und 2,5 mU/µL SPD (MN/SPD-Lösung). DNA-Lösung mit 12,5 µg nehmen und zu Trockenheit in einem Verdampfer verdampft. In 6,5 µL destilliertes Wasser auflösen.
      3. Fügen Sie 5,0 µL MN/SPD-Lösung (Endkonzentration von MN ist 60 mU/µL, Endkonzentration der SPD ist 1 mU/µL) und 1,0 µL Verdauung Puffer (Endkonzentration von Natrium Succinat beträgt 20 mM, Endkonzentration von CaCl2 8 mM). Der letzte Band des Gemisches ist 12,5 µL. Mix und Reaktionen für 3 h bei 37 ° C.
      4. Entfernen Sie 2,5 µL (Übertragung auf eine andere Röhre) für weitere Verdünnung und Analyse der unveränderten Deoxynucleotides (2.5.7.)
    2. Nuklease P1 Bereicherung Verfahren
      1. Hinzufügen der restlichen 10.0 µL Hydrolysat 0,65 µL Natrium Acetat-Puffer (Endkonzentration, 40 mM), 0,65 µL ZnCl2 Lösung (Endkonzentration 0.1 mM), 1,25 µL NP1 Lösung (Endkonzentration, 0,385 µg/µL) und 0,45 µL destilliertes Wasser. Der letzte Band des Gemisches ist 13 µL.
      2. Lassen Sie die Mischung für 30 min bei 37 ° C reagieren, und am Ende der Reaktion mit Zusatz von 3 µL Tris-Lösung.
    3. n-Butanol Bereicherung Verfahren
      1. Die restlichen 10.0 µL DNA-Hydrolysat fügen Sie 215 µL 11,6 mM Ammonium-Formiat Lösung, pH 3,5 und 25 µL 10 mM TBA-Chlorid-Lösung hinzu. Auszug mit 250 µL n-Butanol (mit Wasser gesättigt) durch kräftig mischen. Spin (3 min) bei 1.600 X g Lagen trennen und Ausziehen der oberen n-Butanol Schicht. Extrahieren Sie einmal mehr mit 250 µL n-Butanol (mit Wasser gesättigt), spin, nehmen Sie die oberen n-Butanol Schicht und verbinden sich mit ehemaligen Extrakt.
      2. 400 µL Wasser dazugeben (gesättigt mit n-Butanol) zu extrahieren, und mischen Sie kräftig. Drehen Sie, um Schichten zu trennen und löschen Sie die untere wässrige Schicht. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 400 µL Wasser (gesättigt mit n-Butanol). Hinzufügen 3 µL 250 mM Tris-HCl-Lösung, pH 9,5, n-Butanol Schicht. Verdunsten von n-Butanol, Trockenheit in einem Verdampfer bei Umgebungstemperatur.
      3. Auflösen den Rückstand in 100 µL n-Butanol, verdunsten zu Trockenheit wieder, und den Rückstand in 16,0 µL Wasser auflösen.
    4. Kennzeichnung von der Addukte
      1. Fügen Sie 1 µL Bicine-Puffer-Lösung (Kennzeichnung Puffer) und 4,5 µL einer Mischung mit 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 Pmol kalt ATP und 10.0 U der T4-PNK (T4-Phosphonucleotide-Kinase), 16,0 µL Lösung von NP1 oder Butanol Bereicherung-Mix. Die Endkonzentrationen der Reagenzien werden folgende sein: 20 mM Bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiotreitol, 0,5 mM Spermidine und 0,5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Das Gesamtvolumen der Mischung beträgt 20 µL.
      2. Lassen Sie die Mischung für 30 min bei Raumtemperatur zu reagieren. Anwenden die gesamte Stichprobe (i.e. 20 µL) auf die PEI-Zellulose TLC Platte (2.5.6.).
    5. Bewertung der Wirksamkeit von NP1 oder n -Butanol, die Verbesserung der Verfahren
      1. Waschen Sie der Boden des Röhrchens mit 50 µL Wasser. Mischung kräftig für 30 s und Spin (1 min) bei 1.600 X g in einer Zentrifuge, dort ist keine Verunreinigungen auf dem Deckel. Spot 5 µL auf einem PEI-Zellulose TLC Platte (20 x 20 cm). Chromatographen mit einer Lösung 280 mM (NH4)2SO4 und 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. TLC-Trennung von adduziert deoxynucleotides
      1. Vorwäsche der TLC-Platten mit destilliertem Wasser. Es empfiehlt sich vor allem für selbst gemachte Platten.
        Hinweis: Diese waschen sollte durchgeführt werden, Hintergrund, insbesondere Lösungsmittel vorne erhöhen kann, die gelbe Farbe von Platten, eine Farbe zu entfernen.
      2. Vor Ort die gesamte Probe auf die PEI-Zellulose TLC Platte und starten Chromatographie (2.5.4.); Sanierung von Addukten erfolgt durch die Entwicklung der Platte in D1 und D2 (Abbildung 2).
      3. Entwickeln Sie die Platte in Richtung D1 (Abbildung 2). Verwendung 1,7 M Natriumphosphat Puffer pH 6,8, um sicherzustellen, dass die DNA Addukte bleiben zu Beginn der TLC Platte. Analog, entwickeln Sie die Platte in eine D2-Richtung mit diesen Puffer. Für Informationen über mögliche Puffer für Verfahren siehe Lösungen für Auflösung von mehreren Arten von beschrieben Addukte20,28.
        Hinweis: Die Entwicklung der Platte in eine Richtung D2 kann weggelassen werden.
      4. Waschen Sie die Platte in entionisiertem Wasser nach Chromatographie für ca. 5 min in zwei aufeinander folgenden Bädern. Nach dem Trocknen der Platten.
      5. Die Platten in D3 und D4 Richtung mit 3,5 M Lithium Formiat Puffer, pH-Wert 3.5 zu entwickeln, mit 8,5 M Harnstoff für D3 Richtung und 0,5 M Tris-HCl-Puffer, pH 8.0, mit 0,8 M LiCI und 8,5 M Harnstoff für D4 Richtung (Abbildung 2). Das Lösungsmittel müssen angepasst werden um die Addukt-Spots über die TLC Platte zu entwickeln. Sehen Sie für Informationen über mögliche Puffer für D3 und D4 entwickelnden Verfahren die Lösungen beschrieben, für die Auflösung von mehreren Arten von23,24,25,28Addukte.
      6. Zur Vermeidung von Problemen im D4, nach der Entwicklung in Richtung D4 und eine Wasserwäsche entwickeln Sie die Platten (entlang D4) in 1,7 M Natriumphosphat, pH 6.0 (in der Regel als Entwicklung in Richtung D5 zugewiesen), an die Spitze des Papiers Docht (12 x 11,5 cm).
        Hinweis: Die D5 Richtung kann auch weggelassen werden. In diesem Fall ist es notwendig, den TLC-Tank zu öffnen, wenn das Lösungsmittel die Spitze der TLC erreicht ist, und ermöglichen einen Lauf für bis zu 60 min. Diese Methode ist noch besser als die Zugabe von einem Docht (die Methode, die häufig in vielen Laboren verwendet, um Probleme im D4 löschen).
    7. Quantifizierung der normalen (unveränderten) Deoxynucleotides nach Hydrolyse
      1. Eine aliquote Hydrolysat verdünnen (aus 2.5.1. beschreibt DNA Hydrolyse) mit destilliertem Wasser (i.e., 2,5 µL der Verdauung Mischung aus 2.5.1. 250 µL angepasst und 10 µL dieser Lösung angepasst an 150 µL).
      2. Nehmen eine 5 µL (10 Pmol normale Deoxynucleotides) aliquoten dieser Digest, 2,5 µL 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 9,0 und Label wie in 2.5.4. (der letzte Band des Gemisches ist 10 µL). Für 30 min bei Raumtemperatur reagieren lassen.
      3. Nehmen Sie 4 µL Aliquote des Gemisches und verdünnen Sie, 750 µL mit 10 mM Tris-HCl, pH 9,0. Mix und Spin, es gibt keine Verschmutzung des Deckels zu etablieren. 5 µL auf einem PEI-Zellulose TLC Platte auftragen. Entwickeln die TLC Platte in einer Lösung von 280 mM (NH4)2SO4 und 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Nach TLC trocknen lassen.
      4. Verwenden Sie Autoradiographie, die für ca. 45 min bei Raumtemperatur, die vier unveränderte Deoxynucleotide BIZ-Phosphate zu lokalisieren durchgeführt wird. Schneiden Sie vor Ort für die Quantifizierung von liquid funkeln oder Cerenkov zählen.
    8. Berechnung des relativen Addukt Kennzeichnung (RAL)
      1. Bestimmen Sie die Werte der Grafen in den Addukt Spots und den Grafen in den Aliquoten beschrifteten unveränderten Deoxynucleotides (normal).
        Hinweis: Letztere haben über 180.000 zählt weniger Material als die früheren, eine Figur zu bestimmen ist der Umrechnungsfaktor auf die Anzahl der unveränderten (normal) Deoxynucleotides für die Bewertung der RAL-Werte der Addukt Ebenen anwenden. RAL von DNA-Addukten bemisst sich nach der Gleichung (2) oben gezeigt.
    9. Erkennung der Bindung der Test Karzinogene oder Drogen an DNA mit radioaktiv-markierten Medikament
      1. 3H oder 14C Radioaktivität der DNA verändert mit Chemikalien durch liquid funkeln zählen zu bewerten.
      2. 3 mL einer funkeln-Lösung in der Durchstechflasche funkeln 10-50 µL DNA-Lösung hinzufügen. Mischen Sie gut. Messen Sie die Radioaktivität mit dem Szintillationszähler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verwenden die Protokolle für den Einsatz von Enzym-katalysierten Aktivierung (d. h. P450, Peroxidase und Reduktase) beschriebenen um zu Potenz von Chemikalien (Karzinogene/Drogen) zu untersuchen, um zu Zwischenprodukten, die wiederum ihre kovalente verstoffwechselt werden Bindung an DNA (Erzeugung von DNA-Addukten), konnten wir zu beheben (i) einen neuartigen Wirkmechanismus die pharmakologische Wirkung des Anti-Krebs-Agent-Ellipticine (für einen Beitrag sehen,29,30,31), (Ii) die Ätiologie von zwei Nephropathies zugeordneten oberen important Trakt Krebs verursacht durch Anlage Alkaloid Aristolochic Säure (Aristolochic Säure Nephropathie und Balkan endemische Nephropathie) (für einen Beitrag sehen,32,33,34, 35,36,37,38,39), und (Iii) Die gentoxischen Mechanismen der Karzinogenität von mehreren Karzinogene wie ein Luftschadstoff 3- Nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 und reduktive Pendant, 3-Aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 Pflanzen Alkaloid Aristolochic Säure,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 und ein aromatisches Amin- o- Anisidin. 49 , 50 , 51 , 52 weitere, die Enzyme, die Bestimmung der biologischer Wirkungen dieser Chemikalien ermittelt die beschriebenen Methoden.

Hier Vertreter führt auf oxidative Aktivierung von Ellipticine durch P450s und Peroxidasen was Generation von kovalente Addukte mit DNA und zur Verringerung des 3-NBA Metaboliten, die kovalent modifiziert DNA, werden angezeigt.

Die Pflanze Alkaloid Ellipticine (5,11-Dimethyl-6H- Pyrido [4,3 -b] Carbazole) und seine Derivate sind Antitumormittel, die durch verschiedene Mechanismen, enthalten in Verhaftung des Zellzyklus und die Induktion von als DNA-schädigenden Medikamente wirken Apoptose (für einen Überblick siehe29,30,31). Verwenden die Protokolle, die in dieser Arbeit beschrieben, wir gezeigt, dass das Krebsmedikament kovalenten DNA erzeugt Addukte nach metabolischen Bioaktivierung katalysiert durch mikrosomale P450s (Abbildung 3) und Peroxidasen (Abbildung 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61, und dies erklärt die starke Effizienz dieser Mittel gegen Krebs Zellen30. Die [3H]-radioaktiven Ellipticine und der Nuklease P1-Version der 32P postlabeling Technik wurden überwiegend in den Studien29,30,31,53 eingesetzt ,61. Unter Verwendung der komplexen Studie mit subzellulären Enzymsysteme, die Enzyminhibitoren und reine Enzyme in den Experimenten unter Verwendung der beschriebenen Protokolle, die vorherrschende P450-Enzyme, die oxidierenden Ellipticine, reaktiven Spezies, die Bildung von DNA-Addukten und Strukturen der Diese reaktive Spezies wurden dadurch29,30,31,55. Die P450s untersucht ist das menschliche Enzym CYP3A4 effizienteste Ellipticine Oxidation zu 12-Hydroxyellipticine und 13 Hydroxyellipticine, die Ellipticine-Metaboliten, die spontan, Ellipticine-12-Ylium und Ellipticine-13-Ylium zersetzen Bindung an DNA (Abbildung 5). 55 , 61 die CYP-Enzyme auch generieren weitere Metaboliten wie 9-Hydroxyellipticine, die eine Entgiftung Metabolit, 7-Hydroxyellipticine und Ellipticine N2gilt-Oxid, die als Minderjährige ausgebildet sind Ellipticine Metaboliten. Der 9-Hydroxyellipticine, sowie 7-Hydroxyellipticine und Ellipticine N-2-Oxid entstehen hauptsächlich durch CYP1A1 und CYP2D6, beziehungsweise. 55 , 57 , 58

Peroxidasen (d.h., Meerrettich-Peroxidase (HRP), Lactoperoxidase (LPO), Myeloperoxidase (MPO) und Cyclooxygenasen (COX-1 und COX-2)) verstoffwechseln Ellipticine um das gleiche zu generieren Ellipticine abgeleitete DNA Addukte (Abbildung 4)61 durch die Mechanismen, die in Abbildung 5dargestellt.

Die Nitroaromatic 3-NBA (3-Nitro-7H-BenzdeAnthracen-7-1) ist eine Komponente der Dieselabgase und findet sich in Schwebeteilchen62,63,64. Der wichtige Metabolit von diesem Schadstoff, 3-ABA,64,65 wurde im Urin von Arbeitnehmern der Salzbergwerke erkannt, die Emissionen von Dieselmotoren für eine lange Zeit63ausgesetzt waren. Dieser Befund zeigte, dass diese Arbeitnehmer 3-NBA ausgesetzt waren. Diese Nitroaromatic verursacht Lungen-Tumoren bei Ratten nach intratracheale Instillation67. 3-NBA fungiert auch als ein Mutagen im Ames Salmonella Typhimurium Test (in Stamm YG1024 überexprimiert Nitroreductase und O- Acetyltransferase), Erzeugung von mehr als 6 Millionen Revertants pro Nanomole in diesem Stamm62. Seine genotoxische Potenz auch Generation zeigte, dass nach der Aktivierung durch verschiedene Enzyme, unter Verwendung von Protokollen, die in dieser Arbeit, und in Vivo in mehreren Organen der Nager Tiere (Abbildung 6 beschriebenen mit DNA in Vitro kovalente Addukte )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,67,68.

Die 3-NBA-abgeleitete DNA Addukte gebildet, nachdem 3-NBA Aktivierung mit cytosolischen Reduktasen (d. h. NQO1) waren gemessen an der Nuklease P1 und n-Butanol Anreicherungsverfahren 32P-postlabeling Methode, die in den Protokollen beschrieben in dieser Studie vorgestellt. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von bis zu fünf DNA Addukte (Addukt Plätze 1-5 in Abbildung 7), und drei von ihnen zeichneten sich um 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-Aminobenzanthrone zu sein (dA -N6-C2-ABA; Addukt Spot 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-Aminobenzanthrone (GD -N2-C2-ABA; Addukt Platz 3) und N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (GD-C8 -N-ABA; Addukt Flecken (4) und 5) (Abbildung 7 und Abbildung 8). Nutzung der Nuklease P1-Version der 32P-postlabeling-Methode, die GD-C8 -N-ABA (Addukt Plätze 4 und 5) war nicht nachweisbar (Abbildung 7 und Abbildung 8). Dieses Ergebnis unterstreicht, die einige Einschränkungen dieser Version von 32P-postlabeling auftreten, nämlich, den niedrigen (falls vorhanden) Nachweis von adduziert Deoxynucleotides, die Rezeptorsignals von Nuklease P1 (d. h. Addukte gebildet während Oxidation von Arylaminen oder durch Reduktion von aromatischen Nitroderivatives N- Hydroxyarylamine-Derivate auf C8 Deoxyguanosine ersetzt). Ähnlich wie bei der Studie mit Ellipticine, Nutzung der komplexen Studie mit subzellulären Enzymsysteme, die Enzyminhibitoren, reine Enzyme und DNA-Addukt Normen in den Experimenten mit den Protokollen beschrieben in dieser Arbeit, die vorherrschende cytosolischen Reduzierung der Enzyme metabolisierenden 3-NBA Metaboliten Generierung von DNA Addukte, nämlich die reaktiven Metabolit gebildet durch Reduktion von 3-NBA (N-OH-ABA) und Strukturen der drei DNA-Addukten erzeugte 3-NBA wurden gekennzeichnet (Abbildung 7 und ( Abbildung 8). In der Leber Bioaktivierung von 3-NBA in Vitro wurde festgestellt, dass vor allem auf menschliche und Ratte NQO1 (Abbildung 7), während menschliche N,O- Acetyltransferases (NATs), NAT2, NAT1, Sulfotransferase (NIS), SULT1A1 und zu einer geringerem Maße SULT1A2 sind die vorherrschenden Enzyme der Phase II 3-NBA42aktivieren. Hepatische mikrosomale POR ist auch wirksam bei der Aktivierung des 3-NBA41, aber bei Mäusen, 3-NBA ist hauptsächlich Bioactivated durch NQO1 anstatt dieser mikrosomale POR42. In Lunge, die das Zielgewebe für 3-NBA Karzinogenität67, reduzieren NQO1 und XO 3-NBA auf Metaboliten, die Generierung von DNA-Addukten. XO scheint jedoch, als eine kleine 3-NBA aktivierende Enzym in diesem Organ69zu handeln.

Figure 1
Abbildung 1: Schema der 32P postlabeling Assay. Die einzelnen Schritte von der 32-P-postlabeling-Methode und seine verbesserten Verfahren gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Muster DNA-Addukt Elution auf PEI-Zellulose TLC-Platten. Die multidirektionale Chromatographie von DNA-Addukten auf PEI-Zellulose Platten gezeigt. Ursprung ist eine Startposition auf der PEI-Zellulose TLC Platte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: 32P-postlabeling Analysen von DNA-Addukten gegründet Kalb Thymus DNA mit Ellipticine, NADPH und Ratte (A) und (B) menschlichen hepatischen Microsomen inkubiert, (C) ein Steuerelement ohne Microsomen probieren. Addukte 1 und 2 zugeordnet durch Pfeile entstehen in Deoxyguanosine in der DNA durch Ellipticine mit Microsomen aktiviert. 32 P-postlabeling durchgeführt wurde, beschäftigt die Nuklease P1-Version der Methode (Schritt 2.5.2.) Herkunft befinden sich in der unteren linken Ecke (D3 von unten nach oben und D4 von links nach rechts). D2 wurde weggelassen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: 32P-postlabeling Analysen der Ellipticine-vermittelte DNA-Addukte. Adducts gebildet in Kalb Thymus DNA reagierte mit Ellipticine (100 µM) und Meerrettich-Peroxidase (A), bovine Lactoperoxidase (B), menschliche Myeloperoxidase (C), menschliche Cyclooxygenase-2 (Schafe Cyclooxygenase-1 (D) ( E) (5 µg Peroxidasen in der Inkubationen vorhanden waren), aus Leber DNA von Ratten mit Ellipticine 40 mg pro Kilogramm Körpergewicht (bw) (F), aus Kalb Thymus DNA behandelt mit Ellipticine und menschlichen CYP3A4 reagierte (G), mit 13 - Hydroxyellipticine(H), Ellipticine N-2-Oxid (ich) und 12-Hydroxyelipticine (J). Experimente wurden durchgeführt, mit der Nuklease P1-Version des Assays (Schritt 2.5.2.) Ursprünge sind in der unteren linken Ecke (D3 von unten nach oben und D4 von links nach rechts). D2 wurde weggelassen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Oxidation von Ellipticine durch Peroxidasen und CYPs zeigt die Ellipticine-Metaboliten und diejenigen vorgeschlagen zu DNA Addukte. Die Verbindungen in Klammern sind nicht immer noch unter den experimentellen Bedingungen in den Experimenten verwendeten erkannt, und sie sind der elektrophiler Stoffwechselprodukte postuliert als ultimative Arten Bindung an DNA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: metabolische Aktivierung und DNA-Addukt Bildung von 3-Nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-Nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone Oxidoreductase; NAT, N,O- Acetyltransferases; NIS, Sulfotransferase; CYP Cytochrom P450; POR, NADPH: Cytochrom P450 Oxidoreductase; HRP, Meerrettich-Peroxidase; LPO, Lactoperoxidase; MPO, Myeloperoxidase; COX-1, Cyclooxygenase-1. R = - COCH3 oder -SO3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl) 3 Aminobenzanthrone; GD -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-Aminobenzanthrone; GD-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: 32P-postlabeling Analysen der 3-NBA-abgeleitete DNA-Addukte. Der Nuklease P1-(links Platten) und n-Butanol Absaugung Versionen (richtigen Platten) der Methode wurden eingesetzt. Aein und A-b, Addukte gegründet Kalb, die Thymusdrüse DNA mit 3-NBA (300 µM) nach der Aktivierung mit Ratte hepatischen Cytosols reagiert. Bein und Bb, Addukte Kalb Thymus DNA, reagierten mit 3-NBA (300 µM) nach der Aktivierung mit menschlichen hepatischen Zytosol (gepoolte Bruch) gegründet. Cein und Cb, Addukte gebildet in Kalb Thymus DNA, reagierten mit 3-NBA (300 µM) nach der Aktivierung mit reinen Ratte-Leber NQO1 (0,09 Einheiten). Dein und Db, Addukte Kalb Thymus DNA, reagierten mit 3-NBA (30 µM) nach der Aktivierung mit menschlichen rekombinante NQO1 gegründet (0,06 Einheiten). Eein und Eb, Addukte gebildet in Lachs Hoden DNA mit N-OH-ABA behandelt. Fein und Fb, Addukte gebildet in Leber DNA von Wildtyp Wurfgeschwistern auf C57BL/6 Hintergrund ausgesetzt bis 2 mg 3-NBA pro kg b.w. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: 32P-postlabeling Analysen der 3-NBA-abgeleitete DNA-Addukt Normen [GD -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) und GD-C8 -N-ABA (C)] (Platten ein) und Strukturen des 3-NBA und diese 3-NBA-DNA-Addukten () Platten (b). N-Butanol Absaugung Version der Methode verwendet wurde (Platten in einem). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In diesem Papier wird demonstriert, dass eine allgemein zugängliche Methodik die Potenz von Chemikalien, Bioactivated, metabolische Zwischenprodukte, was Generation von kovalenten DNA sein Studium Addukte. Dies ist eine entscheidende Frage, denn Bewertung der Potenz von Umweltchemikalien oder Drogen deren enzymatische Aktivierung Metaboliten, die Generierung von kovalenten DNA Addukte ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Die Veränderung der DNA durch Karzinogene, die als der Ursache der Tumorentwicklung ist jetzt als ein zentrales Dogma der Karzinogenese verursacht durch Karzinogene beurteilt. Dieser Vorschlag wird bestätigt durch eine Vielzahl von Entdeckungen, wie die Phänomene, die: (i) die krebserregenden Eigenschaften von verschiedenen karzinogenen abhängig Bioaktivierung dieser Verbindungen zu Metaboliten reagieren mit nucleophilen Zentren in DNA; (Ii) die Performance von DNA-Addukten häufig entsprechen viele krebserregende Reaktionen; (Iii) und die Mutation in bestimmten Tumor-Suppressor-Gene und die Aktivierung von mehreren Proto-oncogenes könnte durch deren Änderung mit Chemikalien mit krebserregenden Potenzen verursacht werden. Darüber hinaus hat die kovalente Modifikation der DNA durch Krebsmedikamente nachgewiesen, als eine der effizientesten DNA-schädigenden Wirkungen dieser Medikamente führt zu deren Verwendung in der Krebsbehandlung.

Es gibt zwei kritische Punkte, welche die erfolgreiche Evaluation von Chemikalien für ihre genotoxische Eigenschaften, d. h. ihre Potenzen zu kovalenten DNA Addukte, insbesondere: (i) zu finden, zu lösen, und zu charakterisieren, die Effizienz der enzymatischen Systeme zur Aktivierung Karzinogene/Drogen elektrophiler Arten Bindung die nucleophilen Zentren der DNA, und (Ii) zu entwickeln und einzusetzen, die am besten geeignete Techniken, mit denen Karzinogen/Medikament – DNA Addukte gefunden und strukturell charakterisiert. Die geeigneten Methoden für beide Funktionen werden in dieser Studie beschrieben.

Isolierungsmaßnahmen für zelluläre Brüche, die Biotransformation Enzyme (mikrosomale oder cytosolischen Proben besitzen P450s und zusätzliche Bioactivating Enzyme z.B. Peroxidasen oder Reduktasen POR, NQO1, XO und AO), enthält die Protokolle für Bioaktivierung von Test Karzinogene/Drogen durch die Enzymsysteme (Inkubationen mit DNA) und deren Verwendung in dieser Arbeit dargelegt, gezeigt, wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen ihre Eignung für die Bewertung des genotoxischen Eigenschaften von Chemikalien.

Darüber hinaus die Methoden für die Erkennung und Quantifizierung von Addukte mit DNA wie zwei Versionen der Bereicherung der 32P-postlabeling-Technik (der Nuklease P1- und n -Butanol Extraktionsverfahren) und die Verwendung von radioaktiv-markierten getestete Verbindungen erwiesen sich für Studien Genotoxizität von Xenobiotika Karzinogen/Medikament geeignet.

Über die Bestimmung der kovalenten DNA Addukte, nicht nur diese beiden Methoden, sondern auch andere Methoden geeignet für Detektion und Messung von DNA-Addukten wurden etablierte8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. bis 1981, die Quantifizierung von DNA-Addukten eingesetzte radioaktiven Chemikalien (Karzinogene/Medikamente), nach 3H oder 14C, beschriftet, die synthetisch vorbereitet wurden. Solche Methoden sind sinnvoll für Studien mit Ellipticine verwendet worden, wie in dieser Arbeit beschrieben (siehe53,54). Dennoch ist es meist schwierig, die Derivate mit hoher Radioaktivität für ihre erfolgreiche Nutzung73,80,81vorzubereiten. Daher, obwohl dieses Verfahren noch verwendet wird, ist es leider beschränkt sich auf in-vitro- Experimenten ähnlich wie hier beschrieben. Andere Techniken, Massenspektrometrie, Elektron sprühen Sie Ionisierung (ESI), Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI), Beschleuniger-Massenspektrometrie (AMS), Fluoreszenz, biologische Methoden wie Immunoassay und 32 P-postlabeling in dieser Studie im Detail beschriebenen entwickelt wurden (Übersicht finden Sie unter8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

32P postlabeling Assay beschrieben in das Protokoll dieser Arbeit gezeigt, die hat nicht nur Anwendbarkeit in den in-vitro- Experimenten (siehe Vertreter Ergebnisse), nämlich, testen neue Verbindungen zur Genotoxizität oder mechanistische Untersuchungen der Karzinogen/Drug Aktivierung, sondern hat auch weitere Nutzungen wie z. B. die Bewertung der menschlichen Exposition gegenüber Umwelt-Karzinogene, Studien über die Mechanismen der Tumorentstehung, Überwachung, Reparatur von DNA, die DNA Prüfung Beschädigungen durch endogene Verbindungen und oxidative Reaktionen und untersucht die Reaktion des Patienten auf zytotoxische krebsbekämpfende Drogen72,-83.

Diese Technik ist jedoch nicht ohne einige Einschränkungen-73. Die Läsionen in der DNA, die nicht als Monodeoxynucleotides stabil sind, können nicht zuverlässig bestimmt werden. Die 32P-postlabeling-Methode ist nicht in der Lage, die Strukturen der DNA zu identifizieren Addukt. Daher strukturelle Charakterisierung von DNA-Addukten häufig beruht auf dem Nachweis ihrer Co-Chromatografie mit synthetischen Standards der bekannten Strukturen. In der Tat, war eine solche Methode in beiden Beispielen die repräsentativen Ergebnisse in dieser Arbeit (Ellipticine, 3-NBA) verwendet.

Zusammenfassend, die Protokolle, die in dieser Arbeit gezeigt als geeignete Methoden betrachtet werden können, um die Potenz von Umweltchemikalien zu bewerten oder Drogen zu enzymatisch Bioactivated Metaboliten, die Generierung von kovalenten DNA Addukte, einen sehr wichtigen Prozess für die Entstehung von Krebs und seine Behandlung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der Autor hat nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch tschechischen Wissenschaftsstiftung (GACR, Grant 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14, (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21, (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29, (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25, (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14, (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57, (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213, (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5, (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6, (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577, (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14, (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30, (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13, (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3, (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7, (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12, (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6, (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231, (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45, (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8, (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150, (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814, (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21, (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17, (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28, (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658, (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73, (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158, (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14, (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90, (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23, (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63, (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65, (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18, (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118, (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23, (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17, (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234, (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500, (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116, (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726, (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127, (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62, (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16, (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64, (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82, (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2, (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302, (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37, (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148, (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20, (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31, (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204, (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20, (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221, (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26, (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34, (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247, (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4, (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14, (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378, (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35, (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23, (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27, (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2, (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334, (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics