マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

Cancer Research

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Summary

環境エンリッチメント (EE) は、ライフ スタイル、ストレスと病気間の接続の根底にあるメカニズムを明らかにするために使用される動物の住宅環境です。このプロトコルでは、動物の死亡に影響を与える可能性があります細菌の生物多様性の変化を定義する大腸腫瘍と EE のマウス モデルを使用する手順について説明します。

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Fuller, A. K., Bice, B. D., Venancio, A. R., Crowley, O. M., Staab, A. M., Georges, S. J., Hidalgo, J. R., Warncke, A. V., Angus-Hill, M. L. A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model. J. Vis. Exp. (132), e57182, doi:10.3791/57182 (2018).

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Abstract

いくつかの最近の研究は、人間の病気の改善に豊かな環境での生活の有益な効果を説明しています。マウスにおける環境エンリッチメント (EE) がマウスの免疫システムを活性化腫瘍を低減または腫瘍微小環境における改善マイクロバイ多様性を含む創傷修復応答を刺激することによって腫瘍軸受け動物の生存に影響を与えます。ここではマウスの大腸腫瘍モデルにおけるマイクロバイの生物多様性に関する環境エンリッチメントの効果を評価するための詳細な手順。動物飼育と動物の遺伝子型とマウス コロニー統合に関する考慮事項に関する注意事項、説明、すべての最終的に微生物生物多様性に影響を与えます。これらの注意事項を聞き入れより多くの均一マイクロバイ転送を許可することがあります、その結果調査の調査結果を混同することができます治療非依存の影響を軽減するため。さらに、この手順では、次の長期的な環境エンリッチメント遠位結腸から収集した便から分離された DNA の 16S rDNA 配列を使用してが微生物叢変化によって特徴付けられます。腸内細菌叢の不均衡は、炎症性腸疾患、大腸癌も肥満や糖尿病などの発症に関連付けられます。重要なは、さまざまな人間の病気を再現することができますマウスの堅牢なモデルが存在する疾患マイクロバイ病因の役割を研究する EE ・ マイクロバイ分析このプロトコルを利用できます。

Introduction

環境エンリッチメント (EE) 研究活用集合住宅社会的刺激 (大きい住宅ケージ、動物のより大きいグループ)、認知刺激 (小屋、トンネル、ネスト材料、プラットフォーム)、(実行中の身体活動に影響を与えるパラメーター車輪)。EE は、病気の開始そして進行の散髪誘導性脱毛症、アルツハイマー病を含むマウス モデルの広い配列を使用に及ぼす活動の増加と改善された社会と認知の相互作用を理解する多くの研究所で利用されていますレット症候群といくつかの腫瘍と消化器の病気は、1,2,3,4,5,6をモデル化します。

いくつかのマウス モデルはマウスの大腸癌の研究に開発されています。おそらく明確に定義されたモデルは、 Apcマウスです。Apcマウス 1990年7、ウィリアム ・鳩の研究所で開発された、ひと大腸癌に通常関連付けられているAPC遺伝子の変異マウスのモデルとして使用されています。APC遺伝子変異人間と対照をなしてApcマウスは主に大腸腫瘍の非常にまれな出来事と小腸腫瘍を開発します。ただし、単一ノッキン ノックアウトTcf4、ヘテロ接合体変異Tcf4ヘット対立遺伝子は大幅にApc対立遺伝子8と組み合わせれば大腸腫瘍を増加します。最近、大腸腫瘍のこのマウス モデルは大腸腫瘍6EE の効果を決定するために使用されています。Bice。研究、4 つの異なるマウスの行の男女に EE の生理・表現型効果 (野生型(WT) Tcf4ヘット/+ Apc+/+、Tcf4+/+ Apc分/+Tcf4Het/+Apc分/+)) に定義されました。おそらく最も興味深い発見だった EE が両方の男性と女性の大腸腫瘍動物の寿命を大幅に向上します。これは EE が少なくとも減らすことができること示されて症状の一部は大腸癌に関連付けられているし、動物の健康を改善します。驚くことに、男性のこの改良された寿命減らされた腫瘍の直接の結果ではない、代わりに腫瘍の治癒改善マイクロバイ生物多様性6を含む応答の開始にリンクされていた。

いくつかの EE 特定研究は興味深い結果で公開されています。ただし、技術的な観点からには、重要な結果を多くの場合他の所に変換可能です。濃縮デバイスと使用すると、住宅だけではなく、非常に複雑な問題が、また寝具、食品、換気、繁殖、遺伝学、活動ルーム、動物のプロトコルでは、異なる研究室間の同一の EE 方法論を維持します。他の中の要件9,10,11。1 つの例は動物の統合場所動物必要があります安定統合マウスのコロニーにしたがって非治療関連効果を避けるために、遺伝的背景と食事組成を正規化します。さらに、多くの EE 研究疾患と共通のマウス飼育慣行が腸内マイクロバイ10,12の組成に影響を与えることができる方法でマイクロバイの重要性を実現する前に完了しています。

EE の繁殖戦略や動物の配置正しく実行がいない場合、ストレスを増やすことができます。EE 研究利用する多数のオスおよびメス動物および複数の遺伝子型が、実験のセットアップできますので難しい結合するいくつかのリットルから動物の要件を考えます。したがって、繁殖と離乳戦略は異なるリットルから正しい遺伝子型の離乳の動物の組み合わせを許可するように開発されました。この主な根拠はリットルの間で細菌叢を正常化して動物に実験環境に移動されたときに、ストレスを軽減します。マイクロバイはダム10から送信されました。植民地に微生物の多様性を提供するために女性がジャクソン研究所から購入し、1 ヶ月前に実験が始まった9,10,12コロニーに統合します。マイクロバイ生物多様性動物との間をさらに正常化するには、女性が共同繁殖前に収容されました。次の繁殖、飼育中に共同住宅、脱出する能力は、看護の仔は、妊産婦ケア13,14、おそらくマイクロバイ正規化を促進ストレス レベルを向上しました。非 EE を防ぐために関連、マイクロバイに及ぼす影響は、すべての実験動物のこの共同住宅 1 つ実験ケージに異なるリットルからいくつかの男性を結合するときに発生した戦闘と追加のストレスを防止しました。最後に、すべての遺伝子型の動物の等しい数は、ケージの中で含まれていた。これは遺伝子の全体改善微生物叢の多様性のための機会を提供、coprophagia (便を消費する動物の傾向) または全体的な研究.に可能な遺伝子型固有の動作の違いの貢献を削除

このプロトコルはマイクロバイ研究所叢正規化、もっと制服マイクロバイ集団を有効にする微生物叢伝送と動物コロニーの統合を含む知られている側面を含める前の EE 研究を拡大する戦略を提供します。実験動物の間これらの注意事項を聞き入れは調査の調査結果を混同する非治療関連微生物叢の違いの能力が不可欠です。EE 以外を排除する関連微生物叢変化には発病と進行中の微生物叢組成に EE の役割を定義する研究者ができるようになります。

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Protocol

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ユタの大学によって承認されたプロトコルに従ってここで説明するすべての方法を行った。

1. 実験的なデザインと EE コントロール ケージ セットアップ

注:リファレンスについては、実験的なデザインの概要が示されています (図 1)。

  1. コントロール (NE) と EE ケージを設定 (図 2).
    1. NE ケージをセットアップするには、濃縮デバイスを持たない従来のオートクレーブ制御ケージ (表 1) を使用します。
    2. 大ケージ、グロメットとトンネル (材料表) に対応する十分な大きさのケージごとの 1 つの穴をドリルします。
    3. 子犬の飼育と EE ケージを設定、結ぶ 2 大オートクレーブ ケージ滅菌グロメットのセキュリティで保護されたトンネル (表 1) の床面積を増加する 2 滅菌プラットフォームです。EE の実験用滅菌ホイール、トンネル、イグルー、小屋、クロール ボールを実行していると入れ子の EE ケージ内の材料を提供します。
    4. 同等の換気を提供するために換気されたラックに EE と NE のケージを配置します。
      注:2 プラットフォーム (表 1) と 2 つの大ケージ子犬飼育セットアップ15当たり 12 妊娠雌の最大を可能にする (材料の表を参照してください、ドキュメント、および表 2に 3.2 をステップ)。
    5. マウスをフィード広告自由照射の標準的な食事とオートクレーブ逆浸透水。
    6. 滅菌寝具材料をマウスを提供します。
      注:汚染を防ぐためにフードの空ケージとケージ動物でのすべての操作を行う必要があります。大ケージ ケージ操作、接着フィルムのケージの穴をカバーしてください。
  2. 動物を繁殖に備えます。交尾前 2 週間単一の大きなケージ (表 1) の家 15 2 ヶ女性をグループ化します。別に交尾する前に 2 週間の家生後 2 ヶ月の littermate の男性。
    注:繁殖のため個体数は実験および必要な動物の数に依存します。本研究では 15 の女性を利用した 12 接続されて女性を取得最大値である 1.1.2 (表 2) で説明されているセットアップを飼育子犬の数。
  3. 繁殖、2 人の女性あたりの男性が 1 雄親およびダムの動物を組み合わせてください。朝の最初のチェックは、動物達は夜の間に交配視覚サインがあります膣のプラグのする必要があります。
    注:家の男性と女性それぞれの雌がプラグインまで一緒に。それが外部である場合、膣にプラグを視覚的に識別できます。
    1. 内面化されたプラグを検出プローブを膣口に挿入し、プローブが簡単に挿入されていない膣のプラグが存在する場合 (16; 第 4.3.6 節参照)。
      注:プラグインは、半日として検出される夜に交尾以降朝を記録します。
    2. 女性が膣にプラグにしたら、飼育ケージの他の交配雌 (セットアップ手順 1.1.2 濃縮装置なしで) とグループ住宅大規模な子犬に転送します。
    3. 置換交配のため新しい建物つがいでないグループの女性と女性と 7 日間の期間でリットルの最大数を取得する交尾を続けます。
      注:すべての動物はそれぞれ 7 日以内納期が必要です。
  4. グループ住宅飼育ケージ (セットアップ手順 1.1.2 濃縮装置なしで) 1 つの大きい子犬の内ですべてのくずが発生するようで出産する妊娠中の女性を許可します。
    1. 子犬の番号、生年月日の追跡を維持し、7 日齢ジェノタイピング子犬を開始します。
      1. それらの13,17を識別する番号コードと年齢の 7 日に彼らのつま先に子犬を入れ墨。
      2. 70% エタノールでつま先をきれいにし、軽くつま先17に平行の皮膚表面にインクを含むマイクロ タトゥー デバイスを挿入 (材料の表を参照してください)。
      3. 7 日間の古い新生児から組織の小片を切開によって遺伝子型のハサミで尻尾先端から組織を収集します。
    2. 組織からのゲノム DNA を隔離し、 18で説明したように従来の名手を使用して PCR を実行します。
    3. 母親と大ケージに 14-21 日でセックスによる独立した動物。
      注:古い子犬が自分を餌にすることができる歳まで看護師に自分フィードに十分な若い子犬を続けることを確認します。
    4. 21-28 日、オスおよびメス動物を個別に配布遺伝子型による NE または EE 環境では、必ずケージ (図 2A) あたり各遺伝子型の等しい比率を保つように。
      注:IACUC (表 2) で許可されている最大数に基づいて、各 NE または EE ケージでペットの合計の数を確認します。NE のケージは、せいぜい 5 動物 (表 2) を持っています。EE のケージ、社会的刺激、ないよりも少ない 20 とスペースの制約で EE ケージ (表 2) に 41 以上動物を許されるべき。

2 16 週齢で便コレクション

  1. 開始便コレクション 1 ~ 2 日前、犠牲にし個別に滅菌ツールを使用して解剖時に犠牲の日に便を収集します。
    注:コレクションの前に 1-2 日同時収集スツール、スツールがコレクションの時に存在しない可能性があるためサンプルの損失を避けるために役立ちます。
    1. きれいなケージでは、生きている動物、慎重に首筋から動物をスツール収集。滅菌 microfuge の管に滅菌鉗子を使用して便を収集します。
      注:動物は通常無菌 microfuge の管に直接急速なスツール コレクションは、スツール、固定化したときを排除します。固定化したとき、動物はすぐに排便しない場合、は、きれいなケージにし、排便 (通常 1 時間) には、動物を待ちます。
    2. 犠牲の日に便を収集します。
      1. 動物を安楽死させる、イソフルランに浸した綿球で小さな容器を含むベルジャーの動物を配置します。(2 分) 後に通常呼吸の停止を観察すると、一度、大腸の解剖を許可するようにその背中に動物を置きます。
      2. 70% エタノールをマウスの腹腔に適用します。
      3. 鉗子、尿道口の前方の皮膚を持ち上げるし、胸部に到達するまで腹側正中線に沿ってカットするはさみを使用して各脚に向かって最初の切開の基地からカットします。皮膚を折り返し、同じパターンで腹膜壁をカットするはさみを使用します。
      4. 細かく分析し、遠位結腸直腸からをデタッチ肛門で遠位結腸を把握するのに鉗子を使用します。鉗子でコロンを垂直方向に引きながらコロンを解放する腸間膜をカットするはさみを使用します。
      5. 結腸、盲腸のすぐ下をカットし、フィルター ペーパーにそれを置きます。鉗子を使用して、挿入する開いているハサミの片側を許可するように内腔を開くコロン管の上部を持ち上げます。縦、遠位、近位とスプレイ オープン カット コロン縦。
      6. 滅菌鉗子を使用して滅菌 microfuge の管に遠位大腸から便を収集します。
  2. 細菌の DNA の隔離の時間まで-80 ° C、および microfuge の管にスツールを格納します。
    注:便に加えて、犠牲の日に大腸・小腸ミクロゾームでは, 脂肪組織などから他の全血、血清、血漿、通常などサンプルと腫瘍組織を収集します。研究で定義されているアドレスの質問。

3 便からゲノム DNA の隔離

注:スツール病原体検出プロトコルを次の便からの微生物 DNA を隔離する市販キットを利用します。重量を量りながら-80 ° C のフリーザーとドライアイスのストアに直接サンプルを削除します。

  1. 室温 (RT) 便換散バッファーの 1.4 mL を含むきれいおよび microfuge の管に便の最大 220 mg を転送 (材料の表を参照してください)。
  2. 固体 (図 2B) を徹底的に均質に 1 分の渦のサンプルです。(グラム陽性菌を含む) すべての細菌を溶解に 5 分間、95 ° C に懸濁液を加熱します。
  3. 15 s と便の固形物をペレットに 1 分の 20,000 × g で遠心分離渦のサンプル。上清を 2 mL および microfuge の管に転送します。渦までタブレットが溶解される、PCR 阻害物質を吸収するために各サンプルに 1 つのタブレットを追加および 1 分のサンプルを室温で孵化させなさい。
  4. 3 分の 20,000 × g のサンプルを遠心し、上清を新しいおよび microfuge の管に転送します。新しい 1.5 mL および microfuge の管にプロティナーゼ K の 3 分分注 15 μ L (20 mg/mL 在庫) 20,000 x g で遠心分離機します。プロテイナーゼ K を含むチューブにサンプルの 200 μ L をピペットします。
  5. 管するため塩化換散バッファー、15 の徹底的に渦の 200 μ L を追加 s (材料表参照) チューブにエタノール (96 ~ 100%) の 10 分追加 200 μ L の 70 ° C にサンプルをインキュベートし、ボルテックスでよく混ぜます。
  6. シリカの場所に基づくコレクション 2 mL チューブにスピン列と列にサンプルを適用します。蓋を閉じ、20,000 × g で 1 分間遠心します。
  7. 列を新しい 2 mL のコレクションの管に転送し、500 μ L の洗浄バッファー 1 の列に列、20,000 x g 列を新しい 2 mL 管への転送に 1 分間遠心をキャップし、列に洗浄バッファー 2 の 500 μ L を追加を追加、キャップを閉じて、20,000 x g で 3 分間遠心します。
  8. 蓋、列を新しい 2 mL コレクション チューブに転送し、残留洗浄バッファーを削除する 20,000 × g でさらに 1 分間遠心します。列をラベルおよび microfuge の管 1.5 mL に転送し、膜に EDTA を含む溶出バッファーの 200 μ L の追加によってサンプルを溶出 (材料の表を参照してください)。
  9. キャップを閉じて 1 分 20,000 x g 破棄列に 1 分間遠心サンプル RT でインキュベートします。

4. DNA 濃度測定、PCR の前処理

注:各サンプルのゲノム DNA の濃度を決定するための市販 dsDNA 蛍光アッセイ、蛍光光度計を利用 (材料の表を参照してください)。蛍光色素は二重鎖 DNA を具体的にバインドする必要があります。

  1. 各サンプル (199 μ L dsDNA マスター ミックスの各サンプルの 1 μ L) と、1:50 のレバレッジ希釈の準備標準希釈。DsDNA の設定を使用して蛍光光度計で分析します。
    注:PCR で DNA の高ボリュームを抑制することができます、したがって、使用した DNA のボリュームは PCR の最終巻の 10% 以上をしないでください。蛍光色素の結合している DNA だけが蛍光を発する、最終的な計算された DNA 濃度に汚染物の貢献の可能性を排除すること、蛍光光度計 DNA のサンプルでは、正確に測定可能になります。このレベルの正確な定量は下流シーケンス アプリケーションに不可欠です。
  2. 10 mm トリス、pH 8.5 各サンプルのテンプレート株式を働いているように適切なボリュームの 5 ng/μ L に希釈した PCR テンプレートを準備します。
  3. -20 ° C で試料を保存します。

5. 設計プライマー、16S 希望 V 地域

  1. 選択的に目的の V 16S rRNA 領域を増幅するプライマーを設計します。
  2. 19リボソームのデータベース プロジェクトからプローブ一致が付いているプライマーを分析すると、様々 な門のおおよそのヒット率を決定します。
    注:V1 V3 領域の使用現在の研究はプライマーのどか前方20、V1 領域内の位置 8 と 533 逆21, 533 V3 領域内の位置にバインドでバインドを公開しました。プライマーは、インデックス作成のためのオーバー ハング アダプター シーケンスを含める必要があります。
  3. プライマーを設計する際の 16S メタゲノム配列ライブラリ準備22 (表 3) の推奨に従って各プライマーの 5' 末端でアダプター シーケンスを含めます。
  4. カートリッジ精製でこれらの大規模なプライマーを合成します。乾燥プライマーを再構成し、10 mM トリス、pH 8.5 で 1 μ m まで在庫を働いて PCR を希釈します。

6. 私アンプリコンをオーバー ハング アダプター シーケンス V 地域を増幅する PCR 添付22

  1. 私アンプリコンを PCR の反作用の組合せの表 4で説明されているように設定します。
  2. プレートの接着の明確な PCR プレート シールを配置し、表 5にパラメーターを使用して PCR 増幅を実行します。
  3. (省略可能)PCR の製品 agarose のゲルまたは増幅サイズの定量を可能にする高感度 DNA 分析で私アンプリコンを実行 (材料の表を参照してください)。
    注:この研究から私アンプリコン サイズは 550 bp (図 3A)。

7. PCR クリーンアップを用いた磁気ビーズ22

  1. 結露を収集するために 1 分の 1,000 x g で迅速に増幅 PCR プレートを遠心します。
    注:PCR チューブ ストリップを PCR プレート代わりに使用して、汚染を最小限に抑えることができます。チューブの蓋を破棄し、決して再利用します。
  2. 均等に、それらを分散させるし、磁気の 20 μ L を追加する磁気ビーズ ビーズ各増幅 PCR にも、渦、ピペット ボリューム全体上下にゆっくりと 10 回。
  3. 磁気ビーズを収集し、上清はクリアするまで 5 分位 2 分、マグネット スタンドに PCR プレートの RT でインキュベートします。削除し、上澄みを廃棄します。
  4. 200 μ L 新鮮な 80% エタノール PCR プレートは磁気ビーズを洗浄、立ち上がって 30 インキュベート マグネット スタンドに RT で s。上清を慎重に取り外します。
  5. 2 回目の洗浄を繰り返します。さて、井戸から任意の残留エタノールを外し、10 分間乾燥空気を許可する罰金のピペット チップを使用します。
  6. マグネット スタンドから PCR プレートを外し、各ウェルに 10 mM Tris pH 8.5 の 52.5 μ L を追加します。ピペットを上下のビーズを中断し、2 分間室温でインキュベートする 10 倍。
  7. 磁気ビーズを収集してきれいな PCR プレート上澄みの 50 μ L を転送するマグネット スタンドに PCR プレートを転送します。プレートの接着の明確な PCR プレート シールを置き、1 週間-20 ° C で保存します。

8. インデックス PCR プレート方式の準備

注:インデックスを V1 V3 ライブラリを生成する第 2 PCR を行ったキット (材料の表を参照してください)。(図 3B23) サンプルごとにユニークなデュアル インデックスの組み合わせをマップする既定のインデックス処理スキームが使用されました。

  1. 各サンプルに 2 インデックス プライマーの組み合わせがユニークであることを確認 (つまり、デュアル インデックス)。

9. インデックスとして記述されている22アダプター シーケンスにバーコードを添付する PCR を実行します。

  1. PCR 産物 (クリーン amplicons) の 2.5 μ L を新しい 96 ウェル プレートとインデックス作成を支援するためのインデックス プレート器具の場所に転送します。
  2. 準備板図 (図 3B) の例のように 2 プライマーをインデックスし、インデックス 1 を配置します。
    注:プライマー取り違えを避けるために視覚的な合図を提供: インデックス 2 プライマー チューブ必要が白い帽子と透明な溶液をオレンジ キャップと黄色の溶液にインデックス 1 プライマー チューブが必要をあります。
  3. 表 6で示すようにインデックス PCR ミックス反応を組み立てます。上下に 10 回ピペッティングで混ぜます。粘着の明確な PCR プレート シールでカバーし、1 分間室温で 1,000 x g で収集する遠心分離機します。
  4. インデックス パラメーターを使用して、表 7に PCR を実行します。

10. 最終 PCR ライブラリを浄化します。

注:この PCR クリーンアップは、上記の手順 7 と同じと磁気ビーズを使用して PCR PCR22インデックスのクリーンアップを実行します。

  1. 結露を収集するために 1 分の 1,000 x g ですぐに手順 10 から PCR プレートを遠心します。
  2. 均等に磁気の 20 μ L を追加し、し磁気ビーズ ビーズ各増幅 PCR にも、渦、ミックスにゆっくりと 10 回上下全体のボリュームをピペットします。
  3. 室温で 5 分間インキュベートします。
  4. 磁気ビーズが収集した、清まで 2 分、マグネット スタンドの場所 PCR プレートは明らかです。削除し、上澄みを廃棄します。
  5. 200 μ L 新鮮な 80% エタノール PCR プレートは磁気ビーズを洗浄、立ち上がって 30 インキュベート マグネット スタンドに室温で s。上清を慎重に取り外します。
  6. 2 回目の洗浄を繰り返します。
  7. 次の 2 番目の洗浄井戸から任意の残留エタノールを外し、10 分間乾燥空気を許可する罰金のピペット チップを使用します。
  8. マグネット スタンドから PCR プレートを外し、各ウェルに 10 mM Tris pH 8.5 の 52.5 μ L を追加します。ピペットを上下のビーズを中断し、2 分間室温でインキュベートする 10 倍。
  9. 磁気ビーズを収集してきれいな PCR プレート上澄みの 50 μ L を転送するマグネット スタンドに PCR プレートを転送します。プレートの接着の明確な PCR プレート シールを置き、1 週間-20 ° C で保存します。
  10. (省略可能)Agarose のゲルまたは増幅サイズの定量を可能にする高感度 DNA 分析でインデックスの PCR の製品を実行 (材料の表を参照してください)。
    注:この研究から最終的なインデックス ライブラリのサイズは 668 bp (図 3C D)。

11. 定量化、正規化、および配列のインデックスのライブラリをプール

  1. 蛍光光度計と dsDNA 蛍光アッセイ キット各サンプルの DNA 濃度を決定する (表の資料を参照してください)。
    1. 各インデックスのサンプルおよび標準 (190 μ L dsDNA マスター ミックスと標準の 10 μ L) のサンプル (199 μ L dsDNA のマスターの組合せ、バッファーおよび試薬を含む内の各サンプルの 1 μ L) の 1: 200 の希釈を準備します。DsDNA の設定を使用して蛍光光度計で分析します。
  2. 次の DNA 濃度計算平均ライブラリのサイズを計算することによって、ライブラリを正規化します。アダプターの長さ、インデックスの長さ、およびプライマーから V 私アンプリコン サイズを合計することによってこれを行うし、によって実際のサイズが計算されるサイズ (図 3C22を参照してください) と同様であることに agarose のゲルの製品を表示します。
    1. また、DNA の整合性、増幅サイズ、および濃度 (材料表、図 3D) の定量を可能にする高感度 DNA 分析を利用します。
      注:本研究では平均ライブラリ サイズから算出したものアダプターの長さ、インデックスの長さ、およびプライマーから V1 V3 の増幅サイズを加算します。平均サイズは 668 bp。
    2. 表 8に、数式を使用してサンプルの濃度を正規化します。
  3. 4 nM、プール 5 サンプルを希釈シーケンス処理用単管に各 4 nM サンプルから μ L。

12. 次世代シーケンス システムを使用してライブラリのシーケンスし、データの解析

  1. シーケンス ライブラリ。
    注:本研究では、ユタ大学の高スループット ゲノミクス コア実行ライブラリ変性およびサンプル シーケンス (前述6,22)。
  2. データを解析します。
    注:プールされたサンプルからデータを分離するには、インデックス読み取りは識別され (前述の22) を分離します。
  3. FASTQ ファイルを生成し、以降のデータ解析のためにこれを利用します。

13. 16S 私アンプリコン ライブラリからシーケンス データを分析します。

注:Biceで説明したように、この手順を実行します。 2017、6

  1. (材料の表を参照してください自由に利用可能なデータ分析ツールをインストールします。24)。
  2. (前述の25,26) は、シーケンス化されたデータからデマルチプレクスされた fastq ファイルを組み立てます。すべての組み立てシーケンスを破棄します。
  3. 次のde novoオープン分類単位 (乙) ( 27に従って) プロトコルを選んで分析を行います。
    1. 28の説明に従ってコンパイルされませんによって単一 fastq ファイルにシーケンスと 97% 以上、OTUs に類似性が高いグループのシーケンスをビンします。コア ・ 150 と 75% のアイデンティティ29,30の最小のシーケンスの長さとセットの代表的なシーケンスを合わせます。説明28として分類を割り当てます。
      注:サンプルは、ビン分割することができます、31、続いて分類割り当てと乙表建設32を分析します。
    2. わかりやすい名前と身分証明書サンプルへのリンクおよびマッピング ファイル33,34を検証するサンプルの特性を特定するマッピング ファイルを作成します。
    3. マッピング ファイル35を使用してサンプル説明へリンクを OTUs 乙ネットワークを作る。
    4. まとめた分類群によってプロット36相対的な豊かさの面で分類集計を計算します。
    5. 制服シーケンス水深サンプルに適切なサンプルのアルファ多様性を探る。アルファ多様性の適切な深さを定義するには、合計数37で説明されているようにバイオームを要約テーブル コマンドを使用して、各サンプルの観察を要約します。

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Representative Results

いくつかの研究は、心身医学の実践は、健康上の成果を向上させることを実証しています。同様に、マウスの環境エンリッチメント向上寿命と腫瘍傷修理6などを含む成果が向上します。そこで、EE プロシージャは、最初の実験 (図 1) の開始前にマイクロバイ標準化中この表現型の微生物叢の役割を定義する目的で開発されました。重要なは、すべての繁殖動物は、繁殖の開始前に、少なくとも 1 ヶ月マウス コロニーに統合され新生の子犬が実験に先立ち叢伝送を正規化する 1 つ大きな檻の中で母親と共同収容。動物は 21 日と 28 日の間、各遺伝子型の等しい数がそれぞれ住宅、EE または NE 環境 (図 2A) に引き離されます。16 週ですべての動物から便が収集され、均質化 (図 2B) に続いて細菌 DNA の隔離。最後に、amplicons から増幅 16S スツール マイクロバイ DNA とバーコードが同時にすべてのマイクロバイ ライブラリのシーケンスは、インデックスが作成される (図 3)。WT と NE と EE の両方の状態で担癌動物で識別される一意のシーケンスは、図 4のとおりです。興味深いことに、EE は WT 動物の生物多様性は向上しませんが、この方法により、生物多様性の改善を示す腫瘍軸受け動物 (図 4)、生物多様性が非常に高くなる。。生物多様性のこの増加は門プロテオ バクテリア、重要な Alphaproteobacteria と Betaproteobacteria、クラスの増加し、病原性 Gammaproteobacteria (図 5 の減少の増加の存在に帰することができます。;補足表 1)。最大の増加は、Betaproteobacteria クラス、 Sutterella、分泌 IgA 分解 (図 6も参照してください38) に関わる可能性が高い共生属。

Figure 1
図 1: 実験のタイムラインの表現。短いバンドは、プロトコルのほとんどは、7 日単位で達成と 7 日間 windows を表します。これは実験で子犬の年齢範囲の可視化にも役立ちます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: EE および NE 住宅条件とスツールのホモジネート (前述のプロトコル).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 16S マイクロバイ図書館準備します。(A) スツール ゲノム DNA 由来の Unpurified PCR 増幅産物。(B) インデックス プレート グラフィック使用されるソフトウェアによって設計されて (材料表23)。デュアル インデックスの組み合わせは、I7 (インデックス 1。行) と I5 (インデックス 2;列)、各サンプルが表示されます。各インデックスは 8 bp の長さ。サンプル番号は、EE 研究からマウスのそれぞれの数字を参照してください。(C) Unpurified インデックス PCR の製品。(D) 最終の品質分析精製および 16S ライブラリをプールします。(A, C, D)黒い矢印は、550 bp の増幅と 668 bp インデックス ライブラリを示します。赤い矢印がDに示すように、浄化を以下の廃止、非特定の製品を示す上と下のマーカー サイズ マーカー サイズの参照のサンプルに追加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: アルファ多様性の EE を次の変更Tcf4ヘット/+ Apc分/+動物。WT のアルファ多様性とTcf4ヘット/+ Apc分/+担癌動物。20,000 の読み取り、NE、 pWT EE で = 0.64 と NE との EE Tcf4ヘット/+ Apc分/+p= 0.03 ウェルチ補正 2 標本 t 検定を用いたします。Biceから適応。 2017、6この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: EE を介した変化の EE Tcf4ヘット/+ Apc分/+動物。R ggplot2 はプロテオ バクテリア門、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、および Gammaproteobacteria のクラスの変更を示すボックス ウィスカのプロットを生成されます。外れ値は、円として記載されています。p= 0.005 ウェルチ補正 2 標本 t 検定を用いたします。(SEM) 平均値の標準誤差を使って計算される誤差範囲Biceから適応。 2017、6この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: Sutterellaの EE を次の相対量で変更Tcf4ヘット/+ Apc分/+動物。外れ値は、円として記載されています。p= 0.005 ウェルチ補正 2 標本 t 検定を用いたします。Biceから SEM. 適合を用いてエラーバー。 2017、6この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Supplemental Table 1
補足表 1: NE と EE のマウスから収集した便から細菌の分類分離します。(E) 属や、(D) 家族 (C) 順序 (B) クラス (A) 門レベルで遺伝子型に分類。NE と同じ遺伝子型の EE または WT の比較Tcf4ヘット/+ Apc分/+。P 値は、ウェルチ補正 2 標本の t 検定を使用して計算されます。Biceから適応。 2017、6このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

項目 総面積 (2インチ) 総面積 (cm2) ケージのサイズ (インチ) L x 幅 x 高さ ケージのサイズ (cm) L x 幅 x 高さ
1 つのコントロールのケージ (NE) 68.25 440.32 10.5 × 6.5 × 5.5 26.67 x 16.51 x 13.97
1 つの大きなケージ (EE) 264.36 1706.32 13.87 x 19.06 × 7.75 35.24 x 48.42 x 19.69
2 つの大きなケージ (EE) 528.72 3412.64 13.87 x 19.06 × 7.75 @ 2 35.24 x 48.42 x 19.69 @ 2
2 つのプラットフォーム (EE) 93 600 11.8 x 3.94 x 2.95 @ 2 30 x 10 x 7.5 @ 2
2 つのプラットフォーム (EE) と 2 つの大ケージ 621.72 4013 13.87 x 19.06 × 7.75 + 2 11.8 x 3.94 x 2.95 @ @ 2 35.24 x 48.42 x 19.69 + 2 30 x 10 x 7.5 @ @ 2

表 1: EE と NE ケージのサイズとフロア スペース。

ケージでペット 動物あたり乗必要なインチ EE ケージ エリア (2インチ) 合計ペット同伴可
最大 25 12 2 (4013 cm2) 622 最大 25
25 以上 15 2 (4013 cm2) 622 最大 41
くずで女性 51 2 (4013 cm2) 622 最大 12

表 2: 床領域に基づいてケージの中での動物の数を許可15.

私アンプリコン PCR のプライマー
フォワード 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3'
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3'
シーケンスは、太字で表示されます、非大胆なオーバー ハング アダプター シーケンス特定の軌跡

表 3:増幅 PCR プライマー

私アンプリコン PCR 反応を設定
ボリューム
微生物 DNA (5ng/μ l) 2.5 μ l
プライマーを転送 (1 μ M からステップ 5.1.2) 5.0 μ l
逆プライマー (1 μ M からステップ 5.1.2) 5.0 μ l
HotStart 準備ミックス × 2 12.5 μ l
合計 25.0 μ l

表 4:増幅 PCR ミックス

PCR 増幅の設定
95 ° C、3 分
25 サイクル:
95 ° C、30 秒
55 ° C、30 秒
60 秒のための 72 ° C
72 ° C、3 分
4 ° C で保持します。

表 5: 増幅 PCR プログラム設定。

インデックス PCR バーコード アセンブリ
DNA 2.5 μ l
インデックス プライマー 1 (N7XX) 2.5 μ l
インデックス プライマー 2 (S5XX) 2.5 μ l
HotStart 準備ミックス × 2 12.5 μ l
PCR グレード水 5 μ l
合計 25 μ l

表 6: PCR ミックス インデックスします

インデックス PCR セットアップ
95 ° C、3 分
8 サイクル:
95 ° C、30 秒
55 ° C、30 秒
72 ° C、30 秒
72 ° C、5 分
4 ° C で保持します。
-20 ° C でストア

表 7:インデックス PCR プログラムを設置す

サンプル濃度式プール
(Ng/μ l の DNA 濃度) x 106 nM で濃度を =
(x 平均ライブラリ サイズ 660 g/mol)
この研究からの例は。
(85.2 ng/μ l) x 10 ^6 = 193.3 nM
(660 g/mol x 668 bp)

表 8:サンプルをプーリングする前に正規化の式

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Discussion

この手順は、正常または担癌動物の環境エンリッチメントの次の便から分離された細菌叢の解析できます。これらは男女別と遺伝子型の多くの動物を取得する繁殖を含む大規模な実験なので実験の開始前に動物の間マイクロバイを正規化欠かせません非 EE を避けるために関連のマイクロバイに及ぼす影響生物多様性。

NE と EE の条件間の一貫性を保つのため、繁殖の過程はすべてのマウス最初同じ微生物への暴露があるし、したがって、似たマイクロバイ内容を持っているとされるように行われます。それは可能とそのマウスの遺伝子型が可能性が高い、マイクロバイ組成に影響を与えます。このため、マウス遺伝子型数は便を利用する動物が、マイクロバイのような多様性を発生する条件 NE と EE の間維持されます。

いくつかの困難は、実験設計 EE 明らかです。まず、実験の詳細に依存して、実験に必要な動物の数が総数もケージで使用できる動物の数によって制限されます。たとえば、履歴データ周囲マウス生存 EE の実験では、機構基になる生存率の改善前の実験で観察を定義する動物の数を計算する使用されました。このデータから比較のグループの 17 動物の合計されたアルファが両側 t 検定で生存率の差を検出する 80% 力に必要な = 0.05。だから、41 までは 20-24 (または) 動物実験群はケージごと対コントロール群 4-5 動物は電力の計算を収容する必要があります。したがって、実験ケージと一緒にいくつかの制御グループのケージが必要です。さらに、複雑な遺伝子多型、大量繁殖に必要なが必要になりますすべての遺伝子型の十分な動物数を得ることが困難です。しかし、他の少数の遺伝子の違いが存在する場所のモデルと同じ遺伝子のより多くの動物は、このシステムで分析できる、少ないブリーダーが必要。アメリカ合衆国の 12 の妊娠した女性は2スペース (表 2) 633 で収納が可能します。この問題は、子犬を取れば、彼らはより多くのスペースを取るです。オスの子犬が 14-21 日に女性の子犬から分離し、その特定の国で宇宙ルールに承認された例外は可能でしょう。オスとメスの子犬を誘因することができますそれ以外の場合、選択されていると、マウスの最大の番号の下に滞在する母親と若い年齢で区切られました。これらの研究のための承認を得るために、スペースの制限のローカル ルールを遵守することが欠かせません。最後に、内細菌叢、細菌叢の組成の小さい相違を検出するために必要な動物の数は事前に計算することは困難。本研究では、微生物叢における有意差が 4 動物、グループごとに発見された EE マウス間のより多くの変数またはわずか EE によって変更される、微生物叢が明らかになる動物の数を増加させることが可能です。

メソッドのこの説明には、特定機器とする寝具を使用、表面上は必要があります。しかし、一貫性に影響を与えるいくつかの非自明な問題が発生した場合、これらの非常に大きな、高価な着手および時間のかかる研究の前に対処する必要があります。1 つの主要な問題は、換気です。檻の中の動物の数が多いと換気は、問題になるし、ほとんどの研究者では、制御と実験ケージ間で一貫性のある環境を提供しようとするとき、考慮に入れられている問題です。説明している方法ですべてのケージが実験全体換気を均等化し、制御する換気キャビネットに置かれますケージ。ときは換気されたキャビネットに適合しないで、そのケージを使用してこれを達成することはできません。実験間換気を正常化し、制御することを意味その他動物をテストし、一貫して適用されることができるが、これらのメソッドは、本研究では検討していません。寝具と同様の一貫性の問題が発生します。本研究で使用される結腸癌モデル システムで消化器疾患を持つ動物に摂取特定タイプの寝具、寝具、消化の妨害や病気につながる特にコーンコブ。寝具以外制御環境のように、占められるときを摂取する動物が知られている場合、この点に留意することが重要です。この現象は、それ以降の一貫性のない健康への影響は、すべてのデータに深く影響を与えます。

16S リボソーム遺伝子は、細菌の人口を調査する手段として使用されています。遺伝の可変性、V1-V9、細菌種39の間比較的不変に残る点在の保存領域を表す 9 つの領域が含まれています。V1 V3 領域は特に、種レベルの同定39の最も高い確率を提供します。似たような V1 V3 研究大腸がん (CRC) と大腸腺腫の高度な変更が見つかりました関心の 3 つの門: プロテオ バクテリア、フィルミクテス門、バクテロイデス門21,40,41。運動が微生物人口をシフトでき、フィルミクテス門42の増加をもたらすことも報告されています。このため、本研究は、可能性のある腺腫と CRC に変更される知られているこれらの門の環境エンリッチメントの効果を定義する次の 16S メタゲノム ライブラリ プロトコルの準備22 V1 V3 プライマーでマイクロバイ集団を識別します。この手順は、増幅し、16S rRNA 遺伝子の他の変数の領域をシーケンスに変更できます。1 つの方法は、プローブによって識別されるサンプルで現在の細菌の系統分類を理解するプローブ一致を使用することです。この方法を明確に定義し、関心の微生物の系統分類、プローブが対象にできます。これは便のサンプルで現在の細菌の異なる特性をにより、病気の進行に影響を与える可能性がありますマウス腫瘍のマイクロバイ追加 EE 依存変化を明らかにすることがあります。

担癌動物の EE に続く最も変更された属として識別されたSutterella属は、この手順を使用します。この手順は、任意の方法は、人間の病気の遺伝子組み換えモデルのマイクロバイ組成に摂動の影響を分析するためのものを利用する研究に対応する合わせることができます。たとえば、EE、代わりにSutterella Sutterella接種が微生物の生物多様性を高め、16 週齢雄担癌動物での修理の傷に十分であるかどうかを定義するとマウスを再接種することができます。

間違いなく、このプロトコルの最もユニークな点は EE の前に細菌叢を正常化し、EE 研究を通してマイクロバイ多様性の維持に懸念。マイクロバイ研究を継続的に改善しているのでより堅牢なメソッド、マイクロバイを特徴付けるために発生する、このプロトコルではマイクロバイ特性が時代遅れになる可能性が高いです。たとえば、現在の研究では、16S rRNA を増幅するために使用するプローブ プローブが選択されていると、すべての細菌、マイクロバイに存在を特徴づけるものをに応じてバイアスがあります。調査し、マイクロバイを特徴付けるに使用するメソッドが間違いなく向上させる、デザインと EE の実行の基本的な基礎実験まま、マイクロバイの正規化を念頭 EE 実験の重要な側面。

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Disclosures

著者は、彼らが利益相反のあるを宣言します。

Acknowledgements

我々 はユタ大学の生物統計学コア統計アドバイスや国立がん研究所賞 P30 CA042014 でサポートされているこれらの技術のコアへのアクセスのためのライブラリの順序、および k. ブーシェのユタ大学ゲノム コア B. Dalley をありがとうございます。記載されたプロジェクトは、国立癌研究所助成金 P01 CA073992 K01 CA128891 とハンツマン癌財団によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teklad Diets/Harlan Labs Chow Harlan Labs 3980X Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs.
Cell-Sorb Plus bedding Fangman Specialties 82010 Autoclave prior to use.
AIMS Tattooing System For Neonates AIMS NEO-9 https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system Lab Products 82120ZF Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device Lab Products 82109ZF Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth Lab Products 82100ZF Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top Lab Products 82101ZF Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Tunnel Bio-Serv K3323 or K3332 Connect cages together and use for enrichment
Grommet to connect Tunnel to cages Fabricated by the University of Utah Machine Shop n/a Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable
Fast-track wheel Bio-Serv K3250 or K3251 Use with mouse igloo and floor
Mouse Igloo Bio-Serv K3328, K3570 or K3327 Use with Fast-track wheel and floor
Mouse Igloo floor Bio-Serv K3244 Use with mouse Igloo and Fast-Track
Mouse Hut Bio-Serv K3272, K3102 or K3271
Crawl Ball Bio-Serv K3330 or K3329
Bio-hut Bio-Serv K3352 Wood pulp hut used for sheltering and nesting
Adhesive film  VWR 60941-072 Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping
Laminar Flow Ventilated Rack Techniplast Bio-C36 The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar.
1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free Any supplier
QIAamp DNA Stool MiniKit Qiagen 51504 This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE
Waterbath (capable of heating to 95) Any supplier For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells.
Waterbath (capable of heating to 70 degrees) Any supplier For 70 degree incubation of stool samples 
Ethanol (200 proof) Sigma Aldrich E7023
Fluorometer: Qubit ThermoFisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA broad Range Assay Kit ThermoFisher Scientific Q32850
EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 Qiagen 19086
Experiment specific primers Any Supplier
PCR grade water Any supplier
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix  Kapa Biosystems KK2601 For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns).
Agarose for running diagnostic gels Any supplier
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace Agilent 5067-5583 TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used.
Agencourt AMPure XP Magnetic Beads Beckman Coulter A63880 Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions
Magnetic stand Life Technologies AM10027
Library Preparation Guide Illumina Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Unique Dual Indexing Illumina Illumina Experiment Manager Software Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index Kit Illumina FC-131-1002 Used to add barcodes to amplicons
MicroAmp Optical 96-well reaction plate Applied Biosystems/ThermoFisher N8010560
TruSeq Index Plate Fixture Illumina FC-130-1005
Adhesive clear plate seal Applied Biosystems /ThermoFisher 4360954 Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film
Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads Illumina MS-102-3003
PhiX Control Kit Illumina FC-110-3001
Proteinase K (600 mAU/ml) Qiagen 19131 Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit
Data Analysis Tools Qiime QIIME software Tools Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Step 13.2. Qiime FastQ Join method  (http://code.google.com/p/ea-utils  ).  For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011).
Step 13.3. Qiime De-Novo OTU picking protocol http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Step 13.3.1. Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Step 13.3.1. Pynast Pynast Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). 
Step 13.3.1. Pynast Pynast_Greengenes DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study
13.3.1. Note:  Qiime Multiple Split Libraries http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Note:  Qiime Pick de novo OTUs script http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
Step 13.2.2. Qiime Create a mapping file http://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Step 13.2.2. Qiime Validate a mapping file http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Step 13.3.3. Qiime Link the OTU to sample description to mapping file http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Step 13.3.4. Qiime Summarize Taxa through plots http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Step 13.3.5. Qiime Biome Summarize table http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME.

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References

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