Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

Macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND) peut détecter de petites quantités de molécules associées à risque et sont donc facilement apprêté. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des RCSCND de sang et de tumeurs et de leur mise en route avec les complexes immuns tout en soulignant des précautions qui doivent être menées afin d’éviter leur activation prématurée.

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Santana-Magal, N., Rasoulouniriana, D., Saperia, C., Gutwillig, A., Rider, P., Engleman, E. G., Carmi, Y. Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes. J. Vis. Exp. (135), e57188, doi:10.3791/57188 (2018).

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Abstract

Les cellules dendritiques (DC) sont des populations de cellules hétérogènes qui diffèrent dans leur membrane cellulaire marqueurs, migratoires et leur distribution, ainsi que dans leur présentation de l’antigène et les capacités d’activation des lymphocytes T. Puisque les vaccins la plupart des modèles de tumeurs expérimentales nécessitent des millions de DC, ils sont largement isolés de la moelle osseuse ou de la rate. Cependant, ces DC diffèrent sensiblement du sang et tumeur DC dans leurs réponses à complexes immuns (IC) et probablement d’autres récepteurs couplés Syk lectine. Important, étant donné la sensibilité de la DC aux molécules associées à risque, la présence d’endotoxines ou anticorps récepteurs activation crosslink dans l’un de l’isoler les étapes pourrait entraîner l’amorçage du DC et ainsi influer sur les paramètres, ou du moins la dosage, pour les activer. Par conséquent, nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler le RCSCND de sang et les tumeurs tout en évitant leur activation prématurée. En outre, un protocole est fourni pour l’activation de RCSCND avec tumeur IC et leurs analyses subséquentes.

Introduction

Depuis leur découverte, les cellules dendritiques (DC) ont été au centre de recherches approfondies en raison de leur capacité unique à biaiser la différenciation des cellules de T1. Depuis les dernières décennies, un effort de recherche approfondie a cherché à définir les divers sous-ensembles de DC et de leur fonction au cours de la progression tumorale et immunité 2. Contrôleurs de domaine sont composés de populations de cellules hétérogènes qui ne diffèrent les uns des autres sur leurs récepteurs de reconnaissance de motifs, distribution tissulaire, et migrateurs et antigène présentation fonctionnalités3,4,5. Par rapport aux autres sous-ensembles de DC, DC macrophages dérivés de monocytes (RCSCND) sont beaucoup plus abondant dans les tumeurs et peut être facilement généré de circulation ou tumeur-infiltrant monocytes,6,,7. Par conséquent, plusieurs essais cliniques, qui cherchent à tirer profit de leur prévalence relative reposent sur manipulation in vivo et ex vivo de RCSCND autologue pour obtenir des cellules T immunitaires 8,9.

De même, vaccination DC basé sur des modèles expérimentaux de tumeur nécessite des injections séries 2-3, 5-7 jours d’intervalle, de 1-2 x 106 activé DC pulsé avec des antigènes de la tumeur. Par conséquent, pour atteindre ce grand nombre de DC, la plupart des études de souris ont principalement utilisé RCSCND pendant 7 à 9 jours (IL-4 n’est pas nécessaire dans le cadre de la souris) d’échantillons de précurseurs de la moelle osseuse (BM) dans le GM-CSF10,11. Néanmoins, compte tenu de cette knockout de GM-CSF souris ont globalement normal DC compartiment 12,13et les populations mixtes issues de cette culture,14 la pertinence physiologique de ces DC a été remise en question.

Alternativement, DC peut être systématiquement isolé des cellules de rate. Toutefois, DC ne comprendre qu’environ 0,3 à 0,8 % des cellules de la rate total (soit environ 7 x 105 DC/rate) et de ces cellules, seulement CD103+ DC et RCSCND peuvent migrer vers les organes lymphoïdes. Puisque MoDCs représentent environ 10 à 15 % des splénique DC populations15,16, la plupart des protocoles d’isolement donnent environ 1 x 105 RCSCND par rate. Extension de RCSCND est possible en injectant des cellules transfectées B16 qui sécrètent le GM-CSF, résultant en une augmentation de 100 fois dans la rate RCSCND17. Cependant, l’utilisation de RCSCND pour le développement de vaccins DC est limitée étant donné que cette procédure ne peut se faire chez l’homme et obtenus RCSCND sont déjà fortement activés.

En plus d’obtenir un nombre suffisant de DC, un autre défi pour le développement de vaccins DC efficaces contre les cellules cancéreuses autologue implique l’absence de signaux de danger suffisant dans le cadre de la tumeur pour activer complètement DC. Induction de signaux de costimulation est habituellement obtenue grâce à l’activation des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR), ou lectine de type c signalisation voies18,19,20,21. Une autre approche pour l’activation de DC exploite leur capacité à relever les antigènes grâce à des interactions avec des récepteurs Fcγ de surface (FcγR). En effet, un certain nombre de manuscrits importants ont montré que l’injection de RCSCND de précurseurs de BM activé avec la tumeur-IgG IC peut empêcher la croissance de la tumeur dans paramètres prophylactiques et peut conduire à l’éradication des tumeurs établies22,23 .

Dans deux articles récents, Carmi et coll. a découvert que, contrairement aux BMDC et rate DC, RCSCND du sang et les tumeurs ne peut répondre à IgG IC sans stimuli additionnels. Cela s’est avéré pour être due à la présence de haut niveau intracellulaire de tyrosines phosphatases réglementer FcγR signalisation24,25. En définissant un point de contrôle critique dans DC, ce travail a fourni un aperçu important sur les exigences relatives à la vaccination de base DC réussie. L’exigence pour des stimuli additionnels permettre FcγR signalisation et signalisation sans doute d’autres récepteurs de lectine utilisant une cascade de phosphorylation similaires, donc souligne la nécessité pour éviter les désamorçages DC pendant leur isolement.

Par conséquent, le présent protocole décrit l’isolement des RCSCND de sang et les tumeurs, qui diffèrent nettement de la BM et de la rate DC, et met en évidence les précautions à envisager au cours du processus.

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Protocol

Les protocoles ci-dessous se référer à l’isolement des souris RCSCND, mais les principes généraux peuvent s’appliquer à d’autres cellules de sous-ensembles de DC, aussi bien. 12 - souris C57Bl/6j 16-semaines ont été maintenus dans une Association américaine pour l’animalerie Accreditation of Laboratory Animal Care accrédité. Tous les protocoles ont été approuvés par l’Université de Stanford et Tel-Aviv University Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme.

1. isolement de la tumeur associée dérivée DC

  1. Dans une hotte à flux laminaire, enlever des tumeurs chez des souris de CO2 euthanasiés et placer des tumeurs dans RPMI milieu sans sérum fœtal (SVF).
    Remarque : Il est fortement recommandé de se raser les souris et les pulvériser avec l’éthanol à 70 % avant d’enlever les tumeurs, afin de minimiser la contamination potentielle de la fourrure. Veillez à ce que la tumeur ne dépasse pas 25-40 mm2 , étant donné que les tumeurs de plus grandes ont moins DC qui ont tendance à être fragiles et sujettes à subir la mort cellulaire. Si un plus grand nombre de DC est nécessaires, chaque souris peuvent être injectés avec des cellules de tumeurs à plusieurs endroits.
  2. Sous une hotte laminaire stérile, hacher les tumeurs à l’aide de ciseaux de chirurgie en petits morceaux (environ 1 x 1 mm2).
    1. Ajouter tous les fragments de la tumeur de souris dans un 30 mL fond plat tube stérile avec agitation magnétique bars, qui contient 5 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS), 2 mg/mL collagénase IV et 0,01 mg/mL DNase I.
      ATTENTION : Les cellules myéloïdes produisent de l’énergie par le biais de glycosylation, même sous l’état d’équilibre. Par conséquent, seuls supports d’utilisation qui contient de glucose (p. ex. HBSS RPMI et DMEM), comme la famine de glucose pour aussi peu que 10-15 min entraînera la mort cellulaire et l’apoptose dans les 24 h. utilisation uniquement une collagénase endotoxines faibles IV, comme la collagénase est produit par Gram positif bactéries (Clostridium histolyticum).
  3. Agiter à environ 200-400 tr/min dans un incubateur à 37 oC avec un agitateur magnétique pendant 20-30 min.
  4. Ajouter 5 mL de support complet et remettre en suspension vigoureusement.
  5. Filtrer les cellules à travers un tamis de cellule de 70 µm. Centrifuger à 4 oC 400 rcf pendant 5-10 min granuler les cellules.
    ATTENTION : Ne pas tenter d’isoler les cellules directement après digestion enzymatique, comme certaines tumeurs sont nécrosées et contiennent des quantités relativement importantes de débris cellulaires ou de la matrice extracellulaire. Appliquer des cellules sur milieu de gradient de densité 15 % pour obtenir uniquement les cellules.
  6. Suspendre 9 mL de milieu de gradient de densité avec 1 mL de PBS de x 10 pour ajuster l’osmolalité et d’obtenir la solution-mère Percoll 100 %. Mélanger 1,5 mL de milieu gradient de densité solution avec 8,5 mL HBSS mère et mélanger vigoureusement avec culot dérivées de tumeurs. Doucement la couche 2 mL de DMEM haut gradient moyen de 15 % densité et centrifuger à 400 rcf pendant 20 min à température ambiante. Jeter le surnageant, car les cellules formeront un culot au fond du tube.
    1. Laver les cellules granulés deux fois par re-suspension eux dans 10 mL HBSS contenant 2 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine et 10 mM EDTA (isolement tampon) et centrifuger à 4 oC 400 rcf pendant 5-10 min pour les cellules de granule.
    2. Compter les cellules sur un hémocytomètre utilisant trypan bleu sous un microscope optique.
  7. Remettre en suspension des cellules de 1 x 108 isolément de 1 mL de tampon et les incuber à 4 oC avec 30 μL de CD11b+ conjugués des billes magnétiques pendant 15 min.
    ATTENTION : Évitez d’utiliser des perles CD11c conjugué, car cela activera le DC et induire la mort cellulaire. Ne pas tenter de bloquer les FcγRII et FcγRIII avec des anticorps anti-CD16/32. Blocage des anticorps ligaturer FcγR et induit la phosphorylation forte des MAP kinases et amorcer le contrôleur de domaine.
    1. Retirez les perles non consolidés excédentaires en ajoutant 9 mL de tampon de l’isolement et les cellules de la centrifugeuse à 400 rcf pendant 5-10 min à 4oC.
  8. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon d’isolement. Appliquer les cellules sur une colonne prélavée magnétique. Laver la colonne deux fois avec 3 mL de tampon de l’isolement.
    1. Supprimer la colonne de l’aimant. Pipetter 6 mL de tampon d’isolement sur la colonne et débusquer les cellules marquées par magnétisme dans un tube de prélèvement stérile en poussant le piston. Cellules de centrifugeuse à 400 rcf pendant 5-10 min à 4 oC.
    2. Remettre en suspension les cellules à 100 μL par 1 x 107 cellules et teinture avec l’anticorps conjugué à un fluorophore suivants : Linage négative (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI et Ly6G), MHCII, Ly - 6C.
  9. Trier des cellules en bloquant les petites cellules, à l’aide de diffusion latérale (SSC) et avant la dispersion (FSC) et la culture en milieu complet additionné de 5 ng/mL GM-CSF. Incuber les cellules pendant 1 heure à 3 7 oC afin de permettre des macrophages à adhérer à la plaque. Ensuite, transférer le lâche et les cellules non adhérentes à une nouvelle boîte de Pétri.
    Remarque : La souris RCSCND sont définies comme CD11b+/CD11c+/MHCIISalut/Ly6Clo/int 7,26,27. Expression de Ly6C peut-être varier considérablement entre les modèles de la tumeur et dans certains modèles (par exemple LMP) MoDCs manque complètement d’expression Ly6C. Dans l’ensemble, une tumeur de3 B16F10 100 mm contient en général 5 x 104 de DC, entraînant environ 4-5 x 106 cellules total. De ces cellules, 10 à 15 % sont des cellules immunitaires et 8 à 10 % sont RCSCND. Augmenter le nombre de DC est possible par l’injection de souris présentant des tumeurs à plusieurs endroits. Seules de petites cellules SSC/FCS tri, comme les autres cellules myéloïdes peuvent exprimer des marqueurs tels que CD11c et Ly6C.
    Facultatif : Trier le monocyte infiltration tumorale sous forme de petites cellules SSC/FSC qui expriment Ly6CSalut et sont négatifs pour MHCII. Par la suite, la culture monocytes in vitro avec 50 ng/mL GM-CSF pour obtenir DC.

2. isolement de MS macrophages dérivés de monocytes du sang périphérique

Remarque : Puisque MoDCs matures sont relativement rares dans le sang de souris, le protocole ci-dessous se réfère à leur dérivation in vitro de monocytes triées.

  1. Pour augmenter les niveaux de monocytes dans le sang, d’offrir une souris avec 4 % isoflurane et injecter par voie sous-cutanée (s.c.) avec 1 μg de GM-CSF dans 50 μl de PBS.
  2. Après 1-2 h, sacrifier la souris à l’aide de CO2.
    ATTENTION : Ne sacrifiez pas les souris par dislocation cervicale, car cela provoquerait une hémorragie interne.
  3. Immédiatement après l’euthanasie, la souris de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et enlever la peau qui recouvre le cœur à l’aide de ciseaux chirurgicaux, sous une hotte à flux laminaire stérile. Nettoyez les ciseaux avec de l’éthanol et coupez l’oreillette droite du cœur. Lentement, rincer le coeur dans le ventricule droit avec 20 mM EDTA HBSS à l’aide d’une seringue de 10 mL et une aiguille 25 G.
    1. Recueillir le sang avec une seringue stérile de la cavité pleurale dans un tube stérile contenant de l’héparane sulfate et EDTA. Continuer à vider le cœur jusqu'à ce que le foie et les poumons devenus rose ou les blancs.
  4. S’appliquent à sang sur une centrifugeuse de gradient moyen et de densité à 400 rcf à température ambiante pendant 15 minutes avec frein faible.
    Mise en garde : Gradient moyen utilisation exempte d’endotoxine densité (habituellement moins de 0,12 EU / mL).
    1. Prélever des cellules mononucléaires dans un nouveau tube. Laver les cellules par re-suspension dans 10 mL HBSS contenant 2 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine et 10 mM EDTA (tampon isolation) et centrifugation puis à 4 oC 400 rcf pendant 5-10 min granuler les cellules.
      ATTENTION : Utilisez uniquement les médias qui contient au moins 1 g/L de glucose.
  5. Pour la sélection positive CD11b, remettre en suspension 1 x 108 éléments dans 1 mL de tampon d’isolement et les incuber pendant 15 min et 50 μL de billes magnétiques CD11b conjugué à 4 oC.
    1. Perles de l’excès de lavage en ajoutant 9 mL de tampon d’isolement et de centrifugation à 400 rcf pendant 5-10 min à 4 oC. aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon d’isolement. Appliquer les cellules sur une colonne magnétique prélavée conformément aux instructions du fabricant.
    2. Supprimer la colonne de l’aimant, Pipetter 6 mL de tampon d’isolement sur la colonne et débusquer les cellules marquées par magnétisme dans un tube de prélèvement stérile en poussant le piston. Centrifuger les cellules à 400 rcf pendant 5-10 min à 4 oC. Wash la colonne deux fois avec 3 mL de tampon de l’isolement.
    3. Remettre en suspension les cellules à 1 x 107 cellules/100 μL isolement tampon et tache avec l’anticorps conjugué à un fluorophore suivants : 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII et 0,1 μg Ly-6C/1 x 106 cellules.
  6. Trier les cellules de déclenchement sur la diffusion de petit côté (SSC) et cellules de petits nuages de points avant (FSC).
    Remarque : Les monocytes inflammatoires de souris sont généralement définis comme CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CSalutet patrouillant dans les monocytes sont définies comme CD115+/MHCII de /Ly6Clo/negneg 4,5. Dans les cas où aucune séparation entre les deux sous-ensembles n’est nécessaire, total SSClo/FCSlo/CD115+/lo cellules MHCII peuvent être triées. Les naïfs et les porteurs de tumeur souris contiennent environ 5-8 x 104 RCSCND par 1 mL de sang et 4-5 x 105 RCSCND qui suit l’injection de GM-CSF. D'entre eux, environ 70 % sont des monocytes inflammatoires et 30 % sont alors qu’ils patrouillaient monocytes.
  7. Plaque des cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL dans un média complet additionné de 20 ng/mL GM-CSF. Après 1 jour, transférer les cellules non adhérentes et faiblement adhérentes à une nouvelle plaque et de la culture pour une période supplémentaire de 4-5 jours.
    ATTENTION : Médias DC ne devraient pas être complétés par pyruvate.

3. préparation des Complexes immuns tumeur-IgG

  1. Cellules tumorales de la culture dans le flacon de culture de2 75 cm à la confluence de 70 % dans les médias DMEM complets.
    1. Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine/EDTA pour détacher des cellules de la morphologie des cellules culture fiole et moniteur sous un microscope optique pour éviter trop de trypsinisation.
    2. Ajoutez 8 mL de milieux de culture complet (par 2 mL de trypsine) pour inhiber la digestion trypsique et centrifuger à 4 oC, 400 rcf pendant 5-10 min granuler les cellules.
      Remarque : Veillez à vérifier les cellules tumorales pour le mycoplasme à l’aide d’une trousse commerciale de PCR. Test pour la présence de bactéries Gram-négatives et endotoxines fongiques à l’aide de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) dosage28). Sérum doit être filtré à l’aide de 0,22 μM et testé pour les 9 virus Code of Federal Regulations. En outre, tester les milieux de culture et les sérums en se laissant tomber 100-200 μL sur une gélose LB ou bouillon et la culture pendant 2 jours à 37 oC.
    3. Laver les cellules encore des vestiges de la trypsine et le sérum par re-leur suspension dans 10 mL de PBS et centrifuger à rcf 400 pour 5-10 min. aspirer le surnageant et répéter le lavage 2 fois plus.
  2. Fixer les cellules à la paraformaldéhyde 1,8 % mis en mémoire tamponné pendant 10 min à température ambiante.
    1. Laver les cellules en les suspendant nouveau dans 10 mL de PBS et centrifuger à 4 oC 400 rcf pendant 5-10 min.
    2. Les surnageants obtenus par aspiration et répéter lavent deux fois plus.
      Facultatif : Pour les tests de captation de tumeur, les cellules peuvent être étiquetés par incuber pendant 5 min à 37 oC dans du PBS contenant 1 ester de succinimidyl carboxyfluorescéine μM (CFSE). CFSE est ensuite trempé avec support complet pendant 10 min dans la glace. Les cellules doivent être lavés abondamment dans du PBS contenant 2 % de sérum pour éliminer le colorant résiduel.
  3. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de FACS (PBS complété avec 2 % FCS + 5 mM EDTA) et 0,5 μg/mL d’anti-CD16/32 afin de bloquer les interactions potentielles de protéines non spécifiques. Plaque en une forme de U 96 puits/plaque à une concentration de cellules de5 1 x 10 / 100 μL.
    1. Ajouter différentes dilutions d’anticorps de tumeur-liaison allant de 5 μg - 5 ng/1 x 105 cellules. Incuber les plaques sur la glace pendant 15-20 min.
      NOTE : IgG anticorps ont été isolés dans le sérum de souris femelle âgés de 20 à 24 semaines de naïves sur des colonnes de la protéine A, décrit24.
  4. Laver les cellules en ajoutant 150 μL de PBS et centrifugation de la plaque à 4 oC 400 rcf pendant 5-10 min.
    1. Jeter le surnageant et répéter le lavage deux fois. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de FACS μL 100 contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore. Incuber les plaques sur la glace pendant 20 min.
    2. Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de FACS et centrifugation de la plaque à 400 rcf pendant 5-10 min. Jetez les surnageants et répéter le lavage.
    3. Analyser la liaison de la tumeur par cytométrie en flux et déterminer la concentration minimale requise pour enrober les cellules.
      NOTE : Anticorps qui n’augmentent pas intensité de fluorescence moyenne (IMF) des cellules tumorales colorées par au moins cinq fois isotype contrôle ne doivent pas être utilisés dans les essais fonctionnels ultérieurs.

4. intervention de RCSCND avec IC tumeur-IgG

  1. Enduire des cellules tumorales avec une concentration minimale de IgG, tel que décrit dans les sections 3.1 à 3.4.3
    1. Un jour avant d’activer RCSCND avec tumeur IC, remplacer des milieux de culture RCSCND, qui contient le GM-CSF. Pour ce faire, doucement aspirer les médias et laver les cellules une fois avec les milieux de culture complet pré chauffé.
      NOTE : Isolé mature associées aux tumeurs RCSCND devrait être cultivée au moins 2-3 h (ou même pendant la nuit) après un tri dans les médias sans GM-CSF et avant d’activer leur avec IC.
    2. Pour les analyses de tumeur de captation, ajoute la tumeur marqués au CFSE IC RCSCND à un ratio de 1:5 (IC:MoDC) et incuber pendant la nuit pour les 12-16 h dans 1 mL de médias complet par 1 x 106 DC.
    3. Pour les analyses de FACS d’expériences d’activation RCSCND, ajouter tumeur-IC au ratio de 1:1 (IC:MoDC) et incuber pendant la nuit pour les 12-16 h.
      Remarque : Il est fortement recommandé d’inclure un contrôle positif, dans lequel RCSCND sont stimulés avec 1 μg/mL de LPS ou d’autres agonistes TLR.
    4. Après l’activation au jour le jour, aspirer le surnageant et lavage des cellules doucement trois fois avec un tampon d’isolation, ou 10 mM EDTA HBSS.
    5. Pour en détacher la plaque de DC, incuber les cellules pendant 2-3 min dans 1 mL HBSS contenant 10 mM EDTA et détacher les cellules en pipettant également, vigoureux.
    6. Centrifuger les cellules à rcf 400 et remettre en suspension 1 x 106 DC dans 90 μL PBS additionné de 2 % FCS, 5 mM EDTA (tampon de FACS) et 0,5 μg de bloquer les anticorps. Incuber sur glace pendant 5-10 min.
    7. Ajouter 10 μL de mélange d’anticorps aux cellules de coloration et incuber sur la glace pendant 15 min.
    8. Ajouter 2 mL de FACS tampon aux cellules et centrifuger à 4 oC 400 rcf pendant 5-10 min.
  2. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de FACS 200 μL.
    1. Ajouter 0,5 - 1 μg/mL de DAPI 1-2 min avant l’exécution des exemples, pour exclure les cellules mortes de l’analyse. Incuber pas trop DAPI, comme RCSCND il prendra dans les 10-15 min.

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Representative Results

Au départ, nous avons comparé la capacité des anticorps de souris syngénique et allogéniques naïves pour lier les cellules tumorales. À cette fin, des lignées cellulaires tumorales B16F10 et LMP ont été fixées dans la paraformaldéhyde et lavées abondamment. B16F10 est une lignée de cellules de mélanome malin, qui a été isolée à l’origine de métastases pulmonaires chez les souris C57Bl/6. LMP est une cellule de tumeur du pancréas qui a été isolée chez KrasG12D / +, souris LSL-Trp53R172H / + et Pdx-1-Cre et se développe progressivement chez la souris 129F1. Pour obtenir des IC, les cellules tumorales ont été incubées pendant 20 min sur glace avec 2 μg d’IgG syngénique ou allogénique par les cellules tumorales de 1 x 105 . IgG et IgM anticorps ont été isolées de la circulation des naïfs souris âgée de 20-24 semaine sur la protéine A, puis par chromatographie d’exclusion stérique comme décrit24. Cellules étaient ensuite lavés et colorées avec les anticorps secondaire conjugué PE rat anti-souris IgG, et l’intensité de fluorescence moyenne a été analysée dans un cytomètre en flux. Comme indiqué dans la Figure 1 a, anticorps IgG de souris allogéniques C57Bl/6 lié LMP tumeur cellules ex vivo bien plus efficacement que les anticorps de souris syngénique 129S1. De même, la coloration des B16F10 fixes 129S1 IgG allogénique a plus de dix fois supérieur, comparativement à coloration avec syngénique IgG de souris C57Bl/6 naïves. Fait intéressant, souris porteuses de tumeurs B16 a échoué à produire des anticorps avec la capacité de liaison semblable à celle des souris allogéniques, même au cours de la progression de la tumeur (Figure 1 b).

Nous avons ensuite cherché à comparer la réponse de l’IC de RCSCND du sang et des tumeurs à celle des DC de la rate et de la BM. Pour isoler associées aux tumeurs RCSCND, tumeurs B16F10 sont enzymatiquement dissociés pour obtenir des suspensions de cellules du même. Les cellules immunitaires ont été enrichies à l’aide de billes magnétiques-CD45 et RCSCND étaient encore triées comme SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Clo de FACS (Figure 2 a). Il est à noter que différentes tumeurs DC peuvent avoir différents marqueurs qui définissent leur. Pour isoler RCSCND du sang, des monocytes circulants ont été enrichies de billes magnétiques conjugué CD11b et davantage triés comme SSClo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. Cellules sont cultivées puis 1 nuit GM-CSF, et les cellules non adhérentes et faiblement adhérentes ont été transférés dans une nouvelle plaque et cultivées pour 4-5 jours supplémentaires obtenir RCSCND (Figure 2 b). Comme point de référence, que nous avons utilisé BMDC, agissant comme le « gold standard » DC pour les nombreux tests fonctionnels, ainsi que RCSCND splénique, qui reflètent un sous-ensemble de DC plus physiologique. BMDC ont été obtenus en triant les BM pro-monocytes (CD11b+/Ly6Chi/CD115hi/MHCIIneg), suivie de leur mise en culture pendant 7 jours avec le GM-CSF, décrit24. RCSCND splénique ont été isolées de la suspension de la cellule unique, obtenue en écrasant la rate à travers un tamis de cellule (pré-incubation avec la collagénase n’est pas nécessaire pour RCSCND splénique), suivie d’enrichissement avec billes magnétiques CD11b conjugué. Les cellules étaient ensuite triés comme SSClo/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCIISalut/CD11cSalut et cultivées pendant 1 heure dans RPMI complet à 37oC à restaurer l’activité basale.

Pour étudier l’effet des IgG IC RCSCND activité, nous avons incubé les sous-ensembles DC isolés pendant la nuit avec des cellules tumorales fixe ou avec des cellules de tumeur fixe préalablement recouvertes d’IgG allogénique. Activation de BMDC ou DC splénique avec IC a entraîné une expression accrue CD86 et MHCII, contrairement à RCSCND, ou RCSCND associées à la tumeur (Figure 3 a). La capacité d’absorption teinté CFSE dérivées de tumeurs protéines, avec ou sans IgG allogénique, a été également comparée. Tel qu’observé par microscopie confocale, DC splénique a montré une capacité supérieure à internaliser les protéines dérivées de tumeurs (Figure 3 b).

Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la tumeur DC et RCSCND répondent différemment splénique DC et BMDC à activation avec alloIgG-IC. Par conséquent, les stratégies de vaccination qui souhaite activer tumeur que DC ne peut se fonder uniquement sur les modèles d’activation de BMDC.

Figure 1
Figure 1 : souris allogéniques ont naturellement des anticorps IgG tumeur-liaison dans leur circulation : A. moyenne intensité de fluorescence (MFI) des cellules tumorales LMP colorées avec les anticorps IgG isolés du sang de syngénique (129S1) et la souris de naïves allogéniques (C57Bl/6). B. moyenne intensité de fluorescence (IMF) des B16F10 des cellules tumorales incubées avec l’anticorps IgG isolés de la circulation des souris de tumeur-roulement syngéniques (C57Bl/6), ou de souris naïves allogéniques (129S1). De données étendues 2 a et 2 b de la Carmi Y et al., ce chiffre a été modifié. Nature 7550:99 521-104, 201524.

Figure 2
Figure 2 : schéma de souris RCSCND du sang et les tumeurs B16 de tri. A. Isolation et système de tri des RCSCND cultivée de monocytes de souris. Microscopie confocale DIC image de monocytes inflammatoires et patrouilles après 4 jours de culture (x400). B. isolement et système de tri des RCSCND associées aux tumeurs tumeurs B16. Microscopie confocale représentant DIC image de RCSCND isolé de B16 tumeurs après une culture (x400). Ce chiffre a été modifié par supplémentaire figure 1 Carmi Y Aperçu JCI et coll. 1:18:e89020, 201625. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : RCSCND de la rate et de la BM afficher différents modèles d’activation de tumeurs et RCSCND de sang après incubation avec IC. A. cytométrie d’expression MHCII et CD86 par DC incubé durant une nuit avec tumeur IgG-IC. B. Confocal immunohistochimie de l’absorption de tumeur (verte) et expression MHCII (rouge) de DC incubés durant une nuit avec IC tumeur CFSE marqués. Ce chiffre a été modifié par les figures 3 a et 3DCarmi Y et al. Akt et SHP-1 sont des points de contrôle DC intrinsèques d’immunité tumorale. Aperçu de la JCI 1:18:e89020, 201625. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Vu le grand nombre de DC requis pour la vaccination de souris (environ 2-4 x 106 DC par une souris), la plupart de la vaccination stratégies chez les souris reposent sur l’isolement des DC de la BM et de la rate, suivie de leur activation ex vivo . Cependant, tente d’activer tumeur DC in vivo, en utilisant les mêmes conditions pour l’activation de la rate et BM DC, ont souvent échoué à produire une immunité efficace. Dans deux publications ultérieures, Carmi et al. ont trouvé que sang et tumeur RCSCND diffèrent sensiblement des rate et BM DC, étant donné qu’ils portent haut niveau intrinsèque de la tyrosine phosphatase et exigent d’apprêt avant l’activation avec IC24,25. En outre, ces résultats autres stress la nécessité de prendre des précautions supplémentaires afin de maintenir la DC dans un état d’activation qui mieux reflète leur état physiologique. Par conséquent, le présent protocole vise à fournir une description détaillée du processus d’isolation de RCSCND de tumeurs et de la circulation et pour mettre en évidence les étapes pouvant entraîner leur activation prématurée.

Tout d’abord, afin d’obtenir un nombre suffisant de DC de sang et de tumeurs, il y a un besoin pour un plus grand nombre de souris par rapport à celle des protocoles d’isolement BMDC. Pour augmenter le rendement du contrôleur de domaine, nous utilisons les souris de 16 semaines, qui ont les plus gros volumes de sang et les numérations globale. Nous recevons régulièrement de 5-8 x 104 RCSCND par 1 mL de sang sans injection de GM-CSF et 4-5 x 105 RCSCND suit injection. Pour tumeur DC, on obtient environ 6-8 x 104 RCSCND d’une tumeur de3 mm 100, même si le nombre peut varier entre souris individuels et entre les modèles de la tumeur. Augmenter les résultats taille tumorale à un rendement inférieur de DC, comme une tumeur de3 mm 1 000 aura seulement environ 5 000 DC. Au lieu de cela, nous injectons souris avec des cellules tumorales sur plusieurs sites (en général 4-6), obtenant ainsi jusqu'à 4 x 105 RCSCND par la souris.

En outre, nous recommandons qu’avant leur utilisation expérimentale, les anticorps, les lignées cellulaires, tubes et réactifs de laboratoire général doivent être testés pour endotoxines par test LAL et en ensemençant les médias sur les bactéries agar AC. Lignées cellulaires tumorales sont souvent infectées par Mycoplasma et doivent par conséquent être testées par PCR avant leur incubation avec DC. Utilisation de préparations de collagénase, tels que les Types 1 et 4, est une source primaire d’endotoxines en raison de l’isolement des collagénases de Clostridium histolyticum. Des préparations standards de collagénase peuvent contenir autant que 10 EU/mg d’endotoxines, qui est d’environ 1-2 ng de l’endotoxine / mL du mélange de la digestion. Jahr et al. ont trouvé que les préparations de collagénase contenant 2,7-6,7 ng/mL d’endotoxines induira 1 415-3 967 ng/mL de l’IL-1β suit culture avec PBMC29. En effet, l’amorçage de DC de façon habituelle avec 1 ng du LPS par mL de milieu, mais aussi peu que 100 picogrammes/mL est suffisant pour amorcer les30,31,32. Une autre source potentielle d’endotoxines FBS, pouvant contenir 25 EU/mL ou plus d’endotoxines, soit moins de 10 UE/mL. En supposant que les milieux de culture contient 10 % BF, la charge de l’endotoxine pourraient atteindre 0,5 ng/mL, qui est suffisant pour amorcer la DC.

En outre, nombreux protocoles utilisent des anticorps anti-CD16/32 pour bloquer les récepteurs Fc comme un moyen d’augmenter la spécificité de leur panneau d’anticorps avant le tri. Néanmoins, la réticulation de FcγRIII (CD16) mène à la phosphorylation de Syk/ZAP-70 et PLC-γ, libération de Ca2 + intracellulaire 33et la phosphorylation de P38 et ERK1/2 dans les monocytes humains34 et souris35. Dans nos mains, addition d’anti-CD16/32 à RCSCND cultures induit toujours une forte phosphorylation des kinases P38 et ERK1/2 dans DC moins d’une minute d’exposition. C’est pourquoi, nous, suggèrent fortement évitant l’utilisation des anti-CD16/32 en isolant RCSCND pour in vitro tests fonctionnels.

Un autre protocole commun utilise enrichissement de DC de billes magnétiques CD11c avant leur tri par les FACS. CD11c est un type j’ai glycoprotéine transmembranaire qui reconnaît une variété de ligands, y compris le fibrinogène, LPS, de type I le collagène et la sous-unité de C3b inactivée. Rezzonico et coll. ont montré que la ligature de CD11c avec anticorps induit l’activation de NFκB puissante et la sécrétion de chimiokines36. Dans notre expérience, les anticorps anti-CD11c immobilisée induisent activation cellulaire et l’apoptose, tandis que l’utilisation de leur forme soluble dans le tri des FACS n’induit la phosphorylation de P38 ou de ERK1/2.

Dans l’ensemble, ce protocole est conçu pour réaliser l’isolation de RCSCND avec activation aussi peu que possible, afin que leur activation ultérieure in vitro reflète les conditions requises pour leur activation in vivo.

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Disclosures

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts et qu’ils n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Aucun

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PREMIUM GE-Healthcare 17-5442-02
OptiPrep StemCell Technologies 07820
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19861
Collagenase IV Sigma C9697-50MG Test each lot for endotoxin
DNase I Sigma DN25-10MG
HBSS ThermoFisher 14025092
FBS ThermoFisher 16140071 Test each lot for endotoxin
PE-CD11c Biolegend 117307
APC-CD11b Biolegend 101211
Brilliant Violet 650 MHCII Biolegend 107641
AF48- CD86 Biolegend 105017
APC/Cy7-Ly-C6 Biolegend 108423
PE/Cy7-CD15 Biolegend 135523

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