تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف لنا التثبيت وتضمين البارافين وتقنيات تقطيع رقيقة للأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. في إعداد العينات، يمكن تصور أنماط التعبير محيطة ومراسل بيوفيلم بالفحص المجهري.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تقطيع عن طريق تضمين البارافين أسلوب المنشأة على نطاق واسع في نظم حقيقية النواة. هنا نقدم طريقة لتثبيت البرنامج، التضمين، وتمزيقها للأغشية الحيوية سليمة مستعمرة الميكروبية باستخدام شمع البارافين perfused. للتكيف مع هذا الأسلوب للاستخدام في مستعمرة الأغشية الحيوية، تطوير تقنيات للحفاظ على كل عينة على الركيزة النمو وتغليف شفاف فإنه مع أوفيرلايير أجار، وإضافة يسين للحل مثبت. هذه التحسينات تحسين الاحتفاظ بعينه والحفاظ على ميزات ميكرومورفولوجيكال. نماذج إعداد بهذه الطريقة قابلة رقيقة تمزيقها والتصوير بالمجهر الإلكتروني الضوء، والأسفار، وانتقال العدوى. نحن طبقت هذه التقنية على مستعمرة الأغشية الحيوية الزائفة الزّنجاريّةPseudomonas سينكسانثا ونجحت عصية، و الكوليرا. ارتفاع مستوى التفاصيل التي تظهر في العينات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع مراسل سلالة الهندسة أو استخدام الأصباغ محددة، يمكن أن توفر أفكاراً مثيرة في علم وظائف الأعضاء وتنمية المجتمعات الميكروبية.

Introduction

معظم الميكروبات لها القدرة على شكل الأغشية الحيوية، الذي عقد مجتمعات خلايا معا بالذات المنتجة المصفوفات. الأغشية الحيوية يمكن زراعتها في أنواع عديدة من الأجهزة المادية، مع مختلف النظم لتوفير المواد الغذائية والركيزة. فحوصات محددة لتشكيل بيوفيلم تميل إلى أن تسفر عن هياكل متعددة الخلايا استنساخه، وملاحظة أبنية مشتركة بالنسبة للأنواع المتنوعة فيلوجينيتيكالي على المجتمع أو على مستوى العيانية. عندما تزرع الميكروبات كمستعمرات في المتوسطة الصلبة تحت جو، ينقل المعلومات حول القدرة على إنتاج مصفوفة مورفولوجيا العيانية وكثيراً ما يرتبط مع سائر الصفات 1،2،3. البنية الداخلية للمستعمرات الميكروبية يمكن أيضا أن توفر أدلة بخصوص بيوفيلم-خاصة بالكيمياء وعلم وظائف الأعضاء، ولكن كان من الصعب تميز. تمكين التطبيقات الحديثة لتقنيات كريومبيدينج وكريوسيكتيونينج للمستعمرات البكتيرية التصوير والتصور من السمات المحددة في قرار لم يسبق له مثيل 4،،من56. ومع ذلك، أظهرت الدراسات مع الأنسجة الحيوانية أن التضمين البارافين يوفر الحفاظ على تفوق مورفولوجيا بالمقارنة مع كريومبيدينج 7 ، وقد استخدمت لتصور البكتيريا في أنسجة 8،9. ولذلك قمنا بتطوير بروتوكول للتثبيت، وتضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. وهنا، نحن سوف تصف إعداد الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 بيوفيلم مستعمرة مقاطع رقيقة 10،11، ولكن نحن أيضا بنجاح تطبيق هذا الأسلوب للأغشية الحيوية التي شكلتها البكتيريا سينكسانثا pseudomonas، ونجحت عصية، و الكوليرا12.

تتبع عملية التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة الأغشية الحيوية منطق بسيط. أولاً، يتم المغطى الأغشية الحيوية في طبقة من أجار للحفاظ على مورفولوجيا أثناء المعالجة. ثانيا، المغطى-الأغشية الحيوية مغمورة في مثبت للجزيئات التشعب والحفاظ على ميكرومورفولوجي. هذه هي المجففة ثم مع الكحول، وتطهيرها بالمذيبات غير قطبية أكثر، وثم تسللت مع شمع البارافين السائل. مجرد تسلل، يتم تضمين العينات إلى كتل الشمع لتمزيقها. قطع المقاطع، شنت على الشرائح، وثم امهاء بغية إعادتها إلى دولة أصلية أكثر. من هذه النقطة، يمكن الملون أو المشمولة في وسط تصاعد للتحليل المجهري.

وينتج هذا البروتوكول مقاطع رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مناسبة للتحليل النسيجي. مستعمرة بيوفيلم هياكل فرعية مرئية عندما يتم تصويرها رقيقة أقسام المعدة باستخدام هذا الأسلوب بالفحص المجهري الخفيفة. الأغشية الحيوية يمكن أيضا نمت على البقع الفلورسنت التي تحتوي على وسائط محددة للسمات الفردية أو الملون في خطوة الإماهة، مباشرة قبل تصاعد (خطوات 9.5-9.6). وأخيراً، يمكن إجراء هندسة عكسية الميكروبات لإنتاج البروتينات الفلورية بطريقة التأسيسي أو التنظيم مما يسمح في الموقع إبلاغ الخلية التعبير التوزيع أو الجينات داخل هذه المجتمعات. وقد استخدمنا هذه الأساليب لتحديد عمق بيوفيلم مستعمرة وتوزيع الخلايا وتوزيع مصفوفة، وأنماط النمو والتعبير الجيني الزمانية المكانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-نمو الزائفة الزّنجاريّة "مستعمرة الأغشية الحيوية"

  1. إعداد لوحات متوسطة-بلير
    1. إعداد تريبتوني 10 غرام/لتر، 10 غرام/لتر أجار الحل (انظر الجدول للمواد) في المياه.
    2. اﻷوتوكﻻف ل 20 دقيقة كول إلى 50-60 درجة مئوية في حمام مائي.
    3. صب 45 مل الحل تريبتوني أجار في صحن مربع 100 ملم × 100 ملم (انظر الجدول للمواد) باستخدام أنبوب مخروطي 50 مل. تسمح أجار ترسيخ (~ 20-30 دقيقة). صب طبقة الثانية، 15 مل فوق الطبقة الأولى. إزالة التكثيف من أغطية اسمحوا يصلب بين عشية وضحاها، إذا لزم الأمر بالمسح مع أنسجة خالية من الوبر.
  2. اكتشاف مستعمرة الأغشية الحيوية
    1. متتالية سلالات الفائدة من الأرصدة المجمد إلى رطل أجار لوحات13 واحتضانها في الظلام ح 12-16 في 37 درجة مئوية و 80-100% من الرطوبة النسبية.
    2. لكل سلالة أو تكرار، استخدم مستعمرة واحدة لتطعيم 2 مل رطل واحتضان في الظلام ح 12-16 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
    3. الثقافة الفرعية بتمييع 1: 100 رطل الطازجة وتفرخ في الظلام ح 2.5-3 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
    4. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي وضبط مع رطل العقيمة لتحقيق تعليق خلية مع التطوير التنظيمي500 نانومتر ~ 0.5.
    5. اعتماداً على هذه المستعمرة المنشودة الحجم، بيبيت 2.5-10 ميليلتر من تعليق خلية على صفيحة متوسطة-بلير (تم إعداده في الخطوة 1، 1) والسماح على الفور لتجف ليمكن تيسير ~ 20 دقيقة ترك غطاء بيتري أجار القرب من لهب المكشوف تجفيف.
    6. احتضان المستعمرات بقعة في 25 درجة مئوية و 80-100% من الرطوبة النسبية، في الظلام لمدة تصل إلى 4 أيام.

2-إعداد الحل مثبت

  1. إعداد الحل مثبت في يوم الحصاد عينة. تمييع 37% فورمالدهيد (اتحاد كرة القدم) في برنامج تلفزيوني 1 x إلى تركيز نهائي من 4% اتحاد كرة القدم.
    تنبيه: اتحاد كرة القدم متقلبة والسامة. ارتداء معدات الوقاية ويعملون في غطاء دخان جيد التهوية.
  2. فورا قبل الاستخدام، حل هيدروكلوريد L-يسين في 4% فا (إعدادها في الخطوة 2، 1) في درجة حرارة الغرفة إلى تركيز نهائي من 50 مم L-يسين HCl.

3-توجيه تطبيق مثبت على بيوفيلم مستعمرة [اختياري]

ملاحظة: لقد وجدنا أن مورفولوجيا بيوفيلم هو الحفاظ على أفضل عندما تتم إضافة تراكب أجار قبل التثبيت. بيد أن هذه الخطوة تشكل أيضا تغييرا في الظروف البيئية التي يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني. أنماط التعبير مراسل الفلورسنت ينبغي بالتالي التحقق منها باستخدام بروتوكول منفصل الذي ينفذ خطوة التثبيت قبل إضافة تراكب أجار، كما هو موضح هنا.

  1. في اليوم من التثبيت، والعامل في غطاء دخان جيد التهوية، "الماصة؛" مثبت إعدادها في الخطوة 2 مباشرة إلى السطح أجار حول حافة المستعمرة، يسمح لها بالوصول إلى محيط المستعمرة دون غمر أنه. تنطبق فقط بكثير مثبت كما هو مطلوب بالكامل تحيط المستعمرة، حوالي 500 ميليلتر. تسمح مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها.
  2. وبمجرد مثبت قد تم استيعابها تماما في مستعمرة والمحيطة بها وسائل الإعلام، حوالي 20-30 دقيقة، واتحاد كرة القدم المتبقية لم تعد مرئية في اللوحة، كرر الخطوة 3.1. يسمح هذا مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها.
  3. وبمجرد مثبت قد تم استيعابها تماما في المستعمرة ووسائل الإعلام المحيطة كرر الخطوة 3.1، هذه المرة تطبيق مثبت على سطح المستعمرة مباشرة. يسمح هذا مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها، والشروع في الخطوة 4 فقط بعد كل شيء مثبت وقد تم استيعابها ولم تعد مرئية في اللوحة.

4-تتراكب المستعمرات مع أجار

  1. في يوم التثبيت، إعداد 10 غرام/لتر أجار الحل في المياه والاوتوكلاف لمدة 10-20 دقيقة لحل. بارد في حمام مائي ل 50 ˚C.
  2. بلطف من أجل 15 مل الحل أجار فوق المتوسطة النمو ومستعمرة. تسمح أجار تشكل جل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (الشكل 1B).
  3. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع تشاك مربعة، 3-طبقة مع مستعمرة مغلفة بين طبقتين أعلى. إذا كان إعداد عينات متعددة، تأكد من أن كل تشاك هو قطع بحجم مماثل.
  4. إزالة بلطف أجار الزائدة من تشاك المحتوية على مستعمرة.
  5. رفع الطبقات العليا اثنين من أجار (تحتوي على المستعمرة) بعيداً عن الطبقة السفلي من تشاك (الشكل 1)، ويت رئيس مسطح ملعقة في 1 x برنامج تلفزيوني أو المياه وإدراج بلطف بين الطبقات العليا والسفلي. وينبغي فصل مستعمرة مغلفة من الطبقة السفلي. احرص على عدم تشويه أو ثني مستعمرة مغلفة عند رفعه من قاعدته.

5-التثبيت

  1. العامل في غطاء دخان جيد التهوية، نقل على الفور مستعمرة مغلفة (أي تشاك 2-طبقة) في كاسيت تضمين (انظر الجدول للمواد)، المسمى بقلم تمييز مقاومة للمواد كيميائية. ضع الكاسيت التضمين في الإرسال شرائح زجاجية (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على مثبت أعد الخطوات 2.1-2.2. تأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء محاصرين داخل الكاسيت التضمين.
  2. احتضان العينة في مثبت بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

6-نموذج المعالجة: المخزن المؤقت يغسل الجفاف، والمقاصة، وتسلل

  1. بعد التثبيت بين عشية وضحاها، تغسل العينة مرتين في برنامج تلفزيوني 1 x لكل 1 ح. للحصول على أفضل النتائج، أتمتة كاشف التجانس وتدور باستخدام دالة معالج الأنسجة التلقائي (انظر الجدول للمواد) تعيين إلى إعداد منخفض. إذا كان المعالج لا متوفراً، يمكن تشغيل المعالجة يدوياً.
  2. اتبع الغسيل المخزن المؤقت بالجفاف من خلال سلسلة متدرجة من تخفيف الإيثانول (EtOH) في برنامج تلفزيوني 1 x (25%، 50%، 70%، 95%) 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. يذوي في يغسل ثلاث من 100% EtOH عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. مسح العينة المجففة في يغسل ثلاث من عامل البرتقالي المقاصة القائم على النفط 100% (انظر الجدول للمواد) على 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ساخنة ارتشاح العينة تم مسحها مرتين مع البرافين المنصهر الشمع (انظر الجدول للمواد)، إلى 55˚C، لكل 2 ح.

7-عينة التضمين

  1. ملء قالب شمع شمع البارافين المنصهر يسخن إلى 55 ˚C. استخدام ملعقة ساخنة، شقة بسرعة نقل تشاك تسلل من الكاسيت التضمين في القالب الشمع، ضمان أن تشاك تقع موازية لقاعدة للعفن. تجنب الضغط المفرط على تشاك. قوالب الشمع قد يكون ثلاثي الأبعاد مخصص المطبوعة، أو هي متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
  2. السماح بالشمع على ترسيخ بين عشية وضحاها في 4 ˚C. قد يتم تخزين العينات مصبوب في الشمع الصلبة إلى أجل غير مسمى في 4 ˚C.
  3. مرة واحدة وقد وطدت الشمع، المكوس العينة من العفن وتقليم الشمع الزائد من حول العينة مع شفرة حلاقة. اترك الشمع الزائد تمتد من نهاية واحد من العينة، موازية للطائرة من تمزيقها، التي يمكن استخدامها المشبك إلى مبضع (انظر الجدول للمواد). كما ترك غمد سميكة الشمع، 1 ملم تقريبا، حول العينة وأوجهه على نحو سلس.

8-تقطيع

  1. الحرارة حمام مائي ل 42 ˚C. المشبك العينة إلى مبضع مع سطح المستعمرة الموجهة عمودياً إلى حافة النصل (انظر الجدول للمواد).
  2. تقليم العينة في فترات 50 ميكرون حتى تم التوصل إلى الطائرة المطلوب للمستعمرة، التي سيتم تجميع المقاطع.
  3. قص شريط للعدد المطلوب من 10 ميكرون سميكة الأقسام باستخدام مبضع تعيين سرعة تقطيع 75-80 لفة في الدقيقة وزاوية التخليص من 6-10˚. استخدام الرسام غرامة يميل إلى فصل الشريط من الشفرة.
  4. برفق باستخدام قطره من الماء على طرف ماصة باستور (يفضل) أو الملقط، نقل الشريط إلى حمام الماء. كن حذراً لتجنب فقاعات الهواء الملائمة تحت القسم.
  5. فورا إدراج شريحة في حوض ماء ووضعه أسفل الشريط بزاوية 45˚.
  6. اللمس على حافة ضيقة على الشريط إلى الشريحة، أسفل التسمية متجمد. ينبغي أن يتقيد الشريط.
  7. اسحب الشريحة خارج حوض ماء، ضبط الزاوية ليصبح عمودياً على سطح الماء، والسماح للشريط إلى وضع مسطح ضد الشريحة على طوله. تجنب محاصرة المياه الزائدة أسفل الشريط.
  8. بلطف تقف الشريحة على أنسجة خالية من الوبر ماصة، فتل المياه الزائدة من القسم.
  9. تخطيط الشريحة على منشفة ورقية، والسماح لها جاف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في الظلام. ويمكن تخزين الشرائح إلى أجل غير مسمى في ˚C 4 في الظلام.

9--تحديد حرارة الإماهة وتصاعد

  1. الحرارة صفيحة الساخنة تعادل 45 ˚C. الحرارة الشريحة لمدة 30-60 دقيقة. سوف تصبح شبه المنصهر الشمع وتتسطح ضد الشريحة.
  2. رفع الشريحة من صفيحة برفق ووضع شقة على سطح ناعمة، تعادل، في درجة حرارة الغرفة، باستخدام الرعاية لضمان أن لا سحب الشمع المنصهر على جانبي الشريحة، حتى يتصلب الشمع (~ 1 دقيقة).
  3. استخدام الإرسال شرائح زجاجية، إزالة الشمع الشرائح في يغسل أربعة من مسح عامل لمدة 5 دقائق في كل منها باستخدام الشافطة [بشنر] إزالة الحل بين يغسل.
  4. يغسل الشرائح ثلاث مرات في 100% EtOH لمدة 1 دقيقة.
  5. ترطيب الشرائح في سلسلة متدرجة من الإيثانول في ترتيب عكسي لتجهيز (95% و 70%، 50% و 25%) لمدة 1 دقيقة ويعقب اثنين 1-مين يغسل في برنامج تلفزيوني 1 x.
  6. مباشرة تحميل المقاطع في وسط تصاعد مخزنة تريس (انظر الجدول للمواد)، وتنطبق ساترة، تجنب الأخذ بفقاعات الهواء. تسمح المتوسطة المتصاعدة بلمرة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  7. وبمجرد بلمرة، ختم ساترة للشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. قد يتم تخزين الشرائح مختومة إلى أجل غير مسمى في الظلام في 4 ˚C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ينشئ هذا الأسلوب بيوفيلم رقيقة-الأقسام حيث يمكن تصويرها السمات المورفولوجية المميزة والمناطق للتعبير الجيني DIC والفحص المجهري fluorescence تيم. بينما DIC التصوير باستخدام 40 × الهدف الغمر النفط يمكن أن تكون كافية لإظهار بعض الخصائص المورفولوجية (الشكل 2E)، وقد وجدنا أن الأسفار يوفر الفحص المجهري سلالات هندسيا للبروتين الفلورسنت مؤثرا صريح المحسن التصور لتوزيع الخلايا ضمن العينة (الشكل 2D). صور مقاطع الفردية يمكن مخيط معا لإنشاء شريحة من مستعمرة كاملة (الشكل 2B) وتوفير سياق لإضفاء الطابع المحلي على السمات الهيكلية داخل مورفولوجيا عموما على مستوى العيانية (قارن الشكل 2A، وباء، وجيم). الخصائص المورفولوجية ونيون إشارات يمكن قياسها باستخدام برمجيات التصوير14. يمكن الربط بين هياكل داخل بيوفيلم أو الانتقال بين المناطق للتعبير الجيني ثم مع توزيعات من نواتج الأيض أو تدرجات الكيميائية11 .

ويمكن تعديل هذا البروتوكول وتكييفها بطرق عدة. استخدام سلالة هندسيا للبروتين صريح الفلورسنت تحت سيطرة أحد المروجين محددة تمكن التصور للتوزيع للتعبير الجيني (الشكل 3A). يمكن زراعتها مستعمرات في المتوسط تحتوي على صبغات، أو يمكن إضافة الأصباغ بعد تمزيقها، وصمة عار السكريات محددة (الشكلان 3 باء وجيم). أخيرا، يمكن فحص عينات أعد في نسخة معدلة من هذا البروتوكول تيم (الشكل 3D) للسماح للتصور في دقة أعلى من التي يتيحها DIC أو مجهرية الأسفار.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي تصور الإعداد للنمو مستعمرة قبل التثبيت.
(أ) المستعمرات تزرع على رأس اثنين من طبقات متوسطة النمو وطدت أجار (أعلى وأسفل) وثم (ب) يتم مضافين مع طبقة إضافية (تراكب)، الذي يحافظ على مورفولوجيا مستعمرة. (ج ثم يتم فصل) مستعمرة تقع بين تراكب والطبقة العليا من الطبقة السفلي لمزيد من المعالجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: ميزات ميكرومورفولوجيكال والأسفار يفب في المقاطع العرضية للمستعمرات جزءا لا يتجزأ من البارافين.
بيانات تمثيلية الزائفة الزّنجاريّة PA14 Δ[فز] مستعمرة15 مؤثرا الإعراب عن يفب ونمت لمدة 3 أيام في تريبتوني 1%، 1% أجار تحتوي على أحمر الكونغو وأخذ الأزرق. (أ) أعلى عرض، الصورة الفلورية عرض نصف مستعمرة قبل التثبيت. (ب) قطاع عريض من مستعمرة كاملة بعد تضمين البارافين. وكان تصويرها منطقة محاصر مع عدسة هدف X 10 (ج). ثم تم تصويرها منطقة محاصر في (ج) مع 40 × النفط الغمر الهدف عدسة استخدام الفلورية (د) و "مدينة دبي للإنترنت" (E). تمثل أشرطة مقياس 2 مم (A) و 500 ميكرومتر (ب) و 100 ميكرومتر (ج-ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مراسل التعبير، قبل وبعد المصبوغة بيوفيلم ميزات، وتصوير تيم لعينات بيوفيلم مستعمرة جزءا لا يتجزأ من البارافين.
(أ) الأسفار مراسل ميكسجبر-التجارة والنقل في مستعمرة PA14 P. الزّنجاريّة نمت لمدة 3 أيام على تريبتوني 1 ٪، 1 ٪ أجار. (ب) الأسفار منضم الكونغو الحمراء في مستعمرة سينكسانثا P. نمت لمدة 5 أيام في متوسط تحتوي على الصبغة. (ج) الأسفار فلوريبوندا الوستارية يكتين وصمة عار ل Pel السكاريد في PA14 P. الزّنجاريّة Δ[فز] مستعمرة (نمت لمدة يومين في تريبتوني 1%، 1% أجار تحتوي على أحمر الكونغو وأخذ الأزرق)، يطبق بعد تمزيقها. (د) ال صورة مستعمرة[فز] Δ PA14 P. الزّنجاريّة (نمت لمدة 3 أيام في تريبتوني 1%، 1% أجار تحتوي على أحمر الكونغو وأخذ الأزرق)، والمجهزة لتقطيع عن طريق تضمين البارافين *. يمثل الشريط مقياس 40 ميكرومتر (أ-ب) و 20 ميكرومتر (ج) و 5 ميكرومتر (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

* هذه العينة المجهزة لتقطيع عن طريق تضمين البارافين من خلال الخطوة 4 من البروتوكول المذكور أعلاه، وإهمال الخطوات 4، 1-4-3، وثم تتم معالجتها بشكل منفصل عن تحليل ال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عينات الأنسجة التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة هو أسلوب النسيجي كلاسيكية التي يمكن تصوير هياكل المورفولوجية الدقيقة ويستخدم عادة على أنسجة حقيقية النواة، وقد طبقت بنجاح بعض العينات الجرثومية8 ،9. بينما كريومبيدينج يسمح للقوى الاحتفاظ بإشارة الذاتية وإيمونوفلوريسسينت، تضمين البارافين يفضل عموما حيث أنه يوفر أفضل الحفاظ على مورفولوجيا16. في التكيف مع هذا الأسلوب للتطبيق للأغشية الحيوية الميكروبية، ركزنا على الخصائص التي تنفرد بها نظامنا. مصفوفة من الأنسجة والخلايا وغالباً ما تعقد معا نسبيا قوة، بينما الأغشية الحيوية تميل إلى أن تكون أكثر حساسية؛ ولذلك نحن الأمثل التثبيت روتينية والشمع تضمين البروتوكولات تحقيق أقصى قدر من الاحتفاظ بعينه. الحفاظ على العينة على الركيزة النمو ووتتراكب المستعمرة مع أجار فورا قبل التثبيت يضمن أن العينة لا تضيع من الأعلى أو القاعدة. ومع ذلك، يمكن أن تتلف وتتراكب المستعمرات مع أجار حار جداً المستعمرات، حيث ينبغي اتخاذ المزيد من الحيطة خلال هذه الخطوة.

التثبيت خطوة حاسمة للحفاظ على الهيكل من خلال جفاف قاسية، تبادل المعلومات، وتسلل الخطوات اللازمة لتضمين البارافين. ووجدنا أن التثبيت يسين-فورمالدهايد أفضل يحافظ على سلامة العينة. يمكن أن تتفاعل مع الألدهيدات لتشكيل البوليمرات cross-linked القابلة للذوبان يسين، ديامينى، وتم اقتراح لتعزيز مضمون اكسوبوليميريك (EPS) ضد تدهور الميكانيكية17،18.

وقد لاحظنا أن الخلفية الفلورية يتناقص مع يغسل المتعاقبة في عامل البرتقالي المقاصة القائم على النفط، أو من خلال التعرض لفترة طويلة، خلال عينة الإماهة (الخطوة 9، 3). ، ومع ذلك، يؤدي الإفراط في معالجة مع وكيل التخليص هش العينات التي يصعب على الباب19. قد يكون من الضروري لضبط حجم أو عدد من يغسل تعكس مقدار الشمع حاضرا أثناء كل الإماهة. وبالمثل يمكن أن تنشأ خلفية تزايد الأسفار من التلوث للنسيج تصنيع الكواشف، حيث الشمع، الذي قليلاً أوتوفلوريسسينت، الامتزاج أما كلياً أو جزئيا في إزالة المذيبات أو الإيثانول المستخدمة في هذه الخطوات (خطوات 6.1-6.4). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن الإيثانول يقلل إشارة مراسل، ومن الأهمية بمكان إعادة تشكل fluorophore في يغسل اثنين من برنامج تلفزيوني قبل تصاعد (الخطوة 9.5-9.6).

كما يسمح هذا الأسلوب لإضفاء الطابع المحلي على الأسفار التأسيسي ويحركها المروج في قرار الخلايا. ومع ذلك، فإننا ننصح الحذر عند استخدام هذا الأسلوب إلى تفسير التعبير الجيني. ويعرض خطوة تراكب عرض في هذا البروتوكول (الخطوة 4-2)، يطبق قبل التثبيت في ˚C 50، تغيير بيئية كبيرة بالنسبة لظروف النمو الأولية التي قد تؤثر على أنماط التعبير الجيني. قد يكون من المفيد للتحقق من أنماط التعبير عن طريق تطبيق مثبت للمستعمرة مباشرة، مباشرة قبل صب التراكب، ولكن بتكلفة إلى مورفولوجيا (خطوة اختيارية 3.1-3.3).

هو عامل آخر يؤثر في تفسير الأسفار طبوغرافية الجزء نفسه. مناطق مختلفة من بيوفيلم قد يحمل درجات متفاوتة من السلامة الهيكلية وتكون أكثر أو أقل قابلية للحفاظ عليها عن طريق تثبيت، اعتماداً على أساسها، إذا وجدت، المجموعات الوظيفية، تلك المكونات قادرة على الإسهام في مثبت العابرة للربط 20. نتيجة لذلك المقاطع قد تفقد الكتلة الحيوية غير متناسب من سطح المقطع عند الانتقال من منطقة المورفولوجية أو الأيض واحدة إلى أخرى على طول محور ع المستعمرة. قد تكون معالجة هذه المسألة بالتصوير شريحة الاتصال سليمة للقسم مع مجهر [كنفوكل].

بالإضافة إلى تطبيق هذا الأسلوب لسلالات هندسيا للبروتينات الفلورية صريحة، وقد درسنا ميزات ميكرومورفولوجيكال مجهر إلكتروني (TEM)، وفي عينات بيوفيلم ملطخة بالأصباغ الفلورية محددة (الشكل 3 ألف ). ووصف جينينغز et al. مؤخرا محددة صبغ ل Pel، السكاريد الرئيسية التي تنتجها P. الزّنجاريّة PA14 الأغشية الحيوية 21. كما ورد في البروتوكول وممثل النتائج أعلاه، يسمح تطبيق هذه الصبغة على أقسام للتصور Pel التوزيع في الأغشية الحيوية مستعمرة PA14 في دقة عالية (الشكل 3) 3. على العكس من ذلك، يمكن إضافة إلى متوسط نمو الأصباغ الفلورية مثل أحمر الكونغو وتصويرها بعد تقطيع (الشكل 3B). كما يحتفظ تطبيق تراكب مستعمرة بيوفيلم هيكل خلية ومورفولوجيا طوال التجهيز لل (الشكل 3D).

الأسلوب الأمثل هو موضح هنا تمكن إعداد مستعمرة الأغشية الحيوية لتقطيع عن طريق تضمين البارافين، حيث قد تكون إشارة الذاتية والملامح أو الأصباغ الرصاصية المترجمة في فيفو مع القرار متفوقة مع التقليل من عينة الخسارة والحفاظ على مستعمرة أصلية الماكرو-والصغرى-مورفولوجيس. أننا نعترف بأن استخدام الجهد والوقت وكاشف جوهرية مطلوبة لهذا الأسلوب. بيد أننا نرى أن يتم التصدي لهذه العيوب بدرجة الحفاظ على الخصائص المورفولوجية والقرار من الأسفار في الموقع وقابليته لإجراءات ما قبل وما بعد المصبوغة أو استراتيجيات المعالجة البديلة (مثل التحضير تيم) التي تتيحها هذه التقنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

أيد هذا العمل NSF الوظيفي جائزة 1553023 وجائزة المعاهد الوطنية للصحة/نييد R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51, (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4, (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195, (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81, (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321, (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68, (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33, (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290, (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (36), 11353-11358 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics