Встраивание парафин и тонкий секционирование колонии микробной биоплёнки для микроскопического анализа

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем фиксации, внедрение парафин и тонкого резания методы для колонии микробной биопленки. В подготовленных образцах биопленки каркаса и репортер выражение шаблоны могут быть визуализированы при микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Секционирование через встраивание парафин методика широко установленным в eukaryotic систем. Здесь мы предоставляем метод для фиксации, внедрение и секционирование нетронутыми микробной колонии биоплёнки с помощью перфузии парафина. Адаптировать этот метод для использования на колонии биопленки, мы разработали методы для поддержания каждого образца на подложке ее роста и ламинирование с агар слоя и Добавлено Лизин в фиксирующие решение. Эти оптимизации улучшить образца удержание и сохранение функции микроморфологических. Подготовленный таким образом образцы поддаются тонких секционирование и изображений на свет, флуоресценции и передачи электронной микроскопии. Мы применили эту технику в колонии биоплёнки Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisи Vibrio cholerae. Высокий уровень детализации, видимой в образцах, созданный этим методом, в сочетании с репортером штамм инженерных или использование определенных красителей, может предоставить интересные идеи в физиологии и развитие микробных сообществ.

Introduction

Большинство микробы способны формы биопленки, общины клеток скрепленных собственного производства матриц. Биопленки можно выращивать во многих типах физических установок, с различных режимов предоставления питательных веществ и субстрата. Конкретных анализов для биопленки, как правило, дают воспроизводимости многоклеточные структуры, и общей архитектуры наблюдаются филогенетически разнообразных видов на макроскопическом уровне или сообщества. Когда микробы выращиваются как колоний на твердом носителе под атмосферу, макроскопической морфология передает сведения о емкости для производства матрицы и часто коррелирует с2,другие черты в 1,3. Внутренняя архитектура микробной колоний может также предоставить подсказки относительно конкретных биопленки химия и физиология, но было трудно охарактеризовать. Последние приложений загрузки криостата и cryosectioning методов бактериальных колоний позволили изображений и визуализации определенных функций на беспрецедентной резолюции 4,5,6. Однако исследования с тканей животных показали, что парафин встраивание обеспечивает улучшенный сохранение морфологии, когда по сравнению с загрузки криостата 7 и был использован для визуализации бактерий в тканях 8,9. Поэтому мы разработали протокол для фиксации, внедрение парафин и тонкие секционирование колонии микробной биопленки. Здесь мы будем описывать подготовки Pseudomonas aeruginosa PA14 колонии биопленки шлифов 10,11, но мы также успешно применен этот метод к биопленки, образованный бактерии Pseudomonas synxantha, Сенная палочка, и холерный вибрион12.

Процесс биоплёнки парафин встраивание и тонко секционирования следует простая логика. Во-первых биоплёнки помещены в слое агар для сохранения морфология во время обработки. Во-вторых заключенная биоплёнки погружали в фиксатор чтобы crosslink макромолекул и сохранить микроморфологии. Эти затем обезвоживается с алкоголем, очищаются с более неполярных растворителей и затем проникли с жидкого парафина. После того, как проникли, образцы встроены блоки воск для разрезания. Секции являются вырезать, монтируется на слайдах и затем Регидратированные для того, чтобы вернуть их в более родного государства. С этого момента они могут окрашенных или покрыты в среде установки для микроскопического анализа.

Этот протокол производит шлифов микробной биоплёнки подходит для гистологического анализа. Колонии биопленки подструктурами видны, когда шлифов, подготовлен с использованием этого метода отражаются на световой микроскопии. Биопленки можно также выращивать на СМИ содержащие флуоресцентные пятна специфических для индивидуальных особенностей или витражи на шаге регидратации, непосредственно до монтажа (шаги 9.5-9,6). Наконец микробы могут быть спроектированы для получения флуоресцентных белков в учредительных или регулируется моды, позволяя в situ отчетности распределения или гена выражения ячейки в этих общинах. Мы использовали эти методы для определения глубины биопленки колонии, распределение ячеек, матрица распределения, шаблонов роста и экспрессии генов пространственно-временных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. рост Pseudomonas aeruginosa биоплёнки колонии

  1. Подготовка среднего бислой пластин
    1. Подготовить Триптон 10 г/Л, 10 г/Л агар решение (см. Таблицу материалов) в деионизированной воде.
    2. Автоклав для 20 минут остыть до 50-60 ° C на водяной бане.
    3. Налейте 45 мл раствора агар Триптон квадратных блюдо 100 мм x 100 мм (см. Таблицу материалы) с использованием 50 мл Конические трубки. Разрешить агар затвердеть (~ 20-30 мин). Залейте второй, 15 мл слой поверх первого слоя. Пусть затвердеть на ночь, при необходимости удаления конденсата из крышки, вытирая безворсовой салфеткой.
  2. Кровянистые выделения биоплёнки колонии
    1. Полоска штаммов интерес из морозильника запасов на LB агар пластины13 и инкубировать в темноте для 12-16 ч при 37 ° C и 80-100% относительной влажности.
    2. Для каждого штамма или репликации используйте единую колонию для прививок 2 мл фунтов и инкубировать в темноте для 12-16 ч при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
    3. Югу культуры путем разбавления 1: 100 в свежие LB и инкубации в темноте для 2,5-3 ч при 37 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
    4. Измерение оптической плотности, используя спектрофотометр и отрегулировать с стерильных фунтов для достижения суспензию клеток с ОД500 Нм ~ 0,5.
    5. В зависимости от желаемого колонии размер, накапайте 2,5-10 мкл суспензии клеток на средне бислой пластину (подготовленный на этапе 1.1) и позволяют пятно сухой ~ 20 мин, оставив крышку Петри приоткрытой вблизи открытого пламени может способствовать сушки.
    6. Инкубируйте месте колонии при 25 ° C и 80-100% относительной влажности, в темноте до 4 дней.

2. Подготовка фиксирующие решения

  1. Подготовьте фиксирующие решение в день уборки образца. Разбавить 37% формальдегида (ФА) в однократном ПБС в конечной концентрации 4% FA.
    Предупреждение: FA летучих и токсичных. Носить защитное снаряжение и работать в хорошо проветриваемом зонта.
  2. Непосредственно перед применением, распустить L-лизина гидрохлорид в 4% FA (подготовленных на шаге 2.1) при комнатной температуре до конечной концентрации 50 мм L-лизин HCl.

3. прямое применение фиксатором в колонии биопленки [опционально]

Примечание: Мы обнаружили, что морфология биопленки лучше всего сохранилась когда агар наложения добавляется до фиксации. Однако этот шаг также является изменение экологических условий, которые могут влиять на экспрессию генов. Флуоресцентный репортер выражение шаблоны таким образом должны быть проверены с помощью отдельного протокола, в котором осуществляется фиксация шаг перед добавлением агар оверлея, как описано здесь.

  1. В день фиксации, и работать в хорошо проветриваемом Зонта Пипетка фиксатором, подготовленные на шаге 2 непосредственно на поверхности агара вокруг колонии края, что позволяет ему достичь периферии колонии без погружаемой его. Примените только как много фиксатор, как это необходимо для полного объемного колонии, примерно 500 мкл. фиксатор диффундируют в колонии и окружающие агар.
  2. После того, как фиксатор был полностью всасывается в колонии и окружающие СМИ, около 20-30 мин, и остаточные FA больше не виден на табличке, повторите шаг 3.1. Разрешить этот фиксатор диффундируют в колонии и окружающие агар.
  3. После того, как фиксатор был полностью всасывается в колонии и окружающие СМИ повторите шаг 3.1, на этот раз, применяя фиксатором на поверхности колонии непосредственно. Разрешить этот фиксатор диффундируют в колонии и окружающие агар, перейти к шагу 4 только после всех фиксирующие был всасывается и больше не виден на плите.

4. Наложение колоний с агар

  1. В день фиксации Подготовьте 10 г/Л агар решение в дейонизированной воде и автоклав для 10-20 минут, чтобы распустить. Прохладно в водяной бане до 50 градусов.
  2. Осторожно залейте 15 мл раствора агар среднего роста и колонии. Разрешить агар сформировать гель при комнатной температуре в течение 5 мин (рис. 1B).
  3. Используйте острые лезвия бритвы вырезать квадратный, 3-слойный патрон с колонией, ламинированные между два верхних слоя. Если подготовка нескольких образцов, убедитесь, что каждый патрон разрубается сопоставимого размера.
  4. Осторожно удалите избыток агар из колонии содержащих патрона.
  5. Чтобы поднять два верхних слоев агар (содержащие колонии) от нижнего слоя патрона (рис. 1 c), влажные плоский шпатель в 1 x PBS или воды и осторожно вставьте между верхней и нижней слоями. Ламинированные колонии следует отделить от нижнего слоя. Будьте осторожны, чтобы не исказить или согнуть ламинированные колонии, доставая его из своей базы.

5. Фиксация

  1. Работа в хорошо проветриваемых Зонта, немедленно перевести ламинированные колонии (т.е., 2-слойные Чак) в внедрения кассеты (см. Таблицу материалы), помечены с химической устойчивостью маркером. Поместите внедрения кассету в почтовой программе слайд стекла (см. таблицу материалов) с фиксатором, подготовленный в шагах 2.1-2.2. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха в ловушке внутри кассеты с внедрения.
  2. Проинкубируйте образцы в фиксатор на ночь в темноте при комнатной температуре.

6. образец обработки: Буфер мыть, осушки, очистки и инфильтрации

  1. После ночи фиксации Вымойте образец дважды в однократном ПБС за 1 ч. Для достижения наилучших результатов, автоматизировать гомогенизации реагентом, с помощью спин функция автоматического ткани процессора (см. таблицу материалов) присвоено значение низкий. Если не процессор доступен, обработка может выполняться вручную.
  2. Следуйте буфера мытья по обезвоживанию через серию градуированных этанола (EtOH) разведений в однократном ПБС (25%, 50%, 70%, 95%) за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Обезвоживает в три автомойки 100% EtOH за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Очистить обезвоженный образец в три автомойки 100% апельсин на масляной основе таможенного агента (см. таблицу материалов) за 1 ч при комнатной температуре.
  5. Инфильтрат, очищается образец дважды с расплавленный парафин воск (см. Таблицу материалы), нагревают до 55˚C, 2 ч.

7. пример внедрения

  1. Залейте расплавленный парафин нагревается до 55 градусов восковой формы. Лопаточкой подогревом, плоские для быстрой передачи проникли патрона от внедрения кассету в восковой формы, обеспечивая, что Чак лежит параллельно основание прессформы. Избегайте чрезмерного давления на патрон. Воск формы могут быть пользовательские 3-D печати или коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).
  2. Разрешить воска, чтобы затвердеть на ночь при 4 ° c. Образцы, формованных в твердый воск может храниться бессрочно в 4 градусов.
  3. После того, как воск затвердевшим, акцизный образца от плесени и обрезать излишки воска от вокруг образца с лезвием бритвы. Оставьте излишки воска, простирающейся от одного конца образца, которая параллельна плоскости секционирование, которая может использоваться для зажима в микротома (см. Таблицу материалы). Также оставьте оболочкой воск, примерно 1 мм толщиной, вокруг образца и гладкой его лица.

8. секционирование

  1. Нагревают на водяной бане до 42 градусов. Зажимайте образец в микротом с поверхностью колонии, ориентированные перпендикулярно к краю лезвия (см. Таблицу материалы).
  2. Трим образца в интервалах 50 мкм, пока не будет достигнуто желаемого плоскости колонии, из которого будут собраны разделы.
  3. Перерезали ленточку нужное количество 10 мкм толщиной секций, используя микротом набор для резания скорость 75-80 об/мин и разминированию угол 6-10 ˚. Используйте кисть, острым концом для отсоединения ленты от лезвия.
  4. Аккуратно с помощью капли воды на кончике пипетка Пастера (предпочтительно) или щипцы, передачи ленты на водяной бане. Будьте осторожны избежать захвата воздушных пузырьков в разделе.
  5. Сразу вставить слайд в ванну воды и поместите его под лентой под углом 45о.
  6. Коснуться края узкие ленты на слайд, чуть ниже матовое метки. Ленты должны присоединиться.
  7. Затвор из водяной бани, регулируя угол для того чтобы стать перпендикулярно к поверхности воды и позволяя ленты лежать против слайд вдоль его длины. Избегайте ловушки избыток воды под лентой.
  8. Аккуратно стоите слайд на абсорбирующий безворсовой ткани, влагу лишнюю воду из секции.
  9. Положите слайд на бумажное полотенце и дайте ему высохнуть при комнатной температуре на ночь в темноте. Слайды можно хранить бессрочно в 4 градусов в темноте.

9. тепло фиксации, регидратации и монтаж

  1. Тепло выровняли плита до 45 градусов. Тепла слайд за 30-60 мин. Воск станет полу расплавленного и сгладить против слайд.
  2. Аккуратно снять слайд из поджарки и заложить плашмя на поверхность гладкой, выровненные, комнатной температуры, с использованием меры к тому, что расплавленный воск не тянуть к любой стороне слайда, до тех пор, пока воск затвердеет (~ 1 мин).
  3. С помощью рассылки слайд стекла, де воск слайды в четырех моет очистки агента для 5 минут каждый, с использованием Бюхнера Аспиратор для удаления решение между моет.
  4. Вымойте слайды три раза в 100% EtOH за 1 мин.
  5. Увлажняет слайды в градуированных серии этанола в обратном порядке обработки (95%, 70%, 50% и 25%), за 1 мин, которую каждый следуют два 1-мин моет в однократном ПБС.
  6. Сразу же монтировать разделы в среде трис буфер монтажа (см. Таблицу материалы) и применить coverslip, избегая внедрения воздушных пузырьков. Позволяют монтаж среднего для полимеризации на ночь при комнатной температуре.
  7. После полимеризуется, печать coverslip на слайд, используя четкие ногтей. Запечатанный слайды могут храниться бессрочно в темноте на 4 градусов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот метод создает биопленки, тонко секции которой морфологических особенностей и зон экспрессии генов может быть imaged DIC, флуоресцентной микроскопии и ТЕА. В то время как DIC изображений с помощью 40 X цель погружения нефти может быть достаточно, чтобы показать некоторые морфологические особенности (Рисунок 2E), мы нашли что флуоресценции микроскопии штаммов инженерии конститутивно Экспресс флуоресцентный белок обеспечивает расширение визуализация распределения клеток в образце (Рисунок 2D). Изображения отдельных разделов можно сшиты вместе для создания поперечных всей колонии (Рисунок 2B) и предоставить контекст для локализации структурных особенностей в рамках общей морфологии на макроскопическом уровне (Сравните Рисунок 2A, B и C). Морфологические особенности и флуоресцентные сигналы могут быть измерены с помощью визуализации программного обеспечения14. Структуры в пределах биопленки или переходы между зонами экспрессии генов затем может быть соотнесена с дистрибутивами метаболитов или химические градиенты11 .

Этот протокол можно изменить и приспособлены несколькими способами. Использование штамма спроектирован, чтобы выразить флуоресцентный белок под контролем конкретной промоутера позволяет визуализация распределения экспрессии генов (рис. 3A). Колонии могут быть выращены на носителе, содержащих красители, или красители могут быть добавлены после разрезания, пятно конкретных полисахаридов (рис. 3B и C). Наконец образцы, подготовленный в модифицированной версии настоящего Протокола может быть проверен ТЕА (рис. 3D) для визуализации с высоким разрешением, чем обеспечивается ДВС или микроскопии флуоресцирования.

Figure 1
Рисунок 1: Схема с изображением установки для роста колонии до фиксации.
(A) колонии выращивается поверх двух слоев агар затвердевает роста среднего (сверху и снизу) и (B) затем обложил с дополнительный слой (оверлей), который сохраняет колонии морфологии. (C колонии, зажатая между оверлея и верхний слой затем отделены от нижнего слоя для дальнейшей обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Микроморфологических особенности и рекламы ЯФП флуоресценции в сечениях парафин врезанных колоний.
Репрезентативных данных для Pseudomonas aeruginosa PA14 ΔПГЗ колонии15 конститутивно выражая рекламы ЯФП и вырос за 3 дня на 1% Триптон, 1% агар, содержащие красный Конго и Кумасси синий. (A) топ вид, флуоресценции изображением половину колонии до фиксации. (B) поперечное сечение всей колонии после встраивания парафина. В штучной упаковке области был воспроизведен образ с 10 X объектив (C). Области в штучной упаковке (C) был затем образы с 40 X Нефть погружения объектива с помощью флуоресценции (D) и ОПК (E). Масштаб бары представляют 2 мм (A), 500 мкм (B) и 100 мкм (C-E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Репортер выражение, до и после окрашивания биопленки функций, и изображений ТЕА парафин врезанных колонии биопленки образцов.
() mexGPr-GFP репортер флуоресценции в колонии PA14 P. aeruginosa , вырос за 3 дня на 1% Триптон, агар 1%. (B) флуоресценции связанных Конго красного в колонии P. synxantha , выросли на 5 дней, на носитель, содержащий краситель. (C) флуоресценции Вистерия флорибунда Лектин пятно для Pel полисахарида PA14 P. aeruginosa ΔПГЗ колонии (выросли на 2 дня на триптон 1%, 1% агар содержащие Конго красный и Кумасси синий), применяется после разрезания. (D) ТЕА изображение P. aeruginosa PA14 ΔПГЗ колонии (выросли на 3 дня на 1% Триптон, 1% агар, содержащие красный Конго и Кумасси синий) и обрабатываются для разрезания через встраивание парафин *. Линейки шкалы представляет собой 40 мкм (A-B), 20 мкм (C) и 5 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

* Этот образец был обработан для разрезания через встраивание парафин через шаг 4 выше протокола, опуская шаги 4.1-4.3 и затем обрабатываются отдельно для анализа ТЕА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Образцы тканей парафин встраивание и тонко секционирования представляет собой классический гистологический метод, который позволяет изображения микро морфологических структур и широко используется на эукариотических ткани и с некоторым успехом был применен для микробиологических образцов8 ,9. Хотя загрузки криостата позволяет сильный удержания эндогенных и immunofluorescent сигнала, парафин встраивание обычно предпочтительнее, как он обеспечивает лучшее сохранение морфологии16. В адаптации этот метод для применения в микробной биопленки, мы сосредоточились на характеристики, которые являются уникальными для нашей системы. Клетки и матрица тканей часто проводятся вместе относительно надежно, в то время как биопленки клонат быть более тонкие; Поэтому, мы оптимизировали обычной фиксации и воска, внедрение протоколов для максимального сохранения образцов. Сохранение образца на подложке ее роста и наложение колонии с агар сразу до фиксации гарантирует, что образец не теряется от верхней или базы. Однако наложение колоний с агар, что слишком жарко может повредить колоний, поэтому дополнительную осторожность во время этого шага.

Фиксация является важным шагом для сохранения структуры через суровые обезвоживания, очистка, и инфильтрат шаги, необходимые для внедрения парафина. Мы обнаружили, что лизин формальдегид фиксации лучших сохраняет целостность образца. Растворимые лизин, диамин, может реагировать с альдегиды сформировать сшитых полимеров и было предложено укрепить exopolymeric вещество (EPS) против механического деградации17,18.

Мы заметили, что фон флуоресценции уменьшается с последовательными моет в оранжевый на масляной основе таможенного агента, или с помощью длительного воздействия, во время выборки регидратации (шаг 9.3). Чрезмерная лечения с таможенного агента может однако, привести к хрупких образцов, которые трудны для того чтобы статья19. Это может быть необходимо отрегулировать громкость или количество стирок чтобы отразить количество воска, во время каждого регидратации. Увеличение фонового флуоресцирования можно также возникают от загрязнения ткани, обработки реагентами, где воска, который слегка autofluorescent, полностью или частично смешивается в очистка растворителем или этанола, используемые в следующие шаги (шаги 6.1-6.4). Кроме того, мы обнаружили, что этанола уменьшается сигнал репортер, и это имеет решающее значение для повторного составляют Флюорофор в двух стирок PBS до монтажа (шаг 9.5-9,6).

Этот метод также позволяет для локализации учредительных и промоутер driven флуоресценции в резолюции клеток. Однако мы советуем осторожно при использовании этого метода для интерпретации экспрессии генов. Шаг оверлея, представил в настоящем Протоколе (шаг 4.2), применяется до фиксации на 50 градусов, представляет значительные изменения окружающей среды относительно условий первоначального роста, которые могут повлиять картин выражения гена. Это может быть полезно для проверки выражения модели путем применения фиксатором в колонию напрямую, непосредственно перед заливкой перекрытия, но ценой морфологии (необязательный шаг 3.1-3.3).

Еще один фактор, влияющий на интерпретации флуоресценции является рельеф сам раздел. Различные регионы биопленки могут exhibit различной степени структурной целостности и более или менее поддаются сохранения через фиксацию, зависящ на которой, если таковые имеются, функциональные группы эти компоненты способны вносить фиксирующие cross-linking 20. В результате, разделы могут потерять биомассы непропорционально от поверхности раздела при переходе от одной морфологическое или метаболических зоны к другой оси z колонии. Это может быть рассмотрен изображений нетронутыми фокуса срез секции с конфокального микроскопа.

Помимо применения этой техники штаммов спроектирован, чтобы выразить флуоресцентных белков, мы изучили особенности микроморфологических просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и в образцах биопленки, окрашенных с конкретными флуоресцентных красителей (Рисунок 3A ). Дженнингс et al. недавно описал конкретный краситель для Pel, основных полисахарид, производимые P. aeruginosa PA14 биоплёнки 21. Как описано в протокол и представитель результаты выше, применение этот краситель для секций позволяет для визуализации распределения Pel в PA14 колонии биопленки в высоком разрешении (рис. 3 c) 3. И наоборот флуоресцентных красителей, таких как красный Конго могут быть добавлены к среднего роста и отображаемого после резания (рис. 3B). Применения заплатки также сохраняет колонии биопленки морфологии и cell структуру обработки для ТЕА (Рисунок 3D).

Оптимизированный метод, описанный здесь позволяет подготовка колонии биоплёнки для разрезания через встраивание парафин, которой эндогенного сигнал и особенности или complexed красители могут быть локализованы в vivo с превосходной резолюции при сведении к минимуму образца Потеря и сохранения родной колонии макро - и микро морфологии. Мы признаем, что для этого метода требуются существенные усилия, время и реагента использования. Однако мы считаем, что эти недостатки противопоставить степени морфологических сохранения, резолюции в situ флуоресценции и ограниченой процедуры до и после окрашивания или альтернативные обработки стратегии (например, подготовка к ТЕА), обеспечиваемой этой техники.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NSF карьеры премии 1553023 и NIH/NIAID премии R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51, (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4, (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195, (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81, (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321, (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68, (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33, (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290, (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (36), 11353-11358 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics