微生物菌落生物膜的石蜡嵌入和薄切片显微分析

Immunology and Infection

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Summary

我们描述了微生物菌落生物膜的固定、石蜡嵌入和薄切片技术。在制备的样品中, 生物膜子结构和记者的表达模式可以通过显微技术进行可视化。

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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Abstract

石蜡切片是一种在真核细胞中广泛建立的技术。在这里, 我们提供了一种方法, 以固定, 嵌入和切片的完整的微生物群生物膜使用灌注石蜡。为了适应这种方法在菌落生物膜上的使用, 我们开发了技术, 以保持每个样品在其生长基质和层压它与琼脂层叠, 并添加赖氨酸的固定液。这些优化改进了果皮微形态特性的样本保留和保存。以这种方式制备的样品可以通过光、荧光和透射电镜进行薄切片和成像。我们已将此技术应用于铜绿假单胞菌、假单胞菌 synxantha、枯草芽孢杆菌和霍乱弧菌的菌落生物膜。该方法所产生的样品中可见的高度细节, 加上报告应变工程或特定染料的使用, 可为微生物群落的生理和发育提供令人振奋的见解。

Introduction

大多数微生物都有能力形成生物膜, 细胞群落由自制的基质聚集在一起。生物膜可以生长在许多类型的物理设置, 与各种制度的营养和基质供应。特定的生物膜形成方法往往产生可重复的多细胞结构, 并观察到在群落或宏观层面上 phylogenetically 不同物种的共同结构。当微生物在大气层中作为固体介质的菌落生长时, 宏观形态传达有关矩阵生产能力的信息, 并且经常与其他特性相关, 1,2,3。微生物菌落的内部结构也可以提供有关生物膜特异化学和生理学的线索, 但很难描述。最近, cryoembedding 和 cryosectioning 技术在细菌菌落中的应用已使特定功能的成像和可视化达到空前的分辨率4,5,6。然而, 与动物组织的研究表明, 石蜡嵌入提供了卓越的保存形态, 当与 cryoembedding 7相比, 并已用于可视化的细菌在组织8,9。因此, 我们制定了一个固定, 石蜡嵌入和薄切片微生物菌落生物膜的协议。在这里, 我们将描述铜绿假单胞菌 PA14 菌落-生物膜薄部分10,11的制备, 但我们也成功地将此技术应用于细菌形成的生物膜铜绿假单胞菌 synxantha, 枯草芽孢杆菌,霍乱弧菌12

石蜡嵌入和薄切片生物膜的过程遵循一个简单的逻辑。首先, 生物膜被包裹在一层琼脂中, 以保持加工过程中的形态学。第二, 包裹生物膜被浸没在一个固定剂中, 以交联大分子并保存形貌。然后用酒精脱水, 用更非极性溶剂清除, 然后用液体石蜡渗透。一旦渗入, 样品被嵌入到蜡块中切片。节被剪切, 装在幻灯片上, 然后水化以返回到更纯的状态。从这一点上, 它们可以被染色或覆盖在安装介质中进行微观分析。

本协议生产适合于组织学分析的微生物生物膜薄切片。当使用这种方法制备的薄切片被光镜成像时, 菌落生物膜子结构可见。生物膜也可以在含有特定于个别特征的荧光污渍的介质上生长, 或者在安装前立即在补液步骤 (步骤 9.5-9.6) 上染色。最后, 微生物可以被设计成以一种本构或调控的方式生产荧光蛋白, 允许就地报告这些社区内的细胞分布或基因表达。利用这些方法确定了菌落的生物膜深度、细胞分布、基质分布、生长形态和时空基因表达。

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Protocol

1. 铜绿假单胞菌菌落生物膜的生长

  1. 中双层板的制备
    1. 准备一10克/升胰蛋白胨, 10 克/升琼脂 (参见材料表) 溶液在去离子水。
    2. 20分钟的蒸压釜, 在水浴中冷却至50-60 摄氏度。
    3. 将45毫升的琼脂-胰蛋白胨溶液倒入100毫米 x 100 毫米方盘 (参见材料表), 使用50毫升锥形管。允许琼脂凝固 (~ 20-30 分钟)。在第一层上倒入第二个, 15 毫升的层。让一夜之间凝固, 如果必要的话, 用不起毛的纸巾擦拭盖子。
  2. 斑点菌落生物膜
    1. 条纹的兴趣从冷藏库存到 LB 琼脂板13和孵化在黑暗中为12-16 小时37摄氏度和80-100% 相对湿度。
    2. 对于每一个菌株或复制, 使用一个单一的殖民地接种2毫升 LB 和孵化在黑暗中12-16 小时37摄氏度与颤抖在 250 rpm。
    3. 亚文化通过稀释1:100 入新鲜的磅和孵化在黑暗中为 2.5-3 h 在37°c 与震动在 250 rpm。
    4. 使用分光光度计测量光学密度, 用无菌 LB 进行调整, 以达到500 nm的细胞悬浮, 直径为0.5。
    5. 根据所需的菌落大小, 吸管 2.5-10 µL 的细胞悬浮在中双层板上 (在步骤1.1 中制备), 并允许斑点干20分钟. 离开培养盖半开靠近开放的火焰可以促进干燥。
    6. 孵化点殖民地在25°c 和80-100% 相对湿度, 在黑暗中长达4天。

2. 定影液的制备

  1. 在样品收获日准备固定液。稀释37% 甲醛 (FA) 在 1x PBS 到最后浓度为 4% FA。
    注意: FA 是挥发性和毒性。在通风良好的油烟机上佩戴防护设备和工作。
  2. 使用前立即将 l-赖氨酸盐酸盐溶于 4% FA (在步骤2.1 中制备) 室温下, 最终浓度为50毫米 l-赖氨酸盐酸。

3. 将固定剂直接应用于菌落生物膜 [可选]

注: 我们发现在固定前添加琼脂覆盖物时, 生物膜形态最好保存。然而, 这一步骤也构成了环境条件的变化, 可能会影响基因表达。因此, 荧光记者的表达模式应使用单独的协议进行验证, 其中固定步骤是在添加琼脂叠加之前进行的, 如下所述。

  1. 在固定的日子里, 在通风良好的油烟机里工作, 将步骤2中准备好的定影液直接移到蚁群边缘周围的琼脂表面, 让它到达殖民地的外围而不淹没它。只应用尽可能多的固定, 以充分包围的殖民地, 大约500µL. 允许固定剂扩散到菌落和周围的琼脂。
  2. 一旦固定剂被完全吸收到菌落和周围的介质中, 大约20-30 分钟, 剩余的 FA 就不再可见在盘子上, 重复步骤3.1。允许这个固定剂扩散到殖民地和周围的琼脂。
  3. 一旦固定剂已完全吸收到菌落和周围介质重复步骤 3.1, 这一次将固定剂直接应用于菌落的表面。允许这个固定剂扩散到殖民地和周围的琼脂, 直到步骤 4, 只有在所有的固定剂已被吸收, 并不再可见的板块。

4. 用琼脂覆盖菌落

  1. 在固定的日子, 准备一个10克/升琼脂溶液在去离子水和高压釜10-20 分钟溶解。在水浴冷却到50˚C。
  2. 在生长培养基和菌落上轻轻倒入15毫升琼脂溶液。允许琼脂在室温下形成凝胶5分钟 (图 1B)。
  3. 使用锋利的剃刀刀片切割一个正方形, 3 层的恰克与殖民地层间的前两层。如果准备多个样品, 确保每一个恰克被削减到一个可比的大小。
  4. 轻轻地从包含的卡盘中取出多余的琼脂。
  5. 要将琼脂 (包含菌落) 的两个上层层从恰克的底层 (图 1C) 中抬起, 请在 1x PBS 或水中将刮刀的扁头湿润, 并在顶层和底部之间轻轻插入。层合群应与底层分离。小心不要扭曲或弯曲的层压的殖民地时, 从它的基础上解除。

5. 固定

  1. 在通风良好的油烟机中工作时, 立即将层压的菌落 (即2层卡盘) 转移到嵌入盒中 (请参阅材料表), 并用抗化学标记笔标记。将嵌入的卡带放入玻璃滑动邮件 (见材料表) 中, 其中包含步骤 2.1-2.2 中准备的固定剂。确保嵌入盒内没有气泡。
  2. 在室温下, 在黑暗中在夜间固定固定的样品。

6. 样品处理: 缓冲洗涤、脱水、清除和渗透

  1. 夜间固定后, 每两次在 1x PBS 中清洗样品1小时。为取得最佳效果, 使用自动组织处理器的自旋功能 (见材料表) 自动将试剂均匀化, 设置为低设置。如果没有可用的处理器, 则可以手动运行处理。
  2. 通过在 1x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) 的梯度系列乙醇 (乙醇) 稀释在室温下的1小时, 通过脱水来洗涤缓冲液。
  3. 脱水在三洗涤100% 乙醇为1小时在室温下。
  4. 清除脱水样品在三洗涤100% 橙色油基清洁剂 (参见材料表) 为 1 h 每在室温。
  5. 两次渗透清除样品与熔融石蜡 (参见材料表), 加热到 55˚C, 每2小时。

7. 样品嵌入

  1. 填充蜡模与熔融石蜡加热到55˚C。使用一个加热, 平铲, 迅速将渗入的恰克从嵌入的卡带到蜡模, 确保恰克与模具底座平行。避免在卡盘上施加过多的压力。蜡模可以是定制的3维打印, 或者是商用的 (请参阅材料表)。
  2. 允许蜡在4˚C 一夜之间凝固。在固体蜡模压的样品可以无限期储存在4˚C。
  3. 一旦蜡固化, 从模具中的样品和修剪多余的蜡从样品周围的刀片。将多余的蜡从试样的一端延伸, 平行于切片的平面, 可用于将其夹紧到切片 (参见材料表)。也留下一鞘蜡, 大约1毫米厚, 在样品附近和光滑它的面孔。

8. 切片

  1. 把水浴加热到42˚C。将样品夹在切片上, 使其表面垂直定向到刀片的边缘 (参见材料表)。
  2. 将样品修剪成50µm 的间隔, 直到达到所需的菌落平面, 从中收集剖面。
  3. 使用切片设置为 75-80 rpm 的切片速度和6-10˚的间隙角, 将所需的 10-µm 厚截面的带状带剪切。使用细尖的画笔从刀片式服务器分离功能区。
  4. 使用一滴水在巴斯德吸管 (首选) 或镊子的尖端, 轻轻地把丝带转移到水浴。小心避免在剖面下捕捉气泡。
  5. 立即在水浴中插入一张幻灯片, 并在45˚的角度将其放置在丝带下面。
  6. 触摸丝带的窄边到幻灯片, 就在磨砂标签下面。丝带应该坚持。
  7. 将滑块从水浴中拉出, 调整角度, 使其与水面垂直, 并允许丝带沿其长度平放在滑轨上。避免在丝带下诱捕多余的水。
  8. 轻轻地将滑块放在一个无起毛的无绒组织上, 从切片中吸出多余的水分。
  9. 把滑梯放在纸巾上, 让它在黑暗中过夜, 在室温下晾干。幻灯片可以无限期存储在4˚C 在黑暗中。

9. 热固、补液和安装

  1. 加热一个平整的热板到45˚C。将幻灯片加热30-60 分钟。蜡将变成半熔化和平压在幻灯片上。
  2. 轻轻地从热板上提起滑块, 将其平放到平滑、平整、室温的表面, 使用小心, 以确保熔融蜡不会拉到任何一侧的幻灯片, 直到蜡固化 (~ 1 分钟)。
  3. 使用玻璃滑动邮件, 脱蜡幻灯片在四洗涤清洁剂每5分钟, 使用 Büchner 吸引器, 以消除清洗之间的解决方案。
  4. 在100% 乙醇中三次清洗幻灯片, 每张1分钟。
  5. 水化在连续的95%、70%、50% 和25% 的加工顺序中, 依次为1分钟, 然后在 1x PBS 中进行两次1分钟的洗涤。
  6. 立即装入三缓冲安装介质中的截面 (请参阅材料表) 并应用盖玻片, 避免引入气泡。允许安装介质在室温下聚合过夜。
  7. 一旦聚合, 使用明确的指甲油密封盖玻片到幻灯片。密封的幻灯片可以无限期地存储在黑暗中4˚C。

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Representative Results

该方法产生的生物膜薄切片, 其中明显的形态学特征和区域的基因表达可以成像的 DIC, 荧光显微镜, 和 TEM。虽然 DIC 成像使用一个40X 的油浸泡目标可以足以显示一些形态学特征 (图 2E), 我们发现, 荧光显微镜的菌株设计的组成性快速荧光蛋白提供了增强示例中单元格分布的可视化 (图 2D)。可以将单个剖面的图像缝合在一起, 生成整个菌落 (图 2B) 的剖面, 并为宏观层次的总体形态学中结构特征的本地化提供上下文 (比较图 2A、B 和 C)。形态学特征和荧光信号可以用成像软件14来测量。在生物膜内的结构或基因表达区之间的转换可以与代谢物或化学梯度的分布相关11

本议定书可通过多种方式加以修正和修改。在特定的启动子的控制下, 使用一种用于表达荧光蛋白的应变可以可视化基因表达式的分布 (图 3A)。菌落可以在含有染料的培养基上生长, 或者在切片后添加染料来染色特定的多糖 (图3B 和 C)。最后, 可以通过 TEM (图 3D) 检查在修改后的版本中编写的示例, 以使可视性能够比 DIC 或荧光显微镜所启用的分辨率更高。

Figure 1
图 1: 在固定前对菌落生长进行描述的示意图。
(A) 菌落生长在两层琼脂固化生长培养基 (顶部和底部) 和 (B) 上, 然后用附加层 (叠加) 覆盖, 从而保留了菌落形态。(C) 夹在覆盖层和顶部之间的菌落然后与底层分离, 以便进一步处理。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 果皮微形态的特征和 YFP 荧光在石蜡嵌入的殖民地的剖面。
铜绿假单胞菌 PA14 Δphz菌落15组成性表示 YFP 并在1% 胰蛋白胨1% 琼脂上生长3天的代表数据, 含有刚果红和考马斯蓝。(A) 在固定前显示一个菌落的上半视图、荧光图像。(B) 整个殖民地在石蜡嵌入后的剖面。盒装区域被成像了10X 物镜 (C)。然后用荧光 (D) 和 DIC (E) 对 (C) 中的盒装区域进行了40X 油浸泡物镜的成像。刻度条表示2毫米 (A)、500µm (B) 和100µm (C E)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 生物膜特征的报道、前后染色和石蜡嵌入菌落生物膜样品的 TEM 成像。
(a) mexGPr 报告荧光在铜绿假胞菌PA14 菌落中生长3天, 1% 胰蛋白胨1% 琼脂。(B) 在含有染料的培养基上生长5天的synxantha菌落中的刚果红的荧光。(C) 荧光的紫藤 floribunda凝集素染色的 Pel 多糖在铜绿假单胞菌PA14 Δphz殖民地 (生长2天在1% 胰蛋白胨, 1% 琼脂含有刚果红和考马斯蓝), 在切片后应用。(D) 透射电镜图像的绿脓杆菌PA14 Δphz殖民地 (生长3天在1% 胰蛋白胨, 1% 琼脂含有刚果红和考马斯蓝), 并处理切片通过石蜡嵌入 *。缩放条表示40µm (A B)、20µm (C) 和5µm (D)。请单击此处查看此图的较大版本.

* 本样本经上述协议的步骤4通过石蜡埋入切片处理, 省略步骤 4.1-4.3, 然后分别进行 TEM 分析。

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Discussion

石蜡嵌入和薄切片组织标本是一种经典的组织学技术, 使显微形态学结构的成像和通常用于真核组织, 并已成功地应用于微生物样本8 ,9。虽然 cryoembedding 允许强保留内源和免疫荧光信号, 石蜡嵌入通常是可取的, 因为它提供更好的保存形态学16。在将这种方法应用于微生物生物膜时, 我们关注的是我们系统特有的特性。组织的细胞和基质往往相对较强劲地被紧紧地结合在一起, 而生物膜则更微妙;因此, 我们优化常规固定和蜡嵌入协议, 以最大限度地保留样本。保持样品在其生长基质和覆盖的殖民地与琼脂立即在固定之前, 确保样品不会丢失从顶部或基地。然而, 用太热的琼脂覆盖菌落会破坏菌落, 因此在这一步骤中应格外小心。

固定是一个关键步骤, 以保持结构通过苛刻的脱水, 清除和渗透步骤所需的石蜡嵌入。我们发现, 赖氨酸甲醛的固定最好保存样品的完整性。可溶性赖氨酸, 二胺, 可与醛反应形成交联聚合物, 并已建议加强 exopolymeric 物质 (EPS) 抗机械降解17,18

我们观察到, 在橙油基清除剂中, 或通过长时间暴露, 在样品补液过程中, 背景荧光量随连续洗涤而减少 (步骤 9.3)。但是, 对清除代理的过度处理可能会导致难于19节的脆性示例。可能需要调整洗涤量或数量, 以反映每次补液期间的蜡量。增加的背景荧光可能同样产生于组织处理试剂的污染, 其中蜡, 这是轻微 autofluorescent, 是完全或部分混溶在清洁溶剂或乙醇中使用的这些步骤 (步骤6.1-6.4). 此外, 我们发现乙醇减少了记者信号, 并且在安装前 (步骤 9.5-9.6) 中重新组成 PBS 的两个洗涤荧光是至关重要的。

该方法还允许在细胞的分辨率下对本构和启动子驱动荧光进行定位。然而, 我们建议在使用此方法解释基因表达时要谨慎。本协议中引入的叠加步骤 (步骤 4.2) 在固定在50˚C 之前应用, 对可能影响基因表达模式的初始生长条件带来了相当大的环境变化。通过将固定物直接应用到蚁群中, 然后在浇注叠加之前立即对其进行验证, 但以形态学 (可选步骤 3.1-3.3) 为代价, 对表达式模式进行检验可能很有用。

影响荧光解释的另一个因素是剖面本身的形貌。生物膜的不同区域可能表现出不同程度的结构完整性, 或多或少可以通过固定来保存, 具体取决于哪些功能组这些组件能够有助于固交链接20. 因此, 当从一个形态学或代谢带向另一个沿菌落的 z 轴过渡时, 各部分的生物量可能不成比例地从剖面表面失去。这可能是通过成像一个完整的焦距切片与共聚焦显微镜来解决。

除了将这种技术应用于用于表达荧光蛋白的菌株外, 我们还通过透射电镜 (TEM) 和在特定荧光染料染色的生物膜样品中研究了果皮微形态特性 (图 3A).詹宁斯et最近描述了一种特定于 Pel 的染料, 这是由铜绿假单胞菌PA14 生物膜21产生的主要多糖。如《议定书》和上述代表的结果所述, 这种染料应用于各部分, 可以在高分辨率 (图 3C) 3的 PA14 菌落生物膜中可视化 Pel 分布。反之, 像刚果红色这样的荧光染料可以添加到生长培养基中, 并成像后切片 (图 3B)。在透射电镜处理过程中, 覆盖物的应用也保留了菌落生物膜形态学和细胞结构 (图 3D)。

本文所描述的优化方法可以通过石蜡嵌入制备菌落切片, 其中内源信号和特征或复合染料可在体内进行局部化, 并具有优越分辨率, 同时最小化样品。损失和保存本机菌落宏观和微观形貌。我们承认, 这种方法需要大量的努力, 时间和试剂使用。然而, 我们觉得这些缺点是由形态学保存的程度,原位荧光的分辨率, 和顺从前和后染色程序或替代处理策略 (如准备TEM) 提供的这项技术。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

这项工作得到了 NSF 职业奖1553023和 NIH/NIAID 奖 R01AI103369 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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