Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique

Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons la fixation, enrobage de paraffine et des techniques de sectionnement minces pour les biofilms de colonies microbiennes. Dans les échantillons préparés, patrons de biofilm sous-structure et reporter d’expression peuvent être visualisées par microscopie.

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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Abstract

Sectionnement par enrobage de paraffine est une technique largement établie aux systèmes eucaryotes. Ici, nous fournissons une méthode pour la fixation, enrobage et sectionnant des biofilms de colonies microbiennes intact à l’aide de cire de paraffine perfusée. Pour adapter cette méthode pour une utilisation sur les biofilms de colonie, nous ont développé des techniques pour maintenir chaque échantillon sur son substrat de croissance et il laminage avec une surcouche d’agar et lysine a ajouté à la solution de fixation. Ces optimisations améliorent la conservation d’échantillons et de la préservation des caractéristiques micromorphologiques. Les échantillons préparés de cette manière sont prêtent pour fluidifier le sectionnement et imagerie par microscopie photonique, fluorescence et. Nous avons appliqué cette technique à la colonie des biofilms de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtiliset Vibrio cholerae. Le haut niveau de détail visible dans les échantillons générés par cette méthode, combinée avec la souche journaliste génie ou l’utilisation des colorants spécifiques, peuvent fournir un aperçu passionnant de la physiologie et le développement des communautés microbiennes.

Introduction

La plupart des microbes ont la capacité de forme biofilms, communautés de cellules attachées par des matrices auto-produit. Biofilms peut être cultivés dans de nombreux types de configurations physiques, avec différents régimes de disposition des éléments nutritifs et le substrat. Des tests spécifiques pour la formation de biofilm ont tendance à produire des structures multicellulaires reproductibles et architectures courantes sont observées pour des espèces phylogénétiquement diversifiés au niveau macroscopique ou communauté. Lorsque les microbes sont cultivés comme colonies sur milieu solide sous une atmosphère, morphologie macroscopique fournit des informations sur la capacité de production de la matrice et souvent en corrélation avec les autres traits 1,2,3. L’architecture interne des colonies microbiennes peut également fournir des indices sur le biofilm spécifique chimie et physiologie, mais il a été difficile à caractériser. Les applications récentes de techniques Cryoinclusion et cryosectioning aux colonies bactériennes ont permis d’imagerie et de visualisation des caractéristiques spécifiques à une résolution sans précédent de5, 4,6. Cependant, avec les tissus d’origine animale ont démontré que paraffine incorporation prévoit la conservation supérieure de morphologie comparée à Cryoinclusion 7 et a été utilisée pour visualiser des bactéries dans les tissus 8,9. Nous avons donc mis au point un protocole pour la fixation, enrobage de paraffine et découpe fine des colonies microbiennes biofilms. Ici, nous allons décrire la préparation de Pseudomonas aeruginosa PA14 colonie-biofilm minces 10,11, mais nous avons également avec succès appliqué cette technique aux biofilms formés par les bactéries Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, et Vibrio cholerae12.

Le processus d’enrobage de paraffine et de coupes minces biofilms suit une logique simple. Tout d’abord, les biofilms sont entourées d’une couche de gélose pour préserver la morphologie au cours du traitement. Deuxièmement, les biofilms enfermé sont submergées dans un fixateur aux macromolécules crosslink et préserver la micromorphologie. Ceux-ci sont ensuite déshydratés avec de l’alcool, effacés avec un solvant non polaire plus et puis infiltrés avec de la cire de paraffine liquide. Une fois infiltré, les échantillons sont intégrés dans des blocs de cire pour le sectionnement. Sections sont coupées, montées sur des glissières et puis réhydratées afin de retourner à un État plus naturel. De ce point, peut être teintés ou traitées dans le milieu de montage pour analyse microscopique.

Ce protocole produit des coupes minces des biofilms microbiens d’analyse histologique. Sous-structures de biofilm de colonie sont visibles lors de coupes minces préparées à l’aide de cette méthode sont imagés au microscope photonique. Biofilms également peuvent être cultivées sur des taches fluorescentes contenant de médias spécifiques pour les fonctions individuelles ou teintés à la phase de réhydratation, immédiatement avant le montage (étapes 9,5-9,6). Enfin, les microbes peuvent être conçues pour produire des protéines fluorescentes de manière constitutive ou réglementé permettant in situ rapports d’expression de distribution ou un gène cellulaire au sein de ces communautés. Nous avons utilisé ces méthodes pour déterminer la profondeur de biofilm de colonie, distribution cellulaire, distribution de matrice, profils de croissance et expression génique spatio-temporelle.

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Protocol

1. la croissance de Pseudomonas aeruginosa colonie Biofilms

  1. Préparation des plaques de Medium-bicouche
    1. Préparer un tryptone 10 g/L, la gélose de 10 g/L (voir Table des matières) de solution dans l’eau désionisée.
    2. Autoclave pendant 20 min. laisser refroidir à 50-60 ° C dans un bain d’eau.
    3. Versez 45 mL de la solution de Gélose tryptone dans un plat carré de 100 x 100 mm (voir Table des matières) à l’aide d’un tube conique de 50 mL. Permettre l’agar pour solidifier (~ 20-30 min). Verser une deuxième couche 15 mL au sommet de la première couche. Laisser solidifier du jour au lendemain, enlever la condensation de couvercles si nécessaire en l’essuyant avec un chiffon non pelucheux.
  2. Repérer les Biofilms de colonie
    1. Ensemencer les souches d’intérêt provenant des stocks du congélateur sur LB agar plaques13 et incuber dans l’obscurité pendant 12 à 16 h à 37 ° C et 80-100 % d’humidité relative.
    2. Pour chaque souche ou reproduire, utiliser une seule colonie pour ensemencer 2 mL de LB et incuber dans l’obscurité pendant 12-16 h à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.
    3. Sub culture par dilution au 1/100 en frais LB et en laissant incuber dans l’obscurité pendant 2,5 à 3 h à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.
    4. Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre et ajuster avec LB stérile pour obtenir une suspension de cellules avec une OD500 nm de ~ 0,5.
    5. Selon la colonie désirée taille, ajouter 2,5-10 µL de la suspension de cellules sur une plaque de médium-bicouche (préparée à l’étape 1.1) et permettent la tache sécher pour environ 20 min. laisser le couvercle petri ajar près d’une flamme peut faciliter le séchage.
    6. Incuber le spots colonies à 25 ° C et 80-100 % d’humidité relative, dans l’obscurité pendant 4 jours.

2. préparation de la Solution de fixation

  1. Préparer la solution de fixation sur le jour de la récolte d’échantillon. Diluer les 37 % de formaldéhyde (FA) dans du PBS 1 x à une concentration finale de 4 % FA.
    ATTENTION : FA est volatile et toxique. Porter un équipement protecteur et travailler sous une hotte ventilée.
  2. Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre le chlorhydrate de L-lysine dans 4 % FA (préparé à l’étape 2.1) à température ambiante pour une concentration finale de 50 mM de L-lysine HCl.

3. Application du fixateur à la colonie de Biofilm [facultatif] directe

NOTE : Nous avons trouvé que le biofilm morphologie est mieux conservée lors de la superposition d’agar est ajoutée avant la fixation. Toutefois, cette étape constitue également un changement dans les conditions environnementales qui pourraient influer sur l’expression des gènes. Modèles d’expression de journaliste fluorescent devraient donc être vérifiées en utilisant un protocole distinct dans lequel l’étape de la fixation est effectuée avant l’ajout de la superposition d’agar, comme décrit ici.

  1. Le jour de la fixation et de travailler sous une hotte ventilée, pipette le fixatif préparé à l’étape 2 directement sur la surface de la gélose autour de la colonie, lui permettant d’atteindre la périphérie de la colonie sans submergeant. Ne s’appliquent que comme beaucoup le fixateur qu’est nécessaire pour pleinement entourent la colonie, environ 500 µL. permettre le fixateur de diffuser dans la colonie et l’agar environnante.
  2. Une fois que le fixateur a été complètement absorbé dans la colonie et les médias environnants, environ 20-30 min, et FA résiduelle n’est plus visible sur la plaque, répétez l’étape 3.1. Laissez ce fixatif de diffuser dans la colonie et l’agar environnante.
  3. Une fois que le fixateur est entièrement absorbé par la colonie et les environs media Répétez l’étape 3.1, ce moment appliquer fixateur sur la surface de la colonie directement. Permettre ce fixatif de diffuser dans la colonie et l’agar environnante, procéder à l’étape 4 seulement après tout fixateur a été absorbée et n’est plus visible sur la plaque.

4. recouvrement des Colonies avec Agar

  1. Le jour de la fixation, préparer un 10 g/L de solution d’agar dans l’eau désionisée et stériliser pendant 10-20 minutes pour dissoudre. Laisser refroidir dans un bain d’eau à 50 ° c.
  2. Verser doucement 15 mL de la solution d’agar sur le milieu de croissance et de la colonie. Permettre l’agar pour former un gel à température ambiante pendant 5 min (Figure 1 b).
  3. Utiliser une lame de rasoir tranchante pour couper un mandrin carré, 3 couches avec la colonie laminée entre les couches supérieures de deux. Si vous préparez plusieurs échantillons, veiller à ce que chaque découpe est de taille comparable.
  4. Délicatement enlever excès agar du mandrin contenant de colonie.
  5. Pour soulever les deux couches supérieures de la gélose (contenant la colonie) loin de la couche de fond du mandrin (Figure 1), mouiller la tête plate d’une spatule en 1 x PBS ou eau et insérez délicatement entre les couches supérieures et inférieures. La colonie feuilletée devrait séparer de la couche inférieure. Veillez à ne pas déformer ou plier la colonie feuilletée en soulevant de sa base.

5. fixation

  1. Travailler sous une hotte ventilée, transférer immédiatement la colonie feuilletée (c.-à-d., 2 couches chuck) dans une cassette d’encastrement (voir Table des matières), marquées avec un stylo de marquage résistant aux produits chimiques. Placez la cassette d’encastrement dans une enveloppe de lame de verre (voir table des matières) contenant le fixatif préparé en étapes 2.1-2.2. Assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air emprisonné à l’intérieur de la cassette d’encastrement.
  2. Incuber l’échantillon dans le fixateur pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante.

6. traitement : Tampon de lavage, la déshydratation, compensation et Infiltration

  1. Après fixation au jour le jour, laver l’échantillon deux fois dans du PBS 1 x 1 h chaque. Pour de meilleurs résultats, automatiser l’homogénéisation de réactif à l’aide de la vrille fonction d’un processeur de tissu automatique (voir table des matières) réglée sur un réglage bas. Si aucun processeur n’est disponible, le traitement peut être exécuté manuellement.
  2. Suivez le tampon de lavage par déshydratation à travers une série graduée de solutions dans l’éthanol (EtOH) dans du PBS 1 x (25 %, 50 %, 70 %, 95 %) pendant 1 h à température ambiante chaque.
  3. Déshydrater en trois lavages de 100 % EtOH pour chacune 1 h à température ambiante.
  4. Désactivez l’échantillon déshydraté en trois lavages d’agent de compensation de base d’huile orange 100 % (voir tableau des matériaux) pour 1 h à température ambiante.
  5. Infiltrez l’échantillon dégagé deux fois avec de la paraffine fondue de cire (voir Table des matières), chauffé à 55 ° c, pendant 2 heures chacun.

7. échantillon incorporation

  1. Remplissez un moule en cire de paraffine liquide chauffé à 55 ° c. Utilisez une spatule plate, chauffée permet de transférer rapidement le mandrin infiltré de la cassette d’encastrement dans le moule de cire, en veillant à ce que le mandrin est parallèle à la base du moule. Ne pas appliquer une pression excessive sur le mandrin. Moules de cire peuvent être personnalisé 3D imprimée, ou sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
  2. Laisser la cire se solidifier durant la nuit à 4 ° c. Moulé dans la cire solide des échantillons peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° c.
  3. Une fois la cire a solidifié, l’échantillon du moule de l’accise et couper l’excès de cire d’autour de l’échantillon avec une lame de rasoir. Laissez les excès de cire qui s’étend d’un bout de l’échantillon, parallèle au plan de coupe, qui peut servir à fixer dans le microtome (voir Table des matières). Également laisser une gaine de cire, d’environ 1 mm d’épaisseur, autour de l’échantillon et lisser ses faces.

8. découpe

  1. Faire chauffer un bain d’eau à 42 ° c. Serrer l’échantillon dans le microtome à la surface de la colonie orientée perpendiculairement au bord de la lame (voir Table des matières).
  2. Couper l’échantillon à des intervalles de 50 µm jusqu'à ce que le plan désiré de la colonie a été atteint, d'où sections seront recueillies.
  3. Couper un ruban le nombre désiré de coupes 10 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome, affectez une sectionnement vitesse de 75 à 80 tr/min et un angle de dégagement de 6-10 °. Utilisez un pinceau à pointe fine pour détacher le ruban de la lame.
  4. À l’aide d’une goutte d’eau à l’extrémité d’une pipette Pasteur (de préférence) ou une pince, transférer doucement le ruban à l’eau du bain. Veillez à éviter les bulles d’air de piégeage en vertu de la section.
  5. Immédiatement, insérer une diapositive dans le bain-marie et positionnez-le sous le ruban à un angle de 45˚.
  6. Appuyer sur le côté étroit du ruban pour la diapositive, juste en dessous de l’étiquette givré. Le ruban doit respecter.
  7. Tirer la lame sortant du bain d’eau, réglage de l’angle de devenir perpendiculaire à la surface de l’eau et en permettant le ruban à plat contre la lame sur toute sa longueur. Ne pas emprisonner l’eau en excès sous le ruban.
  8. Doucement, se tiennent le glisser sur un tissu absorbant pelucheux, évacuant l’excès d’eau dans la section.
  9. Poser la culasse sur du papier absorbant et laissez-les sécher à température ambiante pendant la nuit dans l’obscurité. Diapositives peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° c dans l’obscurité.

9. fixation des chaleur, réhydratation et montage

  1. Faire chauffer une plaque chauffante nivelée à 45 ° c. Faire chauffer la lame pendant 30-60 min. La cire deviendra semi fondue et aplatir contre la lame porte-objets.
  2. Doucement soulever le glissement de la plaque chauffante et posez-le à plat sur une surface lisse, nivelé, température ambiante, à l’aide de soin de veiller à ce que la cire fondue ne tire pas de part et d’autre de la glissière, jusqu'à ce que la cire solidifie (~ 1 min).
  3. À l’aide d’une enveloppe de lame de verre, cire hors de diapositives dans quatre lavages de clearing agent de 5 min chacun, à l’aide d’un aspirateur de Büchner pour enlever la solution entre les lavages.
  4. Laver les lames trois fois en 100 % EtOH pendant 1 min chaque.
  5. Réhydrater les lames dans une série graduée de l’éthanol dans l’ordre inverse du traitement (95 %, 70 %, 50 % et 25 %) pendant 1 min, que chacune suivie de deux lavages 1 min dans du PBS 1 x.
  6. Montez immédiatement les sections dans un milieu de montage tampon Tris (voir Table des matières) et appliquer un lamelle couvre-objet, en évitant l’introduction de bulles d’air. Permettre aux milieu de montage polymériser pendant une nuit à température ambiante.
  7. Une fois polymérisé, scellez la lamelle couvre-objet sur la diapositive à l’aide de vernis à ongles transparent. Scellé de diapositives peuvent être conservés indéfiniment dans l’obscurité à 4 ° c.

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Representative Results

Cette méthode génère minces biofilm dans lequel des caractéristiques morphologiques distinctes et les zones d’expression de gène peuvent être photographiées par DIC, microscopie à fluorescence et TEM. Alors que l’imagerie DIC utilisant un 40 X objectif à immersion d’huile peut être suffisant pour montrer certaines caractéristiques morphologiques (Figure 2E), nous avons trouvé cette fluorescence microscopie des souches machinés pour protéine fluorescente constitutivement express offre améliorée visualisation de la distribution de la cellule au sein de l’échantillon (Figure 2D). Images des sections individuelles peuvent être cousues ensemble pour générer un échantillon représentatif de toute la colonie (Figure 2 b) et fournissent un contexte pour la localisation des caractéristiques structurales dans la morphologie globale à l’échelle macroscopique (Comparez Figure 2 a, B et C). Caractéristiques morphologiques et signaux fluorescents peuvent être mesurés à l’aide de logiciels d’imagerie14. Structures au sein du biofilm ou les transitions entre les zones d’expression de gène peuvent alors être corrélées avec des distributions de métabolites ou gradients chimiques11 .

Ce protocole peut être modifié et adapté à plusieurs égards. Utilisation d’une souche machinée pour protéine fluorescente express sous le contrôle d’un promoteur spécifique permet la visualisation de la distribution de l’expression génique (Figure 3 a). Colonies peuvent être cultivés sur un milieu contenant des colorants, ou colorants peuvent être ajoutés après sectionnement, pour tacher de polysaccharides spécifiques (figure 3 b et C). Enfin, les échantillons préparés dans une version modifiée du présent protocole peuvent être examinés par TEM (Figure 3D) permettant la visualisation à une résolution plus élevée que celle activée par la DIC ou la microscopie de fluorescence.

Figure 1
Figure 1 : Schéma illustrant le programme d’installation pour la croissance de la colonie avant la fixation.
(A) les Colonies sont cultivés sur le dessus de deux couches de médium de croissance solide agar (haut et bas) et (B) sont ensuite recouvertes d’une couche supplémentaire (superposition), qui préserve la morphologie des colonies. (C) la colonie en sandwich entre l’incrustation et la couche supérieure est ensuite séparée de la couche de fond pour un traitement ultérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fonctionnalités micromorphologiques et fluorescence YFP dans les sections transversales des colonies de paraffine.
Des données représentatives pour un Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz colonie15 exprimant constitutivement YFP et cultivées pendant 3 jours sur tryptone 1 %, 1 % d’agar contenant Congo rouge et bleu de Coomassie bleu. (A) vue de dessus, image de fluorescence montrant la moitié d’une colonie avant la fixation. (B) section transversale de toute la colonie après incorporation de paraffine. La zone boxed a été photographiée avec un objectif X 10 (C). La zone boxed (c) a été ensuite photographiée avec un 40 X huile d’immersion objectif à l’aide de fluorescence (D) et DIC (E). Barres d’échelle représentent 2 mm (A), 500 µm (B) et 100 µm (C-E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Expression du rapporteur, pre- et post-coloration des fonctionnalités de biofilm et l’imagerie TEM d’échantillons de biofilm de colonie de paraffine.
(A) fluorescence de journaliste mexGPr-GFP dans une colonie P. aeruginosa PA14 cultivée pendant 3 jours sur tryptone 1 %, 1 % d’agar. (B) fluorescence rouge de Congo lié dans une colonie de synxantha P. cultivée pendant 5 jours sur un milieu contenant le colorant. (C) la fluorescence de la tache de lectine floribunda Wisteria pour Pel polysaccharide dans une P. aeruginosa PA14 Δphz colonie (cultivée pendant 2 jours sur tryptone 1 %, 1 % gélose contenant Congo rouge et bleu de Coomassie bleue), appliquée après lamélisation. D image TEM d’une colonie dephz Δ de P. aeruginosa PA14 (cultivée pendant 3 jours sur tryptone 1 %, 1 % d’agar contenant Congo rouge et bleu de Coomassie bleue) et traités pour le sectionnement par enrobage de paraffine *. Barre d’échelle représente 40 µm (A-B), 20 µm (C) et 5 µm (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

* Cet exemple a été traité pour le sectionnement par enrobage de paraffine grâce à l’étape 4 du protocole précité, en omettant les étapes 4.1-4.3 et ensuite traité séparément pour l’analyse TEM.

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Discussion

Des échantillons de tissus enrobage de paraffine et de coupes minces est une technique histologique classique qui permet l’imagerie des structures micro-morphologiques et est couramment utilisée sur les tissus eucaryotes et a été appliquée avec succès aux échantillons microbiens8 ,,9. Cryoinclusion permet à forte rétention de signal endogène et par immunofluorescence, enrobage de paraffine est généralement préférable car il fournit la meilleure préservation de morphologie16. Pour adapter cette méthode pour l’application sur les biofilms microbiens, nous nous sommes concentrés sur les caractéristiques qui sont propres à notre système. Les cellules et la matrice des tissus sont souvent maintenus ensemble relativement robuste, tandis que les biofilms ont tendance à être plus délicates ; donc, nous avons optimisé la fixation systématique et cire intégrant les protocoles pour maximiser la conservation d’échantillons. Maintenant l’exemple sur son substrat de croissance et en superposant la colonie avec agar immédiatement avant la fixation assure que l’échantillon n’est pas perdu par le haut ou la base. Cependant, superposant les colonies avec agar qui est trop chaud peut endommager les colonies, donc il faut faire attention supplémentaire au cours de cette étape.

La fixation est une étape essentielle pour le maintien de structure grâce à la déshydratation sévère, de compensation, et infiltration étapes requises pour l’enrobage de paraffine. Nous avons trouvé que cette fixation de lysine-formaldéhyde meilleure préserve l’intégrité de l’échantillon. Lysine soluble, une diamine, peut réagir avec les aldéhydes pour former des polymères réticulés et a été proposé de renforcer les exopolymères substance (EPS) contre la dégradation mécanique17,18.

Nous avons observé que la fluorescence de fond diminue avec lavages successifs à l’agent orange à base d’huile, ou par une exposition prolongée, lors de la réalimentation de l’échantillon (étape 9.3). Sur-traitement avec l’agent de compensation peut, toutefois, causer des échantillons fragiles qui sont difficiles à l’article19. Il peut être nécessaire d’ajuster le volume ou le nombre de lavages pour tenir compte de la quantité de cire présent lors de chaque réhydratation. Fluorescence de fond accrue peut survenir même contre la contamination des tissus traitement réactifs, où la cire, qui est un peu autofluorescentes, est entièrement ou partiellement miscible dans le solvant de compensation ou de l’éthanol utilisé dans cette procédure (étapes 6.1-6.4). en outre, nous avons trouvé que l’éthanol diminue le signal de la journaliste, et il est essentiel de reconstituer le fluorophore dans deux lavages de PBS avant montage (étape 9,5-9,6).

Cette méthode permet également la localisation de la fluorescence constitutive et pilotée par le promoteur à la résolution des cellules. Nous conseillons cependant attention lorsque vous utilisez cette méthode pour interpréter l’expression des gènes. L’étape de recouvrement introduite par le présent protocole (point 4.2), appliqué avant fixation à 50 ˚C, présente un changement environnemental considérable par rapport aux conditions de croissance initiale qui peut influencer les profils d’expression génique. Il peut être utile vérifier les profils d’expression en appliquant le fixateur à la colonie directement, immédiatement avant de couler la superposition, mais à un coût à la morphologie (étape facultative 3.1 à 3.3).

Un autre facteur influant sur l’interprétation de la fluorescence est la topographie de l’article lui-même. Différentes régions du biofilm peuvent présentent des degrés de l’intégrité structurelle et être plus ou moins sensible à la préservation par l’intermédiaire de fixation, qui, selon le cas échéant, groupes fonctionnels, ces composants sont capables de contribuer à la réticulation fixateur 20. ainsi, sections peuvent perdre la biomasse disproportionnée de la surface de la section lorsqu’il passe d’une zone morphologique ou métabolique à l’autre le long de l’axe z de la colonie. Cela peut être adressée par l’imagerie d’une tranche de focale intacte de la section avec un microscope confocal.

En plus d’appliquer cette technique aux souches machinés pour protéines fluorescentes express, nous avons examiné micromorphologiques caractéristiques par microscopie électronique à transmission (TEM) et dans les échantillons de biofilm teintés avec des colorants fluorescents spécifiques (Figure 3 a ). Jennings et coll. a récemment décrit une spécifique de colorant pour le Pel, le polysaccharide majeur produit par P. aeruginosa PA14 biofilms 21. Comme décrit dans le protocole et représentant les résultats ci-dessus, application de ce colorant aux sections permet pour la visualisation de la distribution de Pel dans les biofilms colonie PA14 à haute résolution (Figure 3) 3. À l’inverse, les colorants fluorescents comme le rouge Congo peuvent être ajoutés au milieu de croissance et imagés après découpe (Figure 3 b). L’application d’un revêtement préserve aussi la structure de morphologie et de la cellule de biofilm colonie tout au long du traitement pour TEM (Figure 3D).

La méthode optimisée décrite ici permet la préparation des biofilms de colonie pour le sectionnement par enrobage de paraffine, dans lequel le signal endogène et fonctionnalités ainsi que les teintures complexés peuvent être localisée en vivo avec une résolution supérieure tout en minimisant l’échantillon pertes et préserver la colonie indigène de macro - et de micro-morphologies. Nous reconnaissons que l’utilisation importante d’effort, de temps et de réactifs sont nécessaires pour cette méthode. Cependant, nous estimons que ces inconvénients sont contrés par le degré de préservation morphologique, la résolution de in situ par fluorescence et la susceptibilité de procédures préalables et post coloration ou stratégies alternatives de traitement (tels que la préparation pour TEM) offertes par cette technique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la NSF carrière prix 1553023 et NIH/NIAID prix R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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References

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